modèles expérimentaux...

Modèles expérimentaux d’HTA

Bernard Jover, Montpellier

L’HYPERTENSION ESSENTIELLE EST ELLE

UNE ENTITE?

HYPERTENSION SECONDAIRE

- Reliée à une perturbation spécifique

- Perdure avec la perturbation

- Disparaît avec la perturbation

HYPERTENSION ESSENTIELLE

Se définit par l’absence de perturbation

spécifique et réversible, directement liée

à l’HTA. (HTA obèse n’est pas EH)

Pas de modèle expérimental adéquat

Que demandons-nous à un modèle animal?

• Mimer la maladie de l ’homme dans sa complexité,

• Permettre d ’isoler certains facteurs,

• Être manipulable (taille, durée de vie, reproductibilité, coût)

• Comprendre la physiopathologie de l ’HTA clinique

• Élucider la relation entre PA et ses complications

• Disposer d ’espèces et de souches adaptées

Ce qui sous-entend

Que connaissons-nous de l’HTA ?

• Sa cause? – 95% des cas: inconnue (mais cette forme d’HTA a un nom:

HTA ESSENTIELLE…)

– 5%: cause identifiée (surrénales, rein, artères, …)

• Son pronostic à un échelon individuel? – QUI fera une complication?

– LAQUELLE ?

• Savons-nous identifier la réponse à un traitement anti-hypertenseur donné à un échelon individuel? – Pas vraiment…

Epidémiologie: Les paramètres associés à l’HTA

• Génétiques – Agrégation familiale

– Caractéristiques ethniques

– Genre

• Environnementaux – Statut socio-économique

– Obésité

– Sédentarité

– Age

– Alimentation (sel, alcool,…)

– Exposition à des agents divers

– …

Pathophysiologie: les mécanismes impliqués dans l’HTA

• Hémodynamique rénale – réduction du flux sanguin rénal mais débit de filtration glomérulaire

normal

• Endothélium – dysfonctionnement endothélial

• Vasculaire – raréfaction capillaire; remodelage vasculaire

• Système nerveux sympathique – baro-réflexe

– Afférences et efférences sympathiques rénales (dénervation)

• Système rénine angiotensine aldostérone

…non exhaustif (Stress Oxydatif, Inflammation, …..)

Modèles expérimentaux

• Il n’y a pas une HTA humaine, mais différentes formes – HTA du sujet jeune maigre Caucasien de 25 ans

– HTA systolique isolée du sujet âgé

– HTA chez un sujet obèse de 60 ans

– HTA sur sténose de l’artère rénale

– HTA avec hyperaldostéronisme primaire…

• Il n’y a pas un modèle expérimental, mais différents modèles pour explorer ces différentes formes

• Analyse des différents aspects de l’étude de l’HTA – Génétique

– Pathophysiologie

– Pharmacologie

Vous avez décidé de créer un modèle

expérimental d’HTA (I)

• Quelle HTA?

– Essentielle ou secondaire? …

• Choix de l’espèce

– HTA spontanée: dindon, chien, rat ou primate

– HTA secondaire: ex: Goldblatt: chien et rat

– HTA par manipulation génétique: rat et souris

(knock-out ou transgénique)

Développement de modèles expérimentaux

pour comprendre les différentes formes d’HTA

L’HTA a un composant

génétique évident

Vous voulez créer des modèles

de rats génétiquement

hypertendus

-4-2024

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

ddp X

-4-2024

0.0

0.1

0.2

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ddp

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0.0

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ddp

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0.0

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0.3

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ddp X

-4-2024

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

ddp17 à 20 générations … …

Pression de sélection

Principes généraux de la constitution de

modèles génétiques de rats hypertendus

• Pression de sélection – Croisements entre eux des rats d’une colonie

• 17- 20 générations de consanguinité

-> Déplacement progressif de la moyenne du niveau tensionnel de la population vers l’HTA

– ~ 95% homozygotes

– Créer aussi une ligne de rats normotendus (voire hypotendus)

• Problème habituel – Risque permanent de dérive vers l’hétérozygotie

• Choix des reproducteurs en fonction de leur niveau tensionnel

Rats spontanément hypertendus:

souches les plus utilisées

• SHR (spontaneously hypertensive rats)

– HTA sévère et précoce

– Rénine normale ou élevée (non basse)

– Système nerveux sympathique élevé

– Paradoxalement peu de complications

– Contrôle: Wistar Kyoto (WKY) Okamoto


souches les plus utilisées

• SP-SHR (Stroke Prone)

– HTA précoce très sévère en alimentation riche en sel (4% à 8% NaCl)

– Rénine normale ou élevée (non basse)

– AVC très fréquents - Thromboses vasculaires – Néphroangiosclérose

– Durée de vie: 18 à 24 mois

• SHHF (Heart Failure)

– HTA avec insuffisance cardiaque,

néphropathie, insulino-résistance


souches moins utilisées

• Rats Milan – HTA modérée avec glomérulosclérose précoce

• Rats Lyon – LH, LN (normotendus) et LL (rats « hypotendus »)

– Hypercholestérolémie, HTA modérée, Forte Protéinurie

• Rats Sabra

– SBN et SBH (Hebrew University) HTA sensible au sel

avec protéinurie spontanée (tumeur de l ’endomètre)


souches les moins utilisées

• Rats GH (NZ) : – HTA modérée avec forte HVG

• Rat Brown-Norway x NZ GH :

– Fragilité vasculaire du BN exacerbée chez le rat

F(1) = BN x New Zealand GH.

• Rat IMAI : – Glomérulosclérose focale spontanée évoluant

vers une HTA, un syndrome néphrotique, une hyperlipidemie, et insuffisance rénale progressive.

Cardiovascular-Renal-Metabolic

Research Rat Models

Spontaneously Hypertensive (SHR)

SHR Heart Failure (SHHF)

SHR Stroke Prone (SHRSP)

SHR Obese (SHROB)

Dahl/Salt Sensitive (DAHL/SS) -HTA si 8%NaCl –Rôle du NO

Goto-Kakizaki (GK)

Zucker

Zucker Diabetic Fatty (ZDF)

ZSF1 (ZDF female x SHHF male)

Modulation des gènes d’un animal pour

développer une HTA

• Animaux transgéniques – Intégration au niveau du génome d’un gène codant pour une

protéine -> surexpression de ce gène

– Ex: Ren2: HTA maligne

• Animaux invalidés (knock out) – uniquement la souris – Toutes les protéines sont potentiellement concernées

– Ex: NO Synthase KO, récepteurs AT1 ou AT2 de l’angiotensine II, …

• Surexpression ou invalidation ubiquitaire – Utilisation à long terme est dictée par la pertinence du modèle

Animal transgénique

- Animal dont le génome a été modifié suite à une

intervention humaine

- Transmissible d'une génération à l'autre (présence lignée

germinale)

1. Addition de nouvelles séquences d'ADN (intégration au

hasard) = transgénèse passive/additive

2. Modification de séquences déjà présentes (KO, KI, transgénèse

ciblée) par genome editing (recombinaison homologue).

La transgénèse passive (classique)

Doyle et al., Transgenic research 2012

Années 1970-1980

femelles 4 sem

superovulation et

accouplement

Récolte des œufs fertilisés, et

maturation jusqu'à ce que le

pronucleus mâle se localise

au centre du zygote

Pronuclei

Microinjection de

l'ADN dans le

pronucléus mâle

Survie 75%

Transfert des embryons dans

l'oviducte de femelles

pseudogestantes

(25-35 embryons par souris)

Naissance au bout de 18 jours

25% des embryons implantés Screening de l'ADN pour identifier

l'incorporation du transgène

(10% des nouveaux nés sont positifs)

GFP, Protéine fluorescente


• Applications : Expression tissu spécifique

Promoteur α-MHC Lac Z polyA

α-MHC : myosin heavy chain → expression spécifique dans le cœur

Animaux transgéniques

Quel(s) gène(s) ?

25

31

32.1

32.2 32.3

41

42.1 42.1 42.1 43

44

RENIN

AGT (M235T)

CHR 1q CHR 3q CHR 17q

25

24

23

22

21.3

21.2

21.1

12

ACE (ID)

GH

COL1A1

PNMT

AE1

NF1

NGF

R

RENIN ANGIOTENSIN SYSTEM

26.3

25

23

22

21.3

21.2

21.1

12

CPA3

AGTR

1

M3S1

RHO

26

24

C4BP

-HB

-ACTININ2

« Fulminant hypertension in transgenic rats

harbouring the mouse Ren-2 gene »

Mullins JJ et al Nature 1990

Surexpression ubiquitaire de hProRenRc

Hypertension. 2006;47[part 2]:552-556

Surexpression de hR(P)R dans les cellules musculaires lisses vasculaires

Comme la

rénine et

l’angiotensine I

sont identiques

probable

cause

surrénalienne

Plasma Aldo

Plasma Aldo/Renine

La souris transgénique recevant le gène de l’endothéline-1

humaine n’est pas hypertendue!

Hocher, JCI 1997

RAT CONSOMIQUE

Animaux invalidés (knock out)

• Animaux invalidés (knock out) – uniquement la souris – Toutes les protéines sont potentiellement concernées

– Ex: NO Synthase KO, récepteurs AT1 ou AT2 de l’angiotensine II, …

• Surexpression ou invalidation ubiquitaire – Utilisation à long terme est dictée par la pertinence du modèle

Le knock-out, invalidation du gène eNOS

Uniquement la souris ?

Délétion du gène GFP

Le knock-out, invalidation d'un gène

Le knock-out, invalidation d'un gène

C’est un modèle d’hypotension


• Limitations de la transgénèse passive

– Rendement faible 3-10% de souriceaux transgéniques

– Technicité élevée, temps de formation long

– Coût élevé

– Intégration à l'origine de réarrangements, duplications… au

niveau du site d'insertion

La transgénèse ciblée

• Inactivation génique : KO (Knock Out)

Perte de fonction

• Remplacement de gène : KI (Knock In)

Gain de fonction

• Cellules souches embryonnaires (ES)

• Recombinaison homologue


Prélèvement

Blastocystes

Culture Superovulation

Accouplement (ou FIV et culture)

Modification

génétique

Microinjection

des cellules ES

dans blastocystes

Implantation dans

utérus femelles

pseudogestantes

2,5 jpc

Naissance

souris chimères

18j

Croisements

Etapes de la transgénèse ciblée

(ou lignées de cellules ES)

Evaluation de la présence du transgène


Invalidation de gène (KO) par recombinaison homologue

Principe : implique la connaissance des séquences concernées : le gène à

invalider + les séquences avoisinantes

gène à invalider

Lac Z,NeoR…

Gène inséré à la place du gène à invalider, sous le

contrôle de ses séquences promotrices

NeoR : gène de résistance à la néomycine (G418)

Séquences identiques permettant la recombinaison homologue

Echange de séquences nucléotidiques

entre 2 séquences d'ADN identiques

ou similaires

Le knock-in, la mutagenèse ciblée

Expériences plus "fines" que la simple invalidation d'un gène

- Le Knock-In est un cas particulier de Knock-Out.

- On remplace un gène par un autre gène, qui se trouve

alors sous le contrôle de l'ensemble des séquences

régulant l'expression du gène invalidé.

- Il est aussi possible de procéder à une mutation ponctuelle

(un gène par une version très légèrement différente de ce

gène).

Modification de séquences par

Edition génomique - Genome editing

Insertion, remplacement ou délétion d'ADN grâce à des nucléases

→ Cassures double brin spécifiques à des endroits choisis du

génome.

→ Stimuler mécanismes de réparation par recombinaison

homologue ou par non homologous end joining (NHEJ)

• Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

• Transcription Activator Like Effector Nucleases (TALENs)

• CRISPR/Cas9

La transgénèse ciblée • Recombinaison homologue seule : faible d'insertion génique

ZNFs TALENs Cas9:sgRNA

NHEJ HR

+ ADN donneur

Non homologous end joining Ligation des extrémités non homologues

Jointure directe entre les brins d'ADN.

Génération d'erreurs (Indel mutations)

Cassure double brin


Modification de séquences par Genome editing

Recombinaison homologue

Pas d'erreur et insertion précise

Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 January ; 14(1): 49–55.

Les systèmes conditionnels

1. Système Cre/LoxP

2. Système Tet/Off Tet/On


• Si le gène est nécessaire au développement, implantation ou reproduction

de la souris, son invalidation à l'état homozygote (-/-) sera létale

• Il est parfois complexe de trouver les bonnes séquences d'homologie, et

certains loci sont résistants à la recombinaison homologue.

• L'invalidation du gène permettra d'élucider sa fonction au cours du

développement mais pas ses fonctions ultérieures

KO conditionnels où le gène est invalidé spécifiquement

dans un tissu ou à partir d'un stade de développement.


Système Cre-loxP La recombinase Cre sous diverses approches

CreON/OFF

Inductible : quand

Cre

Tissu-spécifique : où

Système Tet-On/Tet-Off (1992) Activer ou inactiver un gène de manière réversible dans un tissu donné

(contrairement au système Cre/Lox = irréversible)

En absence de tétracycline, tTA peut se fixer et le gène rapporteur est exprimé

En présence de tétracycline, tTA ne peut pas se fixer et le gène n’est pas exprimé

Tet Off

Prot transactivatrice tTA

E. coli)

En présence de tétracycline, rtTA peut se fixer et le gène rapporteur est exprimé

En absence de tétracycline, rtTA ne peut pas se fixer et le gène n’est pas exprimé

Tet On

Tetracycline Répresseur

rtTA

L’HTA a un composant environnemental

évident

Vous voulez créer des modèles (non

génétiques) de rats hypertendus

Rettig R, 1997

L’HTA suit le rein

TRANSPLANTATION

WKY SHR

F1 (BLHTA)

À l ’âge de 8 semaines, néphrectomie et greffe

Aucune

chirurgie

PAS: 120 180 145

PAS 120 PAS 180

PAS 145

Vaziri. Iranian Journal of Kidney Diseases 2008 Vol2 : 1-10

Causal Link Between Oxidative Stress, Inflammation, and

Hypertension

This interconnection provides the rationale for renin angiotensin system blockade in the

management of hypertension.

Participation of tissue angiotensin system in the vicious cycle

of oxidative stress, inflammation, and hypertension

HTA rénovasculaire

Modèles d’HTA rénovasculaire

• Expériences de Goldblatt (1934) – 1-Kidney, 1 clip

• volume dépendant, rénine basse

– 2-Kidney, 1 clip

• rénine dépendant

– 2-Kidney, 2 clip

• rénine basse

• Initialement: modèle d’HTA essentielle

• A l’origine de la découverte du SRAA

Hyperplasie / hypertrophie de l’appareil juxta-

glomérulaire au cours d’une HTA rénovasculaire

(immunoperoxydase anti-rénine)

Modèles d’HTA par administration de

minéralocorticoide et de sel

• Modèle DOCA- salt

– Uni-néphrectomie + DOCA + NaCl (1%)

– Rénine effondrée, rétention hydrosodée

– HTA volo-dépendante

Modèles d’HTA par administration d’un

vasoconstricteur

• Cyclosporine

– Marmouset, chien, rat

– HTA volo-dépendante ou rénine dépendante selon dose et modèle

• Angiotensine II

– Selon la dose HTA administrée: HTA minime -> HTA maligne

Modèles d’HTA par administration d’un

antagoniste d’un vasodilatateur

• L-NAME

– Antagoniste du NO

– Modifie la relation pression – natriurèse

– HTA sensible au sel

– Rénine normale ou basse

– Forte mortalité à 3 mois

Baylis, JCI 1992- Arnal, JCI 1992

Modèles d’HTA et d’atteinte rénale

• Néphrectomie des 5-6e

– HTA, protéinurie puis insuffisance rénale

Tapia, KI 2003

Autres modèles • New England Deaconess Hospital rat line

– Phéochromocytome spontané

• Rat VDN (Vitamine D+Nicotine)

• Preéclampsie chez la souris

HTA systolique isolée (calcification des vaisseaux)

Intérêt pharmacologique

Le développement des médicaments

Quel modèle utiliser pour montrer que votre

médicament est efficace sur la PA?

• Modèles rénine dépendant – 2K-1C, 1K-1C désodé, Ren2…

-> IEC – ARA 2 (diurétiques : NON; Inh. calciques: pas trop)

• Modèles volo-dépendant – DOCA-salt, Dahl sensible

-> Inh. Calciques (IEC-ARA2: NON)

• Modèles d’HTA spontanés – SHR, LH

-> IEC, ARA-2, inh. Calciques

AGREMENTS

Etablissement d’Expérimentation Animale (EA)

Expérimentation Animale

Niveau 1 : Conception de procédures en EA

Niveau 2 : Réalisation de procédures en EA

Niveau 3 : Soins aux animaux utilisés à des fins scientifiques

Saisine auprès de la Comm Nat de l’EA

Demande d’autorisation utilisation d'animaux à des fins

scientifiques

modèles expérimentaux...

Documents