ministÈre de l'enseignementsupÉrieur et de la...
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RÉPUBLIQUE DE CÔTE D'IVOIREUnion - Discipline - Travail
MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LARECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITÉ DE COCODYU.F.R. DES SCIENCES MÉDICALES
Année: 1997-1998 ~~~
"MEMOIREpour le
na .
1;:1;--J
DIPLÔME D'ÉTUDES APPROFONDIES DEBIOLOGIE HUMAINE TROPICALE
Option: Histologie - cytogénétique
GROUPEMENTS GLUCIDIQUES DE I~A
MEMBRANE DES CELLULES DE SERTOLICHEZ LE RAT WISTAR
Prôenté pur
Responsable du DEA -BHT :Professeur Danicl SESS
/
NlircillcTRE YAva
1CONSEli~FRICAIN ET AilALGACHIi Il! POU~ L'ENSeaGNEMEN'ii' SUPERllèUn i
,i C. ~',M. E. ~ - OUAGMlOUGO\.! :. ~rnvee ., . @~l ~.~. ~.'.~ .. I:nregistré sous n° Î
-' -- --:27.'fJfC~ .ZOO,Directeur de Mémoire:
Profcsscm' Armand EHOUMAN
REMERCIEMENTS
Nous désÏl"ons expnmer toute notre gratitude à
Monsieur Georges GRIGNON, Professeur d'Histologie-Embryologie à la
Faculté de Médecine de l'Université de Nancy l, pour nous avoir accueillis et
permis d'effectuer ce travail au sein de son laboratoire (Histologie
Embryologie et Microscopie Electronique - Faculté de Médecine - Nancy).
Nous remcl"cions
Mesdames R. HATIER, M. WEISSER,; D. MALAPRADE-BAUDOIN, pour leur
aide technique dans le laboratoire d'Histologie -Embryologie et Microscopie
Electronique (Faculté de Médeci ne - Nancy).
Nous dédions ce tnlvail à nos Maîtres
Professeur EHOUMAN ARMAND;
Professeur GUEDEGUINA FREDERIC;
Professeur EGNANKOU KOUAMEJOANNES
Prol'esseur MONNETDAGUI
rSOMMAIRE JPage
INTRODUCTION 3
GENERALITES 5
1 - CELLULE DE SERTOLI 6A - SITUATION GENERALE 6B - STRUCTURE 6C - INTERACTIONS CELLULAIRES 8
II - GLUCIDES DE MEMBRANE 16
III - LECTINES 18A - DEFINITION 18B - APPLJCATIONS 2ü
IV - SYSTEME DE DETECTION 22A - PRINCIPE 22B - METHODES AVIDINE-BIOTINE 22
V - TESTICULE ET LECTINES 24
MATERIEL ET METHODES 26
1 - MATERIEL ; 27A - POPULATION EXPERIMENTALE 27B - REACrrIFS 28
II - METHODES 29A - DEPLEfJON DE LA LIGNEE GERMINALE 29B - PRELEVEMENTS )0C - MARQUAGE DES COUPES 3üD - CONTROLE DE LA SPECIFICITE 32
RESULTATS 33
DiSCUSSiON .4~)
CONCLUSiON 48
RESUME 49
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
FSH:
ABREVIATIONS
Hormone folliculo stimulante
P-Mod-S : Protéi ne modulant la fonction sertolienne
ABP : Androgen binding protein
AMPc : Adenosine lllonophosphate cyclique
ELISA: Enzyme linked immunoabsorbent assay
LAB : Labetled avidin-biotin
ABC: Avidin-biotin complex
AMH: Anti-Müllerian hormone
2
r INT R ODUCTJlON
3
La cellule de Sertoli est une cellule du revêtement épithélial du tube
séminifère du testicule. C'est la cellule de soutien et de nutrition des cellules
germinales. Elle constitue l'ossature ou le cadre structural sur lequel
s'accomplissent la spermatogenèse et la spermiogenèse.
Elle a une activité fonctionnelle cyclique (2], 30. 32) qui s'accompagne de
nombreuses modifications membranaires et rend compte des interactions
cellulaires entre les différents éléments des tubes séminifères.
Mieux comprendre le fonctionnement de la cellule de Sertoli est
essentiel pour permettre une approche dans la compréhension de l'interaction
entre les cellules de Sertoliet les cellules germinales et pour mieux
appréhender l' étiopathogénie de la stérili té masculine.
Les modifications membranaires peuvent être explorées par l'utilisation
des protéines de liaison des glucides, appelées « lecti nes ». Celles-ci sont
d'origine végétale, mais aussi animale et bactérienne. Elles ont des sites de
liaison qui reconnaissent une séquenc~ spécifique des résidus glucidiques (l,
14). Une de ces lecti nes, dénommée concanavaline -A,"sfl mule l'attachement
des cellules germinales isolées à des cellules de Sertoli en coculture selon
GROOTEGOEDJ .A_ et coll., 1982 (17).
L'utilisation des lectines fluorescentes (2,3,4.28) ou hiotinylées (22, 23, 24)
ont constitué une technique de choix dans l'analyse de la distribution des
glycoprotéi nes au niveau des interactions cell ule cie Sertol i - Cell ule
germinzl1e de mammifères adultes, mais peu ont concerné le comportement
des résidus glucidiques au niveau des cellules de Sertoli.
L'objectif de notre travail est de mettre cn évidence, au microscope
optique, et par la technique histochimique des lectines, les groupements
glycosylés de la membrane des cellules de Sertoli dépourvues des cellules
germinales.
4
r GENERALITES
5
1. CELLULE DE SERTOLI
A. SITUATION GENERALE
Le testicule est divisé en lobules contenant des tubes séminifères
non vascularisés au sein desquels deux types cellulaires sont retrouvés : les
cellules de Sertoli et les cellules germinales . La paroi tubulaire ou
membrane propre est constituée d'une lame basale et de cellules
contractiles, appelées cellules péritubulaires (cellules myoïdes), associées
à des fibroblastes et à des fibres collagènes. Entre ces constituants, circule
un fluide interstitiel. Le tissu interstitiel situé entre les tubes séminifères
renferme des cellules de Leydig, des terminaisons nerveuses, des
vaisseaux sanguins et lymphatiques.
B. STRUCTURE
La cellule de Sertoli présente des mitoses dont le nombre décroît
jusqu'à la puberté. Les caractéristiques cytologiques de la cellule de Sertoli
humai ne sont semblables à celles des autres mammifères (32). Nous
prendrons donc comme type de description, la cellule de Sertoli différencié
du rat adulte.
C'est une cellule haute qui repose sur la lame propre du tube
séminifère et s'étend jusqu'à la lumière; son contour est très irrégulier et on
la compare à un chandelier ; elle possède. en effet, de nombreux
prolongements longs et fins qui délimitent au niveau de leur pôle apical et de
leurs faces latérales des encoches destinées à recevoir les cellules de la lignée
germinale. Chaque cellule de Sertoli est clone en contact soit avec d'autres
cellules de Sertali, soit avec des cellules germinales.
6
Cette forme n'est pas évidente dans les coupes testiculaires observées
en microscopie optique car les prolongements cytoplasmiques sont masqués
par les cellules germinales. Seuls les noyaux sont visibles. Jusqu'aux
premières observations en microscopie électronique, on estimait être en
présence d'un « syncytium sertolien» .
En microscopie électronique, le détail de la structure est révélé bien
que de petits fragments du cytoplasme et de la membrane sont observés sur
IJne seule micrographie électronique:
La mem!Jrcme plasmique de la cellule de Sertoli possède des
différenciations de structure variables selon les régions.
o Au voisinage du pôle basal, des complexes de jonction serrée (tight
junctions) unissent les cellules de Sertoli et forment la barrière hémo
testiculaire; ces jonctions étanches délimitent deux compartiments dans
l'épithélium séminifère:
un compartiment basal situé entre ces jonctions
intersertoliennes et la lame basale. II est occupé par les spermatogonies et
les spermatocytes 1 jusqu'au stade préleptotène de la prophase (méiose
réductionnelle) .
- un compartiment central adlurninal qUI s'étend des jonctions
étanches jusqu'à la lumière du tubule. Les cellules de Sertoli y sont en
relation intime avec les spermatocytes J aux stades suivants de la méiose, les
spermatocytes IL Les spermatides, et les différents éléments des étapes de la
spermiogenèse . (Fi gure 1) .
7
Dans le compartiment adluminal, des complexes de jonction associent:
odes desmosomes entre les cellules de Sertoli,
• des jonctions de type gap entre les cellules de Sertoli et les cellules
germinales,
• des formations fibrillaires et lamellaires en regard de l'acrosome des
spermatides.
Le noyau est allongé et profondément encoché. Il possède un nucléole
bien développé.
Le cytoplasme sertolien contient un réticulum endoplasmique lisse
abondant, des éléments du réticulum endoplasmique granulaire, un appareil
de Golgi supranucléaire, des lysosomes, des mitochondries dispersées et un
cytosquelette important constitué de microtubules et microfilaments.
C. INTERACTIONS CELLULAIRES
L'extrême intrication anatomique entre cellules germinales et cellules
. de Sertol i est le reflet de leur interdépendance structurale et fonctionnelle .
Ces cell ules établissent un réseau de communication entre elles qui permet la
fabrication continue de près de 100 et de 200 millions de spermatozoïdes par
jour, chez le rat et 1'homme adulte (21).
Les cellules de Sertoli sont les seules cellules qUI peuvent
communiquer directement avec toutes les autres catégories de cellules
constituant le tube séminifère. Elles fournissent à chaque cellule germinale
l'assistance dont elle a besoin. Elles assurent le support structural et
biochimique nécessaire à la synchronisation cie l'activité de l'ensemble des
8
cellules germinales qui composent chaque stade du cycle de l'épithélium. Il
existe 14 stades du cycle de l'épithélium chez le rat, selon la technique de
transillumination de tubes séminifères fraîchement isolés de PARVINEN M. et
coll., 1986 (30). La microdissection de ces 14 stades définissent 14 segments
individualisés. Chaque segment constitue un environnement pour la cellule
de Sertoli. Et l'environnement des cellules de Sertoli détermine ses
sécrétions.
Les cellules de Sertoli produisent le fluide des tubes séminifères. Le
fluide tubulaire permet le transport des protéines, des peptides et des
stéroïdes, de la partie basale des tubes vers la partie adlllminale :
- JI joue un rôle dans le développement des tubes séminifères par la
production de l'hormone anti-Mü"érienne (AMH);
- Il joue un rôle dans la libération des spermatozoïdes et assure leur
transport dans la tête de l'épididyme. Une centaine de protéines produites
par la cellule de Sertoli sont nécessaires au contrôle de la prolifération, de la
différenciation et du métabolisme 'des ccli ules germinales (tableau 1) On
distingue allssi des protéines de liaison et de transport (tableau Il), des
protéases, des composants de la matrice extracellulaire, des métabolites
énergétiques et di vers éléments des complexes jonctionnels et memhranai l'es
des cellules de Sertoli (tahleau III) .
L'identification de ces nombreux produits sertoliens él été réalisée dans des
cultures cellulaires et leur implication dans la physiologie testiculaire reste ~l
démontrer (1 l, 21, 30, 32) .
Toutefois, la polarisation de l'épithélium permet une sécrétion
bidirectionnelle des produits sertoliens. Les agents destinés aux cellules
germi nales préméiotiques, aux cellules péritu bulai l'es et aux cellules de
Leydig, sont dirigés préférentiellement vers la base des tubes, alors que ceux
qui contrôlent l'activité germinale méiotique et postméiotique et qui
9
accompagnent les spermatozoi"des dans l'épididyme sont sécrétés vers le
compartiment apical.
L'activité des cellules de Sertoli est sous la dépendance d'un contrôle
humoral et d'un contrôle paracrine .
Le contrôle humoral: Les études chez le mammifère adulte établissent
de façon univoque les rôles majeurs de la testostérone, produite par les
cellules de Leydig, et de FSH, produite par 1'hypophyse, dans le contrôle
qualitatif et quantitatif du processus spermatogénétique (36). Les cellules de
Sertoli possèdent les récepteurs spécifiques de ces hormones. Le récepteur
de la tri-iodothyronine, produite par la thyroi"de, a été découvert au niveau
de la cellule de Sertoli (21, 32) " Cette hormone joue, avec la FSH, un rô le
important dans la différenciation de cette cellule, chez plusieurs espèces de
rongeurs dont le rat.
Le con/rôle paracrine : La testostérone est le premier facteur identifié
qui règle l'activité sertolienne .
Les cellules péritubulaires contrôlent le fonctionnement et de la cellule de
Sertoli grâce à une protéine appelée P-Mod-S et la production de plusieurs
consti tuants essentiels de la matrice extracell ulai re .
Des approches réalisées in vivo. consi~~tat:~ à dégarnir sélectivement
l'épithélium séminifère (irradiation, application de chaleur, administration
de produits toxiques), ainsi que le développement de techniques in vitro. ont
permis de démontrer que la régulation paracrine germinale est fonction (21
30, 32, 36) :
- de la nature des cellules germinales " Par exemple, les
sperrnatocytes pachytènes sont plus actifs que les jeunes spermatides, pour
régler les productions d'ABP, d'inhibinc. de fluide lubulaire, cie transferrine
et pour contrôler le nombre des récepteurs de la FSH "
10
- du stade de développement des cellules de Sertoli . Les cellules
de Sertoli interagissent mieux avec les spermatides lorsqu'elles sont
prélevées chez des animaux pubères.
- du paramètre sertol ien considéré
- et de la présence ou de l'absence de la FSH et de l'AMPc dans
les milieux de culture.
Ces expériences in vitro démontrent ég,liement que les effets des cellules
germinales sont relayés, soit par:
e des molécules solubles présentes dans des milieux conditionnés par les
spermatocytes pachytène et les spermatides rondes dont la purification est
en cours;
o une molécule présente au nIveau des membranes plasmiques des cellules
de Sertoli, des spermatocytes et des jeunes spermatides, appelée LRP;
o enfin, la phagocytose de matériel germinal par les cellules de Sertoli
C'est le cas des corps résiduels qiJi correspondent aux fragments
cytoplasmiques se détachant des spermatides âgées au moment de la
spermiation pour être ensuite phagocytés par les cellules de Sertal i . Cette
phagocytose influence les processus de division et de différenciation des
spermatogonies et des spermatocytes préleptotène par l'intermédiaire de
1' ILl a et l' lL6 .
Il
Lysosome Il ~~~~
Membranebasale
-- Zonula ocludens
Regionacrosomique
d'une spermatide
Parei d'unC3pillairc
FigUl'C l RCpl'éscntatioll d'une portion dc tubc séminifèrc,Adapté de CZYBA J ,C.el co/ /,. 1993 (8) et JEGOU B. el co//.. 1995 (21 ) .
12
Tableau 1:
LES PRINCIPAUX FACTEURS SERTOLIENS IMPLIQUES DANS LA
PROLIFERATION, LA DIFFERENCIATION ET LE METABOLISME
GERMINAL
Cl Activine
" Inhibine =
Stimule la prol ifération des spermatogonies
Inhibe la prolifération des spermatogonies
Cl Transforming growth factors (TGF -13)" et Insulin growth factor-l (IGF-1) =
Interviennent dans les divisions et la différenciationgerminale. Leurs récepteurs sont identifiés au nivcaudes cellules germinales. L'IG F-l stimule laréplication de l'ADN des spermatogonies clc tru i tc.
r·..:f~·"">!.",,},,~,
;.~~';:>.-! "
o Interleukine l a (IL la) = Stimule la répl ication cie l'A DN méiotique etmitotiquc.
" Interleukine 6 (lL6) = Inhibe la répl ication cie l'A DN méiotique etmitotique.
o Facteur Steel - Intervient clans le guiclage cles cellules germinalesprimordiales vers les crêtes génitales et clans laprol ifération gcrmi nale. au cours cludévcloppement.
o 3a -hydroxy-4-pregnen-20-one (3HIl) =
Stimule le développement des spermatocytesprimaires.
13
Tableau II :
PROTEINES DE LIAISON ET DE TRANSPORT
o Transferrine =
• Céruloplasmine =
.. Androgen-binding protein (ABI)) =
Retinol-binding protein (RBP) =
Sulfated glycoprotein 1 (SGPl) =
.. Sulfated glycoprotcin 2 (SGP2) =
.. a2-macroglohulinc -
o y-glutamyl transpcptidasc (yGTP) =
14
Transporte le fer
Transporte le cuivre
Transporte les androgènes
Transporte le rétinol aux cellulesméiotiques et post-méiotiques quile transforment en aciderétinoïque.
Transporte les précurseurs delipides et d'acides gras spécifiques.
Transporte les lipides.
Transporte lcs facteurs impliquésdans les divisions germinales.
Transporte le glutathi.on.
Tableau III :
AUTRES FACTEURS
PROTEASES ET INHIBITEURS DES PROTEASES
o Activateurs du plasminogène (AP) =Dégradent les jonctions inter-sertoliennes et le~
jonctions entre cellules de Sertoli et cellulesgerminales, à certains stades du 'cycle del'épithélium.
o Cyclic protein 2 (CP2) / procathepsine L =Intervient dans la libération desspennatozoïdes.
o Cystatine C = Inhine la cathepsine L.
Collagénase de type IV et autres métalloprotéinases =S'impliquent dans le remodelage permanent del'épithéli um séminifère.
COMPOSANTS DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE = MEC
o Collagène 1 et IV, laminine, et protéoglycannes =La MEC est indispensable à la polarisationdes cellules de Sertoli, au stockage et à l'actiondes facleurs de croissance.
METABOLITES ENERGETIQUES
• Lactate et pyruvate =
o Glutathion =
Indispensables aux cellules germinales qui nepeuv,ent pas métaboliser le glucose.
AGENT OXYDANT
est transféré aux cellules germi nales.
o Testines =
CONSTITUANTS DES COMPLEXES .fONCTIONNELS
protéines des complexes jonctionnels.
AUTRES COMPOSANTS MEMBRANAIRES
9 Livcr'- n~gulating protein (LRP) =Règle les interactions cellules de Sertolispermatocytes primaires. Il est présentsur ces 2 ccII ules à la ['ois.
15
II. GLUCIDES DE MEMBRANE
Toutes les cellules eucaryotes possèdent des glucides au niveau de leurs
surfaces. Ces glucides sont à la fois sous forme de :
o chaînes oligosaccharidiques et polysaccharidiques liées de façon covalente
aux protéines membranaires (glycoprotéines),
o chaînes oligosaccharidiques liées de façon covalente aux lipides
(glycolipides) .
o molécules de protéoglycannes transmembranaires dans lesquelles de
longues chaînes de glycosaminoglycannes sont liées de façon covalente à
un noyau protéique (matrice extracellulaire) .
Ces glucides sont exclusivement localisés sur la face non cytosolique
des membranes plasmiques et internes:
- dans les membranes internes, les résidus glucidiques sont situés
face à la lumière du compartiment; limité par la membrane (réticulum
endoplasmique, appareil de Golgi ... ),
- au niveau de la membrane plasmique, ceux-ci sont exposés à
l'extérieur de la cellule et participent à la formation de l'enveloppe cellulaire
ou glycocalyx (Figure 2) .
Le glycocalyx décrit la zone périphérique riche en glucides ct située à la
surface externe des cellules eucaryotes . Cette zone peLit être mise en
évidence par des colorations histochimiques, ainsi que par des lectines
marquées (l, 12) .
L'étude du rôle des glucides est d'actualité, notamment en raIson de
leur implication clans les phénomènes de reconnaissance et d'adhésion
cellulaire (l,In. 13.25,35) . les structures de surface des cellules évoluent
par des modifications du degré ou du type de glycosylation (1. 1n, 33) .
16
o ~ résiduglucidique
enveloppecellulaire(glycocalyxl
doublecouchelipidique
glycoprotéineadsorbée
Figure 2 : Enveloppe cellulaire ou glycocaly'x
Les résidus glucidiques sont situés a 1"extérieur de la
membrane plasmique. Schénw riréde ALl3t:1?TS' 13. er co//., 1983 (1).
17
III. LECTINES
A. DEFINITION
Les lectines sont des substances découvertes en 1888. à parti r
d'hémagglutinine extraite du ricin. Ces substances ont été appelées « lectines»
en 1954 ; ce mot d'origine latine, dérive de « lectus », et de « !egere », qui
veulent dire: choisir, sélectionner.
Les lectines se définissent comme des protéines d'origine non immune, qUI
proviennent d'une grande variété de sources biologiques (tableau IV) et qui se
fixent sur des hydrates de carbone spécifiques (14, 15). Elles sont présentes,
naturellement, à l'état soluble dans des liquides biologiques, ou à la surface des
membranes cellulaires (29). Elles n'ont pas d'activité enzymatique.
Les lectines possèdent deux sites de fixation glucidique : elles fixent
surtout des glucides liés de façon covalente à des protéines ou à des lipides. Ces
protéines réagissent surtout avec les groupements glycosylés terminaux, non
réduits (31). Certaines lectines peuvent agir avec les composants internes des
chaînes hydrocarbonées, mais aussi avec des composés non gl L1cides tels que
l'adénine et des ligands hydrophobes (6).
La spécificité d'une lectine est définie par [es termes cie mono ou
oligosaccharides qui inhibent les réactions d'agglutination ou cie précipitation.
Il existe plusieurs spécificités glucidiques pour L1ne lectine. mais avec un sucre
prédominant (tableau IV).
18
Tableau IV :
SOURCES BIOLOGIQUES ET SPECIFICITE DE QUELQUES LECTINES
ESPECES / SOURCES NOMS ABREVIATIONS
SPECIFIQUES DES GROUPEMENTS Œ-D-GLUCOSE / a-D -MANNOSE
Canava/ia ensilorlnis(Haricot)
Lens clflinaris(Lenti Ile)
Canavalia ens~lorl/1is
Agglutinine
Lens cllfinaris Agglutinine
CanA
LCA
SPECIFIQUES DES GROUPEMENTS N-ACETYLGLYCOSAMINE
Gr~tlonia simplic~tofia
Triticum vulf!,orisL,
(Germe de blé)
Gr~tlonia simpficilo/iaAgglutinine - II
Wheat Germ Agglutinine
GSA-II
WGA
;
SPECIFIQUES DES GROUPEMENTS N-ACETYLGALACTOSAiVIINE / a-GALACTOSE
Do/ichos hi/lorus
Phaseo/us vlI/gari,\'(Haricot muge)
Gr iflr)J/ i{/ sil IlP/i(,Ur)/iu
Arachis /npuguc(/(arachide)
Do/iC/1O.\' hUlorus Agglutinine
Phytohémagglutini ne
Gri/j(m iu simp!ici/o liaAoolutinine-I
::':'0
Peanut Agglutinine
DBA
PHA
GSA-I
PNA
Vlex europaeus(Graine cie lotus)
SPECIFIQUES DES GROUPEMENTS FUCOSE
V/ex elfropaells Agglutinine-I
19
UEA-I
B. APPLICATIONS
Les lectines sont des molécules stables et suffisamment antigéniques
pour permettre la production d'anticorps anti-lectine (27) . Cependant, il est
incorrect de parler de « l'immunohistochimie des lectines» (31) parce que
celles-ci sont d'origine non immune. Elles ont deux applications principales
1. La stimulation mitogénigueCertaines lectines sont des puissants mitogènes qui augmentent le taux
de division cellulaire en culture. Ce pouvoir est à la base du test de
transformation Iymphoblastique (TTL) qui permet d'évaluer Ln vitro
l'immunité cellulaire. PHA et ConA stimulent les lymphocytes T, LCA
stimule les lymphocytes B et T (27).
2. La détection des groupements hvdrocarbonésL'utilisation des lectines a permis de mettre en évidence les fractions
glucidiques des glycoprotéines au microscope optique et électron.iqu~ (3~),.,..
par:
o des techniques d'agglutination utilisant les lectines nu" Ir/arquées
Beaucoup de lectines portent le terme «agglutine» dans leur nom.
Lem capacité agglutinante est due au fait qu'elles sont polyvalentes. souvent
tétravalentes, et peuvent, ainsi occuper simultanément cle multiples sites de
liaison hydrocarbonnés (27). Cette méthode est commune clans l'étude du
typage cles groupes sanguins humains. DBA (réactif anti-substance A), et
GS-IB4 (réactif anti-substance B) sont de routine pour la détermination du
système ABO .
o des techniques utilisant des lectines Inarquées
Les lectines sont largement utilisées comme marqueurs histochimiques
de différenciation. maturation. transformation néoplasique et changements
fonctionnels comllle la grossesse (9).
20
3. Les autres applicationsCl Une application récente est celle d'un déri vé des tests colorimétriques en
phase solide type ELISA . Ce test est communément appelé : ELLA
(Enzyme-Linked-Lectin-Assay) . Cette méthode permet de détecter et de
quantifier les groupements hydrocarbonés.
• L'utilisation des lectines radiomarquées permettrait la localisation
scintigraphique des tumeurs in vivo et des métastases en particulier.
• Les lectines sont applicables dans les techniques d ·électrophorèse en gel et
de transfert, afin de mettre en évidence des séquences de sucre spécifiques,
ou d'isoler et purifier des glycoprotéines (12) . Elles sont marquées ou
incorporées directement dans le gel.
• Ces substances peuvent permettre des séparations cellulaires par
chromatographie d'affinité (27) .
21
IV. SYSTEME DE DETECTION
A. PRINCIPE
L'histochimie des lectines permet de détecter le site précis de la
liaison lectine-groupement glucidique spécifique . Les techniques de
détection sont di rectes. Elles sont réalisables en microscopie optique (lectines
couplées à la peroxydase), en microscopie en lumière ultraviolette (lectines
couplées à un f1uorochrome) et en microscopie électronique (lectines
couplées à la ferritine, à la peroxydase ou à l'or colloïdal) .
B. METHODES AVIDINE-BIOTINE
Ce sont des méthodes d'amplification qui utilisent la très forte affinité
de l'avidine ou la streptavidine pour la biotine (l'aviciine possédant 4 sites de
liaison pour la biotine) . Il existe deux méthodes avidine-bioti ne courantes:
- la technique avidine ma~quée-biotine (LAS),
- la technique du complexe avidine-biotine (ASC) (Figure 3) .
Les 2 méthodes nécessitent une lectine biotinylée . La peroxydase est le
marqueur enzymatique- le plus utilisé. Cette enzyme est révélée par son
chromogène spécil"ique appelé la diaminobenzidine (DAS) . La révélation
s'effectue par l'intermédiai re d'une ré,ù::tion chi miq ue (type oxydoréduction)
La DA B donne des électrons au peroxyde d' hydrogène, grâce à la
peroxydase, et forme un composé oxydé qui se polymérise rapidement en
laissant un précipité brun insoluble dans l'alcool sur le site de réaction, et
permet tous les types de contre colorations et l'utilisation de tous les milieux
de montage. Ce pigment est stable avec le temps (5).
22
Avidine Biotille Peroxydase
Lectine biotinylée Complexe avidine- biotine peroxydase
Le complexe ABC réagit avec la lectine biotinvlée
Figure 3 : La méthode du complexe avidine-biotine
V. TESTICULES ET LECTINES
Des études expérimentales intéressant les interactions entre cellules de
Sertol i - cell ules germi nales ont mis en évidence des groupements
glucidiques chez l'animal adulte par l'utilisation de l'histochimie des lectines
(2, 3, 4, 22, 23, 24, 26, 28).
Con A, PNA et WGA constituent une technique de choix dans
l'analyse de la distribution, la transformation, la sécrétion, l'absorption et la
dégradation des glycoprotéines au niveau des tissus reproducteurs mâles (2).
Con A présente des sites de liaison au niveau de tout l'épithélium
séminifère, du tissu interstitiel et de la lame basale chez l'adulte.
WGA réagit au niveau des zones de contact spermatides - cellules de
Sertoli et PNA marque intensément les spermatocytes, les spermatides et les
éléments cie la spermiogénèse.
24
Figure 4 : Testicule de rat âgé de 24 jOUl'S
Tiré de 1-IATtER R et GRIGNON G .. 1980 (18)
1 Epithéliulll séminifère2 Spermatocyte l3 COlllparti ment basal4 Tissu interstitiel5 Membrane pro pre
25
MATERIEL ET METHODES
26
1. MATERIEL
A. POPULATION EXPERIMENTALE
La population expérimentale a été obtenue par des accouplements de
rats Wistar mâles et femelles adultes. Ces rats ont été élevés au laboratoire,
nourris à l'aide des aliments Rat (Société Pietrement, France) et abreuvés
avec de l'caLi de boisson ad Libitum.
L'accouplement se fait à raison de 3 femelles, en gestus, pour l mâle, dans
une cage, durant toute une nuit (12 femelles par séance d'accouplement).
Des frottis sont effectués le lendemain, chez les femelles, à la recherche de
spermatozoides. En cas de frottis positif, on fixe le premier jour de gestation
le lendemain du frottis.
NOLIS avons réalisé cinq séances d'accouplement: les trois premIers ont
donné un frottis positif par séance, Les 4èrne et Sème séances ont permis
d'avoir quatre rates gestantes.
Les nouveau-nés mâles obtenus ont consti tué:
o la population témoin,
• la population ayant subi une cryptorchidie bilatérale.
• et la population irradiée.
27
B. REACTIFS
1. Trois lectines biotinylées (Veclor Lahoralories)
sont utilisées:
- con A : spécifique des groupements a-D-G\c / C/.-D-Man.
- PNA : spécifique des groupements N-Gal-B (1-->3) 3 Ga! Nac,
- WGA : spécifique des groupements B-(1-->4) N-Glc Nac.
1. Trois sucres spécifiques (Sigma ChenlÏco! Co .. SI Lois USA)
sont utilisées pour la neutralisation des lectines:
- 30 a 0 mannopyranosyl D mannopyranose spécifique cie con A.
- 60 f) 0 galactopyranosyl 0 galactopY"anose spécifique (Je PNA,
- N-acctyl D glucosamine spécifique de WGA .
28
II. METHODES
A. DEPLETION DE LA LIGNEE GERMINALE
1. La cryptorchidie bilatérale
Elle est réalisée chez 6 rats nouveau-nés, à la loupe binoculaire.
Les rats sont anesthésiés à l'éther. Après une incision médiane, de petite
tadle, au niveau de l'abdomen, chaque testicule est remonté dans l'abdomen,
le gubernaculum testis est sectionné et le testicule est ensuite rattaché à la
paroi abdominale en suturant l'albuginée à ladite paroi qui est, enfin,
refermée en deux plans musculaire et cutané.
2. L'irradiation prénatale
Elle s'effectue chez les rates adultes. au 18ème jour de gestation,
anesthésiées à l'éther. Il s'agit d'une irradiation locale, au niveau de
l'abdomen.
Les rates sont immobilisées en décubitus dorsal, sur une planche de
dissection. La distance entre la source de rad iation et l'abdomen est de 60
cm. Une dose unique de 300 rads est émise pendant 3 mi nutes.
Dans le cadre de notre travail, la réalisation de l'irradiation prénatale,
dépendait cie la disponibilité du médecin du centre d'irradiation Alexis
Vautrin de Brabois (Nancy) et de l'obtention d'au moins 2 rates gestantes qui
auraient 18 jours de gestation lors du rendez-vous avec ce médecin.
29
RESULTATS
PLANCHE 1
Testicule de rat témoin âgé de 19 jours, fixé au Bouin-Hollande sublimé
~I• -<h' 1
'. .. 1
: ,~.:.~. ,:,·;1
~t}:~ .~~~~')~·1'1Figure 5 x 10
Absence de marquage à la Con A dilué à 1/101 = tube séminifère; 2 = noyau de spermatogonies et de cel! ulesde Sertoli ; 3 = noyau de spermatocytes; 4 = lame basale:5 = lumière tubulaire; 6 ~ tissu interstitiel.
Figure 6 : x 10Absence de marquage au WGA dilué à I/lO
34
PLANCHE II
Testicule de rat témoin âgé de ]9 jours, fixé au Bouin-Hollande sublimé
Figure 7 x 10Absence de marquage à la PNA dilué à 11i0
Figure 8 : x 25Aorandissemcnt de la FiQ,urc 7o ~
PLANCHE III
Testicule de rat témoin âgé de 40 jours, fixé au Bouin-Hollande sublimé
Figure 9 : x 10Absence de marquage à la Con A dilué à IIIO
Fioure 10: x 25t?
Agrandissement de la Figure 97 = noyaux de SIJCrmatides : 8 = prolongements cytoplasmiques
PLANCHE IVTesticule de rat témoin âgé de 40 jours, fixé au Bouin-Hollande sublimé
Figure Il : x 10.Marquage de faible intensité à la WGA dilué à \110.
Figure 12 : x 25Agrandissement de la Figure 11MarLJuage intéressant les prolongements cytoplasmiques el lesspermatides proches cie la IUl1lière .
.17
PLANCHE V
Testicule de rat témoin âgé de 40 jours, fixé au Bouin-Hollande Sublimé,-
Figure 13 x 10.Marquage à la PNA de forte intenslté dilué au 111 O.
Figure 14: x 25.Agrandissement de la figure 13.Marquage intéressant le comparli ment des spermatocytes el dessperrnatides et les prolongements cytoplasmiques des cellules deSertol i.
PLANCHE VI
Testicule de rat témoin âgé de 19 jours, fixé au Formol 10%
Figure 15 : x la.Absence de marquage à la PNA dilué à 1/10.Les tubes séminifères et les noyaux des cellules sontreconnaissables. Les détélÏls morphologiques ne sont paspréservés.
Figure 16: x 10.Absence de marquage ù la WGA dilué à 1/l0.
PLANCHE VII
Testicule de rat irradié âgé de 40 jours, fixé au Bouin-Hollande Sublimé.Absence de cellule germinale dans l'épithélium des tubes séminifères.
.,... ~ '!: .. ~.
Figure 17: x 10Absence de marquage à la Con A dilué au III 0
. Présence de noyaux cellulaires et de prolongementscytoplasmiques.
Fiourc 18: x 10.b
Absence cie marquage au \VGA dilué à 1110.
4()
PLANCHE VIII
Testicule de rat cryptorchide âgé de 40 jours fixé, au Bouin-HollandeSublimé.Présence de quelques noyaux de cellules germinales dans l'épithélium destubes séminifères
Figure 19 : x 10Absence de marquage à la Con A dilué à li 10
Figu re 20 : x 10Absence de marquage au WGA dilué à I!lO
--+1
PLANCHE IX
Testicule de rat âgé de 40 jours, fixé au Bouin-Hollande sublimé.Marquage à la PNA dil ué à 1Il O.
Figure 21: x 10Rat irradié. Absence de marquage.
,.~
',''.".,;-.:,'
.,' "'.~
.......:.":.1 •
Fig" rc 22: x 10Rat cryptorchide. Absence de marquage.
42
DISCUSSION
43
La population expéritnentale
Les tubes séminifères de rat témoin de 19 jours sont bien définis. fis
sont limités par une membrane basale sur laquelle reposent des noyaux de
cellules de Sertoli et de spermatogonies. II est difficile de distinguer ces
cellules en microscopie optique. Cependant, la structure de la cellule de
Sertoli étant largement décrite dans la littérature, il est aisé de rapporter ces
noyaux aux cellules profondement situées de l'épithél ium séminifère.
HATIERR. et GRIGNON G. (18) notèrent la présence des spermatocytes que
nous avons observé, au cours de notre travail, au niveau du testicule de rat
âgé de J9 jours.
A 40 jours de Vie, J'épithélium séminifère du testicule témoin
comporte des spermatides et la lumière tubaire est quelques fois occupée par
les prolongements cytoplasmiques des cellules de Sertoli.
L'observation des coupes de testicules de rat cryptorchide, âgé de 40
jours, montre que les tubes séminifères ont une lumière bordée par un
épithélium mince constitué de cellules de Sertoli (noyaux et prolongements
cytoplasmiques) et de quelques spermatocytes. Certains centres iuminaux
sont occupés par des noyaux.
Les tubes séminifères cie rat irradié âgés de /~·O .l0urs sont
essentiellement bordés par les noyaux et prolongements cytoplasmiques de
cellules de Sertoli. Il n'y a pas de cellule germinale.
Toutes ces observations ont été rapportées par plusieurs auteurs (16, 17,30).
La cryptorchidie bilatérale entraîne une élimination des cellules germinales ~\
l'exception des spermatogon ies et de certai ns spermatocytes I)ri mai l'es.
L'irradiation prénatale provoque une disparition totale des cellules
germi nales car les gonocytes sont les éléments les pl us sensi bles de la 1ignée
germi nales.
Le choix d'une population expérimentale âgée de 19 et 40 jours s'est basé
sur trois faits essentiels:
1. De nombreuses données ont intéressé la structure. la physiologie et la
différenciation de la cellule de Sertoli ( 18,30,32).
2. Plusieurs études ont démontré la présence de résidus glycosylés au niveau
du testicule chez le rat adulte (2, 22, 23, 28).
3. Peu de travaux ont été réalisé sur le comportement des groupements
glucidiques au niveau de la cellule de Sertoli dépourvue des cellules
germinales et en période prépubertaire.
Le Inarquage à la lectine Con A biotinvlée diluée à 1/10
Le marquage est négatif sur toutes les coupes traitées et quelque soit la
population d'étude.
Le Inarquage à la lectine WCA hiotinvlée diluée cl 1/10
Nous n'avons pas de site de liaison WGA - résidus glucidiques dans le
testicule de rat témoin de 19 jours. Chez le rat de 40 jours, un marquage de
faible intensité intéresse les prolongements cytoplasmiques des cellules de
Sertoli dans la lumière tubaire et les membranes cie contact cellule de
Sertol i-spermatide.
Les testicules irracliés el cryptorchicles ne montrent aucune réaction
positive.
Le tnarquoge cl la leuille fJNA hiofil7vlée diluée Ù 1/10
PNA se lie à ses résidus glucidiques dans le testicule de rat témoin âgé de 40
jours. La réaction est située dans le compartiment acJlurninal des tubes
séminifères el est en relation avec les sperrnatocytes ct les spermatides.
Il n'y a pas de marquage pour les testicules irradiés ct cryptorchidcs.
45
La présence des cellules germinales déterminerait-elle les modifications de la
membrane au niveau de la cellule de Sertoli ?
Selon HATIER R. et Coll., 1982 (19), la différenciation des cellules de Sertoli
est indépendante de la présence des cellules germinales jusqu'à l'âge de 40
jours; ceci devrait expliquer l'absence de marquage pour Con A, WGA et
PNA chez les rats témoins âgés de ]9 jours.
A partir de 40 jours, des sites de liaison PNA-résidus glucidiques et WGA
résidus glucidiques apparaissent sur les coupes de rats témoins, car la cellule
de Sertol i acquiert les caractéristiques des cell ules sécrétantes (18) et que sa
membrane entre en contact avec les spermatocytes II et les spermatides.
A l'exception des résultats obtenus pour Con A, ceux-ci sont en corrélation
avec les données décrites par ARYAM. et VANHA-PERTULLAT. 1984, 1985 et
1986 (2, 3, 4), JONES C. J-P. et Coll. 1992, 1993 (22, 23, 24), LEE M. et
DANJANOU 1 1984 (26).
En l'absence de cellule germinale, dans le cadre de la cryptorchidie
bi latérale et de l' i l'radiation prénatale, il n'existe aucune réaction positive
pour les trois lectines.
Nous pouvons c10nc conclure que la présence des cellules germinales semble
déterminer les modifications membranaires au niveau de la cellule de Sertoli
comme le prouvent MALMIR R. et Coll. 1990 (28).
L'hypothèse que Con A pourrait réagir positivement chez le rat témoin dès
la période pubertaire reste à démontrer.
La spécf/ïcité des marquages a été vér~fiée : l'incubation préalable des
lectines avec leur sucre spécifique permet de les neutraliser.
L'inhibition est très importante pour PNA, mais partielle car un seul sucre a
été utilisé (60 f) D galactopyranosyl D galactopyranose).
La lleurralisation est complète pour \VGA avec son sucre spécifique (N
acétyl D glucosamine)
La ./ixation
La fixation a été un élément de notre étude, dans la mesure où nous avons
voulu apprécier les fixateurs dérivés du formol (formol 10% et Bouin
Hollande sublimé). Ceux-ci permettent un grand nombre de marquage mais
le formol 10% est responsable d'une morphologie de qualité moyenne
comme nOLIs l'avons montré sur les figures 15 et 16 (5).
47
rCONCLUSION
Au cours de notre étude nous avons mis en évidence la présence des
groupements glucidiques au niveau des cellules de Sertoli du testicule chez le
rat jeune. Cette mise en évidence a été possible grâce à l'histochimie des
lectines.
Cette histochimie s'est avérée difficile et complexe maIs le marquage
par les PNA et WGA est beaucoup plus spécifique.
L'irradiation et la cryptorchidie bilatérale ont permIs d'isoler la
cellule de Sertoli. Cette étude gagnerait à être complétée par la microscopie
électronique et l'utilisation de traceurs; membranaires (lanthanum).
Mieux comprendre le fonctionnement de la cellule de Sertoli est
essentiel pour permettre ulle approche dans la compréhension de
['interaction entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales.
De nouvelles avancées dans ce dOlllai ne sont aussi indispensables pou r
mieux appréhender l'étiopathogénie de la stérilité masculine (varicocèle,
ectopie testiculaire. cryptorchid ie uni ou hi latérale).
48
(RESUME J
Afin de mettre en évidence, au lTIlcroscope optique, les groupements
glycosylés de la membrane des cellules de Sertoli isolées chez des jeunes
rats, les auteurs ont utilisé des lectines biotinylées (Con A, WGA, PNA).
Les résultats ont montré un marquage positif intense pOLIr PNA et
faible pour WGA chez le rat témoin. La cryptorchidie bilatérale et
l'irradiation prénatale ont entrainé une déplétion totale en cellule germinale
chez le rat irradié et partielle chez le rat cryptorchide avec absence de
marquage pour les trois lectines.
Cette étude permet une approche dans la compréhension cie
l'j nteraction entre les cellules de Sertol j ct les cellules germinales.
Mots clés: Cellule cie Sertoli ~ lectine ~ cryptorchidie ~ irradiation
prénatale
-+9
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VI
Annexe A
LA FIXATION DU PRELEVEMENT TESTICULAIRE
o La solution de Bouin sublimé (fraîchement préparée) :
Bouin-Hollande suhlùné- Solution mère de Bouin-Hollande- Formol à 40% du commerce (formol neutre)- Solution aqueuse saturée de chlorure mercurique (le sublimé)
80 ml10 ml10 ml
Solution mère de Bouin-Hollande- Eau disti liée- Acétate neutre de cuivre- Acide picrique
1000 ml25 0
b
40 (Jb
Dissoudre à froid au mortier, l'acétate de cuivre dans les 1000 mld'eau distillée, puis ajouter peu ·à peu en remuant l'acide picrique.Après dissolution, filtrer la solution et la conserver à températureambiante.
1) La sol ution de !"ormo! 10% :
- Formol neutre du commerce- Eau distillée
10 ml90 ml
Annexe B
I~A DESHYDRATATION ET L'INCLUSION DU PRELEVEMENT
fi Le lavage: Les échantillons fixés sont lavés dans un bain d'alcool à 7()0
pendant 24 heures, afin d'être soustraits à l'action des fixateurs.
o La déshydratation: les échantillons sont progressivement déshydratés parpassage dans des bains d'alcool de degrés croissants:
- un bain d'alcool 95° pendant 2 heures
- un hain d'alcool absolu pendant 2 ou 3 heures
- puis dans un bain de toluène pendant 45 minutes à 1 heure 30minutes afin d'éliminer toute trace résiduelle d'alcool. Ce temps porteaussi le nom d'éclaircissement car le toluène est un hydrocarbure quirend les tissus transparents.
- Enfin, une imprégnation dans un hain de parat/ine est réalisée: lesfragments tissulaires sont placés dans des bains de paraffine liquideavec leur étiquette, à chaud, dans une étuve à 56°-58° pendant 2 à 3jours. Cette imprégnation à la param ne permet cl' éliminer le toluène.
o L'inclusion: de la paraffine liquide neuve cst versée au foncl des moulesspéciaux appelés: barre de LeuckarCLes échantillons sortis du bain deparaffine sont placés et orientés dans ces moules (à raisoll de Ull à cieuxéchanti lions) et le tout est refroidi à l'ai r 1ibre.
La paraffine destinée à l'inclusion définitive Ile cloit jamais avoir servipour les bains et renfermer aucune trace de dissolvant. Sinon elle forme unemasse pâteuse et blanchâtre en se solidifiant.
Après refroidissement le bloc de paraJfïne solide, contenantl'échantillon est démoulé, numéroté à l'aide cl' Llne poi nte dure et conservédans des peti tes boîtes de carton.
Annexe C
LA COUPE
III La préparation du liquide d'étalement: la préparation de l'eau gélatinée à5 %:
jeter 5 g de poudre de gélati ne dans 100 ml d'eau disti liée tiède. Laisserreposer un moment jusqu'à dissolutlon complète de la poudre.La solution de gélatine se conserve mal. Elle doit être renouveléefréquemment.
o La préparation des lames porte objet: les lames sont trempées dans unesolution d'alcool puis essuyées. Elles sont ensuite gravées sur un angleavec une pointe de diamant; ce procédé assure un marquage indélébile etpermet de noter les références des pièces à couper. Il sert également àrepérer le recto et le verso de la lame au moment de la coloration et dumontage.
o La confection des coupes: les coupes épaisses de 5 ~l.m, sont obtenues au['ur et à mesure des passages du bloc sur le fil du rasoir, grâce au systèmed'avance mécanique du microtome à paraffine type Minot.. Ces coupesforment un ruban en se collant les unes aux autres.
o Le collage et l'étalement: les rubans de paraffine obtenus sont recueillissur un pinceau, disposés sur une feuille de papier. à l'abri des courantsd'air. et numérotés.
Une grosse goutte d'eau gélatinée 5% est déposée sur la lame porte objetséchée et gravée. A l'aide d'un scalpel, les coupes sont mises à flotter, enruban ou individuellement, à la surface du liquide: I"ensemble est portée surune platine chauffante pour permettre l'étalement des coupes (le passage surle rasoir les écrase) et leur collage (la gélatine étant une substance adhésive).
. ~ ~
o Le séchage: les coupes étalées et collées, I"excès de liquide est écoulé avecprécaution en maintenant les coupes en place à l'aide d'une aiguille montéetandis que la lame est doucement inclinée. Puis les coupes sont disposéesulle dernière fois avec l'aiguille. Ensuite les lames refroidies, sontessorées par pression, sur un coussi net de papier Joseph (les coupes étantplacées contre le papier). L'essorage améliore le collage ct l'étalement.
Les coupes essorées sont disposées sur des séchoirs à rainures (planchettes cieVigier). Le séchage se fait à l'étuve à 40°-45°. La paralTine ["ond sansinconvénient; les coupes sc recouvrent d'une fine pellicule de paraffine quiles IJrotège de l'air et les conservent il1délïniment.Puis les lames sont empilées, après refroidissement. et stockées jusqu'à leuruti 1isation.
Annexe D
LE DEPARAFFINAGE ET LA REHYDRATATION DES COUPES
C'est une étape qui suit, en les inversant, les principales phases del'inclusion. Les lames sont successivement plongées clans une batterie de cuvesde verre à panier amovible, qui permettent de transporter 5 à 10 lames. Cescuves sont rempl is de bains de toI uène servant à dissoudre la paraffine, de bainsd'alcool de degrés décroissants destinés à expulser le toluène paraffiné, et debain d'eau pour réhydrater les coupes.
En pratique:
Echantillons fixés au formol 10%
- un hain de toluène- un hain de toluène- un hain de toluène- un hain d'alcool absolu- un hain d'alcool absolu- un hain d'alcool 95°- un hain d'alcool 70°- un huin d'eau courante'
: 5 minutes: :) minutes: :) minutes: 5 minutes: 5 minutes: :) minutes: j mlJ1utes: :) minutes
Echantillons fixés au Bouin-Hollande sublimé
- /111 hain de toluène- un hain de toluène- un hain de toluène- un hain d'alcool ahsolu- /11/ hain d'alcool ahsolu
'1 '. '1 ' l' 105°- UII HlIIl ( acoo. >'
- lin hain d'alcool iodé à 7()0
- un hain d'hyposu(flte de sodiulII,- un hain d'eau courante
: :) minutes: 5 rninutes: 5 minutes: 5 mi \lutes: :) minutes: :) minutes: :) minutes
1SIc: :) minutes: :) mi nlites
L'alcool dissout le sublimé et l'iode permet l'élimination de ce sel en letransformant en iodure de mercure. Ce lavage est important pour éviter laformation dans les tissus, de fins préci pités sous formes de poussières,d'aiguilles ou de granulations, dûs au sublimé et aux combinaisons du subliméavec les phosphates alcalins des tissus ou à ses transformations en sels basiquesinsolubles.L'hyposulfite de sodium: élimine l'iode.
Alcool iodé à 70°
Alcool à 70° : 1 vol umeTeinture d'iode : en quantité suffisante pour
donner la teinte brune. Au bout de quelques temps, l'alcool se décoloreet la teinture d'iode est ajoutée à nouveau; l'action est répétée jusqu'à ceque l'alcool ne se décolore pl us.
Hvposulfïte de sodium à J%
Hyposulfite de NaEau distillée
1 0o
100 ml
Annexe E
LA COLORATION
Le Kernechtrot ou rouge nucléaire solide (coloration monochrome).
En pratique:
- 5 à la minutes dans la solution de rouge nucléaire solide.Le temps peut être prolongé plusieurs heures car l'empâtement est nul.
- le lavage à l'eau distillée ou à l'eau courante (le colorant résiste aussi aulavage alcoolique).
La solution colore les noyaux en rouge vif. Une colorationcytoplasmique au choix, peut être associée.
Les produits:
La solution de rouRe nucléaire solide
- Rouge solide ( Kernechtrot)- Sulfate d'aluminium- Eau distillée
: 0,1 g: .) g: 100 ml
Dissoudre d'abord le sulfate d'aluminium dans un peu d'eau distillée.puis ajouter le Kernechtrot et porter à ébullitioll. Compléter la solution à100 ml et laisser refroidir. Filtrer au moment de l'emploi. Ce colorantest peu stable et doit être renouvellé tous les six mois.
Annexe F
LE TAMPON PHOSPHATE 0,1 M pH 7,4
9 La solution de tampon phosphate 0.2 M pH 7,4
- Solution A :
Disodium hydrogénophosphate 12 H20(Na2 HP04, 12 H20)Eau distillée
- Solution B :
Sodium dihydrogénophosphate 2 H20(Na H2P04, 2 H20)Eau distillée
71.63 g
: 1000m\
780, û
250 ml
Ajuster le pH de la solution A ZI 7A à l'aide de la solution B. Filtrerla solution finale et la conserver à 4°C.
9 Le tampon phosphate O. [ M pH 7.4
- Tampon phosphate 0,2 M pH 7.4- Eau distillée (filtrée)
1 volulllc1 vol L1mc