CELLULE STAMINALICELLULE STAMINALIAPPLICAZIONI APPLICAZIONI

TERAPEUTICHETERAPEUTICHE

Maurilio SampaolesiMaurilio SampaolesiMaurilio SampaolesiMaurilio Sampaolesi

LESSON 8LESSON 8Corso ANATOMIA UMANA IICorso ANATOMIA UMANA II

SpecialisticaSpecialistica

(2011(2011--2012)2012)

cellule staminali cellule staminali ematopoietiche:ematopoietiche:ematopoietiche:ematopoietiche:terapia cellulareterapia cellulare

SCRISCRI

•HUMAN ANATOMY II -

LESSONS- PAVIA BIOTECHNOLOGY

http://paviabiotechonology.myblog.it/

TESSUTO CONNETTIVOTESSUTO CONNETTIVO

CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHECELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE

terapia cellulare ortodossaterapia cellulare ortodossa--sostituzione di cellule ematopoietiche difettose o malate sostituzione di cellule ematopoietiche difettose o malate (es. ADA(es. ADA--SCID) con cellule da donatore (terapia eterologa) o SCID) con cellule da donatore (terapia eterologa) o cellule del panziente corrette geneticamente (terapia cellule del panziente corrette geneticamente (terapia autologa) autologa) -- LINFOMI (tumori linfocitari)LINFOMI (tumori linfocitari)

CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHECELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE

terapia cellulare nonterapia cellulare non--ortodossaortodossa--utilizzo di HSC per altri tessuti effetto diretto utilizzo di HSC per altri tessuti effetto diretto transdifferenziativo ed effetto autocrinotransdifferenziativo ed effetto autocrino--paracrino paracrino (angiogenesi, fattori di crescita, fattori antiapoptotici, (angiogenesi, fattori di crescita, fattori antiapoptotici, immunosoppressivi, antiinfiammatori)immunosoppressivi, antiinfiammatori)--patologie cardiache (clinical trials!!!)patologie cardiache (clinical trials!!!)--patologie muscolaripatologie muscolari--altre patologiealtre patologie

Ematopoiesi embrionaleEmatopoiesi embrionale

•• PrimitivaPrimitiva----

–– ExtraExtra--embryonaleembryonale--nello yolk sacnello yolk sac

–– Definizione: early site of first erythrocytes in Definizione: early site of first erythrocytes in the developing embryo. These cells can only the developing embryo. These cells can only the developing embryo. These cells can only the developing embryo. These cells can only develop into the erythroid cell not other blood develop into the erythroid cell not other blood cell lineages. Primitive red blood cells are cell lineages. Primitive red blood cells are larger than mature red cells of the definitive larger than mature red cells of the definitive lineage, remain nucleated and express a lineage, remain nucleated and express a unique set of hemaglobins.unique set of hemaglobins.

Isole del sangue del sacco Isole del sangue del sacco vitellinovitellino

•• Yolk sac is a bilayer Yolk sac is a bilayer organ composed of organ composed of extraembryonic extraembryonic mesoderm and mesoderm and visceral endoderm.visceral endoderm.visceral endoderm.visceral endoderm.

•• Yolk sac is important Yolk sac is important in the processing of in the processing of maternal macromaternal macro--molecules and molecules and development of first development of first RBC. RBC.

HemangioblastsHemangioblasts(emangioblasta)(emangioblasta)

•• Progenitore teorico comune che può Progenitore teorico comune che può differenziare sia in cellula differenziare sia in cellula ematopoietica che endotelialeematopoietica che endotelialeematopoietica che endotelialeematopoietica che endoteliale

•• CharacteristicheCharacteristiche

–– Espressione di FlkEspressione di Flk--1 (VEGF Receptor), 1 (VEGF Receptor), kitkit--1 (stem cell factor receptor)1 (stem cell factor receptor)

–– Altri marcatori di progenitori Altri marcatori di progenitori ematopoieticiematopoietici

Primitive Red Blood CellsPrimitive Red Blood Cells

•• Soon after their development Soon after their development of the primitive vasculature of of the primitive vasculature of the embryo proper primitive the embryo proper primitive red blood cells are seen. red blood cells are seen.

•• These cells continue to divide These cells continue to divide in the blood stream,in the blood stream,in the blood stream,in the blood stream,

•• contain 4 times as much contain 4 times as much hemoglobin as adult cellshemoglobin as adult cells

•• There is continued There is continued differentiation that results in differentiation that results in an enucleated cell similar to an enucleated cell similar to adult cells.adult cells.

Ruolo dei fattori di crescita Ruolo dei fattori di crescita nel’eritropoiesi primitivanel’eritropoiesi primitiva

•• ErythropoietinErythropoietin---- growth factor associated with adult red growth factor associated with adult red blood cell development has been implicated in primitive blood cell development has been implicated in primitive RBC development. RBC development.

•• Role is still controversial but most recent data suggest and Role is still controversial but most recent data suggest and involvement. Erythropoietin increases hemoglobin involvement. Erythropoietin increases hemoglobin involvement. Erythropoietin increases hemoglobin involvement. Erythropoietin increases hemoglobin production production

•• mRNA transcripts or receptor have been observed.mRNA transcripts or receptor have been observed.

•• However, in a erythropoietin knockout system there are still However, in a erythropoietin knockout system there are still some hemoglobin producing cells of this lineage so not some hemoglobin producing cells of this lineage so not totally dependent as the fetal liver system is.totally dependent as the fetal liver system is.

EMATOPOIESI DEFINITIVAEMATOPOIESI DEFINITIVA--Yolk SacYolk Sac

•• Developmental cells that can give rise to the complete set of Developmental cells that can give rise to the complete set of hematopoietic cells. Thought to be a distinct developmental event from hematopoietic cells. Thought to be a distinct developmental event from primitive hematopoiesisprimitive hematopoiesis

•• Initiates in yolk sac and continues in the embryo proper.Initiates in yolk sac and continues in the embryo proper.

•• BFUBFU--E and CFUE and CFU--E originate in yolk sac (E originate in yolk sac (mouse E8.5 and 9.5 respectivelymouse E8.5 and 9.5 respectively))

•• Theses cells then migrate into the newly formed embryo where they fully Theses cells then migrate into the newly formed embryo where they fully •• Theses cells then migrate into the newly formed embryo where they fully Theses cells then migrate into the newly formed embryo where they fully differentiate.differentiate.

•• Macrophage precursors are also found in early development in the yolk Macrophage precursors are also found in early development in the yolk sac again suggesting definitive hematopoiesis in the yolk sac. sac again suggesting definitive hematopoiesis in the yolk sac.

BFUBFU--E = BurstE = Burst--Forming cell UnitForming cell Unit--ErythrocytesErythrocytes(unità di formazione esplosiva di colonie eritrocitarie)(unità di formazione esplosiva di colonie eritrocitarie)

in vitro circa 5000 cell/colonia in presenza di IL3; insens. EPOin vitro circa 5000 cell/colonia in presenza di IL3; insens. EPO

CFUCFU--E = Colony formation UnitE = Colony formation Unit-- ErythrocytesErythrocytes(unità di formazione di colonie eritrocitarie(unità di formazione di colonie eritrocitariein vitro circa 60 cell/colonia in presenza di EPOin vitro circa 60 cell/colonia in presenza di EPO

•• Definitive hematopoiesisDefinitive hematopoiesis--generation of more complex (lymphoidgeneration of more complex (lymphoid--myeloidmyeloid--erythroid) progenitors and adult repopulating hematopoietic erythroid) progenitors and adult repopulating hematopoietic stem cells.stem cells.

•• SiteSite--paraaortic splanchnopleura (PAS) and aortaparaaortic splanchnopleura (PAS) and aorta--gonadgonad--mesonephros mesonephros (AGM) region(AGM) region

EMATOPOIESI DEFINITIVAEMATOPOIESI DEFINITIVA-- in Embryo Properin Embryo Proper

(AGM) region(AGM) region

•• Primary site of fetal hematopoiesis is the liverPrimary site of fetal hematopoiesis is the liver

•• Key to understanding the development of the HSC is understanding Key to understanding the development of the HSC is understanding the unique microenvironment of each of the sites(Growth factors, cellthe unique microenvironment of each of the sites(Growth factors, cell--cell contacts)cell contacts)

•• Hematopoietic Stem Cells (HSC) are pluripotent cells that can develop Hematopoietic Stem Cells (HSC) are pluripotent cells that can develop into all blood cell lineages and other (??) cell types.into all blood cell lineages and other (??) cell types.

Runx1 and AGM Runx1 and AGM Hematopoietic DevelopmentHematopoietic Development

•• Transcription factor associated Transcription factor associated with maintenance of HSCwith maintenance of HSC

•• Knockout models lose fetal Knockout models lose fetal blood development not yolk sacblood development not yolk sac

•• Appears in the hematopoietic Appears in the hematopoietic •• Appears in the hematopoietic Appears in the hematopoietic islands of the AGM during first islands of the AGM during first definitive blood production in the definitive blood production in the embryo properembryo proper

Adult HematopoiesisAdult Hematopoiesis

Lymphoid DevelopmentLymphoid Development

Maintenance of Stem Cell PopulationsMaintenance of Stem Cell PopulationsRole of Bone Marrow Environment and Stromal CellsRole of Bone Marrow Environment and Stromal Cells

Role of Stromal Cells in Role of Stromal Cells in

HematopoiesisHematopoiesis

Steps in ErythropoiesisSteps in Erythropoiesis

Self renewal vs differentiationSelf renewal vs differentiation

1.Pluripotent stem cells1.Pluripotent stem cells2. Multipotent progenitors2. Multipotent progenitors3. Committed progenitors3. Committed progenitors4. Progressively maturing 4. Progressively maturing

precursorsprecursorsprecursorsprecursors

Concentration of Epo modulates Concentration of Epo modulates growth and apoptosis of erythroblastsgrowth and apoptosis of erythroblasts

CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHECELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE(HSC)(HSC)

Composizione del sangue

• Plasma: 55 %

• Parte corpuscolata: 45 %

– Globuli rossi 4.5 x 106/µl– Globuli rossi 4.5 x 10 /µl

– Globuli bianchi 9.0 x 103/µl

– Piastrine 2.5 x 105/µl

• Proteine plasmatiche: prealbumina, albumina, fibrinogeno, globuline

IRRADIAZIONE X LO STUDIO DI CELLULE STAMINALIIRRADIAZIONE X LO STUDIO DI CELLULE STAMINALI

SITI DI EMATOPOIESI NEI MAMMIFERISITI DI EMATOPOIESI NEI MAMMIFERI

(AGM) aorta(AGM) aorta--gonadgonad--mesonephros regionmesonephros region

CD34 positive nella aorta dorsale di embrione umanoCD34 positive nella aorta dorsale di embrione umano

HSC nel fegato del feto murinoHSC nel fegato del feto murino

FREQUENZA di HSCFREQUENZA di HSC

COME VIENE MANTENUTO IL NUMERO COME VIENE MANTENUTO IL NUMERO DI CELLULE STAMINALI ?DI CELLULE STAMINALI ?

DIVISIONE SIMMETRICADIVISIONE ASIMMETRICA

LA FREQUENZA DI CELLULE STAMINALI E’ LA FREQUENZA DI CELLULE STAMINALI E’ CONTROLLATA GENETICAMENTECONTROLLATA GENETICAMENTE

LA TELOMERASI E’ RICHIESTA PER EVITARE LA TELOMERASI E’ RICHIESTA PER EVITARE L’ACCORCIAMENTO DEI TELOMERI DURANTEL’ACCORCIAMENTO DEI TELOMERI DURANTE

LA DIVISIONE DELLE HSC NEI TRAPIANTI SERIALILA DIVISIONE DELLE HSC NEI TRAPIANTI SERIALI

ESISTE UN PROGRAMMA GENETICO PER ESISTE UN PROGRAMMA GENETICO PER DEFINIRE LE CELLULE STAMINALI?DEFINIRE LE CELLULE STAMINALI?

ISOLAMENTO E TRASDUZIONE DELLE HSCISOLAMENTO E TRASDUZIONE DELLE HSC

PUO’ UNA CELLULA STAMINALE PLURIPOTENTE PUO’ UNA CELLULA STAMINALE PLURIPOTENTE ESSERE TOTIPOTENTE?ESSERE TOTIPOTENTE?

“TRANSDIFFERENZIAMENTO DA UNA SINGOLA HSC”“TRANSDIFFERENZIAMENTO DA UNA SINGOLA HSC”PARABIOSI SPERIMENTALEPARABIOSI SPERIMENTALE

Il trapianto di midollo osseo sembrò quindi una Il trapianto di midollo osseo sembrò quindi una nuova possibile terapia per le distrofie muscolarinuova possibile terapia per le distrofie muscolari

E infatti un anno dopo:E infatti un anno dopo:Ma in realtà meno dell’ 1% delleMa in realtà meno dell’ 1% dellefibre muscolari viene “curato”fibre muscolari viene “curato”

SCRISCRI

Ragioni per il fallimento del trapiantoRagioni per il fallimento del trapianto1. Il topo mdx sviluppa una malattia meno grave della distrofia di Duchenne1. Il topo mdx sviluppa una malattia meno grave della distrofia di Duchenne2. Le cellule che formano muscolo non hanno problemi senza la distrofina2. Le cellule che formano muscolo non hanno problemi senza la distrofina3. Il tessuto connettivo che si accumula costituisce una barriera per cellule derivate 3. Il tessuto connettivo che si accumula costituisce una barriera per cellule derivate

dal circolodal circolo4. La micro4. La micro--circolazione del muscolo scheletrico è anche ridotta nelle distrofie circolazione del muscolo scheletrico è anche ridotta nelle distrofie

muscolarimuscolari5. I progenitori miogenici circolanti o associati ai vasi potrebbero essersi evoluti per 5. I progenitori miogenici circolanti o associati ai vasi potrebbero essersi evoluti per

l’accrescimento perinatale dei tessuti più che per la loro rigenerazionel’accrescimento perinatale dei tessuti più che per la loro rigenerazione

A volte le cose vanno meglioA volte le cose vanno meglioPurified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes

in vivoin vivoLagasse et al. Nature Medicine 6, 1129, 2000Lagasse et al. Nature Medicine 6, 1129, 2000

SCRISCRI

Cellule staminali emopoietiche da topi Rosa 26 formano nuovi Cellule staminali emopoietiche da topi Rosa 26 formano nuovi

lobuli epatici (blu) quando iniettate nella vena porta di un topo lobuli epatici (blu) quando iniettate nella vena porta di un topo

FAHFAH--//-- che manca di un enzima del fegato e va incontro a necrosi che manca di un enzima del fegato e va incontro a necrosi

epatica quando privato di un farmaco. In questo caso le cellule epatica quando privato di un farmaco. In questo caso le cellule

donatrici hanno un immediato vantaggio selettivo rispetto alle donatrici hanno un immediato vantaggio selettivo rispetto alle

cellule residenti.cellule residenti.

SCRISCRI

SCRISCRI

SCRISCRI

SCRISCRI

SCRISCRI

NorthAmerica (1)

Caribbean (2)

Europe(5)

Asia (6)

20,720,7

19,919,9

15,915,9 1,11,1

Donatori nel Mondo P.M.P. Donatori nel Mondo P.M.P. –– Anno 2002Anno 2002

SouthAmerica (4)

CentralAmerica (3)

Australia

19,919,9

7,97,9

2,62,6

10,410,4

SouthAfrica

2,62,6

Fonte: International Registry Fonte: International Registry –– Transplant Procurement MangementTransplant Procurement Mangement

perioperative multicomponent pheresis (PMP). PMP is a technique whereby whole blood is separated into packed red blood cells, plasma, and platelets

SPAGNA __________ 33,7SPAGNA __________ 33,7

AUSTRIA __________ 24,3AUSTRIA __________ 24,3

BELGIO ___________ 21,7BELGIO ___________ 21,7

PORTOGALLO _____ 21,7PORTOGALLO _____ 21,7

FRANCIA __________ 20,0FRANCIA __________ 20,0

FINLANDIA ________ 17,0FINLANDIA ________ 17,0

ITALIA _________ 18,0*ITALIA _________ 18,0*

Donatori in Europa P.M.P. Donatori in Europa P.M.P. –– Anno 2002Anno 2002

FINLANDIA ________ 17,0FINLANDIA ________ 17,0

NORVEGIA ________ 13,7NORVEGIA ________ 13,7

UK________________ 13,0UK________________ 13,0

DANIMARCA ______ 12,7DANIMARCA ______ 12,7

POLONIA _________ 12,7POLONIA _________ 12,7

OLANDA __________ 12,6OLANDA __________ 12,6

GERMANIA ________ 12,2GERMANIA ________ 12,2

SVEZIA ___________ 11,1SVEZIA ___________ 11,1

SVIZZERA_________ 10,4SVIZZERA_________ 10,4

Attività donazione per regione Attività donazione per regione –– Anno 2003*Anno 2003*2

1,1

30

,8

21

,1

19

,6 22

,2

39

,1

23

,7

17

,2

24

,9

34

,3

17

,5

26

,5

17

,2

22

,3

20

,5

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,2

22

,9

21

,1 23

,4

18

,6

Anno 2002 Anno 2003*

Donatori Utilizzati Donatori Utilizzati –– P.M.P. P.M.P.

7,0 7,4

12

,1

19

,6

13

,7

12

,6

10

,5

10

,0

7,6

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,2

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14

,5

11

,2

8,5

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9,7

17

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7,2 9

,5

12

,9

6,4

3,4

18

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Ab

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* Proiezione annuale su dati del 31 luglio 2003 * Proiezione annuale su dati del 31 luglio 2003

Attività trapianto di cellule staminali emopoieticheAttività trapianto di cellule staminali emopoietiche

3.667

3.898

4.245

Totale trapianti Totale trapianti

1.1121.168

Allogenico Allogenico

2.786

3.077

Autologo Autologo

2001 2002 2003*

1.025

1.112

2001 2002 2003*

2.6322.786

2001 2002 2003*

3.8

98

3.4

99

3.1

95

2.1

04

1.8

89

FONTE: EBMT Activity survey 2001: A. Gratwohl, H. Baldomero, Basel, SwitzerlandFONTE: EBMT Activity survey 2001: A. Gratwohl, H. Baldomero, Basel, Switzerland

Trapianto di cellule staminali emopoietiche in EuropaTrapianto di cellule staminali emopoietiche in Europa20032003

2.1

04

1.8

89

57

75

73

52

74

43

42

93

73

36

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17

28

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16

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66

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81

32

12

71

07

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72

72

01

31

21

21

19 4

Ita

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