anemies nutritionntlles par carence en...
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UNIVERSITE DE DAKAR
FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
N° 22ANNEE 1984
ANEMIES NUTRITIONNtLLES PAR CARENCE
EN ACIDE FOLIQUE ET EN VITAMINE B 12 :
étude des méthodes de dosage et essai de mise au pointd'un programme de lutte
THESE
présentée et soutenue publiquement le 9 mars 1984
devant la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Dakar
pour obtenir le grade de DOCTEUR EN PHARMACIE
(DIPLOME D'ETAn
...
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par
Alioune DIEYE
né en 1957 à NDIAGO (R.I.M)
Interne des Hôpitaux de DAKAR
i, 1
JURY:
Président de Thèse: Professeur Ibrahima WONE
Examinateurs Professeur Issa LOProfesseur Francis LE GAILLARD
Directeur de Thèse: Docteur A. Makhtar NDIAYE, Directeur de l'O.R.A.N.A.(Organisme de Recherches sur l'Alimentationet la Nutrition Africaines)
-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-
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1 DOYEN Iv1. Ibrahirra DIOP MAR
! PREMIER ASSESSEUR ......•...•....•........................•............ M. Ournar SYLLAl '1
1 DEUXIEME ASSESSEUR .........................................•....•..... M. Samba DIALLO
J CHEF DES SERVICES ADMJ}ITSTRATIFS M. Ousmane SOUMAREj
-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-
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UNIVERSITE DE DAKAR
FACULTE DE MEDECINE ET DEPHAJlMACIE
l - MEDECINE
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M. Papa DerriJa mIJ'.YE Anatomie PathologiqueM. René NDOYE BiophysiqueM. Idrissa POUYE Orthopédie-Traumatologie
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Gynécologie-Obstétrique
Hématologie
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Cardiolo!9-e
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Neurologie
Bactériologie-VirologieBiochiwie Médicale
Cancérologie
OphtallJl;:)logie
Médecine Préventive
M.M.M.M.folrœ.M.
Jacques
Gilles
Alexis
Jean Berrard
JacotlelineJacques
/ CfI.ARGES D'ENSEIGNEMENr
AJThDill
CH:F.BOOl'il'JEL
COUMBAP.AS
MAUFERON
PIOOEI'
srEPHANY
Histologie-Embryologie
Chirurgie Générale
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Neurologie
Biophysique
Psychiatrie._----------------------------------------------------------------------------------------------+ Personnel en détachement.
Moussa Lamine
M.Mme.
I>1r.e.
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Gisple
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L/ r',I,I'T'RES - ;\::;SIS'l'AL'l'S
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Histologie-Embryologie
HGrnatolog:ie
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Pharmacie Galénique
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Toxicologie
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PhanaCCCi'lOsieChimie ~ralytique
Phar~acclociE: etPharmacody~amie .
ZoolOGie
Phar~acie Chimique etChimie Or0.anique
Pilarmilcolonie et?hilrmacodyni'lmie
Pharmilcie Galénique
J EDE DIE CET R A V AIL•••••••••
-=-=-=-=~-=~~~~~=-~-=~-=-~=-=-=-=-~=-=
A mon père et à ma mère
Pour tout ce que vous avez enduré pour moi.
Puisse Allah vous garder encore longtemps parmi nous.
A ma femme
Courage.
A ma fi lle Fama
J'espère que tu feras mieux que ton père.
A mes tantes
Alla DER NlANG
Khady FALL
Adja Fatou LAM
Merci infiniment.
A mes beaux-parents (in memorium)
A mon homonyme A1ioune OlEYE et famille
A Tar OlEYE et famille
A Birane OlEYE et famille
A Amina OlEYE et famille
A Aziz DlAGNE et famille
A SOwdiatou OlEYE (in mémorium)
A mon grand-père El Hadji Talla Lü
A tous mes frères et soeurs Che ikh, Tar, sath, sa liou , Az iz, Bira ne,
Baye, Aby, Khady, Moussa, lbra, Mor et
Marne Kha1y.
• • •1•••
A toute la famille DIEYE
A toute la famille LO
A ma soeur et amie Arame NDOYE
En témoignage de ma reconnaissance.
A tous mes cousins et oncles
A tous mes neveux et nièces
Mamadou, Cheikh, Mansour, Moustapha,
Mbaye, et Matar DIAGNE (in mémorium)
A toutes les familles
A
DIOP, TEUW, GAYE, NIANG, NDIAYE, et SENE.
- Fatou GAYE et famille
- Boubacar DIOP et famille
- Abdourahmane DIEYE et famille
- Assane FALL et famille
- saliou DIEYE et famille
- Anta SAR et famille
A tous mes amis et camarades particulièrement à
- Ya ly SENE et fami lle
- Pape TEUW et Madame
- Oumar DIEYE et famille
- Oumar FALL et famille
- Doudou SENE et famille
- Cheikh DIAGNE - Dr Ben Khaled - Moussa TEUW
- Ngarndé DIEYE - Cheikh LAM - Rawane NDOYE
- Baye DIEYE - sa li ou GAYE - Morse GAYE
- Babacar DIOP - Ibra NDIAYE - Ousmane NIANG
- Tidiane DIOP - Ibrahima AIDARA - Cheikh BOYE
- Marne Ami - Youssou NIANG - Abderrahmane BA
- Driss - Jules - El Mamoun
- Ibrahima BA - Abdou GAYE - DRAME
Que les liens qui nous unissent se raffermissent davantage.
A tous mes camarades d'enfance
... / ...
A tous les internes et anciens internes des H8pitaux de DAKAR
A mes camarades de promotion
A tous ceux qui par leur sollicitude, leurs conseils, leur encouragement
nous ont aidé à réaliser ce travail, particulièrement
- SLAVOV Richard
- CHEVASSUS Agnès
- GALLCN
- Me lle TOURE
En témoignage de notre reconnaissance.
A tout le personnel de l' O.R.A.N .A, de l' Ins ti tut pasteur, de la Pharmacie
et de la Biochimie de DANTEC et de FANN.
A toute la Faculté de Médecine et de Pharmacie de DAKAR
A tous les pays du Tiers-Monde
Puisse un jour disparaître à jamais le spectre de la
maladie et de la malnutrition.
A toute l'humanité
"Toute entreprise technologique ne doi t avoir qu'un seu 1
sujet de préoccupation: l'Homme et sa destinée. Ne
l'oubliez jamais, au milieu de vos diagrammes et de
vos équations" Albert EINSTEIN
•••1•••
A NOS MAITRES ET JUGES
A NOTRE MAITRE ET PRESIDENT DE JURY
Le Professeur Ibrahima WONE---------------------------Médecine Préventive et santé Publique
Permettez-nous de vous dire notre très respectueuse
gratitude pour le précieux enseignement que nous avons
reçu de vous, et pour l'honneur que vous nous faites en
acceptant la présidence de notre jury.
A NOTRE MAITRE ET JUGE
Le Professeur Issa La
Pharmacie galénique et Législation
Pharmacien-Chef de l'Hôpital Aristides Le Dantec
Ancien Interne des Hôpitaux de DAKAR
Votre disponibilité permanente est une preuve de l'intérêt
que vous portez aux problèmes des Etudiants du Département.
Nous sommes très sensible au soutien que vous nous apportez
dans le cadre de l'Internat.
Toute notre reconnaissance.
A NOTRE MAITRE ET JUGE
Le Professeur Francis LE GAILLARD
Biochimie Pharmaceutique
La facilité avec laquelle vous avez accepté d'être notre
Juge nous a profondément marqué.
Nos sincères remerciements.
.../ ...
A NOTRE MAITRE ET DIRECTEUR DE THESE
Le Docteur A. Makhtar NDIAYE
Directeur de l'O.R.A.N.A (Organisme de Recherche sur
l'Alimentation et la Nutrition Africaine).
Vous nous avez confié ce travail, ensuite vous avez bien
voulu nous accueillir dans votre Organisme où vous guidez
efficacement nos premiers pas en Nutrition. Nous sommes
très sensible à la confiance que vous avez à notre endroit.
Soyez assuré que nous ferons de notre mieux pour ne pas vous
décevoir.
"par délibération, la Faculté a arrêté que les opinions
émises dans les dissertations qui lui seront présentées, doivent être
considérées comme propres à leurs auteurs et qu'elle n'entend leur
donner aucune approbation ni improbation".
Liste des abréviations
----------------------------------------
A.F
A.N
A.O.A.C
A.T.C.C
Co.
G.R
Hb
Ht
mcg
mcl
ng
O.M.S
O.R.A.N.A
pg
ppm
O.R.S.T.O.M.
Acide fo lique
Anémie nutritionnelle
Association Official American Chemist
American type culture collection
Cobalt
Acide dihydrofolique
Acide tetrahydrofolique
Acide formiminoglutamique
Globu les rouges
Hémoglobine
Hématocrite
Microgramme
Microlitre
Millimole
Nanogramme
Organisation mondiale de la santé
Organisme de Recherche sur
l'Alimentation et la Nutrition
Africaines
Picogramme
partie par million (mg/kg ou ml/l)
Acide tétrahydrofolique
Vitamine B12
Office de Recherche Scientifique
et Technique d'Outre-Mer.
.11i:,
l N T R 0 DUC T ION
-=-=-=-~=-=-=-~=-~~=-=-=-=-~=-=-~
- 1 -
"L'anémie est définie cormne étant un état pathologique dans
lequel la teneur du sang en Hémoglobine est inférieure à celle qui
est norma le pour le suj et considéré" (O.M. S 1968).
L'anémie se manifeste sur le plan clinique
d'abord par des signes fonctionnels:
• asthénie physique avec diminution des
possibilités de travail puis asthénie
inte llect ue lle.
• ensuite comportement spécial (aggressivité
irritabilité, ou alors état de choc),
• dyspnée,
• signes cardio-vasculaires.
- puis par des signes physiques
• pâleur au niveau des muqueuses (lèvres,
cavité buccale),
• modifications au niveau des ongles,
• iJ;:rticaire,
• glossite,
• troubles neurologiques,
• parfois ictère,
• splénomégalie.
Cependant les signes cliniques seuls ne suffisent pas,
alors il faut faire appel à la biologie. Le clinicien dispose de
nombreux examens biologiques qui lui permettent de s'orienter vers
une étio logie précise.
.0.1 •••
- 2 -,
En cas d'anémie carentielle, il faut dépister le facteur
déficitaire, lui imputer le tableau Pathologique observé et guérir
celui-ci par un apport spécifique.
La variabilité des tableaux cliniques, la fréquence des poly
carences accroissent les difficultés.
Cette complexité a amené un comité d'experts de l'O.M.S à
préciser en 1968 (83) :
1- que l'anémie ne constitue jamais la manifestation
inaugurale d'une carence nutritionnelle, mais en est
toujours un signe tardif
2- que les anémies carentielles les plus fréquentes sont
secondaires aux déficiences en fer, en folates et en
vitamine B12 0
La carence en fer est la première cause des anémies de l'adulte
et nOtamment de la femme enceinte (177).
La carence en acide folique se classe en deuxième position
parmi les causes les plus courantes d'anémies nutritionnelles (119 - 47)0
Les autres carences qui jouent un rôle moins important dans
la pathogénèse des anémies sont la carence en vitamine B12
(193 - 10)
et probablement la carence en protéines (189 - 65)•.
"Le dosage de la vitamine B12 sérique et du folate sérique et
erythrocytaire permet de dépister les déficiences possibles en ces
nutriments" (124).
Notre travail se propose d'apporter une modeste contribution
à l'étude des méthodes de dosage de la vitamine B et de l'acide12
... / ...
- 3,-
LCL
folique etYun essai de mise au point d'un programme de lutte contre
les anémies nutritionnelles par carence en folates et en vitamine
Elle comportera trois parties
- Dans la première, nous ferons un bref rappel sur les
anémies nutritionnelles que nous situerons surtout sur
le plan géographique. Ensuite, nous étudierons le méta
bolisme de l'acide folique et de la vitamine B12
et leurs
interrelations ;
- Dans la deuxième partie, nous traiterons essentiellement
des méthodes de dosage de l'acide folique et de la
vitamine B12
- Dans la troisième partie, enfin, nous présenterons un
programme d'action pour la lutte contre les A. N. par
carence en acide folique et en vitamine B12
•
PREMIERE PARTIE
~~~~=~-=-=-=-~=-=-~=-~~=
Rappel sur les anémies nutritionnelles, sur le métabolisme de l'acide
folique et de la vitamine B12
et leurs interrelations.
Chap. l Rappel sur les anémies nutritionnelles (A. N.)
- 4 ~
Les A. N. préoccupent de nombreux pays et bien des organismes
de recherche.
En Amérique Lati ne et dans les caraïbes. le "Wi lliam' s Water
man FUnd". le "National Institute of Health des V.S.A". en collaboration
avec "l'Organisation Part Américairle de la santé". mènent depuis 1958
des enquêtes sur les A. N.
Des études analogues sont faites dans l'Asie du Sud-Est en
1961 par "Ute United States and Japan Coopérative médical Science
Programu •
De même, en Inde comme en OJganda. le "Welcome Trust of London"
dirige depuis plusieurs années des recherches sur l'anémie mégaloblas
tique et ferriprive, tandis que le Ministère de la Santé du Royaume-Vni~
étudie la carence en folate en Grande-Bretagne.
En Afrique de l'Ouest. dans le cadre de l'O.R.A.N.A, des études
ont été effectuées (141) (142) (143)(144).
Mais l'étude des A. N. porte surtout sur celles de la femme
enceinte et de l'enfant en raison de leur relative fréquence et de
leur caractère cosmopolite.
Cependant, la distribution géographique des anémies nutrition
nelles varie considérablement. Si la répartition de l'anémie de Biermer
est largement prédominante dans la zone nordique des pays tempérés, les
autres anémies nutritionnelles macrocytaires apparaissent comme des
endémies essentiellement tropicales et subtropicales.
11. Définition d'une anémie nutritionnelle.
• ••1•••
",
1
11!!
- 5 -
L'anémie nutritionnelle est définie comme étant un état patho
logique dans lequel la teneur du sang en hémoglobine, l'hématocrite
ou le nombre d'hématies est devenue anormalement faible par suite
d'une carence en un ou plusieurs nutriments essentiels, quelle que
soit la cause de cette carence (83).
Au nombre de ces nutriments, on distingue le fer, les folates
et la vitamine B12
•
2/. Répartition géographique des A. N. (105)
2-1 Pays developpés de la zone tempérée
(Etats-Unis, Europe du Nord, G. B., France,
R.R.A, Europe Méditerranéenne).
En pays tempérés developpés, les A. N. par carence en vitamine
B12, acide folique, fer et protides existent aussi bien chez l'enfant
que chez l'adulte, aVec une fréquence diversement appréciée.
2-1-1 carence martiale
Elle touche 5 à 25 % de la population et se voit à tout âge
avec nette prédominance féminine.
2-1-2 carence en vitamine B12
A c8té de la maladie de Biermerla plus fréquente (9 fois 10),
due à l'absence de facteur intrinsèque de CASTLE, existent des anémies
para-biermériennes en particulier l'anémie du botriocéphale, apanage
des pays d'Europe du Nord.
2-1-3 carence en acide foligue
•••1•••
,.~,~l
1
1!t
1
- 6 -
Décrite surtout chez la femme enceinte, la carence folique
s'observe dans 0,01 à 5 % des cas.
2-1-4 carence proteigue
Elle ne s'observe que lors des restrictions alimentaires très
sévères.
Le caractère sporadique de ces anémies nutritionnelles des
pays tempérés développés semble contraster avec celui apparemment en
démique des A. N. des pays en voie de développement.
2-2 Pays en voie de développement non africains
(Amérique Centrale et du Sud, Asie) Proche-Orient)
En Amérique Centrale et du Sud, l'existence des A. N. semble
être un fait établi. Tous les types de carence se voient mais avec une
fréquence variable selon les auteurs.
La carence martiale reste prépondérante chez les femmes en
ceintes (61,2 % en Amérique Centrale, 60 % en Amérique du Sud).
Le déficit en vit. B12 est plus fréquent en Amérique Centrale
(71 %) qu'en Amérique du Sud (23 % des femmes enceintes).
La carence en acide folique semble généraliser touchant aussi
bien les enfants que les adultes.
Dans les zones subtropicales du Proche-Orient, les A. N. par
carence martiale associées à une dépletion en folate ont été étudiées
surtout chez la femme enceinte.
Dans les zones tropicales asiatiques, aux Indes en particulier,
les carences protéiques sont fréquentes chez les enfants ; la prévalence
•••1•••
- 7 ~
des A. N. par carence en fer chez les femmes enceintes est de 38 % en
milieu urbain contre 51,7 % en milieu rural, tandis que la carence en
vit. B12
est de 35 % en zone urbaine et 49 % en zone rurale.
2-3 Pays subtropicaux et tropicaux d'Afrique
Si l'on en juge par le nombre de publications, les anémies
nutritionnelles paraissent fréquentes dans les pays africains, tropicaux
ou non.
2-3-1 Afrique du Nord
Les anémies nutritionnelles sont dominées par les anémies
mégaloblastiques de la gravido-puerpéralité en rapport avec une carence
folique (surtout en Algérie) ; la carence en vitamine B12
est rare.
2-3-2 Afrique de l'Est
Les anémies rencontrées en Afrique de l'Est sont identiques à
celles rencontrées dans les autres pays tropicaux du monde.
Elles diffèrent seulement par leur incidence, leur variété et
leur distribution. Les A. N. par carence martiale par exemple représentent
42 % des cas et prédominent dans les régions chaudes tandis que les ané
mies mégaloblastiques 58 % des cas sont l'apanage des zones froides et
hautes.
La carence protidique joue un rôle mineur dans la genèse de
ses anémies.
2-3-3 Afrique du Sud
•••1•••
if,1
11f
i1
- 8 - .
Les A. N. sont dominées par les formes mégaloblastiques. La plu
part de celles-ci sont chez les Bantous associées à une grossesse (77 %).
La maladie de Biermer a une incidence nettement plus élevée chez les
Blancs (72 %) •
Ces anémies nutritionnelles observées chez le Bantou relèvent le
plus souvent de carences complexes proteiques et vitaminiques.
2-3-4 Afrique de l'Ouest
Les travaUX ont surtout porté sur les anémies nutritionnelles de
l'adulte en particulier de la femme enceinte en raison de leur grande
fréquence.
De nombreux travaUx précisent la Part de certaines carences dans
le déterminisme des syndromes anémiques. Les anémies hypochromes ferripri
ves sont fréquentes, de même que les carences fOliques. Elles intéressent
les populations tant urbaines que rurales.
Ainsi, la proportion des femmes gravides anémiées est de 22 ~ 2,2 %
de l'ensemble des femmes enceintes.
L'anémie hypochrome hyposidérémique représente 16,6 % des anémies
de la femme enceinte, tandis que la carence folique avec anémie est de
14,1 %, d'où l'importance de son étude.
3/. Conclusion sur ce rappel des A. N.
La distribution géographique, éthnique et sociale permet de séparer
deux enti tés :
- d'une part l'anémie de Biermer mégaloblastique, maladie
à prédisposition hériditaire, apanage des pays tempérés
d'Europe et des Etats-Unis d'Amérique, frappant toutes
les classes soci.ales et y représentant 90 % des anémies
mégaloblastiques.
- d'autre part, les anémies nutritionnelles, apanage des
. ·.1 ...
- 9 ~
pays tropicaux commes les Indes, l'Afrique de l'Est, l'Afrique Occidentale,
l'Afrique Australe.
Si les anémies nutritionnelles par carence ferriprive sont dans
l'ensemble bien cernées, les carences folique et vitaminique B12
restent
encore à étudier surtout dans les pays en voie de développement où elles
semblent jouer un rôle plus important que celui qu'on leur attribue.
o 0
o
1fi1,t
!f1
!!i1
...1... 1
1i1,,j1i
r
1t
Char. II Acide folique
- 10 ~
1/. His torique
1930 - 1938-----------Lucy WILLS étudie en Inde une anémie macrocytaire survenant
surtout pendant la grossesse et curable par une préparation à base de
levure. C'est le "WILL' S factor".
1940
SNELL et PETERSON constatent que deux bactéries: Lactobacillus
casei ainsi que Streptococcus faecalis ont besoin, pour survivre, d'une
substance qui se trouve dans la levure et le foie. C'est le "L. casei
factor" ou vitamine Bc (c de chicken)
1941
MITCHELL nomme "acide folique" une substance extraite de l'é
pinard et d'autres légumes verts et qui est un facteur de croissance pour
S. faecalis. La même année HUTCHINGS découvre l'identité de l'acide folique
et des substances suivantes: WILL'S factor, vitamine B ou L. casei factor.c
1945
Une équipe américaine, de l'Am~rican Cyanamid Co, réalise la
synthèse de l'acide ptéroyglutamique. On l'emploie comme traitement dans
l'anémie mégaloblastique. On effectue la synthèse des ses dérivés:
acide ptéroy-di, triglutamique.
1947
SAUBERLICH et BAUMANN isolent l'acide folinique, facteur de
croissance pour Pediococcus cerevisiae.
2/. Structure et propriétés de l'acide folique et des substances voisines
(179) (146)
Tab lea\Jl( let II
Fig. 1
• • •1•••
Transporrcurdc c:ldic:lIIX ~·11 :l'ornede carbone
1
1
·------·T~:lns le sérum et le fClie. Tr:lnspor.1 tcur de r:'h.Jic:w~ :\ 1 :lfl.ltnc dc car
bone
Poudre blanchâtre :l. 1 Forme activc dc l'acide tOlilluCcouleur de crème. s'qxy-dant à l'air, instable :l. lalumière. surtOut ensolutionForme L(-): [C1J~ -16,9·
In'l>ble en milieuxacides et neutres
11
1 Cristaux incolores D:lns les micro-organismes. FJc·1 (lXln - 15,1 0 (facteur teur de croissance pour 1.(U(I'}WJlIO(
1 n:lturel) rilro,-orll"', 1Arloht7tilho ("/fi. Slrrp.1 [IXI~ + 16,76° (racé- 1 IMOUIU jtu(n/ù. LJ1flo/J.7rill"J flro/Ji-
1
mate, facteur synthé- 1 nO!"J; rr:tnspfJf[cur de r.ldic;Ju:( :l 1, lique) atome de carhonc1
----------'----
H HC=C
/ \CH -NH-C CCONHCH-CII -CH-Caotl/2", ,12
C-C COOIIH H
H2
H HC=C
/ \CH -NH-C C-CONHCHCHCtlCOOH/2", 122
C-C COOtlH H
__' 1
H H . ---- --_._- I;~~~~~~ ·i:l~~·:----1 A~~,~ooi.;c :I:r,ciclc (nli'lue; i~:f=C, 1 ~ 1 hine la liivisinn cellul,IÎre
CtlNH-C j-CONHCtICH -CH -CaoH/ 2 " f 1 2 2
C-C CaoHH H
H H/C=C\
ru-NH-C j-CONH-CH-ruCH -CODH/-~ " f l''~ 2
C-C COOH~ H H
......-CH2
Il HC=C
/ \--NC jCONHCHCH -CIlCOOH
1 \ f 1 2 2, /C1I2 C--c CaoH/ H H
----
Acide télrahydroptéroyJ- CIIHnN,O.glutamique, H,PteGlu 445,44 0(acide tétrahydro- Il H
folique, THF) HN/C-.-...C//I......1 Il
~/~N/~N/H
--
Acide 5-formyltélu- CIOHnN,O,hydroptéroylgluta- 473,45 0 Cmique (facleur citro- Il 1
varum, acide fol inique, HN/C-.-...C/N
leucovorine) 1 Il~/~N/~N
_ H
-
Acide 5,lO-méthylène- Cs.H..N,O.tétrah ydropteroylglu- 457,45
~tamiquc 0 \(. formaldéhyde actif.) Il
C-.-...NHN/ C/_1 Il
Hii/~N/~N~
---------- --
Acide 5-méthyltétra- CIOH..N,O.hydropléroylgluta- 459,47 0 ~Jmiquc Il
C-.-... N ~HN/ C/ '-ë
1 Il 1
Hii/~N/~N/(H
---------- ------ -_._---
Acide 4-aminoptéroyl- CIIHs.N,O,glutamique 440,42 NII2(aminoptérine)
N"",lc/N,c1 Il 1
~/~N/~N""'C
1
N,..,
Tableau II
- 14 - .
3/. Biogenèse (179)
L'acide folique est synthétisé par les végétaux supérieurs,
par les micro-organismes (flore intestinale) et dans les tissus animaux.
Les étapes de la synthèse sont probablement les suivantes:
Purines-------~/ ptéridines -------~ester pyrophosphorique
de la 2-amino-4-hydroxy
6-hydroxy-methydihydropté-
ridine
+ acide p. amino
benzofque
acide dihydr~térofque
+ acide glutamique
(acide tétrahylrofolique
1tétrahydro-folate
déshydrogénase
acide dihydrofolique
acide folique
(---------~---------)
( fig. 2 Biogénèse de l'acide fOlique )
(-------------~)
•••1•••
- 16 - .
5/. Apport alimentaire (155) (98)( 149)
5- 1 Les sou rces de f 0 la tes
_ les légumes: en particulier asperges, endives, 'laitues,épinards, choux, carottes, tomates.
Les légumes contiennent plus de 1 mg d'acide folique pour
100 g de poids sec, surtout sous forme de dérivés formylés, parfaitement
assimi lab les.
- les fruits
poires, noix de coco.
pommes, bananes, citrons, raisins, oranges,
- la levure.
le foie, le rein.
le lait : surtout le lait de vache qui en contient 55 microgs
par litre, mais l'acide folique est détruit lors de l'ébulition.
5-2 Apports quotidiens recommandés par l'O.M.S (tableau III)
6/. Absorption (155) (151)
Seul l'acide pteroyLnonoglutamique peut être absorbé. La plus
grande partie de l'acide folique alimentaire doit être hydrolysée par la
conjuguase (gamma L glutamyl carboxy-peptidase) présente dans la muqueuse
duodénojéjunale.
L'absorption est rapide. Elle se réalise dans la partie proxi
male de l'intestin grêle. Aux doses physiologiques, cette absorption se
fait suivant un phénomène actif, alors qu'aux doses pharmocologiques,
l'absorption est passive.
La conjugase intestinale peut être inhibée par un grand nombre
de substances, comme le sel sodique de la bromo-sulfonephtaleine, certains
antifoliques (methrotrexate), certains contraceptifs oraux, les sels biliaires •
.../ ...
1il
1
1
Jl
111i1
APports quotidiens recommandés d'acide folique
(O.M. S 1975)
Tableau III
( )( Groupe Folate total (microg.) )(----------------------------------------------------------------)( )( Groupe d'~ge : )( )( + o - 6 mois 40 - 50 )( )( + 7 - 12 mois 120 )( )( + 1 - 12 ans 200 )( )( + 13 ans et plus 400 )( )( + Femmes enceintes 800 )( )( + Femmes a llaitant es 600 )( )( )
- 17 -
.../ ...
'r
1î
1
1
1
1
j
1
i
- foie----
- 18 -
7/. Transformation (35)
Une fois absorbés, les folates plasmatiques vont être stockés
dans différents tissus et organes et transformés en leurs formes actives.
Les taux plasmatiques sont de 5 à 15 microgs/ml (5 à 15 mg/1)
principal lieu de réserve des folates
1 g de tissu frais contient 7 microgrammes.
Les folates hépatiques sont surtout sous la forme ,de N5-CH3-~F
et ne sont actifs pratiquement que sur Lactobacillus casei.
- bile: contient 2 à 10 fois plus de folates que le sang.
rls sont sous forme de fo~~l-glutamate réduit et oxydé.
- reins (tubules) peuvent réabsorber l'acide folique et
aussi le stocker.
- !~~_~~!~~~~_~~~E~:~~~~E~~~~~~E~~ : ils sont inactifs ~icro
bio logiquement. Leur taux est 20 à 30 fois supérieur à ce lui du plasma.
Ce sont des ptéroyl-polyglutamiques.
Les réserves en folates d'un individu sont d'environ 5 mg.
8/. Excrétion (35)
Elle se fait dans les urines. On y trouve
- acide folique,
- N10 formyl-F1l 4,
- N5- méthy 1';' F1l4,
- acide folinique.
9./ carences en acide folique
•••1•••
- 19 -
9-1 carences expérimentales
Selon Herbert (96), une privation d'acide folique pendant
quatre mois, entraine l'apparition d'une anémie avec mégaloblasto~e
médullaire. L'anémie est précédé d'anomalies leucocytaires (Hyperseg
mentation des neutrophiles) et de modifications de la morphologie des
erythrocytes (macro-ovalocytose).
HERBERT a proposé le schéma suivant d'ordre d'apparition des
sympt8mes
carence folique nutritionnelle expérimentale chez l'homme: séguence
d'apparition des sympt8mes biochimique et hématologique. (fig. 4)
•••1oe.
aN
22 j
(Baisse des folates sériques inférieurelà 3 ng/ml
Hypersegmentation (moyenne des lobes supérieure à 3,35)
49 j. Augmentation du Figlu urinaire
95 jBaisse des folates globulaires
123 j inférieurSà 20 ng/mlMacroovalocytose (franche)
127 jMégàloblastose médullaire (franche)
135 JAnémie
137jHb inférieur à 14 g % fGR inférieurs à 4,6 10'
o
Fig. 4
2 4 6 8 la
SEMAINES
12 14 16 18
• • •1•••
20
- 21 -
9-2 causes des carences foliques
Elles sont regroupées dans le tableau ci-après
(39 - 97 - 138 - 190 - 200)
Défauts d'apport vieillards, pauvreté, troubles psychiques graves,
gastrectomie, alcoolisme chronique, nouveaux-nés
nourris au lait de chèvre.
Malabsorption spruê, maladie coeliaque, résection intestinale étendue,
diverticulose jéjunale, syndrome de l'anse aveugle,
maladie de WHIPPLE, Sclérodermie, amylose, syndrome
carcinorde, entérite post-radiothérapique, parasitose
en particulier lambliase, artérite mésentérique, trai
tement prolongé par la néomycine.
Pertes excessives : HémOdialyses répétées
Besoins augmentés: grossesse, lactation, prématurité (réserves faibles,
besoins élevés), anémies hémolytiques (surtout
congénitales: microsphérocytose héréditaire,
thalassémie, drépanocytose, porphyrie erythropofétique,
aussi acquises : anémies hémolytiques avec auto-Ac,
maladie de MARCHIAFAVA - MICHELLI), myéolosclérose,
myélomatose, polycythémie, anémie à sidéroblastes,
leucémies, cancers, réticulocytoses.
--------------------------------------------------------------------------------Antagonistes et
drogues apparentées
Méthotrexate, 6 mercaptopurine, pyriméthamine,
triméthoprime, nitrofurantolne, triamtèrene,
sulfamides, cyclosérine, anticonvuloivants :
hydantofne seul ou associé au phénobarbital.
primidone.
--------------------------------------------------------------------------------
.../ ...
- 22 -
Circonstances diverses
- tubercu lose,
- maladie de CROHN,
- arthrite rhumatofde,
- dermatoses.
10/. Mode d'action du déficit en A. F. (35)
Les coenzymes foliques sont nécessaires pour de nombreuses
réactions biochimiques intervenant dans la synthèse des purines et des
pyrimidines.
Tout déficit folique peut diminuer la synthèse d'A.D.N en
diminuant celle de thymidilate qui en est l'une des deux bases pyrimidiques
constitutives (fig 5).
D~ns cette réaction, le 5,10 méthylène THF est oxydé en DHF.
La régénrération de THF, qui est la forme active de l'acide folique,
nécessite l'intervention d'une enzyme, la dihydrofolate-réductase.
L'inhibition de la synthèse d'ADN peut donc résulter d'une carence vraie
ou relative en acide folique mais aussi de l'intervention de substances
empêchant la régénération de THF gr~ce à l'enzyme réductase.
iThymidilate
Î<Déoxyuridy la te
5,10 méthylène THF~<_.-- THF<1 OHF
DHF - réductase
•••1•••
Chap" III Vitamine E12
- 23 -
1- Historique (157) (14)
La découverte, en 1926, par MINOT et MURPHY, de l'action
curative du foie vis à vis de l'anémie pernicieuse a été le point de
départ:,de très nombreuses recherches biochimiques et physiologiques qui
ont abouti, en 1948, à la découverte de la vitamine B12
"
L'identification par Mary SHORB de l'activité antipernicieuse
du foie à l'activité de croissance des extraits hépatiques sur Lactobacillus
lactis Dorner et l'utilisation de paparne activée par le cyanure qui trans
forme toutes les formes de la vitamine B12
en cyanocobalamine plus stable
et cristallisable, ont largement contribué à l'isolement de la vitamine B12
0
Celui-ci a été effectué simultanémment par Rickes, Brink,
Koniuszy, Wood et Folkers aux Etats-Unis, et Lester Smith et Parker en
Ang let erre"
La formule complète de la vitamine B12
, établie en partie
grâce au spectre des rayons X, a été publiée en 1955 par Hodgkin, Lester
Smith, Todd et leurs coll.
2- Structure et propriétés (179)
rab leau IV et Tab leau V
Fig. 6
•••1•••
- 26 -
3- Biogen~se (179) (35)
La vitamine B 2 n'est pas synthétisée par les cellules des1 .
mammif~res mais uniquement par des micro-organismes dans l'eau, le sol
et le tube digestif de l'homme ou des animaux. Nous dépendons donc
totalement des sources alimentaires de vit. B12
, présente dans la plu
part des tissus animaux mais absente des végétaux. (35)
La biosynth~se se fait selon le schéma suivant (Fig. 7)
Précurseurs de la porphyrine ---------------)') noyau corrine } ~) Cobinamide
Thréonine ~;> aminopropano1
Cobinamide-phosphate
GTP
~GDP - Cobinamlde
5,6 - diméthy1
benzimidazo1e
riboside
Vitamine B12
Fig. 7
•• •1•••
- 27 -
Apports quotidiens recommandés de vitamine B12
(O.M.S 1975
Tableau VII
( )( Groupe Vitamine B
12(microg.»
(----------------------------------------------------------------)( )( Groupe d'âge : )( )( + 0- 12 mois 0,3 )( )( + 1 - 3 ans 0,9 )( )( + 4 - 9 ans 1,5 )( )( + 10 ans et plus 2,0)( )( + Femmes enceintes 3,0)( )( + Femmes allaitantes 2,5)( )( )
.../ ...
- 28 -
4- Apport alimentaire
4-1 Aliments contenant de la vitamine B12
Tableau VI
- Huîtres
0,5m~ et p1us/g. sec
Foie et reinsde marmnif ères
Viandes maigresde
)))))
Grains de céré- )ales )
- Légumes vert s )))))))))
- Levure
Médiocres ou nuls
sec
de mer
- boeuf, veau,agneau,poulet.
Bons
Poissons- Oeufs- Lait
0,05 à 0,5mllg/g
(( Excellents((((((((((((((
4-2 Les apports
- La dose minimale quotidienne nécessaire pour maintenir
une hématoporèse normale chez un adulte sain est de 1 à 2 Micrograrmnes (35).
- Beaucoup d'auteurs pensent que les régimes habituels con
tiennent 50 à 100 micrograrmnes de vitamine B12
par gr., ce qui couvre
largement les besoins quotidiens.
- Apports recormnandés par l'O.M.S (Tableau Vl]
5- Absorption et transport (fig 8) (155)
5-1 : Absorption
Il existe deux mécanismes pour l'absorption intestinale de
la vitamine B12
•
- Mécanisme actif :
Quelle que soit la dose de vitamine B12
qui parvienne à
l'iléon, 1,5 micrograrmne seulement est absorbé avec l'~ide d'une
mucoprotéine du suc gastrique, le facteur intrinséque (179).
• ••1•••
1
1
1!
1
- 29 -
- Mécanisme passif
C'est une simple diffusion qui se déroule tout au long de
l'intestin. Elle nécessite la présence d'une grande quantité de vitamine
B12
(très supérieure aux doses habituelles).
Environ 1 % de la vitamine B12
libre est ainsi absorbé.
Dans les alimentst d'origine animalet la vitamine B12 est
complexée aux protéines. Elle est libérée des aliments par la chaleur
de la cuisson et par l'activité gastrique (acide chlorhydrique et
enzymes digestives) (fig. &).
Une fois libret la vitamine B12
se lie au facteur intrinsèque
secrété par les cellules pariétales de l'estomac.
Le facteur intrinsèque transporte ainsi la vitamine B12
à son
site d'absorption (récepteur iléal) (27) et protège la vitamine B12
de
dégradations enzymatiques au niveau intestinal, et de son utilisation
par des bactéries intestinales.
Parvenu à l'iléon, le complexe vitamine B1Z
- facteur intrin
sèque s'attache aux récepteurs spécifiques présents sur la bordure en
brosse des cellules, en présence de cations bivalents (ca++t Mg++) à un
pH supérieur à 5,6 de préférence.
Le facteur intrinsèque ne semble pas ~tre absorbé et resterait
dans la lumière intestinale après absorption de la vitamine B1Z
• Cependant t
ROTHENBERG et Coll. (164) semblent démontrer le passage du facteur intrin
sèque dans la cellule et son entrée dans les mitochondries, puisqu'ils
arrivent à précipiter la majeure partie de la vitamine B1Z
accumulée dans
les mitochondries par un sérum antifacteur intrinsèque. Mais, la contamina
tion de la préparation par des fragments de microvillosités ne peut ~tre
totalement exclue.
quoiqu'il en soit t le passage intracellulaire de la vitamine
B12 est une étape longue (plusieurs heures avant qu'on ne la retrouve dans
le sang portal). Ce passage semble dépendre de la présence d'oxygène et de
glucose.
• •• /.0.
1!
t
1
fi
1llf1(
- 31 -
Les différents p~OCessus se déroulant dans la cellule ne sont
pas bien connus. Les mitochondries joueraient un rôle important, peut-être
dans la conversion partielle de la vitamine B12 absorbée en 5- déoxy- adé
nosine- cobalamine (coenzyme B12).
5-2 Transport
Trois types de fractions protéiques plasmatiques participent
dans le transport de la vitamine B12
: ce sont les transcobalamines (35).
- La TCI
C'est u~e alpha-globuline de P.M: 121 000. Elle est
produite par les globules blancs et est responsable du taux de vitamine
B12
sérique endogène. sa concentration plasmatique est de 60 microgr./l
- La TC II
C'est une bêta-globuline, de PM : 38 000.
Son lieu de synthèse est non connu chez l'homme et son
taux p lamat ique es t 15 à 25 mi crog/ 1.
- La TC III
Rô le ma 1 connu.
Dans le sang portal, la vitamine B12
se lie à des protéines dont
la transcobalamine II, qui joue un rôle essentiel dans l'extraction de la
vitamine B12
descellules intestinales et dans son transport sanguin (86, 87).
L'importance de la transcobalamine II est encore accrue par la
description de carence en vitamine B12
par malabsorption associée à un
déficit en transcobalamine II (85).
6- Excrétion
Elle se fait presque exclusivement par voie biliaire; seules
de petites quantités passent dans l'urine (0 - 0,27 microgrammes/j) (179) •
•• •1•••
réversible de la vitamine B12
, secondaire à une
à une carence folique. (169 - 91 - 36 - 115).
au cours du syndrâme de ZOLLINGER-ELLISON
- 32 -
7- causes des carences en vitamine B12
7-1 carences d'apport
Ellessont assez rares dans les pays développés, mais existent
dans les pays du Tiers-monde en général, et dans les pays tropicaux
d'Afrique en particulier.
7-2 Défaut d'activité gastrique
- achlorhydries,
- gastrectomies.
7-3 Défaut dans la liaison au facteur intrinsèque
C'est la plus importante des causes de malabsorption de la
vitamine B12
•
7-4: Transit intestinal du complexe facteur intrinsèque-vitamine B12
Sténose, fistules, anse borgne, diverticulose multiple,
Dysmicrobisme intestinal.
- ~~~~~-~~~:~~:§~~~!~~~~
- !~~~~~!~~~:~_~~~::§~~!~~~ (188)
7-5 :Défaut de fixation complexe vitamine B12
- facteur intrinsèque
aux récepteurs intestinaux.
- Malabsorptions de la vitamine B12
, secondaire aux affections
iléa les.
- Ma labsorption
carence en vitamine B12
ou
- Malabsorption
(171)173).
- L'existence d'un facteur intrinsèque inefficace (112).
• • •1 o ••
1
f"
- 33 - '
7-6 Autres causes
L'acide para-aminosalicylique, la colchicine, l'alcool, la
néomycine influent sur l'absorption de la vitamine B12•
8- Mode d'action du déficit en vitamine B12 (35) (90)
Le déficit en vitamine B12
intervient par l'intermédiaire
d'un défaut en folates actifs qui réduit la synthèse de thymidilate.
Dans les cellules, la conversion de l'homocysteine en méthionine nécessite
l'intervention d'une part de la vitamine B12
(méthy1cobalamine) et d'autre
part d'acide folique (5 - méthyl - THF).
C'est d'après cette notion que HERBERT et ZALUSKY ont élaboré
l'hypothèse du ''méthyl folate - trap" ou piège métabolique.
Elle parait donner la meilleure explication du rôle d'un défi
cit en vitamine B12
dans la réduction de la synthèse du thymidylate.
Cette hypothèse établit que le déficit en vitamine B12
réduit
la méthylation de l'homocysteine en méthionine (fig. 9)
N5 méthyl l'HF THF
\ J
BJ CH3"1
J.Homocyste~ne
Fig. 9
lMéthionine
.0./0 ••
- 34 -
Durant cette conversion, est réalisée simultanément la conver
sion de 5 - méthyl - THF en THF. Le déficit en vitamine B12
va donc causer
une accumulation de 5 - méthyl THF aux dépens du THF. Les cellules vont
donc être privées de ce THF ainsi que du 5,10 - méthylène -THF dont nous
savons qU'il est indispensable pour la conversion du déoxyuridylate en
thymidilate.
Ceci explique que, lors d'une carence en vitamine B12
, le taux
des folates erythrocytaires (qui sont en partie des THF) soit abaissé,
alors que le taux des folates sériques (qui sont des 5 méthyl - THF)
est souvent élevé.
o 0
o
•••1•••
Chap. IV
- 35 -
Interrelations vitamine B12
- acide folique (32) (155)
Il Y a complémentarité d'action entre la vit. B12
, l'acide
folique et la pyridoxine (190).
Dans l'anémie de Biermer, le taux des folates sériques est
élevé, celui des globules rouges, bas et le FIGLU est augmenté.
D'autre part, l'anémie mégaloblastique par carence en Vitamine
B12
est corrigée par une dose infime de vit. B12
, forte d'acide folique;
l'anémi~ mégaloblastique par carence en acide folique est corrigée inver
sement par une dose infime d'acide folique, forte de vit. B12 •
En cas de carence en vit. B12
, qui permet la libération du
FIGLU, par transfert du groupement méthyl du 5 méthyl THF à l'homocysteine
avec formation de méthionine, les 5 méthyl THF s'accumulent, "pris au piège",
réduisant ainsi le pool de THF disponible, d'où carence de la synthèse de
l'ADN (68).
En effet, l'accumulation du méthyl THF provoque la diminution
de la teneur des tissus en THF, formyl THF et méthylène THF entrainant la
baisse de l'ADN (doù la mégalobastose) et des autres réactions où inter
viennent ces coenzymes foliques (fig. 10) (68).
Cette hypothèse a suivi les travaux de BUCHANAN, NORONHA et
SILVERMAN, HERBERT et ZALUSKY, JOHNS et BERTINO et plus récemment de
BLAKEY.
0 ••1.0.
Les folates
a limenta ires
~(_a_b.,..s.,...o_r_
p--:t_i_o_n ----,>7 l'HF ~
réduction ~((
Méthionine
Coenzyme contenant
vit.
Fig. 10 Relations entre les coenzymes foliques et la biosynthèse de la
méthionine (108)
En cas de carence folique, une diminution du taux de la vit. B1Z
majore la mégaloblastose ; dans des cultures de moëlle de malades carencés
en vit. B1Z
et ayant un taux normal ou augmenté d'acide folique, l'incorpo
ration du déoxyuridylate dans la thymine de l'ADN, qui est altérée, est
corrigée partiellement par la vit. B1Z
' complètement par de l'acide folique
( 187).
Mais, malgré toutes ces données en faveur de l~hypothèse d'une
prise au piège des méthyl THF dans le foie des mammifères, on n'a pas écarté
l'idée qu'il existe une réaction de méthylation de l'homocysteine indépendante
de la vit. B1Z
•
Ainsi FOSTER a fourni un début de preuve de son existence dans
le foie humain et WANG l'a mise en évidence dans le foie de rat (147).
par ailleurs, on a démontré que l'acide folinique est transformé
en 5 méthyl l'HF lors de son passage à travers la cellule intestinale et que,
•••1•••
- 37 - .
si on fait ingérer de l'acide folinique, qui est donc l'équivalent pour
du 5 méthyl THF, à un malade porteur d'une anémie de BIERMER, il se produit
rapidement une crise réticulocytaire. On en déduit qu'il existe un second
enzyme méthyltransférase, indépendant de la vitamine B12
, ce qui va contre
l'hypothèse de la"prise au piège" des 5 méthyl nIF (l9Ü.
Une conséquence de la relation vit. B12
et acide folique la
nécessité d'un diagnostic correct avant tout traitement.
En effet, dans l'anémie de BIERMER, le traitement par les folates
bien que satisfaisant sur le plallhématologique, est dangereux, car il peut
aggraver les lésions neurologiques.
La vitamine B12
a un raIe neurologique indépendant de sa fonc
tion dans l'hématoporèse.
o 0
o
•••1•••
o EUX lEM E PAR T l E
-=-=-=-==-=-==-=--==:-=-=-=-=-==-==-=-=-=-=
Etude des méthodes de dosage de l'acide folique et de la vitamine BiZ
"
Char. l Acide foligue
- 38 -
1- Prélèvements
1-1 sang total
Le sang est recueilli chez le sujet à je~n dans un tube sec
par ponction veineuse au niveau du pli du coude. Il est conservé soit
à 4°c, lyophilisé, soit à - 20°c. L'hémo1ysat est congelé après addition
d'acide ascorbique.
1-2 Urines
Elles sont collectées dans un récipient contenant 2 ml de
toluène et 8 ml d'acide acétique pendant une période variable selon la
méthode, après ingestion d'histidine.
1-3 Sérum
Le prélèvement se fait dans les mêmes conditions que le sang
total. Cependant, le sérum doit être exempt d'hémolyse car le taux d'acide
folique dans le sang est 20 à 30 fois supérieur à celui du sérum (200).
1-4 Fécès (cf 3-4)
2- Les méthodes directes
2-1 Méthodes chimiques (185), (154)
L'acide folique peut être dosé par voie chimique par différents
procédés
2-1-1 Réduction chimioue donnant une amine diazotable---------------~-------------------------------
- 39 -
L'acide folique est décomposé par réduction (sous l'action
du zinc et Hc1 0,5 N) avec formation d'une ptéridine et d'acide para
amino-benzorque (ou d'un de ses dérivés peptidi~ues). par diazotation de
ce dernier et copulation avec la N-naphty1-éthy1ène-diamine, il se forme
un composé succeptique d'être dosé par colorimétrie.
2-1-2 F1uorimétrie (5)
O~'dé par le permanganate de K, l'acide folique est converti
en acide 2-amino-4-hydroxyptéridine-6-carboxy1ique ,ui devient fluorescent
par irradiation avec une lumière de longueur d'onde de 365 micromètres.
2-1-3 ~~~~:~~:~e~~~ (à titre d'information).
Cependant ces méthodes chimiques n'ont pas donné de satisfac
tion lorsGu'on les a appliquées à des produits biologiques et quand il s'est
agi de déterminer de petites quantités d'acide folique (156).
2-2 Méthodes microbio1ogiques (158) (2) (150) (63) (192) (183) (28) (62)
2- 2-1
Si un microorganisme ne peut pas synthétiser une vitamine,
il présente alors un besoin absolu de ce facteur et sa croissance sera
proportionnelle, dans certaines limites, à la quantité de vitamine introduite
dans un milieu complet par ailleurs. Il faut donc se placer au-dess~us de la
dose de vitamine assurant le plein développement de la souche.
Le dosage est alors constitué par une courbe-étalon compre
nant des doses connues et croissantes de vitamine pure, et par des quantités
croissantes d'extrait qui forment une courbe expérimentale; ces doses sont
toutes ajoutées à un milieu complet sauf en la vitamine faisant l'objet du
dosage.
- 40 -
La mesure de la croissance permet d'évaluer la teneur en
vitamine de l'extrait.
CeS méthodes microbiologiques posent un certain nombre de
conditions très précises:
- une souche adéquate ;
- un milieu de base complet pour le micro-organisme,
seulement déficient en la vitamine à doser
- la mesure de la croissance microbiologique
- l'extraction de la vitamine, de manière à la
rendre utilisable par le micro-organisme.
2- 2-2 Germes ut i lisés
QUatre germes peuvent théoriquement être utilisés pour la
mesure de l'activité folate du sérum sanguin. Il s'agit de : Lactobacillus
casei, Streptococcus faecalis, Bacillus coagulans et Pediococcus cerevisiae.
Ils fournissent des réponses variables selon les dérivés de
l'acide folique utilisés.
• Lactobacillus casei ATCC 7469
Ce germe répond à l'acide folique, l'acide N10
formyl-folique, l'acide ptéroytriglutamique, l'acide folinique, des
polyglutamates et à l'acide NS
méthyl TIlF.
• Bacillus coagulans ATCC 12245
Ce germe est sujet a des mutations fréquentes qui
le rendent indépendant de l'acide folique.
• Streptococcus faecalis ATCC 8043
•••1•••
- 41 -
Ce germe répond à l'acide folique, l'acide N10formylptérorque et l'acide folinique.
Ce germe ne répond pas de façon aussi nette que
Lactobaci Uus casei aux po lyg lu tamates ; il ne répond pas au ma térie 1
acide folique du sérum, l'acide N5 méthyl THF est inactif.
Pediococcus cerevisiae
ATCC 8081i=
~Leuconostoc citrovorum)
Ce germe répond à l'acide folique, l'acide NIa
formyl THF, l'acide tétrahydrofolique.
2-2-3 : ~~~~~:~_~~:~~~~!~~:~_~~~~~~~~~~_~~~~_!~_~~~~~~.
2- 2-3-1 Inf luence de la vi tamine C
2-2-3-1-1
Les avis sont nuancés. Certains pensent que le sérum ne
subit pas de perte en activité folate s'il est stocké à - 20°c pendant
2 ans sans acide ascorbique (156).
Les experts de l'OMS constatent que dans le sérum frais
lyophilisé, l'acide folique reste stable pendant plus de 2 ans à 4°c et
pendant au moins deux mois à la température ambiante, si le matériel est
tenu à l'abri de la lumière.
Cependant pour des délais supérieurs à deux ans, il est
nécessaire d'ajouter 5 mg pour protéger l'activité folate.
2- 2-3-1- 2
.00/ •••
- ~2 -
Elle protège l'activité folate pendant l'autoclavage et
pendant l'incubation.
2-2-3-1-3
Si l'incubation est prolongée jusqu'à 60 H, la vit. C
n'a aucun rôle stimulant sur la croissance des germes, mais si elle est
de courte durée (20 H), un effet stimulant est noté.
2-2-3-2 Influence des médicaments
Le traitement donné aux malades les jours précédant le
prélèvement doit être examiné car il peut intervenir sur le dosage.
C'est ainsi que la croissance des germes est inhibée par
les antibiotiques notamment l'érythromycine, la tétracycline, la néomycine
et la penicilline (200).
Donc l'abst~ntjp~ à ces médicaticas doit être respectée,
encore que la température à l'autoclave réduise leur effet inhibiteur.
2- 2-3-3
Il est conseillé de faire le prélèvement à jeûn car la
nourriture augmente la teneur en folate du sérum de façon appréciable,
notamment les foies de poulet et de boeuf.
2- 2-3-4
Il a été constaté que les sérums de malades atteints de
steatorrhée idiopathique, de sprue tropicale, parfois de maladie hépatique
et dans certains cas de grossesse inhibent la croissance de L. casei.
2-2-4 Matériel et méthode: (158) (150) (182)---------------------------------------
•••1•••
La méthode type conseillée par l'OMS est celle qui utilise
Lactobacillus casei, car dit-elle: "la concordance intra et inter-labora
toires est bonne, mais la complexité de cette techni'lue exige un contrôle
permanent et l'uti lisation régu lière de préparations de référence".
2-2-4-1 Milieux de culture: (178)
• Milieu utilisé pour la conservation de la souche
Lactobacilli Agar A.O.A.C
• ~lilieu utilisé pour la préparation de l'inoculum
Lactobacilli Broth A.O.A.C
Préparation de l'inoculum :
La souche est conservée sur milieu solide. La veille du
dosage, le germe est repiqué en milieu liquide; après incubation d'une
nuit à 37 Qc, la suspension est centrifugée, lavée trois fois à l'aide de
solution physiologique puis remise en suspension dans la ml d'eau physio
logique; 0,1 ml de la suspension est am21,é il 10 ;<"...
, Milieu utilisé pour le dosage
~:ilieu de f,'J<.ER et co).1 ~ dl l'hydrolysat acide de caseine
est remplacé par un hydrolysat enzymatique.
Au mon"ent du besoin, on ajoL:te 140 mg de vitamine C pour
100 ml de mi lieu.
Préparation des solutions
Solution tampon
- Solution A
- Solution B
Na H2
Po4
, H2
0 :
Na 2 HPo 4' 12 H20
27,6 g/l ;
71,6 g/l.
Mélanger 212,5 ml de solution A et 37,5 ml de solution B
et diluer à 1 1 (pH 6,Ü.
•••1•••
- 44 -
Ajouter 330 mg d'acide ascorbique pour 100 ml (0,33 %).
Solution ~talon :
On pr~pare une solution d'acide folique de référence
on èffectue les dilutions nécessaires pour obtenir une solution renfermant
0,2 mcg/l ; à la dernière dilution pour 100 ml sont ajoutés 22,5 ml de solu
tion tampon renfermant l'acide ascorbique.
Echantillon à analyser:
Dans un tube à centrifuger on place 1 ml de sérum et
6,50 ml de solution tampon. Le tube est chauffé au B.M pendant 4 à 5 mn à
1000c puis on ajoute 22,5 ml d'eau bidistillée et on centrifuge. La solution
surnageante est utilisée pour l'essai.
2- 2-4- 2
• L'épreuve est effectuée dans des tubes à réaction par
faitement propres et stériles dont l'ouverture est bouchée par une bourre
d'ouate hydrofuge.
• Pour établir la courbe d'atalonnage, on répartit dans
des tubes des volumes de la solution étalon (à 0,2 mcg/l) : 0,5 ml, 1 ml,
2 ml, 4 ml on opère de même avec la solution de l'échantillon à analyser.
On utilise 3 tubes par concentration.
Dans tous les tubes, le volume est complété à 5 ml avec de
l'eau puis on ajoute 5 ml de milieu utilisé pour le dosage~ On joint à l'essai
2 tubes contenant seulement l'eau distillée et le milieu, ils servent de témoin.
• Les tubes sont passés 5 rnn à 120°, refroidis rapidement
et ensemencés au moyen d'une goutte de l'inoculurn préparé comme il est indi
qué ci-dessus.
- 45 -
Après agitation, les tubes sont placés au B. M. à 37°c
pendant une nuit puis la valeur des troubles est évaluée au néphélomètre.
Les courbes correspondant à l'étalon et à l'échantillon
sont dressées. Pour chaque échantillon analysé, l'activité relative de
celui-ci est calculée par rapport à l'étalon de référence.
Lorsque l'activité folate du sérum est plus faible ou plus
élevée que la valeur attendue, l'essai est recommencé, en effectuant la
précipitation sur une quantité plus élevée ou plus faible de sérum, de fa~on
à obtenir des lectures néphélométriques qui se situent dans la partie sensible
de la courbe.
Valeurs normales de la folémie (tableau VIII ) (140)
( )( AGE : CHIFFRES EXTREMES: MOYENNE : NBRE D'ESSAÜ
~--------------------:----------------------:------------------:-------------)
~ Nouveau - né • 14 21 ng/ 1 17,9 ng/ 1 28 ~~ 6 mois - 18 mois 6 14 ng/ 1 8,7 ng/l 44 ~~ 18 mois - 3 ans 6 20 ng/l 8,8 ng/l 46 ~( 3 ans - 15 ans 6 12 ng/ 1 8 5 1 )( , ng/ 37)
( Adultes 6 22 ng/ 1 4 )( 1 • 2 ng/ 1 45)
( )( :. )
( ))
Tab leau VIII
•••1•••
- 46 - .
Une concentration trop é1évée en vit C ainsi que une
température trop élevée à l'aut~~lavQge
proteines.
empêche la précipitation des
L'acide folique étant trop thermolabile, il est préférable
de choisir la température la plus basse possible.
2-3 Méthode radioimmuno1ogique : (32) (64) (102) (3)
Kit (1251) Fo1ate Ra('Uoassay.
(Référence du Kit : Gat CA 251 - c1inica1 Assays division
des laboratoires Traveno1).
2-3-1
Il est basé sur la compétition de liaisons avec une proteine,
des fo1ates plasmatiques libérées et des fo1ates marqués avec 1 125 •
L'échantillon subit en premier un chauffage à 1000 c qui dé
nature les proteines liant les fo1ates.
Puis les fo1ates libres et les fo1ates marqués se lient
compétitivement à une proteine extraite du lait de bovins.
Une série de N. méthy1tétrahydrofo1ate standard allant de
0,8 à 30 ng/m1 est également incubée en présence de fo1ates marqués, pour
établir une courbe étalon.
La fraction radio-active et non radio-active non liée par
la protéine du lait est absorbée par du charbon et séparée par centrifuga
tion et décantation.
La radio-activité contenue dans la protéine du lait est
déterminée par un compteur gamma en C. P. N (coup par minute). Les résultats
sont reportés sur un graphique semi-1ogarithmique sur lequel on trace la
courbe, et la quantité de fo1ate en mcg/1 des échanti11ons.est déterminée
à l'aide de cette courbe.
..0/ •••
2-3-2
- 47 - .
Réactifs
A (1 125j ptéroylglutamic acid tracer
Chaque flacon du Kit contient 2 microcuries dans un
tampon basique.
B Milk Folate Binding protein (lyophilisé)
tituer avec 5 ml d'eau bidistillée.
la recons-
C N- méthyltétrahydrofolic acid Blank (lyophi Usé) •
D N- méthyltétrahydrofolic acid Standard (lyophilisé)
contient 0,01 M d'acide ascorbique) reconstitué avec
0,5 ml d'eau bidistillée, conserver la solution à
-700 c
E Lysine Buffer concentrate (10 X), dilué à 100 avec
H20. Se conserve 2 moi s •
F P.B.S concentrate (10 X) dilué à 100 avec H2
0 ajusté
au pH 7,0 - 7,2 (chauffer si cristaux).
G Acide ascorbique en comprimés.
H Dextran Coated Charca l tab lets.
Tous ces réactifs contiennent 0,2 M d'azide de Na comme conser
vateur et seront conservés entre 2 et Bac.
2-3-3
Le dosage se fait sur du sérum non hémolysé.
Ajouter une tablette de vit. C pour 2 ml de sérum
(au moment du dosage ou avant la congélation après le prélèvement).
.../ ...
ajustage pH
2-3-4
2-3-5
- 48 -
~c:!t:~e~~~~
- Tubes en polypropy lène (12 x 57 mm) bouché,
- Pipettes de précision 500, 100, 50 microlitres,
- Centrifuge~se refrigérée,
- Bain-Marie 100°c et 37°c "± 2,
- Compteur à gamma,
- Hcl 0,1 N
- Nao H 0,1 N
- Amener les réactifs à la température de la pièce,
- ~~rquer les tubes polypropylène en do~ble,
- Décongeler les sérums, ajouter 1 comprimé de vit. C
par 2 ml,
- Préparer les standards s'il y a lieu (sauf blanc),
- Prise d'essai: 100 microl. x 2 des standards et des
échanti lIons,
- Tampon de travail (Lysine)
• à préparer chaçue jour juste avant le dosage,
• ajouter au tampon lysine (mère), une tablette
pour 5 ml soit 6 tablettes pour 30 ml pour des
séries de 50 tubes. Ajuster le pH entre 10,3
et 10,7 avec NaoH 0,1 N et éventuellement
Hcl 0,1 N.
• ajouter 500 mcl de ce tampon de travail, placer
les bouchons surIes tubes de manière à ce qu'ils,
ne soient pas hermétiquement fermés
• mettre 15 mn à 10°c,
• refroidir à la température de la pièce 20 à 25°c
durant 5 mn,
• ajouter 500 mcl de tampon PBS, bien mélanger le
po; toir ou chaque tube,
•••1•••
- 49 - .
• mettre des gants à partir d~ moment où on doit
ajouter: 50 mcl ( 121) ptéroylglutamic acid tracer,
• ajouter aussit6t 50 mcl de '~ilk folate binding
protein" mélanger doucement,
• incuber à 37°c pendant 30 mn,
• sortir du bain-marie et ajouter 1 "Dextran coated char
col tablet" attendre qu'elle soit en suspension,
• vortexer en tenant le tube en bas, afin que le charbon
ne se dépose pas en haut du tube,
• incuber pendant 5 mn à la température de la pièce après
addition du "charbon" au dernier t~be,
• centrifuger 15 mn à 3 OCO t/mn entre 2 et Soc,
• décanter le surnageant "très doucement" afin que les
particules de charbon entrainées par le surnageant ne
se déposent sur les parois du tube verseur et ne par
viennent pas au tube récepteur, car elles contiennent
du matériel radio-actif,
• compter au compteur gamma (Institut pasteur DAKAR),
• tracer la courbe sur le papier semi-Iogarithmique
fourni et déterminer les résultats à l'aide de cette
courbe (graphique I)
Taux normaux: 3 - 15 ng/ml
Déficit en folate taux inférieur à 3 ng/ml.
- "Ce dosage doit être fait à l'abri de la lumière".
- Tous les·rés idus sont amenés à l' Ins ti tu t Pa s teur. Les so lides
sont emballés dans des feuilles d'aluminium sur lesquelles on
.0.1 •••
- 50 -
125 .inscrit la date et ( 1). Ils sont stockés dans une pou-
belle en plomb.
- Les résidus liquides sont conditionnés dans une bouteille
en verre et stockés dans une pièce spéciale.
- QUand ces résidus ne sont plus radio-actifs (la semaines),
ils sont jetés comme d'autres déchets.
- Il est recommandé d'être prudent que le matériel peut trans
mettre l'hépatite virale.
.0./0.0
_ _-_._--._ __....-- .....-i~. ~
2 3 45671.1 2 3 4 5 6 71.1 2 3 4 5
"1:p: :Z:: :::: :::=:r··:~'t ....t.... , .• m;hi;lf~:r =u" ......_ +.,-'-
. , -+" - 1--;-""" TYPICAL STANDARD CURVE 2:... h-.,- -i (Do nol use 10 calculale unknowns) +.=
, ".,H- -i, ;; ~. ' S:~§::::L~ ,lttM~~
- 51 -'
5.000
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'.:';": .~-I=. ,.;:':;--
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FOUTE CONCENTRATION ng/ml
GRAPHIQUE l
_ 52 -
2-4 Test de clairance (161)
Cette méthode consiste à administrer une petite dose
d'acide folique par voie IV (15 mcg/kg de poids) et de mesurer les taux
d'acide folique sérique 3,15 mn et 30 mn après l'injection.
Normalement, les taux d'acide folique sérique, mesurés
par les méthodes microbiologiques utilisant le streptoc~ccus faecalis sont
comprises entre 75 et 186 mcg/l à 3 mn, entre 21 et 80 mcg/l à 15 mn et entre
4 et 49 mcg/l à 30 mn.
Interprétation:
Lorsque les réseryes en acide folique sont déprimées,
l'élimination est rapide. Lorsque l'acide folique est en abondance, il
disparait lentement du plasma. Ce test est quelque fois influencé par d'au
tres causes que celles de déficience en acide folique et notamment par un
déficit primaire en vitamine B12
•
Lorsque les demandes en folates sont exagérées COfmile
dans la grossesse, l'hypertr.yroïdie, la myélofibrose chronique, l'anémie
hémolytique et les leucémies, une clairance rapide en acide folique repré
sente une utilisation allgmentée d'acide folique.
3- Méthodes indirectes
Il consiste à faire ingérer une dose standard de L
Histidine, très variable selon les auteurs (de 2 à 20 g)."On recueille
les urines après, et pendant un temps différent selon la méthode (5 à 24 h)
et l'on dose la quantité de FIGLU présente (fig. 11).
Histidine ------~)Acide uroca ni que ~) Acide f ormiminog lu tamiquel1
• (Acide nIF
; Acide Formimino1
~Acide glutamique
Fig. 11
nIF
• 0.1 •• 0
- 53 -
La carence en acide folique entraine un blocage de la
transformation de l'histidine en acide glutamique aVec élimination uri
naire de FIGLU (155).
Le taux de FIGLU dans l'urine est déterminé par diverses
mê~hodes parmi lesquelles
3-1-1 Electrophorèse à haut voltage (32)
3-1-1-1 Méthode
25 mcl d'urine sont imbibés sur papier filtre (WHATMAN N°
3 M) et électrophorisés à 60 kv et 60 à 80 ampères, pendant 20 mn dans les
conditions suivantes
- le tampon est un acétate de pyridine à pH 4,
- on ajoute une quantité connue de FIGLU Standard.
Après séparation, les taches de FIGLU sont repérées de
deux manières
le papier est plongé dans un réactif au Nitroprus
siate de ferricyanide ce qui donne une réaction
orangée aVec le FIGLU.
- un papier par échantillon est e}~osé à une vapeur
ammoniaquée concentrée, ce qui convertit le FIGLU
en acide glutamique.
Les bandes de papier sont ensuite asséchées à 1100 pen
dant 10 mn, puis plongées dans l'acétone et l'acide acétique, pour neu
traliser l'excès d'ammoniaque, enfin de nouveau asséchées à 1100 pendant
30 secondes. Ensuite, les papiers ammoniaqués et non ammoniaqués sont
soumis à la ninhydrine avec sufate de nickel. 24 h après, une tache apparait
sur"le papier traité à l'ammoniac et qui correspond au composé standard de
FIGLU. Il n'y a pas de tàche sur le papier soumis à la ninhydrine seule.
Il suffit ensuite de comparer les papiers
•••1•••
- 54
- tache de FIGLU obtenue après électrophorèse, d'une
urine contenant une quantité de FIGLU connue.
- tache de FIGLU obtenue après électrophorèse, d'une
urine contenant une quantité de FIGLù inconnue et,
dans les 8 h après l'ingestion de 15 g d'histidine.
L'intensité de la tache colorimétrique est mesurée à l'aide
d'un spectrophotomètre.
3-1-1-2 : Résultats
Cette méthode permet de mesurer une quantité de FIGLU de
la mg/le sans surcharge d'histidine et même en cas de déficit en acide
folique, on ne retrouve pas de FIGLU dans les urines ou très peu. Normale
ment, après surcharge de 15 g d'histidine une personne excrète entre la
et 30 mg/l d'urine. S'il existe un déficit en acide folique, l'excrétion
de FIGLU, dépasse 1 000 mg/24 heures.
3-1-2 Méthodes enzymatigues (32)
3-1-2-1 : ~~~~~~~
Une portion de l'échantillon à doser est traitée pour faire
disparaître les substances interférentes et, ensuite soumise à l'hydrolyse
alcaline afin de transformer le FIGLU en acide glutamique. Ce dernier est
ajouté à une solution contenant de l'acide glutamique déshydrogénase et un
excès de dinitrophényl (DNP). La réaction se lit comme suit:
Acide glutamique + DNP + H20 ~< ~) alpha cétoglutarate + DNPH + NH4
Le taux de DNPH, provenant de l'équilibre est déterminé
spectrophotométriquement, et par comparaison avec une courbe de référence,
on détermine la concentration en acide glutamique. Une autre portion est
traitée mais non hydrolysée. La différence entre les deux taux d'acide
glutamique est égale à la concentration en FIGLU.
•••1•••
3-1-2-2 Matériel
- 55
3-1-2-2-1
NaoH 3 et 6 moles
Nacl 0,3 mole
Hydroxylaminométhane 0,5 mole pH : 8,1
Na2
HPo4
0,2 mole à pH : 7,6 et 8,0.
3-1-2-2-2
filtré
Charbon activé (Norite)---------------------- est
1 litre de Hc1 à 10 %Jljouté à 200 g de charbon.
Le mélange est porté à l'ébullition, refroidi, puis
le charbon est lavé aVec de l'eau, filtré puis séché à 105°c.
3-1-2-2-3 DNP
solution de DNP à (4 g/l) aVec hydroxyméthylamino
méthane 0,5 N à pH 8, 1.
Cette enzyme est obtenue par dissolution dans le
glycérol. Une solution de réserve est préparée. On dilue l'enzyme à une
concentration de 30 mg par 100 ml dans du Na2
HP0 4 0,2 mole à pH 7,6.
La solution reste stable au moins 6 mois, si elle est
emmagasinée à 4°c.
3-1-2-2-5
3-1-2-2-6
Substance standard.
FIGLU
Substance standard obtenue à partir d'une substance
cristallisée vendue dans le commerce, contenant 50 % de FIGLU et 10 % d'acide
glutamique (on les sépare par chromatographie).
.../ ...
- 56 -
3-1-2-3-1 :
L'urine humaine collectéedans un récipient contenant
2 ml de toluène et 8 ml d'acide acétique comprend une quantité d'urine
recueillie dans une période de 8 H après ingestion de 15 g d'histidine.
3-1-2-3-2
5 ml d'urine sont ajoutés à un tube test, contenant
0,1 ml de tampon phosphate (pH = 8) et 6 ml d'eau. De grands volumes d'urine
peuvent être utilisés mais la quantité d'eau ajoutée sera réduite. On main
tient le volume à 11,1 ml.
On plonge ces échantillons dans l'eau glacée. On ajoute
au mélange quelques gouttes de la solution sodique à 6 moles pour amener
le pH à 7. S'il Y a floculation, on centrifuge. On passe ensuite l'échantillon
sur colonne PERMUTIT, pour chasser les ions ammonium. On jette les 3 premiers
millilitres de l'effluent. Le reste est collecté, divisé en deux portions de
3 ml. On a j oute 1 ml de Nac l 0,3 mo le et 150 mg de charbon à la premi ère
portion. La suspension est secouée vigoureusement, centrifugée et le sur
nageant décanté pour le dosage de l'acide glutamique. (On ajoute du charbon,
afin d'enlever les particules absorbant à 340 micromètres, longueur à laquelle
on mesure l'absorption du DPNH, et afin de chasser les substances non spécifi
ques, produisant l'oxygénation du DPNH).
Les portions d'effluent de 3 ml sont portées à pH : 12
avec addition de 0,15 ml de NaoH 0,3 mole.
Le mélange est alors incubé à 37°c pendant 30 mn o Dans
ces conditions, la conversion du FIGLU en acide glutamique est complète. Après
l'hydrolyse, on ajoute 0,15 ml de Hc1 3 mo1~ On mélange, on ajoute 1 ml de
PERMUTIT sec et on agite la suspension pendant 2 mn afin de chasser le gaz
ammoniac. Le tube est centrifugé et le surnageant décanté dans un tube con
tenant 150 mg de charbon de bois. Le surnageant sert au dosage de l'acide
glutamique.
• ••1•••
- 57
3-1-2-4
3-1- 2-4-1
en fait une dilution du DNP avec l'hydroxyméthyla
mi-nométhane dans un volume égal de Na2
HP0 4 032~ ~ pH : 7,6. On ajoute
0,5 ml de cette solution à 0,5 ml de solution test (solution d'acide gluta
mique déshydrogénase). Tous les tubes sont incubés dans un bassin à. 37°c.
L'équilibre s'obtient en 15 mn.
3-1-2-4-2
La densité optique est déterminée 15 et 30 mn après
le début de la réaction. La lecture se fait à 340 micromètres dans un spectro
photomètre de BECHERM~~.
Ces courbes (graphique II) établies par solution stan
dard doivent être contrôlées de temps en temps. On lit la concentration en
acide glutamique à l'aide de la courbe de référence. La concentration en
FIGLU est déterminée en soustrayant la concentration finale et initiale d'acide
glutamique. On calcule le poids d'acide glutamique et de FIGLU en mg comme
sui t :Volume d'urine
- Acide glutamique (m. M) x 2,96 x
1 000
x 147
PM = 147
- FIGLU en (m. M) x 3,26 x
PM = 174
Volume d'urine
1 000x 174
3-1-2-5 Résultats
Par cette méthode, on décèle une concentration en
FIGLU de 0,005 m M. Après surcharge en Histidine chez les sujets normaux,
la concentration en FIGLU est 1,1 à 7,3 mg.
3-1-3
3-1-3-1 Matériel
• ••1• ••
1·
COIf)
densi té. optique
"",1
0,4
0,3
0,2
0,11 .
/10 20
f~
30 40 - Contenu en GA (m. M)
Graph.i.que IIDosage de l'acide glutamique
- 59 -
3-1-3-1-1
On emploie un extrait de fOie, contenant une prépara
tion enzymatique pour réduire l'acide folique à une forme active et d'autre
part pour transférer le groupement formimino du FIGLU à cette forme active
d'acide folique. Le produit de la réaction finale est converti en acide
5 - 10 méthényl THF avec de l'HeL et lu spectrophotométriquement.
3-1-3-1-2 Eau
L'eau utilisée passe à travers une résine échangeuse
d'ions.
3-1-3-1-3 Solution de substrat
KH2
p04
20 m. moles
Acide citrique 2 m. moles
Hg S04' 7 H20 2 m. moles
Trinitrophéno l (TNP)
Acide folique (0.024 g).
Le phosphate monopotassique et l'acide citrique sont
dissous et le pH ajusté à 6 aVec de la potasse. L'acide folique, le TNP et
le Mg S04 sont ajoutés et le volume amené à 100 ml. On stocke la solution
à - 20°c.
3-1-3-1-4
Toutes ces opérations sont faites à" 2 - 4°c. Le foie
de Poulet gelé est découpé en tranches de 2 mm, mis dans 1,3 volume de phos
phate de potassium à PH 6 et homogénéisé pendant 15 secondes. Le résidu
d!homogeinisation est centrifugé pendant 10 mn et le surnageant dialysé. On
ajuste le pH à 6 et on centrifuge le résidu insoluble. L'extrait est conservé
à - 20°c.
3-1-3-1-5
0,5 mole/l à pH 6.
Solution standard
On prépare des solutions standard de FIGLU contenant
• ••1•••
3-1-3-1-6 Echantillons d'urine
- 60 -
L'urine est collectée directement dans des récipients
en polythène contenant 5 ml de Nacl.
3-1-3-2 Méthode
Une partie de l'extrait de foie est mélangée à deux
parts de solution de substrat : 3 ml de la solution sont distribuées dans
des tubes de verre de 12 x 125 mm et incubés à 37°c pendant 2 heures~ L'urine
à tester est ajoutée à chaque tube. Le montant d'acide formiminoglutamique
ne doit pas excéder 0,2 mole) le volume urinaire~âllant;da. 0,01 à 0,4 ml.
On ajoute de l'eau distillée pour faire un volume de 3,4 ml, le tube étant
retourné 3 fois et incubé pendant u~lus de deux heures. A la fin de cette
phase, 1,5 ml de HCL 3N est ajouté à chaque tube et mélangé. Le mélange est
filtré et le filtrat clair est lu dans un spectrophotomètre à 350 micromètres.
Les tubes à tester et les contrôles sont traités de la même manière.
3-1-3-3 Résultats
Les sujets normaux excrétent moins de 17 mg de FIGLU
après dose orale d'histidine.
Interprétation du test à l'histidine (32)
Ce test n'est pas spécifique car le FIGLU est métabolisé
dans le foie, et lors de désordres hépatiques on peut trouver un taux de ?IGLU
urinaire élevé, bien qu'il n'y ait pas de déficit en acide folique. D'autre
part, lors des anémies mégaloblastiques de la grossesse, le test au FIGLU n'est
pas un bon test car il est souvent négatif. La raison de cette négativité n'est
pas bien claire. On a pensé qU'il s'agirait d'une perte en histidine pendant
la grossesse en raison d'un seuil rénal abaissé et d'une utilisation de
l'histidine pour la synthèse proteique. Mais à l'opposé, dans les anémies
induites par les antifoliques, on retrouve un taux de FIGLU dans les urines
élevé et quelquefois l'excrétion urinaire élevée précède l'anémie.
•••1•••
- 61 -
3-2 Dosage de la lactico-deshydrogénase sérique (155)
La LDH est augmentée dans les ar.émies mégaloblastiques
du fait de l'hémolyse intramédullaire. Cette augmentation est peu spécifique
et ne permet pas de distinguer une carence en acide folique d'one carence
en vitamine B12
•
3-3 Test thérapeutique (155)
On donne des doses physiologiques d'acide folique
(50 à 100microgfj) en suivant le réticulocytose. Ce test aide à distinguer
une carence en acide folique d'une carence en vitamine B12
•
3-4 Test de traversée digestive (excrétion urinaire et fécale de la
radioactivité après dose orale d'acide folique tritié (32).
3-4-1 Matériel
On utilise de l'acide folique marqué au tritium dont
l'activité spécifique est de 100 microcuries par mg. On sépare la molécule
d'acide folique en position C9
N10
par chromatographie sur colonne: 50 %
de la radioactivité est fixée sur l'acide ptéroylglutamique et le restant
dans la portion ptéridine.
3-4-2
On donne des doses de 20 micorcuries. L'acide folique
tritié est suspendu dans l'eau distillée et dissous dans qûelques gouttes
de NaoH 0,1 N. On ajoute de l'acide folique non radioactif et de l'eau dis
ti llée 0
3-4-3 Dosage radioactif dans l'urine
Les échantillons sont testés par scintillation liqui
dienne à - 10°c dans un courant refrigéré. Le liquide à scintillation est
.. un mélange de diphényl oxazole et de benzène dissous dans un mélange de volumes
égaux de toluène et d'éthanol. Le compteur a une efficacité de 15 % pour le
tritium avec 8 comptes à la seconde.
• ••1•••
- 62 - .
3-4-4
Les échantillons sont chauffés avec de l'acide nitri
que et perchlorique pour oxydation.
3-4-5 Procédé
On donne une dose orale ou intraveineuse de 40 mcg/kg
de poids d'acide folique tritié. On collecte les urines de 24 H. On emma
gasine l'urine pour chromatographie à - 20°c. Les fécès sont gardés pendant
4 jours après administration de la dose orale d'acide folique tritié.
3-4-6 Résultats
Des pics de concentration sérique se placent dans la
première ou deuxième heure apr~s l'ingestion de la dose orale et excèdent
40ngjl chez les sujets ne souffrant pas de malabsorption. Les témoins excrè
tent plus de 28 % de la dose orale dans leurs urines, les sujets carencés
en acide folique moins de 20 %. Cette méthode est très peu utilisée et cri
tiquable (155).
4- Conclusions sur les méthodes de dosage de l'acide foligue.
D'après Marchetti (128), (36) la déficience en folate
peut être établie chez l'homme en mesurant l'activité du folate sérique, soit
par une méthode microbiologique aVec Lactobacillus casei, soit par radio
isotopie. Le dosage microbiologique est long et ennuyeux par rapport au do
sage radioimmunologique ; néanmoins il permet d'obtenir une détermination
précise de chaque dérivé d'acide folique présent dans le sérum. Une compa
raison des taux obtenus par les deux méthodes montre une adéquate correlation.
Cependant les résultats d'échantillons individuels montrent que les valeurs
obtenues par la radio-isotopie sont inférieures de 10 - 30 % que celles
obtenues par le dosage microbiologique. Les résultats bas du test radio
isotopique peuvent être dus à la présence dans le sérum d'un taux élevé de
protéines transporteuses endogènes insaturées et/ou par la différence
d'affinité des lactoglobulines, proteines transporteuses utilisées dans le
test, pour l'acide folique (saturé) et le 5 méthyl THF ou le 10 formyl THF •
•• 0/ •••
- 63 -
Comme nous l'avons vu, plusieurs méthodes sont utilisées
pour le dosage de l'acide folique. Certaines sont des méthodes de pointe
(dosage radi~mmunologique), nécessitant l'utilisation de produits ra
dioactifs (donc dangereux) et un équipement extrêmement sophistiqué et
cher (compteur gamma), d'autres n'ont pas donné les résultats escomptés
et sont même dépassées (méthodes chimiques).
A l'heure actuelle, les méthodes microbiologiques sont
les plus utilisées et paraissent donner les meilleurs résultats surtout
avec Lactobacillus casei. Selon l'OMS (124) la concordance intra-et inter
laboratoire est bonne. Cette méthode semble donc toute indiquée comme
méthode type surtout pour les pays en voie de développement, d'ailleurs
c'est elle qui est adoptée par l'O.R.A.N.A.
o 0
o
.../ ...
- 64 -
Chap. rr : Vitamine B12
1- Prélèvement
1-1 Sérum
On pratique chez un sujet à jeûn une ponction veineuse
au niveau du pli du coude. Le sang est recueilli dans un tube sec. Les do
sages sont faits sur le sérum après rétraction du caillot.
1-2 Urines
Les urines de 24 heures sont recueillies et complétées
à 2 litres avec de l'eau.
1-3 Fécès
rls sont recueillis pendant une durée variable, suivant
l'individu, de 3 à 7 jours. Ensuite, il faut les homogéneiser, les déssécher,
puis les réduire en cendres. Ces résidus sont soumis au comptage.
2- Les méthodes directes
2-1 Méthodes chimiques
- Elles ne sont pas rigoureusement spécifiques car elles
sont basées soit sur l'estimation du 5,6 - diméthylbenzimidazole libéré par
hydrolyse acide de la vit. B12
, soit sur la mesure du cyanure libéré par pho
tolyse (157).
- La polarographie est aussi utilisée en solution pure
après avoir séparer les divers constituants par diffusion à contre-courant,
par chromatographie sur colonne ou échangeuse d'ions (179).
2-2 : Méthodes microbiologiques
•••1• ••
2-2-2-1 Bactéries
- 65 -
Eschérichia coli répond aux Cobalamines, Cobamides,
pseudo-vitamine B12
- Lactobacillus leichmanii répond aux Cobalamine~, pseudo
vitamine B12
(29)_
2- 2-2-2 Protozoaires
Englena gracilis répond aux Cobalamines et pseudo
vitamine B12
- Ochromonas malhamensis répond aux Cobalamines seulement (29).
Nous avons choisi de décrire pour chaque groupe de
micro-organismes, la méthode la plus utilisée.
2-2-3 Méthode utilisant Englena gracilis (2)
2- 2-3-1
2- 2-3-1-1 La stabi lité
2-2-3-1-1-1
La combinaison de l'o~ygène et de la lumière est
très néfaste pour la vit. B12
• La cyanocabalamine se photolyse en hydro
xycobalamine qui elle-même est très sensible à l'oxygène. On aboutit ainsi
à des pertes considérables de vit. B12
- Une solution abandonnée une semaine
à la lumière solaire diffuse ne présente pas d'altérations dues à la photolyse,
cependant après un trimestre 87 % de la vitamine sont détruits.
2-2-3-1-1-2 : Influence du PH.
Les solutions de vit. B12
sont réputées stables à
froid à des pH compris entre 3,5 et 7,0, et plus particulièrement entre 4,0
et 4,2. Entre pH 4,0 et 7,0, les pertes sont de l'ordre de 10 % en auto
clavage pendant 30 mn à 115° d'une solution pure de vit. B12
• A pH 10,0, un
chauffage entraine une destruction totale par suite d'oxydation_
• ••1• ••
- 66 ...
2-2-3-1-1-3 : Influence des vitamines
La thiamine et l'amide nicotinique exercent une action
néfaste sur la stabilité de la vit. B12
•
Thiamine et Nicotinamide
mg/ml
% de perte après---~....~--==""""--=...."".=~--
r;_~_~_~99~~ ~_i_~_~~~~ ~~_I_~_~~~~
1
5
10
45,5
95,0
98,0
ooo
27,5
34,5
44,5
2-2-3-1-1-4 : Infl uence des minéraux
Le cuivre est très nuisible pour la stabilité de la cya
nocabalamine, soit seul, soit en association avec l'acide ascorbique. C'est
ainsi qu'à pH 2,5, une solution de 20 microgrammes/ml de B12
contenant 10 ppm
de cuivre accuse des pertes importantes.
De plus le cuivre exerce une action catalysante sur la
destruction de la vit. B12
par la vit. C.
Certains éléments (Co, Mg) sembleraient protéger la vit.
B12
en présence de vit C, d'autres (Mo, F, Mn) entraineraient une destruc
tion partielle de la vitamine.
2-2-3-1-1-5 : Influence des substances réductrices
Les réducteurs organiques sont à la fois nuisibles et
favorables; à hautes doses, ils détruisent la cyanocabalamine, tandis
qu'avec des taux plus faibles et en présence du milieu de base ils peuvent
exercer une action protectrice.
La vit. C, l'acide thioglycollique provoquent une destru
tion ou une hydrogénation de la vit. B12
, ce phénomène ne se produisant
pas en présence du milieu de base.
La vit. B12
traitée avec l'hydrosulfite est inactivée,
la destruction peut être totale si le réducteur est introduit à fortes doses.
Ainsi on observe deux faits suivants:
•••1•••
- 67 -
- sur le plan purement chimique, les réducteurs
détruisent la vit. B12
,
- sur le plan biologique, les réducteurs introduits
à un certain taux dans le milieu de base suppri
ment le besoin des lactobacillus en cyanocobala
mine. Au contraire l'oxydation augmente considé
rablement le besoin des lactobacillus en vit. B12
•
2-2-3-1-1-6 : Influence des médicaments
L'auréomycine agit sur le développement de Englena gracilis,
tant sur son taux de multiplication que son métabolisme. En effet les cultures
développées sur un milieu renfermant l'antibiotique Se révèlent plus ou moins
totalement dépourvues de pigments chlorophylliens, ce qui confère aux cellules
un aspect allant du blanoh~tre au brunâtre.
2-2-3-2
Englena gracilis est une algue flagellée qui exige de la
vit. B12
pour son développement. C'est pourquoi, elle a été utilisée pour
doser la cyanocabalamine.
En pratique, E. gracilis variété bacillaris est la souche
la plus utilisée mais il en existe d'autres telles que la souche "Z", la
souche "T" employées par certains auteurs.
Les souches sont conservées en milieu liquide, milieu de
base (tableau IX plus vitamine B 2' dans des erlens contenant par exemple,_ 125 ml de milieu et 15 pg de vitamine. L'incubation se prolonge pendant un
minbnum de 3 à 5 j à une température comprise entre 28°c et 31°c, une
température plus élevée présente un effet inhibiteur.
Les cultures doivent être éclairées, pendant leur dévelop
pement ; on peut les illuminer par des tubes fluorescents "lumière du jour"
ou de lumière blanche placées à 30 cm au-dessus des bouillons.
2-2-3-2-1 : Milieu de base (tableau IX)_______________________""Cr. ._
Un pH de 3,6 donne un développement intense de l'algue •
•00/ •••
'l'ab leau IX Source (2)
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- 68 -
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Sull';,le Jouble Je F(' cl .\Jl i (Ill;:: .
S".'lI'~le <le ~(' "y "r"l~ \Ill~! •...•..•.. '1.\Ilrale de Co hY'dr:olc ',Illg .•.•••••...•
Chlorure <lr (.Il Il\Iln,l': ,Ill:;,' ..•••••••
SuIE,II' .rI' Z" l'y,lralé .Ill;:.......•.....Chlorur., <le l" "Y',lmlé (Illg; ••••••••••
Sul raie dc Cu 11\'11""10: 1Il~: ., .Acidc 1"'Tiquc •............••••...••:\loly'I"lale de ;\/1. (III;:)..• ; .••••••••••.\,~i(lc molyhliquc à S;. ('. Illn (m;:) ....P:.r"mol~'I,J.. lc Il~ .\/11(III;;; ....•••••••'11:1:'l'al\~(I~lc d.l :'\II~ (III;:~ ...••• , ••..•
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Il,:!
Il,11\1
- 69 -
Le dosage se fait dans des tubes. On utilise généralement
un volume de 4 ml. La courbe éta lon va généra 1ement de 0, 001 à 0,1 pg par
tube. La grande sensibilité de cette méthode a eu pour conséquence que E.
graci1is est souvent utilisée dans le cas de dosage de la vit. B12
dans
le sang. La stérilisation des milieux se fait à des te~pératures plus basses
qu'nabitue11ement 100 à 105°c à l'autoc1avage.
Les premières méthodes utilisaient un ensemencement aVec
une culture stock à raison de 1 ml pour 100 ml de milieu final. Par la
suite, le mode d'ensemencement a fait l'objet de recherches qui ont mis,
en évidence que la croissance de la souche est -plus élevée si l'inocu1um
est dilué et qu'elle est encore plus forte si l'inocu1um a été lavé.
Sur le plan pratique, il existe peu de différence entre
un ensemencement avec une culture lavée et une culture diluée.
Un facteur se combinant aVec la vit. B12
a été décelé dans
le liquide des cultures. Il rend la vit. B12
inutilisable pour E. graci1is.
Ce facteur serait un produit d'excrétion d~ micro-organisme et son taux est
proportionnel aVec l'âge de la culture.
C'est ainsi qU'il est recommandé de Se servir d'un inocu1um
jeune. L'incubation des cultures peut se faire entre 25° et 31°c sous éclai
rage fluorescent blanc ou "lumière du jour" et se poursuit pendant 6 à la
jours habituellement.
Avec le milieu de Ross (tableau IX ) le développement de
la culture est maximum en 8 jours pour les doses faibles, tandis que pour
des quantités plus fortes de vitamine, la croissance Se poursuit pendant la
à 12 jours. La mesure de la croissance de l'algue peut se faire de différentes
manières :
•••1•••
- 70 -
- la turbidité des cultures peut être mesurée à l'aide
d'un néphé10mètre (filtre rouge),
- il est possible de pratiquer la numération des cellules
en employant un hémacytomètre ou une cellule à numération. Cependant il est
difficile d'obtenir une bonne homogénéisation de la culture au niveau de la
numération. Par ailleurs toutes les techniques de numération demandent
beaucoup de temps, ainsi il est délicat de prôner une telle lecture dans
le cas d'analyses en séries.
- l'algue renfermant des pigments caroténofdes et de
la chlorophylle, on peut mesurer indirectement le développement des cultures
en dosant co1orimètriquement ces pigments extraits par l'alcool absolu, le
méthanol ou l'acétone. Après centrifugation et lavage des cellules, elles
sont mises en suspension dans 8 ml de solvant pendant 30 mn et l'intensité
de la coloration est lue après une nouvelle centrifugation.
Il existe une bonne concordance entre la mesure de ces
pigments et le comptage des cellules. Cependant la proportionnalité entre le
taux de vit. B12
du milieu et la chlorophylle formée n'est rigoureuse que
si le milieu de base est exclusivement minéral.
Il est évident que cette technique ne peut être utilisée
dans le cas où les algues ont été cultivées à l'obscurité ou en présence de
streptomycine, ce qui provoque une absence de pigmentation.
Il faut alors employer d'autres méthodes de mesure
soit prendre le pH à l'aide d'une électrode, soit doser le N ou le P de la
culture formée.
La thymidine et les désoxyrib~ides sont inactifs pour Eo
graci1is jusqu'à des doses de 10 microgrammes/m1.
.../ ...
- 71 -
De plus un certain nombre de substances se révèlent
inactives hydrolysat de caseine, peptone traitée au charbon, acide
nucl~ique de la levure, méthionine, acide folique, xanthoptérine, adénine,
guanine, hypoxanthine, thymine, cytosine, uracile"ainsi que des dérivés ou
composés d'oxypurine, guanine, guanosine, xanthine, ptérine et pyrimidine.
Englena gracilis n'est pas touchée par la vit. C aU taux de 10 mg/ml.
De même, les folates, les acides pantothénique, para
aminobenzoïque sont dénués d'effet pour des taux allant de 0,05 à 50 mcg/ml.
Par contre, à 50 mcg/ml l'acide nicotinique est tota
lement inhibiteur, mais cette propriété disparaît rapidement avec des con
centrations décroissantes. L'alcool à 12,5 % et l'ammoniaque à 5,0 %
présentent également un effet inhibiteur qui disparaît avec des taux plus
faib les.
2-2-4 Méthode utilisant Lactobacillus leichmannii (88, 44)
Les méthodes utilisant L. leichmannii et Englena
gracilis sont suffisamment sensibles et spécifiques pour la détermination
de la vit. B12
sérique. La sensibilité de la méthode à Lactobacillus est de
1 pg/ml (dilution finale) et celle de Englena 0,25 pg/ml.
En regardant la spécifité, la méthode de Englena est
meilleure parce que les désoxyribosides augmentent généralement la croissance
de Lactobacillus leichmannii.
En utilisation clinique, cependant, la méthode à
Englena a l'inconvénient de nécessiter un temps long, 5 à 7 jours (période
d'incubation longue) et de la lumière pour la croissance de la culture,
tandis que la méthode à Lactobacillus est rapide (18 à 20 h) et n'a pas
d'exigence concernant la croissance de la culture.
2-2-4-1 Méthode
•••1•••
- 72 -
Lactobacillus leichmannii 313 (A T CC: 7830)
Les souches sont conservées en culture dans une gélose
contenant du jus de tomate (American type culture collection).
2-2-4-1-2 : Inoculum
Un jour avant les analyses, le micro-organisme est transféré
dans un tube contenant le milieu de base, dans lequel est additionné du
cyanure de potassium et de la vitamine B12
(0,002 mcg/ml). (La solution du
milieu de base a été mise en autoclavage pendant 10 mn à 120°c).
Le tube est incubé pendant 16 -24 heures à 37°c au bout
desquelles apparaît une importante culture.
La suspension bactérienne est centrifugée juste avant
l'utilisation. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans de
l'eau physiologique pendant 3 mn. Quelques gouttes de la dernière suspension
sont diluées avec la solution saline, et une goutte de cette dilution est
utilisée pour l'incubation.
2-2-4-1-3 Mi lieu de base (tab leau X )
2-2-4-1-4 : Solution standard
Elle contient 20 mcg/ml de vit. B12
et 10 mcg/ml de CNK.
On effectue une série de dilution de telle sorte que les dilutions finales
correspondent à des concentrations de vit. B12
de 80, 40, 20, 10, 5, et 2,5
pg/ml. Pour chaque concentration standard, on fait 3 tubes.
2-2-4-1-5 : ~~~~~~
Les échantillons sont dilués aVec un mélange acide acétique
acétate de Na à pH 4,5 contenant du cyanure de potassium. Le sérum dilué est
chauffé pendant 15 mn à 100°c.
La vit. B12 est reliée aux protéines sériques. Ces dernières
sont précipitées. Après refroidissement et centrifugation, le surnageant est
prêt pour le dosage ou bien on le dilue à nouveau.
Pour chaque sérum, on fait deux dilutions et pour chaque
dilution 3 tubes (donc pour un sérum, on a 6 tubes).
• ••1•••
SOclrcc (2) - 73 -
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1
- 75 -
2-2-4-1-6 : Procédé
On ajoute un petit volume du milieu de base dans les tubes
standards et les tubes tests. Ils sont ensuite stérilisés à l'autoclave
pendant 5 mn à 120°c. Après refroidissement, chaque tube est ensemencé aVec
une goutte d'inoculum et incubé pendant 18 - 20 h à 37°c au Bain-Marie.
2-2-4-1-7 : Lecture
Après incubation, les tubes sont agités et lus au colorimÈtre
de Beckman. Le pourcentage de transmission est fonction de la turbidbnètrie
donc de la concentration en vitamine B12
•
2-2-4-2 : Résultats
Sur la base des résultats obtenus, une courbe standard est
tracée sur un papier semi-logarithmique. On met en ordonnée la moyenne du
pourcentage de transmission des 3 tubes et en abscisse la concentration en
vitamine B12
•
La concentration des sérums à doser est lue sur la courbe.
Cette concentration n'est valable que si la valeur du pourcentage de trans
mission de chaque tube ne diffère de plus de la % de la moyenne des 3 tubes.
Dans le cas où il y a concordance entre 2 valeurs, si la troisième est large
ment éloignée, on l'écarte.
2-2-4-2-2 : Nombre d'échantillons
Dans chaque série de dosage, on doit avoir :
- 6 concentrations standard de vit. B12
, chacune aVec
3 tubes.
14 sérums à doser avec 2 dilutions pour chaque sérum
et 3 tubes pour chaque dilution.
- 1 sérum contrôle avec 2 dilutions et 3 tubes pour chaque
dilution.
- 2 contrales négatifs.
- 1 contrôle positif.
• ••1•••
- 76 -
Le sérum contrôlé est un échantillon ou un mélange d'échan
tillons utilisé chaque jour pour vérifier la reproductibilité de la méthode.
Le contrôle négatif est un échantillon dépourvu de vit. B12 •
Le contrôle positif est un sérum qui a un taux élevé en vit.
B12
et qui permet de vérifier le milieu de base et l'inoculum (croissance
maximum) •
La reproductibilité de la méthode a été évaluée sur la
base des résultats de 30 j d'analyse
La moyenne a été de
correspond à une précisi~n de t la %
comme satisfaisante.
2-2-4-2-4 : Détectabi1ité
d'échantillons de sérums.+1125 - 110 pg de vit. B12/m1. Cela
(limite 95 %) qui peut être considéré
Dans les expériences de détectabi1ité auxquelles, il a été
ajouté 50 - 800 pg de vit. B12
/m1 de sérum, 98t 6 % de la quantité ajoutée
a été détectée.
2-2-4-2-5 : Sources d'erreur
Les résultats peuvent être compromis par la présence d'agents
inhibiteurs (antibiotiques, sulfamides) et d'agents protecteurs des échantillons.
Ceci est généralement révè1é au cours des analyses par des phénomènes de
convergences (négatifs ou positifs) ("drift" phenomenon).
Un repas pris avant le prélèvement de sang ne paraît pas
affecter la concentration mesurable de vit. B12
•
2-2-4-2-6 : Taux normaux
Il a été trouvé que chez des sujets sains (~gés de 20 à 65 ans),
le taux de vit. B12 sérique était compris entre 250 - 900 pg/m1, ce qui est
en accord avec la littérature et que le taux sérique d'un même individu était
relativement constant.
• • •1.0.
- 77 -
2-3 Chromatographie en Phase Liquide Haute Performance (H. P. L. Co)
Le développement récent de la H P L C devrait permettre
de simplifier et de rendre plus aisé le dosage des vitamines: meilleur
isolement de la vitamine à doser, possibilité de doser plusieurs vitamines
en une seule expétience, simplification de la méthode de dosage (absorption
ultraviolette, fluorescence) puisque les risques d'interférences sont forte
ment diminués avec la possibilité de récupérer les produits séparés (56).
La H P L C est applicable pour les vitamines du groupe B,
donc pour la vitamine B12
•
Nous le signalons à titre d'information car la H P L C ne
peut être appliquée à l'heure actuelle comme méthode de dosage de routine,
surtout dans les pays en voie de développement.
• • •1o ••
- 78 -
3- Les méthodes indirectes
3-1 Dosage biologique .(157)
Les animaux normaux utilisés doivent d'abord être traités
pour appauvrir leurs réserves de B12
(transmises par la mère aux jeunes) et
toutes les précautions doivent être prises pour éviter l'absorption des matières
fécales, source de vit. B12
• Diverses techniques ont été proposées
- régime pauvre en vit. B12
pour les poules,
- soja-glucose pour les rats,
- régime végétarien pour les souris.
L'incorporation de caseine iodée ou de thyroxine au régime
retarde la croissance qui reprend par addition de vitamine B12
• Le lactose
qui diminue la croissance du rat a également été utilisé.
L'augmentation de la teneur en protéines peut également
servir à diminuer les réserves de l'animal en vit. B12
0 Un régime soja-mars~
contenant 20 % de graisse permet d'obtenir rapidement des poulets carencés
en vit. B12
•
Ces méthodes biologiques ne sont pas absolument spécifiques
de la vitamine B12
, mais elles peuvent conduire à des indications intéressantes
sur le rôle physiologique de celle-ci.
Actuellement, elles ne sont plus utilisées pour doser la
3-2 : Test à la valine: dosage de l'élimination urinaire d'acide
mé thy lma lonigu e (155).
Ce test repose sur l'existence d'un coenzyme B12
dans la
transformation de l'acide propionique en acide succinique (fig. 12) •B
Propiony 1 Co A } Mé thy lma lony 1 Co A-1.-12
)succinyl Co A
(fig. 12)
Son intérêt est assez grand, car des taux excessifs necas
sont observés qu'eryd'avitaminose B12
et le test n'est pas influencé par
un traitement à l'acide folique.
Les techn~ques de dosage sont complexes et peu répandues •
•••1•••
- 79 -
3-3 Test thérapeutique (155)
Il peut aider à distinguer une carence en acide folique
d'une carence en vitamine B12•
On donne des doses physiologiques de vitamine B12
(1 mcg/j)
en suivant la réticu10cytose qui augmente au fur-et-à-mesure (155).6 heures
déjà après le début du test à la vitamine B12
, les normob1astes commencent
à se substituer aux mégaloblastes et ce remplacement est à peu près achevé
au bout de 4 j, délai après lequel se déclenche une décharge de réticu10cytes
dans la circulation avec un maximum vers le 6ème jour (8).
3-4 Tests de traversée digestive (exploration de la vitamine B12
marquée au Cobalt) (126)
3-4-1
La vit. B12
a d'abord été marquée par le Co. 60 puis Co. 58
HEINLE uti lisant Co. 60 en 1952 (92)
SCHILLING (R, F,) en 1953 ( 166)
BRADLEY utilisant le Co. 58 en 1954 (30)
BERLYNE utilisant le Co. 57 en 1957.
ensui te Co, 56 0
Essais humains
3-4-2
- mesure de l'élimination urinaire de la vitamine B12
administrée per os,
évaluation de l'élimination urinaire de la vitamine B12
marquée après ingestion buccale accompagnée ou suivie
d'une injection parentérale de vit. B12 ordinaire ayant
pour but de saturer le foie du sujet soumis à l'expérience,
- mesure de la radioactivité hépatique après absorption
buccale de la vitamine,
- enfin, mesure de la radioactivité de sérum après adminis
tration par voie buccale de vitamine marquée de haute
activité spécifique (176).
Cependant nous ne décrirons que celle de l'évaluation de
l'élimination urinaire.
• ••1•••
3- 4-3-1
- 80 -
3-4-3 : Mesure de l'élimination urinaire (165) (51)
~~e~:~~~~~-~~-!~-~~~~~~~~-~i2-~~:S~~~
La première forme de la vit. B12
marquée est celle
de la cyanocobalamine au cobalt 60. Mais, la période particulièrement
longue du cobalt 60 (5 ans), en limite les applications et surtout la possi
bilité de renouveler aussi fréquement qU'il serait nécessaire les examens
à pratiquer chez un même sujet.
C'est pourquoi, les auteurs se sont appliqués à
préparer des vitamines B12
marquées aux isotopes 56, 57, 58 du Co. dont
les périodes varient de deux ans et demi à 72 jours.
La vit. B12
marquée est obtenue par biosynthèse en
incorporant le Co radio-actif dans le milieu de culture du Streptomyces
Griseus car il ne peut être pratiqué d'échange chimique sur la molécule de
cyanocobalamine et l'irridiation directe de la vitamine cristallisée au
moyen de neutrons ne lui confère qu'une très faible activité spécifique.
Les sels de Co radio-actif sont mis en milieu prati
quement dépourvu de Co soumis à la fermentation par le Streptomyces Griseus.
La nécessité d'obtenir une haute activité spécifique et
une efficacité de conversions satisfaisante oblige à utiliser des taux
limites de Co conduisant à des titres faibles, ce qui rend beaucoup plus
difficile la purification.
La vitamine B12
marquée est purifiée par chromato
graphie, puis cristallisée.
3-4-3-2 Technique urinaire d'exploration pour la----------------------------------------vitamine B marquée.----------12--------
La vit. B12
Cobalt 60 est livrée en tubes de verre
scellés chaque tube contenant une assez grande quantité de produit.
Le premier temps est donc de fragmenter la quantité
initiale de vitamine B12
Co 60 en un certain nombre d'échantillons par mise
en solution des cristaux dans du sérum physiologique.
Cette solution est divisée en un nombre de parts égales
en volume et en radio-activité.
.../ ...
- 81 -
L'une de ceS doses servira d'étalon et sera mise en.
solution dans un récipient de même type que CeUX utilisés pour le comptage
de la radio-activité des urines recueillies en 24 heures 0
On opère avec des bocaux à urineSde modèle standard
d'une contenance de deux litres.
Les autres doses sont administrées aux malades à
explorer.
3-4-3-2-1
On fait absorber par voie orale la dose test de vit.
B12
Co 60 et, par voie intra-musculaire, on administre une dose saturante
de vitamine B12
ordinaire de 1 000 gammas (cette dose ayant pour but de
saturer le foie du sujet et de permettre ainsi l'élbnination urinaire de
la vi tamine B12 marquée).
Chez le sujet normal, sécrétant des facteurs intrin~
sèques, il y aura passage de la vitamine B12
Co 60 du tube digestif dans le
sang, le foie étant saturé par la vit. B12
ordinaire.
La vitamine radio-active se répartira dans l'organisme
du sujet qui en élbninera, par voie urinaire, de 10 à 20 %.
Chez les biermériens présentant un défaut d'absorption
intestinale, l'élimination urinaire est nulle.
3-4-3-2-2 Evaluation de la radio-activité des urines émises
Après avoir soigneusement recueilli les urines pendant
24 heures, On complète le volume à deux litres dans le bocal avec de l'eau.
Ce récipient étant identique à celui où a été mise la solution de vit. B12
Co 60, on veille à ce que les hauteurs de liquide dans les deux bocaux soient
les mêmes. Ceci-de façon à ne pas faire varier la distance de la source de
rayonnement au compteur, car l'intensité du rayonnement est inversement
proportionnelle au carré de la distance.
On observe une distance fixe du plan du fond du bocal
à la membrane du tube compteur à scintillations, distance fixée à 35 cm,
•••1•• 0
- 82 -
la hauteur du liquide dans les deux bocaux étant la même, on a une distance
fixe entre la source émettrice et la membrane du compteur.
On effectue des comptages sur des temps égaux,
l'appareil étant muni d'une minuterie.
Il faut tenir compte, dans les calculs, du bruit
de fond de l'appareil qui est variable et doit être évalué lors de chaque
manipulation.
Le bruit de fond doit être retranché du chiffre des
différents comptag~pour estimer la radio-activité réelle des échantillons
et celle de la dose étalon.
~-Dans un premier temps:
On estime la valeur du bruit de fond en comptant les
impacts enregistrés par l'appareil durant la fraction
de temps chois i.
- Dans un deuxième temps :
on éva lue la radio-activité de la dose de vitamine
B12
Co 60 administrée.
Cette dose est placée dans les mêmes conditions que
les urines recueillies dans 24 heures, c'est-à-dire qu'elle est mise en
solution dans le même volume que les urines, soit deux litres, en veillant
surtout à ce que les surfaces liquidiennes soient à la même hauteur.
La différence des résultats enregistrés par l'appareil,
dans ce cas et lors de l'évaluation du bruit de fond (celui-ci s'estimant sur
le même intervalle de temps, le compteur fonctionne à vide), nous donne la
valeur de l'activité radio-~ctive de la dose administrée.
En procédant de même pour le comptag~ de la radio-activité
des urines, toujours en ayant soin de soustraire la valeur du bruit de fond
de l'appareil, nous apprécions l'intensité du rayonnement émis par la quantité
de vitamine B12
marquée éliminée dans les urines de 24 heures.
Il faut noter qu'il importe de veiller à ce que l'axe
des récipients utilisés au cours de la manipulation soit fidèlement repéré
sur la base de l'appareil de façon à ne pas faire varier la distance de la
source émettrice à la membrane du compteur.
• ••1•••
- 83 -
KATZ et coll. (111) ont modifié cette technque
On donne au patient simultanément de la vitamine B12
marquée par du Co 57 et du complexe vitamine B12 - facteur intrinsèque
marqué par du Co 60. Ce procédé diminue le temps des investigations néces
saires lorsque l'on suspecte un déficit du facteur intrinsèque chez un
patient.
4- Conclusions sur les méthodes de dosage de la vitamine B12
point de vue de l'OMS (124)
"Le dosage de la vitamine B12
dans le sérum a donné des
résultats concordant pour les laboratoires utilisant Eng1ena graci1is, de
même que ceux obtenus par les laboratoires où une quantité (0,1 ml) de
sérum exempt de vit. B12
est ajoutée aux solutions aqueuses étalons.
sans cette addition, les taux sériques sont plus faibles
et plus variables, mais ils ne sont pas modifiés au point de compromettre
l'utilisation de la méthode à des fins de diagnostic.
Le groupe a"jugé que ce dosage pouvait être adopté
comme méthode type.
Les résultats obtenus avec Lactobaci11us 1eischmannii,
quoique peut-être plus variables, sont comparables à ceux donnés par E.
graci1is dans le cas des sérums à teneur normale ou très faible en vit.
B12, mais les variations sont beaucoup plus marquées lorsque les concentra
tions en vi tamine B12 sont de 60 à 200 pg/m1.
La méthode est valable pour le diagnostfc, mais n'est
pas recommandé pour la recherche.
QUant à l'utilisation de E. Coli, les résultats disponibles
ne sont pas encore suffisants pour permettre de juger cette méthode de dosage.
Avec les technques utilisant des isotopes, les résultats
sont beaucoup plus fluctuants et tendent à être plus élevés qu'avec les
technques microbiologiques.
A ce stade, il semble douteux que le dosage de la vit.
B12 par le moyen d'isotopes radio-actifs soit susceptible d'application
généra le" 0
•••1•••
- 84 -
Ainsi les méthodes microbiologiques sont sans doute,
celles que doivent utilisées les pays en voie de développement. La méthode
utilisant Englena gracis et celle utilisant Lactobacillus leichmannii sont
les plus indiquées compte-tenu de leur sensibilité, leur spécifité et les
moyens relativement modestes nécessaires à leurs applications.
o 0
o
•••1•••
T ROI SIE M E PAR T l E
-~-=-~~~=-==-~~=-=-=-~=-~=
Programme d'action pour la lutte contre les anémies nutritionnelles
par carence en acide folique et en vitamine B12
-
Chap. l Introduction
- 85 - .
Les anémies nutritionnelles posent un problème dans
le monde entier, mais c'est dans les pays en développement qu'elles sont
les plus répandues. La carence en folate arrive en deuxième position parmi
les causes les plus courantes d'anémie nutritionnelle, après le fer.
Parallèlement à l'accumulation des données sur la pré
valence de l'.anémie, on est parvenu à mieux comprendre ses effets néfastes,
à mieux connaître les autres troubles du métabolisme provoqués par ces ca
rences nutritionnelles et à perfectionner les techniques de laboratoire
permettant d'étudier, de diagnostiquer et de mesurer les états de carence.
Malheureusement ces progrès scientifiques n'ont guère contribué jusqu'à
présent à la lutte contre les anémies nutritionnelles qui continuent à poser
un grave problème de santé publique dans de nombreuses régions du monde,
surtout dans les pays en voie de développement.
Selon des observations de chercheurs de l'O.R.S.T.O.M
O.R.A.N.A (15,34), la carence en folate par insuffisance d'apport est plus
importante qu'on ne le pense car il y a une surrestimation de la teneur en
acide folique des aliments consommés. Ceci reste à confirmer par le dosage
de l'acide folique dans les aliments.
QUoiqu'il en soit une étude s'impose pour préciser dans
quelles proportions interviennent les carences en acide folique et en vit.
B12
dans les anémies nutritionnelles. Cette étude devra être considérée comme
une action de santé publique compte-tenu des effets néfastes de l'anémie et
de la carence nutritionnelle sur les populations.
La nécessité de cette étude est d'avantage ressentie
après les Conclusions de différents travaux portant sur les anémies
nutritionnelles.
• ••1•••
- 86 -
En effet NDIAYE et coll., après une étude des proteines
sériques au cours des A. N. de la femme enceinte au SENEGAL, chez 59 femmes
de la Région de BAMBEY dont 29 présentaient une anémie selon les critères
de l'a.M.S, arrivent à la conclusion suivante: "les variations des proteines
sériques spécifiques constatées dans cette étude nous paraissent difficiles
à interpréter, et dans tous les cas, l'utilisation de ces dosages ne nous
paraît à elle seule suffire à unê caractérisation nette de l'anémie nutrition
nelle de la femme enceinte" (143, 141).
Dans une autre étude concernant 172 femmes de différentes
régions: Dakar (97), Thiès (25), Louga (24) et saint-Louis (26) et por~ant
sur "Fer et f erritine_sériques au cours des A. N. chez la femme sénéga lai se"
(142), il a été trouvé 63 femmes anémiées soit 37 % de la population.
Les auteurs arrivent à la conclusion que cette anémie ne
paraît pas devoir trouver son origine dans une carence d'apport en fer, la
déficience paraissant avoir son origine à un autre niveau de l'érythropoièse.
Et ils terminent sur l'intérêt que les dosages vitaminiques pourraient avoir
pour une connaissance plus parfaite des mécanismes biologiques à l'origine
de ces A. N.
D'autres travaux portant sur la déficience en vitamine A
et A. N. en zone sahélienne ont été effectués.
NDIAYE et coll. ont voulu dans cette étude, examiner au
SENEGAL dans une zone sahélienne englobant Bambey, Diourbel, Mbacké - chez
56 enfants d'âge préscolaire (3 à 7 ans) et 76 femmes (17 à 30 ans) - les
relations éventuelles pouvant exister entre les taux plasmatiques de vit. A
et les deux paramètres hématologiques (Hb et Ht) qui définissent l'anémie
nutritionnelle. Les résultats obtenus suggèrent que le taux de vit. A plas
matique n'est pas en relation directe avec l'anémie (144).
Nous n'aborderons ici que la lutte contre l'A. N. par carence
folique. Cependant nous soulignerons que la lutte contre l'anémie par carence
martiale a été abordée dans une précédente étude dans le cadre de l'O.R.A.N.A
•••1•••
- 87 -
(177). Enfin nous traiterons le cas particulier de la vit. B12
car selon
beaucoup d'auteurs sa carence n'est pas directement responsable d'A. N.
o 0
o
••./.0.
· - 88 -
Chap II: Détermination du problème (tableau)(l ) (124)
Bilan de la situation dans la population
On doit commencer par recueillir les renseignements
alimentaires nécessaires portant sur la nature des aliments, leur quantité,
la richesse de ces aliments en A.F ete.
Ensui te, il fau t .étudier la préva lence de l'A. N. par
carence folique. Dans le cas où les études ne sont pas immédiatement réali
sables, elles devraient porter sur les groupes de population les plus exposés,
enfants d'~ge préscolaire et femmes en âge de procréer dans la mesure où c'est
pendant la grossesse que la demande en A. F. est la plus forte, les carences
existantes deviennent plus faciles à dépister.
Pour évaluer la prévalence, on peut utiliser deux voies
- mesurer les folates sérique et erythrocytaire par
des méthodes décrites dans la deuxième partie,
mesurer le taux d'Hb si on n'a pas les moyens de
la première voie.
Mesure du taux d'Hb
Le principe consiste à construire une courbe de dis
tibution de fréquence du taux d'Hb de la population que l'on veut étudier.
On compare la courbe obtenue à la courbe de distribution des valeurs normales
de l'Hb.
Dans le graphique IV, la courbe A représente la courbe
théorique obtenue chez des sujets à taux d'Hb normal.
Si dans la population, la prévalence de l'anémie est nulle
ou peu importante, la courbe B (courbe de distribution de fréquence de la
population étudiée) se rapproche de la courbe A.
•••1•••
C'o." PROGRAMME D'ACTION POUR LA LUTTE CONTRE \ LES AN(MIES NUTRITIONNELLES ET LEUR ~LIMINATION
Estimation de la prévalence1 11 des anémies et des carences
en fer et en folate
Elevée Basse Modêrê.
A2Aucune mesure à prendre,
82 sauf en faveur desfemmes enceintes
Non satisfaisant Satisfaisant Satisfaisant Non satisfaisant
SupplémentationEnrichissementSatisfaisantsNon satisfaisanu
Application d. la suppl.C12 thérapeutiqu.'
l'échell. national.JrHO 7.0l0
SatisfaisantNon satisfaisantNon satisfaisantSatisfaisant
Application de la suppl.A6 thérapeutique à
l'échelle nationale
Satisfaisant Non satisfaisant
Application del'enrichissement
à l'échelle nationale
'l'ab leau XI
Source (124)
Courbes de distribution de fréquence destaux d'hémoglobine
Sujets normaux (A)
oc....'\
120
100
i . 80
'60
40
7
Fréquence.
8 10 11 15 Hb (gl1.) ,
Graphi que IV Source (82)
- 91 -
Si par contre l'anémie est très importante, la courbe B
sera décalée vers la gauche. Les concentrations d'Hb chez les sujets sains
et les sujets anémiques se chevauchent.
Le taux normal d'Hb est la concentration en Hb maintenue
constante par l'organisme du sujet. Seront anémiques les sujets dont le
taux est devenu inférieur à cette normale.
La zone en croix représente les sujets que l'on trouve
anémiques selon la distribution des fréquences, mais qui sont plutôt normaux selon
les critères de l'O.M.S.
La zone hachurée correspond aux sujets normaux selon la
courbe mais considérée anémiques selon les critères de l'O.M.S.
Dans la -détermination du problème, il faut établir des
normes minimales acceptables pour chaque pays, plus les normeS seront élevées
plus il sera difficile de les atteindre.
Dans l'établissement de ceS normes, il faut tenir compte
des ressources financières et humaines du pays ainsi que de Ses autres
besoins en matière de santé publique.
Si la prévalence de l'anémie et de la carence est faible,
il ne sera pas nécessaire de prendre une mesure de santé pub lique sauf en
faveur des femmes enceintes qui pourront bénéficier d'une supplémentation
préventive.
Dans les régions à forte prévalence, il sera nécessaire de
les diviser en deux catégories selon que la prévalence de l'anémie nutrition
nelle y sera élevée ou modérée.
• ••1•••
Chap. III
- 92 - .
Régions où la prévalence de l'anémie est élevée (124).
On doit entreprendre un programme de supplémentation
thérapeutique •
1- .=E~s~s~a:.:i:....J:p:.:i:..::l::.::o:.::t;.::e=-...::d:.::e::-::s:..:u::.lp:..tp:..;l:.:ém=e:.:n::.:t:..:a=--t~l::.,:.o::;n~t::.:h:.:.e:::.'r=-a:.:..p,"-=e.::.u.:::t=-i.::1g..;;u-=e~(..;;t_a~b~l:.;;;e;",.a_u-=.:X~I"'--_---:.:A2 )
Les caractéristiques de l'essai varient selon les régions
et dépendent de l'alimentation et de l'état nutritionnel de la population.
Indépendamment des réserves de folates des sujets, l'ab
sorption de supplément de folates dépend de divers facteurs tels que la
composition du régime alimentaire et la prévalence de différents troubles
intestinaux.
C'est pourquoi, il est nécessaire d'estimer au moyen d'un
essai pilote, quelle dose d'une certaine forme d'acide folique il faudra
administrer pour obtenir un effet déterminé dans la population cible en un
temps donné, par exemple, trois mois.
Cette estimation pourra être faite de deux manières :
- en mesurant l'absorption au moyen de radio-isotopes,
- en étudiant la réponse de l'Hb aux doses utilisées
dans l'essai.
Si l'on dispose des moyens voulus, on étudiera l'absorption
à partir de comprimés d'acide folique marqué à des dosages différents ou
d'avantage entre 100 et 500mcg, sur un échantillon de population d'où Seront
exclues les femmes enceintes.
Les comprimés d'acide folique marqué employés pour l'essai
devront être semblables à tous autres égards à ceux qui seront utilisés
ultérieurement pour la supplémentation et devront être administrés de la
manière prévue pour le programme de supplémentation par exemple aVec le repas.
Les comprimés seront administrés pendant plusieurs jours, afin de réduire à un
minimum les effets des variations journalières de l'absorption.
• ••1•••
- 93 -
S'il est impossible de faire des études isotopiques ou
si l'on désire obtenir une confirmation des résultats de ces études, on
pourra faire un essai pilote pour déterminer les réponses hémoglobiniques
dans des groupes de sujets recevant des supplémentations à différentes
doses. C'est la solution la mieux adaptée aux pays du tiers-monde.
Les sujets soumis à l'essai devront constituer un
échantillon représentatif de la population. On évitera donc de les choisir
dans une section spéciale de-la collectivité, par exemple parmi les malades
qui s'adressent à un h8pital ou sont traités dans un h8pital. On constituera
un groupe pour chaque dose à essayer plus un groupe témoin auquel on adminis
trera seulement un placébo.
La pratique consistant à choisir des sujets non anémiques
pour constituer le groupe"témoin" est inacceptable parce qu'il importe
que la composition de ce groupe soit la même à tous égards que celle des
autres groupes. Les sujets devront être répartis de manière probabiliste
entre les divers groupes au moyen d'une table de nombres aléatoires appro
priée.
Dans les populations où la prévalence de l'anémie est très
élevée, il sera indiqué de commencer par diviser l'ensemble des sujets en
plusieurs strates selon leur taux d'hémoglobine initial, puis de répartir
aléatoirement les sujets de chaque strate entre les divers groupes de trai
tement (tableau XII). On obtiendra ainsi des groupes dont la composition
sera plus homogène du point de vue du taux d'hémoglobine initial.
Afin d'empêcher que des suj ets affectés à l'un des que 1
conques groupes ne subissent des effets graves du fait de l'anémie dont ils
souffrent, les individus présentant un taux d'Hb inférieur à un seuil déter
miné d'avance ne seront pas compris dans l'essai et toute personne dont le
taux d'Hb tombera au-dessous de ce seuil au cours de l'essai en sera exclue.
• ••1• ••
- 95 - ,
Le nombre de sujets nécessaires dans chaque groupe dépen
dra de la gravité de l'anémie et du degré de certitude aVec lequel on désire
déceler une élevation donnée du taux d'hémoglobine. En pratique, chaque groupe
devra compter au moins 30 sujets allant jusqu'au bout de l'essai.
Pour décider de la durée de l'essai, il faudra prendre
en considération divers facteurs. D'une manière générale, plus l'essai sera
long, plus l'effet de petites doses du supplément d'acide folique sera net.
Toutefois, il sera probablement plus économique d'organiser l'essai pilote
initial en prévoyant l'administration de doses assez fortes pendant une durée
relativement brève.
Il est essentiel que quelqu'un soit chargé de veiller
personnellement à ce que les sujets prennent tous les jours leurs comprimés.
Faute de cette précaution, les résultats obtenus pourraient conduire à des
conclusions erronées.
L'analyse des résultats peut se faire de plusieurs manières,
par exemple en déterminant l'élevation moyenne du taux d'Hb dans chaque groupe,
ou bien le nombre d'individus anémiques subsistant dans chaque groupe.
2- Résultats de la supplémentation thérapeutique pilote.
L'analyse des résultats indiquera si l'essai a donné une
réponse non satisfaisante ou une réponse satisfaisante.
nonSi la réponse est ~atisfaisante, les doses de l'acide folique
utilisées étaient insuffisantes ou elles ont été mal absorbées ou bien l'ané
mie était due à la carence en d'autres nutriments.
Dans ce cas, l'essai doit être remanié (tableau XI",~ A3
) et
l'étude doit être répétée.
Si l'analyse des résultats révèle que la réponse a été
satisfaisante, il peut être bon de procéder à un nouvel essai pour déterminer
la limite inférieure de la supplémentation efficace.
• ••1•••
- 96 -
Il faut cependant considérer que les dépenses afférentes à
un programme de supp1émentation sont constituées non pas tant par le coût
de la quantité de substance active contenue dans les comprimés, mais surtout
par le coût des comprimés eux-mêmes et particulièrement par les frais ad
ministratifs et autres (transport etc.) qui impliquent leur distribution.
Pour illustrer nos propos, nous prendrons l'exemple d'un
programme de supp1émentation d'acide folique réduit au strict minimum ayant
30 personnes "témoin" et 30 personnes "sujets".
Selon les tarifs 82/83 de la P. N. A. (Pharmacie Nationale
d'Approvisionnement) du SENEGAL, le prix d'un comprimé d'A. F. 5 mg est de
4,10 Frs soit 4 100 Frs pour une boite de 1 000 comprimés. Pour un program
me de 3 mois, soit 90 jours, à raison de 1 comprimé par jour, une personne
utilisera 90 x 4,10 = 369 Frs sans tenir compte des frais administratifs ni
des moyens de transport dont le coût n'est pas à négliger. Ainsi, il faudra
Il 070 Frs pour 30 sujets tests.
Le coût de la supp1émentation sera évalué en fonction du
prix de l'acide folique, des moyens de transport, des frais du personnel
de santé etc. et en fonction de chaque pays pour ne pas dire chaque région.
Avant de se lancer dans un programme de supp1émentation
pilote, les autorités sanitaires concernées devront faire une étude exha~tive
de tous les facteurs touchant de près ou de loin ce programme.
3- Essais pratiques de supp1émentation thérapeutique (tableau XI-A4
)
Dans une action de santé pub1i<Iue, il est impossible d'exercer
une surveillance pour s'assurer que le supplément est bien consommé tous les
jours par les personnes auxquelles il est destiné. Les essais pilotes doivent
être suivis d'essais pratiques avant qu'on puisse recommander la mise en ap
plication d'un programme à l'échelle nationale.
• ••1•••
- 97 -
Les essais pratiques devront être conduits sur les groupes
de population les plus exposés. Les sujets seront divisés aléatoirement
(avec stratification si la prévalence de l'anémie est très élevée) en deux
groupes, dont l'un recevra le supplément et l'autre le placébo. Le calendrier
de distribution des comprimés sera le mille que celui prévu pour l'exécution
du programme à l'échelle nationale.
Cependant un problème d'éducation se pose pour que les
sujets puissent prendre convenablement la dose de supplément.
Mais il Y a deux facteurs dont il faut tenir compte
- Un personnel suffisant pour assurer le maximum de
contact avec les populations par conséquent le maximum
de chance pour que les sujets prennent leur supplément,
- Le coût du programme de supplémentation qui augmente.
De toute fa~on, il faudra assurer un minimum de contact
nécessaire au dessous duquel des résultats valables ne peuvent être escomptés.
Ce minimum dépendra de la compréhension et de la motivation des sujets d'une
part et du personnel de santé d'autre part.
A la fin de la période d'essai, on pourra évaluer les résul
tats par des méthodes identiques à celles décrites dans l'analyse des résult
tats deI' essai pilote de supp lémentation.
Si dans l'essai pratique, on n'est pas parvenu à réduire la
prévalence de l'anémie à un niveau acceptable, il y aura lieu de répéter
l'essai en le remaniant sur un ou plusieurs points:
- essayer de rendre plus régulière la prise de comprimés
par des distributions fréquentes
- développer l'information et la motivation du personnel
de santé participant à l'essai et intensifier l'éducation
'sanitaire pour convaincre les sujets de l'importance d'une
prise régulière des comprimés
•••1•••
- 98
- augmenter la dose de supplément en augmentant le nombre
de comprimés à prendre chaque jour.
Si malgré tout cela, les essais pratiques ne donnent pas
de résultats satisfaisants, il faut porter tous les efforts nécessaires
sur les sujets les plus anémiés dont l'état peut entrainer des effets f~cheux ;
sujets dont le taux d'Hb par exemple est inférieur à 8 g/100 ml.
4- Programme national de supplémentation thérapeutique (tableau XI- A6
)
Après que les essais pratiques de supplémentation auront
été menés à bien dans des groupes de population très exposés, on pourra
organiser un programme national de supplémentat10n portant sur ces groupes,
en calculer le coût et le mettre en route.
o 0
o
•••1•••
Chap. IV Régions où la prévalence des anémies est modérée (124).
- 99
Dans les régions où la prévalence de l'anémie est modérée,
il sera indispensable de doser les fo1ates sérique et erythrocytaire pour
déterminer la prévalence de la carence en fo1ate.
Si la carence est très fréquente, on s'efforcera d'accroître
l'acide folique. Comme il est difficile de modifier les habitudes alimentaires,
on pourra avoir intérêt à recourir à l'enrichissement des aliments pour ac
croître l'apport alimentaire.
Dans certaines populations où les mesures d'enrichissement
des aliments ne sont pas possibles, il pourra être nécessaire d'organiser
des programmes de supp1émentation à petite dose, mais de longue durée.
1- Essai pilote de supp1émentation préventive (tab1eu XI_ C2
)
Il permet de déterminer si un supplément donné réduit
effectivement la prévalence de la carence.
L'essai est organisé de manière qu'un groupe tém6în reçoive
un p1acébo. Les autres groupes auront des quantités croissantes d'acide folique.
L'acide folique devra être consommé avec les repas, et l'on
s'assurera de sa consommation régulière.
Des études isotopiques pourront détermine~ la quantité du
nutriment qu'il faudrait ajouter à la ration alimentaire.
Mais dans nos pays en voie de développement où les moyens
manquent, on mesurera simplement le taux d'Hb et l'Ht pour s'assurer que la
carence est tombée à un niveau acceptable alors qu'elle est restée inchangée
dans le groupe témoin.
• ••/0 ••
- 100 - .
Si des résultats satisfaisants n'ont pas été atteints, alors
l'essai doit êtrè remanié soit en augmentant la quantité d'acide folique
soit en évitant l'irihibition par les aliments.
2- Enrichissement ou supp 1émentat ion ? (tab 1eau XI - C4)
Selon les résultats de l'essai pilote, on recourira à l'une
ou l'autre méthode.
3- Choix de l'additif et ~u véhicule pour l'enrichissement
d'enrichissement (tableau Xl-CS)
essai simu lé
Avant de choisir une forme d'acide folique se prêtant à
l'enrichissement, il faut examiner s'il est absorbab1e, s'il est stable
au stockage et à la cuisson, et quels sont ses effets sur l'aliment. Quant
au véhicule, il doit avoir les caractéristiques suivantes ~
-Compatibilité avec l'acide folique,
- Consommation large en quantité suffisante,
- Le traitement doit se faire dans un petit
nombre de centres pour permettre la surveillance
et le contrôle de la quantité.
On pourra tester différents véhicules :
- les céréales
Elles sont peu coûteuses et constituent la principale source
calorique des populations pauvres. Elles sont largement consommées sur le
plan mondial; il s'agira du blé, du mars, du riz ou du mil (177).
- lait et produits laitiers
L'inconvénient est qU'ils sont peu ou pas utilisés au sein
des populations à haut risque.
Les problèmes posés par l'enrichissement des fo1ates sont
surtout: les effets du traitement des aliments, de leur cuisson et de leurs
conditions de conservation sur la teneur en fo1ate.
.../ ...
'101
Dans un essai d'enrichissement simulé pratiqué sur des
femmes enceintes, l'enrichissement d'un repas de mars destiné à fournir
une quantité supplémentaire de 1 mg d'acide folique par jour, a provoqué
yne augmentation importante des teneurs sérique et erythrocytaire en folate
et a pu prévenir l'anémie, qui a été très frequente dans le groupe témoin (48).
D'autres études ont montré que le mars et le riz enrichis
amenaient des augmentations égales de la teneur en folate, qui étaient
environ deux fois plus fortes que celles qu'on obtenait par ingestion d'une
quantité correspondante de solution d'acide folique. Par contre, l'augmen
tation obtenue aU moyen du pain enrichi était moindre. Le folate n'était pas
détruit par l'ébullition ni par la cuisson aU four aUx températures et pen
dant la durée habituelles pour la préparation de ces aliments. Toutefois,
la cuisson pendant une durée plus longue entrainait une déperdition de folate
(N. Colman et aU -, citée dans (124) ).
Dans une autre étude, un repas de mars enrichi contenant
suffisamment de folate pour entrainer une consommation supplémentaire de
300 à 500 mcg/j a été administré à 5 femmes allaitantes atteintes d'anémie
mégaloblastLque due à une carence en folate. Chez les 5 femmes, la réponse
hématologique a été optimale et il n'y a pas eu de réponse réticulocytaire
secondaire chez deux des malades, auxquelles on a administré par la suite
des doses pharmacologiques (47).
Si l'essai ne donne pas de résultats satisfaisants, il
faudra le remanier (tableau - C6) et recommencer, ou bien conclure que
l'enrichissement est impossible et que la supplémentation préventive sera
donc indispensable.
4- Essai d'enrichissement (tableau XI -C7
)
QUand il est établi qu'un essai simulé d'enrichissement
a donné des résultats satisfaisants, on procédera à l'essai d'enrichissement
proprement dit.
..0/ •.•
102 - .
Le produit alimentaire enrichi en folate sera fourni à
un groupe de sujets, tandis qu'un groupe témoin continuera de recevoir
le produit habituel.
L'essai doit être effectué dans un établissement résidentiel,
puis répété dans des conditions plus conformes à la réalité.
On fournit le produit par des voies d'approvisionnement
habituelles par exemple à toutes les familles d'un village, mais non à
celles d'un village semblable qui servira de témoin.
On comparera l'état nutritionnel des sujets recevant le
produit enrichi pat rapport au village témoin.
5- Programme national d'enrichissement (tableau.XI - CS).
Quand les essais d'enrichissement sont jugés satisfaisants,
un programme national devra être organisé.
Il doit tenir compte du coût et l'ensemble des opérations
nécessaires à son application.
o 0
o
• •• /0 ••
Chap. V Cas de la vitamine B12
- 103
Depuis sa découverte, la vit. B12
a permis de soigner la
maladie de Biermer qui a été toujours considérée comme fatale. AVAnt cette
découverte, de nombreuses thérapeutiques furent utilisées contre la maladie
de Biermer :
- Hépatothérapie :
Elle date de l'Antiquité. On utilisait le foie et ses dérivés.
- Gastérothérapie :
Après la découverte du facteur intrinsèque par" CASTLE
naquit la gastérothérapie basée sur l'utilisation d'un extrait de muqueuse
gastrique. On administrait de la poudre d'estomac de porc désséché en cachets
ou en solution. Cependant les résultats étaient modestes.
- L'acide folique :
Il se révela comme agissant fortement à des doses de 10 à
-15 mg par voie buccale sur l'anémie de Biermer, mais on s'est aper~u par la
suite que le système nerveux central subissait un empirement ou même l'appa
rition d'un syndrome neuro-anémique (14).
Mais depuis 1948, la vit. B12
a pris la place de tout~~ ces
thérapeutiques.
La vitamine B12
est utilisée aussi dans les anémies méga
loblastiques de l'homme autres que l'anémie de Biermer. Ces anémies sont
dues soit à un apport alimentaire insuffisant, soit à une absorption dé
fectueuse ou encore à une consommation excessive en vit. B12
(8).
En ce qui concerne les anémies par insuffisance d'apport
alimentaire de vit. B12
, les opinions varient selon les auteurs.
Selon ASCHKENASY, à priori une carence en vit. B12
devrait
être habituelle chez les végétariens, à cause de l'absence presque complète
de ce facteur dans les aliments végétaux. En effet, chez les '~égans" (sujets
qui excluent de leur alimentation toute protéine animale, y compris le lait),
on a trouvé des taux sériques de vit. B12
en général beaucoup plus bas (128+pg/ml - 15) que chez des sujets normalement nourris (140 - 900 pg/ml) •
•••1•••
- 104 ~
Selon HERBERT (96), les régimes végétariens même les plus
stricts, ne sont pas entièrement dépourvus de vit. B12
; celle-ci est
apportée par les microorganismes présents dans les nodosités des racines
de légumineuses. D'autre part, grâce au facteur intrinsèque, la vit. B12
excrétée par la bile est réabsorbée dans sa totalité chez ceS sujets, ce
qui retarde d'autant l'épuisement des réserves tissulaires.
ADAMS et Coll. (1) soutiennent que les anémies mégaloblas
tiques observées dans les pays en voie de développement au cours des dénu
tritions globales (marasme) ou de la malnutrition protéique-résultent presque
toujours d'une privation d'acide folique et non celle de vit. B12
dont les
taux sériques restent en général normaux.
Ainsi beaucoup d'auteurs excluent la carence en vit. B12
dans les A. N. par carence. Mais il faut souligner que la présence de la
vit. B12
et de l'acide folique est indispensable à la multiplication cellulaire.
La ca~ence d'une de ceS vitamines retentit sur l'hématoporèse.
Pour conclure, nous dirons que dans les pays en développement
particulièrement dans ceux du sahel où le bétail est durement frappé par
la sécheresse, une carence en vit. B12
même rare ne peut être exclue chez
les hommes adultes à plus forte raison chez les sujets à haut risque (f~mmes
enceintes et enfants). Et comme nous le soulignions dans le cas de l'acide
folique, généralement les apports alimentaires réels sont surestimés. Une
enquête nutritionnelle seule)portant sur la vit. B12
pourra nous permettre
de connaître l'incidence de cette carence et par conséquent de nous fixer
sur les méthodes de lutte à employer; supplémentation ou enrichissement.
o 0
o
RES UME ET CON C LUS ION S G E N E R ALE S
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=_=::_=
- 105 -
Le travail que nous avons entrepris porte sur les anémies
nutrionnelles par carence en acide folique et en vitamine B12 • Il
comprend 3 parties :
- La première est CCGstituée d'un rappel sur les
A.N. ; d'une étude du mét~bolisme de l'acide
folique, de la vitamine B12
et leurs interre
lations ;
- La deuxième porte sur l'étude de leurs métcodes
de dosage ;
La troisième est un essai de mise au point d'un
programme de lutte contre les A.N. par carence en
A.F. et en vit. B12
•
Dans la première partie, nous avons tout d'abord fait un
bref rappel sur les anémies nutritionnelles. C'est ainsi que selon
leurs distributions géographique, ethnique et sociale, nous pouvons
distinguer deux entités:
- D'une part l'anémie de Biermer, apanage des pays
développés, frappant toutes les classes sociales
et y représentant 90 % des anémies mégaloblastiques.
D'autre part, les A.N., apanage des pays en voie
de développement (Asie, Afrique, Amérique Centrale
et du Sud).
Ensuite, nous avons présenté l'acide folique dont le foie
est le principal lieu de réserve. Son absorption se fait après hydrolyse
par la conjugase intestinale. Cette dernière peut être inhibée par un
certain nombre de substances dont les antifoliques.
Parmi les causes de carence en A.F., on y retrouve les
défauts d'apport, grossesse, lactation et les malabsorptions.
• ••1•••
106
Le déficit en A.F. diminue la synthèse de l'A.D.N qui
se manifeste par une méga10b1astose.
La vitamine B12
quant à elle est absorbée selon deux
mécanismes
- Actif avec l'aide du facteur intrinsèque,
- Passif qui est une simple diffusion.
parmi les caUSes de carence, sont signalés les défauts
d'apport qui ne sont pas négligeables. La carence en vit. B12
diminue
la synthèse de l'A.D.N.
Les interre1ationSacide fo1ique~- vit. B12
ont pour
conséquence que l'anémie méga 10b1astique par carence en vit. B12
est corrigée par une dose infime de vit. B12
, forte d'acide folique
. tandis que l'anémie méga10b1astique par carence folique est corrigée
par une dose infime d'acide folique, forte de vit. B12
•
La deuxième partie traite des méthodes de dosage de ces
deux vitamines.
Il existe aussi bien pour l'acide folique que pour la
vit. B12
des méthodes directes, évaluant leur teneur sérique ou ery
throcytaire (acide folique) et des méthodes indirectes évaluant leur
carence par l'intermédiaire d'autres constantes biologiques.
Le dosage microbio10gique de l'acide folique avec Lacto
baci11us casei est très utilisé car il présente beaucoup d'avantages:
- Moyens matériels peu coOteux,
- Facile à mettre en oeuvre,
- Sensibilité et spécifité bonnes.
Ainsi nous le conseillons comme méthode type pour le
dépistage des carences foliques dans les pays en voie de développement •
• •• /0 ••
- 107 ~
Les dosages microbio1ogiques de la vit. B12
utilisant
E. graci1is et L. 1eichmannii sont meilleurs que les autres car ils
présentent plus d'avantages. Leur utilisation dans les pays en voie
de développement pour dépister les carences ne devra pas poser de
prot1èmes majeurs.
La troisième partie consiste à la mise au point d'un
programme de lutte contre les A.N. par carence en A.F. et en vit. B12
•
Il existe deux méttodes de lutte dont le choix dépend de
la prévalence de l'anémie dans la population. Dans les régions où elle
est élevée, on doit entreprendre un programme de supp1émentation théra
peutique. Si l'anémie est modérée, et dans le cas où il est difficile
de modifier les habitudes alimentaires, on pourra recourir à l'enrichis
sement des aliments.
- La supp1émentation thérapeutique
Consiste à apporter le supplément d'acide folique ou
de vit. B12
par voie orale ou injectable pour compenser le déficit.
Un essai pilote permettant de déterminer la dose d'acide
folique doit être entrepris. Cependant pour avoir le maximum de chance
de réussite, il doit tenir compte de tous les problèmes qui se poseront
transport, administration, personnel de santé, éducation sanitaire etc.
- L'enrichissement des aliments
Il consiste à incorporer dans un a1ime~t appelé véhicule
un complément d'acide folique ou de vit. B12
•
Nous pensons que les céréales qui constituent l'alimen
tation de base au SAHEL, pourront être utilisées dans un programme d'en
richissement au niveau de ces pays.
•••1•••
B l B LlO G R A PHI E
-=-=-=-~=~=-~-=-=-=-~=~~=-=
- 108 -
Enfin, nous souhaitons que d'autres études soient
entreprises pour mieux cerner les anémies nutritionnelles par carence
en A.F. et en vit. B12
qui risquent de prendre des proportions
inquiétantes aVec la sécheresse qui s'abat sur le SAHEL.-
o 0
o
- 109 -
1- ADAMS, J. F. ; BODDY, K. -
Action des affections rénales et hépatiques sur le métabolisme
de la vitamine B12
•
Ülncet 14 avril 1966, t 2, p.o 322 - 329.
2- ADRIAN, Je.ltll -
Le dosage microbiologique des vitamines du groupe B.
Paris : CNRS, 1959, 127 - 173.
3- AIRD, A ; CARTER, R. H. ; RUSH, B. -
Quality control i~ the microbiological serum folate assay.
Pathology, Austral, 1977, 2~ nO 3, 199 -205, bibl. (17 réf.).
4- ALLEN, Robert H. -
Clinical role and current status of serum cobalamin (vit. B12
) assays.
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AN N E X E S-- G LOS SA IRE
-=-=-=-=-=-=-=-==-=-=-=-=-=-=-=-=-=--=-=-=
ANNEXES
-~~=-=-=-~-=-=-=-=
Jus de tcmate
Si l'on part des tomates fraîches, elles sont ébouillantées,
épluchées et pulpées. Centrifuger et recueillir le liquide surnageant.
Si l'on part d'une boîte de conserve, centrifuger le con
centré, puis filtrer le liquide obtenu avec du clarcel jusqu'à l'obten
tion d'un liquide clair.
Solution de xanthine
Peser 200 mg de xanthine, les suspendre dans un peu d'eau
et ajouter de l'ammoniaque à chaud pour dissoUdre. Amener à 200 ml et
stéri liser.
Solution commune de purines (adénine, uracile, guanine)
Peser 200 mg de chacune des trois purines et les mettre en
suspension dans 100 ml d'eau.
A chaud les dissoudre avec de l'acide chlorhydrique à 20 %
et ajuster à 200 ml. La solution contient 1 mg d'adénine, de guanine et
d'uracile par ml.
Stéri liser 10 mn à 1200 •
Solution de DL - Tryptophane
Deux grammes de DL tryptophane sont mis en suspension dans
300 ml d'eau environ et chauffés. Avant l'ébullition ajouter la quantité
minimum d'acide chlorhydrique à 20 % pour dissoudre le tryptophane. Ajouter
immédiatement de l'eau en assez grande quantité et amener à un litre. Si
on observe une coloration rose, le tryptophane a été indolisé.
I.P. solution contient 1 mg de L - tryptophane par ml.
Conserver au réfrigérateur.
• ••1•••
solution de L - cystine
Quatre grammes de L - cystine sont mis en suspension dans
300 ml d'eau environ puis on porte à chaud. Avant l'ébullition ajouter
de l'acide chlorhydrique à 20 % jusqu'à solubilisation de la cystine,
en mesurant la quantité ainsi utilisée. Une fois la cystine dissoute,
ajouter la même quantité d'acide chlorhydrique que celle nécessitée pour
la mise en solution et amener à environ 900 ml avec de l'eau.
Ajuster à 1 litre, ce qui donne une concentration de L
cystine de 4 mg par ml.
Conserver au réfrigérateur.
Hydrolysat acide de caseine
On peut partir du produit Difco "casaminoacido vitamin free".
On suspend 50 g de ce produit dans 500 ml d'eau, on porte au bain-marie
ou à l'autoclave rapidement et après refroidissement filter.
D'un autre côté, il est parfaitement possible de partir
d'une caseine commerciale ou même d'un lait concentré ou non et d'en
eh~raire la caseine qui sera ensuite hydrolysé et dévitaminée.
Dans ce cas, le lait étant à sa concentration normale, verser
dans une ampoule à décanter et ajouter 15 ml de NH 40H concentrée puis un
mélange en parties égales d'éther et d'alcool (500 ml environ pour 1 1 de
lait). Décanter la phase aqueuse que l'on porte à l'ébullition pendant 1
heure environ pour chasser les traces de solvants et d'ammoniaque.
On acidifie ensuite avec de l'acide acétique à 15 % jusqu'à
précipitation complète de la caseine. Recueillir la caseine et l'hydrolyser
selon les modalités indiquées ci-dessous.
Hydrolyse de la caseine par l'acide chlorhydrique : 100 g
de caseine sont suspendus dans 500 ml de Hcl à 20 % et mis sous reflux
pendant une vingtaine d'heures. On évapore ensuite l'acide par distillation
sous vide jusqu'à obtention d'un résidu p~teux qu'on reprend par l'eau et
qu'on amène à pH 3,5 avec de la soude et à 1 litre.
• ••1• ••
Agiter avec 20 g de charbon (Norit A ou Darco G - 60)
pendant une durée allant de 15 à 60 mn selon l'intensité du brassage.
Filtrer. Le filtrat doit être jaune très p~le.
Conserver stérilement (autoclavage 15 mn à 115°).
La solution referme 100 mg de caseine par ml.
Hydrolyse de la caseine par l'acide sulfurique 100 g
de caseine sont traités dans 500 ml d'acide sulfurique à 25 % (en volume)
pendant 10 h à 120°. Neutraliser ensuite l'acide par de la baryte fine
ment moulue ou en solution sur buchner, laver et vérifier que la solution
ne renferme pas de traces de baryte (qui seraient éliminées par une
addition d'acide sulfurique).
Amener la solution à 1 1 et terminer comme précédemment
par un traitement au charbon à pH 3,5.
Glucose + A + B
Nous proposons de composer un mélange sec aVec le glucose,
le tampon phosphate (solution A) et les digo-éléments (solution B). En
prenant soin de réaliser ce mélange aVec des produits préalablement dés
séchés au dessicateur, et une fois le mélange fini-de le repasser au
dessicateur, on obtient un produit se conservant facilement plusieurs
mois dans des bouteilles bien bouchées.
Les proportions du mélange sont les suivantes
glucose •••••••••••••••••••••••••••••••••
Po4
H2K•••••••••••••••••••••••••••••••••
P04HK2~~~~~~~···························S04Mg hydraté •••••••••••••••••••••••••••
S04Fe •••••••••••••••••••••••••••••••••••
S04Mn •••••••••••••••••••••••••••••••••••
Cl Na •••••••••••••••••••••••••••••••••••
1 000 g
25 g
25 g
10 g
1 g
1 g
1 g
G LOS SAI R E
- -- - - - - - - - - - --------------------------
Acide folique fola te
Apport quotidien recommandé :
QUantité quotidienne d'un nutriment qui est jugée
satisfaisante pour maintenir pratiquement tout individu en bonne
santé.
Note L'apport recommandé pour tel ou tel nutriment n'est pas censé
couvrir les besoins supplémentaires en ce nutriment qui "peuvent
résulter de conditions anormales, telles que les infections
microbiennes et parasitaires, les syndromes de malabsorption
ou les anomalies du métabolisme d'origine génétique ou dégénérative".
Certains additifs alimentaires, médicaments ou autres produits
chimiques élèvent aussi les besoins en nutriments essentiels.
Pour chaque nutriment, l'apport recommandé vaut pour les cas
où par hypothèse, les besoins en calories et en tous autres
nutriments sont pleinement satisfaits.·
carence nutritionnelle:
Manque absolu ou relatif d'un nutriment qui, slil persiste
suffisamment longtemps et atteint une gravité suffisante, détermine une
maladie de carence.
Concentration normale d'hémoglobine
Concentration d'Hb chez un sujet donné, dans des conditions
idéales de santé et de nutrition.
Pour une collectivité, dans des conditions idéales de santé
et de nutrition, la distribution de fréquence des teneurs en Hb dans un
échantillon représentatif exprime la distribution de fréquence normale
pour l'ensemble de la collectivité.
0 ••1•••
Enrichissement
Parmi les divers termes en usage, c'est le terme
"enrichissement" (en anglais fortification) qui est recommandé
par le comité mixte FAOjOMS d'experts de la Nutrition dans son
huitième rapport, connne celui "qui convient le mieux pour désigner
le procédé consistant à ajouter des substances nutritives à des aliments
afin de préserver ou d'améliorer la qualité du régime d'un groupe, d'une
collectivité ou d'une population.
Maladie de carence
Tout état pathologique spécifique, accompagné de signes
cliniques caractéristiques, da à un apport insuffisant d'énergie ou
de nutriments essentiels; il est généralement d'origine alimentaire -
et est souvent évitable ou curable par augmentation de l'apport jusqu'au
niveau vou lu.
TABLE DES MAT1ERES
-=-~~=-=-=-=-~=-~=-=-=
Introduction •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
Première Partie :
1- Rappel sur les anémies nutritionnelles (A.N)
1- Définition d'une anémie nutritionnelle
2- Répartition géographique des A.N
2-1: pays développés de la zone
PAGES---1
4
4
5
2-2
2-3
tempérée •••••••••••••••••••
Pays en voie de développement
Pays subtropicaux et tropicaux
d'Afrique ••••••••••••••••••
5
6
7
3- COnclusion.o ••••••••••••••••••••••
11- Acide folique •••••••••••••••••••••••••••
1- Historique ••••••••••••••••••••••••
2- Structure et propriétés de l'acide
folique et des substances voisines
3- Biogenèse •••••••••••••••••••••••••
4- Catabolisme •••••••••••••••••••••••
5- Apport alimentaire••••••••••••••••
5-1 Sources ••••••••••••••••••••
5-2 Apports quotidiens recomman
dés par l'OMS••••••••••••••
6- Absorption•••••••••••••••• o •••••••
7- Transformation ••••••••••••••••••••
8- Excrétion•••••••••••••••••••••••••
9- Carence en acide folique ••••••••••
8
10
10
10
14
15
16
16
16
16
18
18
18
9-1
9-2
Carences expérimentales ••••
Causes des carences ••••••••
19
21
•••1•••
10- Mode d'action du déficit en A.F••••••••••
111- Vitamine B12
•• o ••••••••••••••••••••••••••••••
1- Historique •••••••••••••••••••••••••••••••
2- Structure et propriétés ••••••••••••••••••
3- Biogenèse ••••••••••••••••••••••••••••••••
4- Apport Alimentaire •••••••••••••••••••••••
5- Absorption et transport ••••••••••••••••••
6- Excrétion••••••••••••••••••••••••••••••••
7- causes des carences ••••••••••••••••••••••
8- Mode d'action du déficit en vitamine B12
22
23
23
23
26
28
28
31
32
33
IV- Interrelations vitamine B12
- acide folique ••• 35
Deuxième Par~ie :
2- Les méthodes directes •••••••••••••••••••• c
3- Méthodes indirectes ••••••••••••••••••••••
1- Acide folique •••••••••••••• o •••••••••••••••••••
1- Prélèvements •••••••••••••••••••••••••••••
2-1 : Méthodes chimiques •••••••••••••••
2-2/: Méthodes microbiologiques ••••••••
2-3 Méthode radio-llnmunologique ••••••
2-4 Test de clairance ••••••••••••••••
38
38
38
38
39
46
52
52
52Test à l'histidine (FIGLU) •••••••3-1
3-1-1 : Electrophorèse à haut
Voltage ••••••••••••••••••••
Dosage de la lacticodéshydrogénase
Test thérapeutique••••••••••••••••.
Test de traversée digestive •••••••
3-2
3-3
3-4
3-1-2
3-1-3
3-4-1
3-4-2
3-4-3
3-4-4
Méthodes enzymatiques ••••••
Méthode spectrophotométrique
Matériel ••••••••••••••••••••
Préparations des solutions ••
Dosage radioactif dans l'urine
Dosage radioactif dans les fécès
53
54
57
61
61
61
61
61
61
62
•••1•••
ERRATA------------------------
Page Lire ••••• o. Au lie~ de ••••••••___________ 1 t ----------------~------------------------
18 •••• sont de 5 à 15 mcg/l (5 à 15ng/m1)
5 à 15 mcg/ml (5 à 15 mg/1)
21 parasitoses parasitose
30 transcobalamine transcobalomine
36 fom,)'l THF formul THF
45 les valeurs normales de la folérnieen mcg/l
ng/l
50 prudent, que prudent que
65 Escherichia Eschérichia
Euglena gradlis Englena gracilis
considéré!t'sera le-mmej
.' 'il ~ .~ •
! Anémies nacrocytaires!
•.-sera le même
considérée
: Anémies J!lacrocytaires
76
97
113 nO 35
emarque :
.-----------!-:!_---~------------------------------!--~------------------------------------------. , . ,. \. . .
La fin de la conclusion se trouve ap~ès la page de Bibliographie c'est-à-dire
à la page 108.
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