REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATI QUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L ’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES- SENIA

FACULTE DES SCIENCES DEPARTENT DE PHYSIQ UE

MEMOIRE

présenté par

Melle Samira NAIR

Pour obtenir

LE DIPLOME DE MAGISTER

Spécialité : Physique Option : BioPhysique Mathématique & Simulations

intitulé :

les Phénomènes de Repliement et de Dépliement des Protéines : Exemple: Protéine d’ubiquitine Etude de Simulation et Conséquences Médicales

soutenu le : 05.05.2009 .à la salle de conférences de la Faculté des Sciences devant le Jury composé des membres suivants : SLIMANI MILOUD : Professeur à l’Univ. d’Oran Es-sénia, Algérie (Président) DJEMAÏ Abed-El-Farid : Professeur à l’Univ. d’Oran Es-sénia, Algérie (Rapporteur) BOUKREDIMI Djamel : Maître de Conférences à l’Univ. d’Oran Es-sénia, -

Algérie

(Examinateur)-

Es-sénia

BELHADJI Maâmar : Professeur à l’Univ.d’ Oran , Algérie

(Examinateur)

Ce travail est dédié à ma mère qui est partie trop tôt. A mon père, a mes frères et mes sœurs.

Remerciements

Je tiens à remercier ... Tout particulièrement Le professeur A.E.F.Djemai, mon encadreur, Responsable de la Post- Graduation de Biophysique Mathématique & simulations, pour la confiance et la liberté qu'il m'a accordée et pour la collaboration fructueuse

que nous avons eue, autant sur un plan scientifique, dans notre effort de combiner des approches théoriques et expérimentales, que sur un plan humain, et le soutien qu’il m’a témoigné tout au long de cette mémoire. Je le remercie, pour toutes les discussions que nous avons pu avoir et pour les précieux conseils qu'il m'a donnés, et pour sa patience et ses encouragements qui m’ont permis de travailler dans les meilleures conditions. Je le remercie sincèrement d’avoir inspiré ce mémoire avec enthousiasme.

Je remercie le professeur Slimani Miloud, pour l’honneur qu’il me fait de présider le jury de mémoire, Merci également au professeur Belhadj Maâmar et

Docteur Boukredimi Djamel, qui ont bien voulu examiner et me faire l’honneur de juger et de corriger mon travail et pour leur encouragement et leur disponibilité.

J’adresse également mes plus vifs remerciements au professeur N.Karam, et au professeur S.Hiadsi, pour leurs conseils, soutien et disponibilité.

Un merci tout particulier à Zouambi Leila pour son encouragement, sa gentillesse et sa disponibilité en toutes circonstances.

Je remercie Mr M.O.Bensaid Pour les longues discussions et les conseils en simulation qui a contribué à la réussite de ce travail, ainsi Melle F.Benyatou pour ses conseils et sa disponibilité.

Merci à tous les étudiants en thèse de mémoire rencontrés: Mr M.Amraoui, O.Bouhacina, M.Boukabcha, pour leur soutien et disponibilité.

Merci aussi à vous que je ne cite pas ici mais qui avez contribué à ce mémoire par vos conseils ou votre amitié.

Sommaire Chapitre I : Structure et Fonction des Protéines

1. Introduction 2. Eléments de base en biologie moléculaire

2.1. Eucaryotes et procaryotes 2.2. Acide aminé (AA) 2.3. Acide nucléique, bases azotées et nucléoti des 2.5. Structure et transformations de l ’ADN et types d ’ARN 2.6. Ribosome 2.7. Code génétique

3. Biosynthèse des protéines 3.1. Mécanisme de la traduction

3.1.1. L’initiation 3.1.2 .l’élongation 3.1.3. La terminaison

4. Structure des protéines 4.1. Structure générale 4.2 Les acide aminés

4.2.1 Le carbone central (chiral) 4.2.2 Propriétés physico-chimiques des acides aminés

4.2.2.1 Ionisation 4.2.2.2 Propriétés physiques

4.2.2.2.1 Aspect 4.2.2.2.2 Isomère optique 4.2.2.2.3 Absorption dans l’ultraviolet

4.2.2.1.4 Solubilité 4.2.3 Propriétés chimique des acides aminés

4.2.3.1 Réactions dues à la présence du carboxyle 4.2.3.1.1 Formation des sels 4.2.3.1.2 Décarboxylation

4.2.3.2 Réaction dues à la présence du groupement aminé 4.2.3.2.1 N-alkylation et N-arylation 4.2.3.2.2 N-acylation 4.2.3.2.3. Action de formol 4.2.3.2.4. Action de l’acide nitreux 4.2.3.2.5. Désamination

4.3 Séquence 4.4 Classification des α-aminoacides selon la nature des chaînes latérales

4.4.1 Les acides amines polaires 4.4.2 Les acides amines chargées 4.4.3 Les acides aminés hydrophobes

4.5 La liaison peptidique 4.5.1 Formation de la liaison peptidique 4.5.2 Propriétés géométr iques de la liaison peptidique 4.5.3 L’isomérie cis et trans

4.6 Les angle de la chaîne peptidique 4.6.1 Les propriétés des angles des chaines peptidiques

4.7. Diagramme de ramachandran 4.8. Les différents niveaux de structure des protéines

4.8.1. Liaison intervenant dans la structure spatiale des protéines

4.8.1.1 liaisons disulfures ou pont disulfure 4.8.1.2 Liaison ionique ou saline 4.8.1.3 Liaison hydrogène 4.8.1.4 Liaison hydrophobe

4.8.2. La structure primaire 4.8.3. La structure secondaire

4.8.3.1 Les hélices 4.8.3.1.1 L’hélice α 4.8.3.1.2 Autres structures hélicoïdales

4.8.3.2 Le feuillet β 4.8.3.3 Coudes et boucles

4.8.4 Structure tertiaire des protéines 4.8.5 Structure quaternaire des protéines

5. Les types des protéines 5.1 Classification des protéines suivant leurs formes 5.2 Classification des protéines suivant leur fonction biologique 5.3 Classification des protéines suivant leur composition

6. techniques de séparation des protéines 6.1 Gel de filtration 6.2 Précipitation suivant leur solubilité 6.3 Chromatographie d’affinité 6.4 Chromatographie échangeuse d ’ion 6.5 Electrophorèse

7. Propriétés des protéines 7.1 Propriétés physico-chimique

7.1.1 Solubilité 7.1.1.1 Influence de la concentration en sel (force ionique µ) 7.1.1.2 Influence du pH 7.1.1.3 Influence de la température et de solvants organiques 7.1.1.4 Propriétés électriques

7.2. Propriétés physiques 7.2.1 Sédimentation 7.2.2 Viscosité 7.2.3 Propriétés optiques 7.2.4 Masse molaire

7.3 Propriétés chimiques 7.3.1 Propriétés de la liaison peptidique 7.3.2 Propriétés des chaines latérales

7.5 Propriétés biologiques 8. Relation structure fonction dans les protéines 9. Conclusion

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Chapitre II : Stabilité des Protéines (Repliement et Dépliement)

1. Introduction 2. Stabilité des protéines et cinétique de repliement

2.1. Une stabilité marginale

2.2. Les effets di fférents qui influençant la stabilité de la structure native 2.2.1. Interactions électrostatiques 2.2.2. Effets hydrophobes et solvatation 2.2.3. Ponts disulfure

3. Cœur hydrophobe 4. Dénaturation des protéines 5. Repliement des protéines 6. L’Aspect cinétique et thermodynamique du repliement 7. Approche théorique pour l’étude de repliement des protéines

7.1. « Random Energy Model » et Protéines 7.1.1. Le Random Energy Model (REM) 7.1.2. Application naïve au cas des hétér opolymères aléatoires 7.1.3. Le paramètre d’ordre pertinent :

7.2. Cinétiques de repliement des protéines 7.2.1. Repliement : cinétique de 1er ordre réarrangement

intramoléculaire 8. Modèles pour l’effet de repliement

8.1. L’effondrement hydrophobe : 8.2. Le modèle de nucléation-propagation 8.3. Le modèle de diffusion-collision 8.4. Le modèle « Framework » 8.5. Le modèle hiérarchique 8.6. Le modèle « Jigsaw Puzzle » 8.7. Le modèle de « l’entonnoir énergétique de repliement 8.8. Les modèles expérimentaux de repliement

8.8 .1. Le repliement à deux états 9. Caractérisation des différents états impliqué dans l’effet de repliement

9.1 L’´etat natif 9.2 L’´etat dénature – La pelote statistique 9.3 Les états intermédiaires du repliement – Le « molten globule »

10. Forces de repliement 11. Chaperons et repliement des protéines in vivo 12. Modèles théoriques pour étudier le repliement 13. Une description théorique simple 14. Dépliement des protéines 15. Etude du repliement des protéines par des simulations de dépliement

15.1. Mécanismes de repliement simple 15.2. Mécanismes de repliement complexe

16. Rigidité et souplesse des protéines 16.1. Dynamique des protéines 16.2. Facteurs de température

17. La prédiction de structure 18. Conclusion

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Chapitre III : Etude Théorique du Repliement

et Simulation Numérique 1 .Introduction 2. L'espace CARTÉSIEN et Déterminations des symboles, notations 3. Degrés de liberté, fonction d'interaction et équations de mouvement 4. HAMILTONIEN et fonction d'interaction : Champs de forces utilisés

4.1. Champ de force 4.1.1. Interactions entre atomes liés

4.1.1.1. Elongation des liaisons covalentes entre atomes 4.1.1.2. Déformation des angles entre atomes liés 4.1.1.3. Termes de torsion, angles dièdres et impropres

4.1.2. Interactions non-liées 4.1.2.1. Interactions de LENNARD-JONES 4.1.2.2. Interactions électrostatiques

4.1.3. Forces spéciales dues aux contr aintes 4.1.4. Inclusion de la polarisabilité

5. Mécanique et dynamique moléculaires 5.1. Minimisation de l'énergie 5.2 .Dynamique moléculaire

5.2.1. Principe 5.2.2. Résolution de l’équation du mouvement

6 .Systèmes dans le vide 7. Système dans un milieu solvates (non vide)

7.1. Solvant explicite 7.2. Solvant implicite (modèle de Born généralisé)

8. Modélisation de la dynamique de la chaîne peptidique des protéines en solution par RMN à travers les couplages dipolaires.

8.1. Couplage dipolaires résiduels et dinarique (Base théorique) 8.1.1. L’Interaction Dipôle-Dipôle Directe 8.1.2. Couplages Dipolaires Résiduels en milieux orientant

8.2. Utilisation des CDR dans l’étude dynamique 8.2.1. Traitement théorique 8.2.2. Modèle à symétrie axiale 8.2.3. Modèle des Fluctuations Axiales Gaussiennes 8.2.4. Modèle du saut à deux sites

8.3. Méthodes numériques 8.3.1. Le Tenseur d’Alignement 8.3.2. Calcul du paramètre de dynamique

9. Logiciel TINKER : 10. Description des algorithmes 11. Analyse des repliements (Utilisation des repliements sur les génomes) 12. Banques et Classifications (Banques de structures) 13. Simulation de dynamique moléculaire

13.1. Réalisation d’une dynamique moléculaire 13.1.1. Structure initiale de la molécule 134.1.2. Paramétrisation 13.1.3. Minimisation de la structure

14. Ensemble appliquée à la dynamique moléculaire 15. Topologie du système 16. Protéine d’Ubiquitine

16.1. Protéine d’ubiquitine 16.2. Structure de l’ubiquitine 16.3. Mécanisme d'action

17. Théorie et méthodes 17.1. Modèles de protéine et fonctions d’énergie

18. Modèle de protéine à simuler 18.1. Protéine ubiquitine (VPS27)1o06 18.2. Régions de 1o06

19. Résultats et discussion 20. Conclusion

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Chapitre IV : Conséquences Médicales 1. Introduction 2. La protéine prion et prion pathogène 3. L’ubiquitine et la protéine chaperonne 4. Le système d’ubiquitination 4.1. Enzyme activant l’ubiquitine, E1 4.2. Enzymes conjuguant l ’ubiquitine, E2S 4.3. Les ubiquitines-Ligases E3S et leur classification 5. protéasome-ubiquitine 6. La voie ubiquitine–protéasome 7. Maladies pathologiques impliquant l'ubiquitine 8. Maladies neuro-dégénératives

8.1. Maladie d'Alzheimer 8.2. La maladie de Parkinson 8.3. Maladie de Creutzfeldt-Jakob

9. Conclusion

Légende des Figures : Chapitre 1 : Fig1 : Squelette d’un brin d’ADN. Fig2 : Les quatre bases azotées. Fig3 : Liaison A=T : deux liaisons hydrogène. Fig4 : Liaison CΞG : trois liaisons hydrogène. Fig5 : Sucre des nucléotides = ribose Fig6 : Structure de l’ADN Fig7 : Conformation de la double hélice de l'ADN dans sa conf ormation usuelle (ADN-B). Rouge: le brin phosphodiester. Bleu: Guanine. Jaune: Cytosine. Fig8 : Structure générale de l’ADN. Fig9 : le processus de la réplication de l’ADN. Fig10 : Le déroulement de la transcription avec l’élément ARN polymérase. Fig11 : structure de l’ARN messager. Fig12 : Represente la structure generale d’un ARNt. Fig13 : figure représente le ribosome. Fig14 : représente la transcription et la traduction des protéines Fig15 : Structure de l’ARN messager avec ces codons Fig16 :l’initiation de la traduction de protéine Fig17 : Enchaînement de 2 AA Fig18 :l’étape de l’élongation Fig19 : Résultat final de la traduction « la protéine » Fig20 : structure générale d’une protéine Fig21 : représente une structure générale théorique des α-acide amines N’existe pas en réalité. Fig22 : Figure représente les di fférentes catégories des acides aminés Fig23 : géométrie dans l ’espace des types d’acides aminés Fig24 : réactions représentent la formation de la liaison peptidique Fig25 : distance de liaison peptidique Fig26 : Configurations trans et cis Fig27 : Configurations trans et cis pour des liaisons peptidique du types X-pro Fig28 : les angles dièdres des chaines peptidiques Fig29 : les angles dièdres des chaines peptidiques Fig30 :representation de Newman se sont troix exemples de valeur d’angles diéddres Fig31: Le graphique de Ramachandran Fig32 : Carte de Ramachandr an représente des glycines Fig33 : les différents niveaux de structure des pr otéines Fig34 : La structure primaire d’une protéine Fig35 : les hélices α Fig36 : exemple d’un feuillet β Fig37 : feuillets plissés β Parallèles Fig38: feuillets plissés β Antiparallèles Fig39 : Coudes d ’inversion; Reverse turn ou β turn Fig40 : Exemple d’une présentation en structure tertiaire d’une protéine Fig41 : Exemple d’une représentation en structure quaternaire d’une protéine Fig42 : Relation entre les différentes catégories de str uctures

Chapitre 2 : Fig. 1 : Les protéines sont marginalement stables « Effets compensatoi res ». Fig. 2: Représentes les di fférents effets qui influence la stabilité d’une protéine. Fig. 3 : Une protéine mal repliée peut encore retrouver sa conformation correcte. Fig.4 : Dénaturation et renaturation spontanée d’une petite protéi ne. Fig. 5 : Représentation explicite et implicite de l’eau et simulation du repliement. Une conformation dénaturée (à gauche) et repliée (à droite) de la petite protéine Trpcage. Fig.6 :(repliement) La protéine assemblée se replie pour former une structure tridimensionnelle précise. Fig. 7 : diagramme représente le Repliement en entonnoir schématique d’une protéine. La largeur de l’entonnoir représente l’entropie, la profondeur, l’énergie—“Folding funnel” of a pro tein . Wi d t h and depth respectively represent entropy and energy. Fig. 8 : a) Paysage énergétique plat de type trou d’un terrain de golf correspondant au Paradoxe de Levinthal b) paysage énergétique présentant un chemin de repliement de A vers l’état natif N. c) paysage énergétique idéal qui guide les conformations vers la conformation native N d) paysage énergétique pour lequel il existe un repliement rapide de A vers N et un processus lent de B vers N avec un état intermédiaire transitoire. Fig.9 : Entropie pour le Random Energy Model . Fig. 10 : Détermination graphique de la température de repliement. Fig. 11 : Représentation schématique des deux modèles de repl iements d ’âpres. Fig. 12: Représentation schématique de la structure cristalline du lysozyme. Sur la droite, le domaine α est constitué de cinq hélices (en rouge et jaune). Sur la gauche, le domaine β est constitué de trois brins b (en bleu) et d’une hélice. Fig.13 : Représentation schématique du dépliement (a -> f) ou du repliement (f -> a) du Lysozyme à six étapes différentes d’une trajectoire de dépliements obtenus par simulation de dynamique moléculaire. Les hélices α sont représentées par des serpentins en bleu et les feuillets β par des flèches rouges.

Chapitre 3 : Fig.1 : Modèles (e,R*) et (e,s) des paramètres de VAN DER WAALS pour Une molécule diatomique de type X-X. Energie d'interaction en Fonction de la distance de séparation entre les deux atomes. Fig.2 : Représentation de la méthode du champ de r éaction. L'atome i auCentre de la sphère de rayon est entouré de charges situées À Le champ de réaction est créé par les charges images à . Fig.3 : Inconvénient des méthodes de gr adient : le minimum local atteint par les deux Boules a et b est di fférent et dépend de la position (configuration) initiale. Fig. 4 : Schéma représente les deux spins, de l’orientation du champ magnétique B0 et de l’angle θ. Fig.5 : représentation des Orientation du champ B0 et du vecteur internucléaire dans le repère lié à la molécule. Fig.6 : A gauche : Coordonnées d ’un vecteur internucléaire dans le repère principal du tenseur d’alignement. A droite : Isocontours des CDR par rapport à un tenseur d’alignement ; la valeur des CDR va croissant du gris au noir en passant par le blanc.

Fig.7 : Milieu orientant Fig. 8 : Illustration du mouvement FAG et du passage du repère peptidique au repère principal de la molécule par la rotation d’angle (α,β,γ). Le vecteur N-NH est en jaune Fig.9: Comparaison entre le modèle FAG (trait plein) et saut à deux sites (pointillés), D étant

la valeur du couplage (pas à l’échelle) (α = β = γ = 60°, Aa = 20.10-4, Ar = 13.10-4) Fig.10 : Représentation de La structure de l’ubiquitine. Fig.11: surface moléculaire de l'ubiquitine Fig.12 : la structure de l’ubiquitine (VPS27)1o06. Fig.13 : Séquence de la chai ne A d’après les clase de scop,DSSP ,PDB. Fig.14 : structure secondai re de la chaine A. Fig.15 : Interface TINKER (Keywords set (Édition des paramètres) à gauche, visualisation graphiqueà droite de la protéine 1o06. Fig.16 : Structure native de l’Ubiquitine (1o06), prise par TINKER. Fig.17 : Structure de l’ubiquitine (1o06) analysée par PDB XYZ. Fig.18 : Evolution dynamique de la structure de l’ubiquitine (1o06) sous le champ de for ce AMBER99, T INKER. Photos pri ses toutes les trois mn. Fig.19 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t. Fig.20 : les phases de la dynamique de l’ubiquitine (1o06), champ de force AMBER99, TINKER. Fig.21 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t. Fig.22 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T. Fig.23 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t, Fig.24: L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NPE chaque 100picosecande. Fig.25: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t. Fig.26 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T. Fig.27 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t, Fig.28 : L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NPT chaque 100picosecande. Fig.29 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t. Fig.30: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T. Fig.31 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t, Fig.32 :L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NVE chaque 100picosecande. Fig.33 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t. Fig.34 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température. Fig.35: Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t Fig.36 : L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NVT chaque 100picosecande. Fig.37: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

Fig.38: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température. Fig.39: Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t Chapitre 4 : Fig.1 : Modèle de la protéine prion PrP2 Fig.2 : Structure cristalline de l'ubiquitine Fig.3 : Représentation du protéasome obtenue par Diffractométrie de rayons X après cristallisation. Le cœur catalytique 20S est en bleu. Les deux complexes régulateurs 11S sont en rouge. Fig.4 : Interaction entre la voie « loi N-terminale » et le système ubiqui tine protéasome. Fig.5 : Représentation de la dégradation des protéines par l’ubiquitine-protéasome. Fig.6 :Modèle de dégradation de CD4 en présence de Vpu (Margottin et al.,1998). Fig.7 : figure représente une cellule en début de mitose, et une cell ule en interphase, et la protéine Vpu, visualisée grâce a un ant icorps couplé à un fluorochome vert, est présente dans des compar timents péri-nucléaires (Golgi, réticulum). Fig.8 : Schéma de la structure cristalline de l’ubiquitine avec la Représentation des feuillets β (4) et de la longue hélice α (résidus 23 à 34). Fig.9 : Représentation schémati que de la famille De gènes ayant une fusi on naturelle à l’ubiquitine UBI1… Fig.10 : Aspect des lésions observées dans la maladie d’Alzheimer à l’examen microscopique. Fig.11 : schéma représente le Mécanismes mis en jeu dans la mort des neurones dopaminergiques. Fig.12 : Voies moléculaires impliquées dans la pathogénie de la maladie de Parkinson. Fig.13 : Maladie de Parkinson et voie protéolytique ubiquitine-protéasome.

Légende des Tableaux :

Chapitre 1 : Tableau1 : présente les différents radicaux des acides ami nés Tableau 2 : Le tableau de code génét ique Tableau 3 : Tableau du modèle « sphère solides » les valeurs limitent Chapitre2 : Tableau 1 : représentes des di fférents mouvements des protéines. Chapitre4 : Tableau 1 : Influence de l’acidose métabolique sur le métabolisme protéique au cours des maladies rénales et chez les sujets sains. Tableau 2 : Résultats obtenus à par tir de test de viabil ité cellulaire (MTT) sur des cellules PC12 utilisant différents peptides β dont la taille varie de 40 à 42 acides aminés et dont la Séquence varie du sauvage à une séquence mutée au ni veau de la méthionine 35.

INTRODUCTION GENERALE

INTRODUCTION GENERALE : Une protéine est une macromolécule biologique constituée par une ou plusieurs chaines d’acides aminés reliées entre elles par des liaisons peptidiques. Généralement, on parle de « protéine » lorsque la chaîne contient pl us de 100 acides aminés. Quoique dans le cas contraire, on parle de « peptides » ou de « polypeptides », mais plus souvent simplement de « petite protéine ». Les protéines sont donc des macromolécules polymériques possédant des propriétés physico-chimiques très importantes au sein des organismes vivants. Elles sont considérées à juste titre comme étant l es molécules de la « vie ».

Leurs structures définissent leurs fonctions au sein des différents organismes vivants. En fait, la structure de base des protéines, nommée structure primaire, est la séquence l inéaire des acides aminés. Toutefois, une protéine ne garde jamais une forme strictement linéaire. En effet, l'énergie contenue dans les liaisons hydrogène, les ponts disulfures, l'attraction entre les charges positives et négatives, et les radicaux hydrophobes ou hydr ophiles, exigent de la protéine d’adopter une structure secondaire en hélice alpha ou en feuillet bêta. D’ailleurs, les protéines sont encore plus compactes en adoptant une structure tertiaire. Cependant, quand une protéine est formée de plus d'une chaîne polypeptidique, tel que l'hémoglobine et certaines enzymes, on di t qu'elle a une structure quaternaire.

On distingue plusieurs types de protéines. Leur classification peut se faire de plusieurs façons : selon la structure, selon la fonction biologique ou selon leur composition.

L’étude des confor mations structurelles des protéines constitue un des thème s de recherche fondamentale et expérimentale actuelle de grande importance. En effet, beaucoup de scientifiques de différentes disciplines s’intéressent de plus en plus à ce thème dont l ’importance en médeci ne commence à se pr éciser davantage.

Dans ce contexte, le phénomène du repliement des protéines a été expliqué comme étant le passage d’une chaîne d’acides aminés vers une structure tridimensionnelle native bien déterminée et permettant à la protéine d’exercer sa fonction biologique. C’est la dernière étape de l’emploi de l’information contenue dans l’ADN. Or, la structure native est totalement prédéfinie par l’ordre des acides aminés dans la chaîne polypeptidique. ADN Transcription ARN Traduction chaîne polypeptidique Repliement Protéine

En effet, le passage de la structure primaire à la structure tertiaire se fait par un processus purement physique, appelé repliement. En pratique, cela veut dire, qu’une protéine en s’écartant fortement de sa structure native, suite par exemple à un choc avec une autre macromolécule, erre parmi ses multiples états non-natifs pendant un temps très élevé à l’échelle atomique, en tentant de retrouver sa structure native.

Plus précisément, ce phénomène de repliement produit une ségrégation des groupes alcanes au sein de la protéine ainsi qu’une exposition au solvant des chaînes latérales les plus polaires. Cette ségrégation réduit les zones de contact alcane-eau, et ceci se répercute sur la potentielle thermodynamique de la protéine. Dans ce cas, on dira que la structure repliée est stabilisée par l’effet hydrophobe des

groupes alcanes. Par contre, l’état déplié, quant à lui, est stabilisé par le nombre énorme de conformations, et donc caractérisé par une grande entropie.

Néanmoins, le mécanisme exact qui conduit au phénomène de repliement de

ces protéines reste à ce jour une énigme. Certes, plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer ce phénomène. Toutefois, cet énigme a été formalisé correctement dans le cadre de ce qui est appelé le paradoxe de Levinthal. Ce paradoxe peut être levé par le concept de chemin de repliement, qui consiste à dire que la protéine ne cherche pas sa structure native « par hasard », mais plutôt par un « chemin spécifique» parmi les différentes structures non-natives qui mènera vers un minimum local d’énergie, c'est-à-dire vers sa structure native qui est la plus stable au niveau thermodynamique, et ce dans les meilleurs délais.

En pratique, il a été remarqué qu’une protéine à température ambiante se replie en quelques secondes, voire même quelques millisecondes, que cela soit in vitro ou in vivo. En théorie, pour une protéine composée d’une séquence de « n » acides aminés, possédant chacun « m » conformations possibles, le nombre total de conformations possibles que peut adopter cette protéine (dans sa recherche de sa structure native) est égal à mn. Sachant que le temps de passage d ’une conformation à une autre est d’environ 10-13s, et si on considère par exemple que m=2 et n=100, ceci se traduit par un temps égal à environ 1010 années (même ordre de grandeur que l’âge présumé de l ’Univers)!!!.

Récemment, les méthodes numériques ont connues un essor très important

dans différents domaines d’application. En particulier, les simulations de dynamique moléculaire, qui permettent d’étudier le comportement d’un système moléculaire complexe en fonction du temps, se sont développées énormément par le biais de logiciels de plus en plus performant et évolués. En fait, ces simulations permettent d’échantillonner un espace de conformation important et inabordable aux expériences de minimisation d’énergie.

Le but de ce mémoire est d’étudier le phénomène de repliement (et de

dépliement) des protéines par une approche de simulation de dynamique moléculaire en utilisant le logiciel TINKER version 4.2 /2004.

En particulier, on s’est intéressé à la molécule d’ubiquitine. Cette protéine

particulière est employée comme marqueur de protéines cibles. Elle est très importante en médecine, vu que le processus d’ubiquitination, qui indique la fixation spécifique et régulée d’ubiquitine sur une protéine cible, a pour but de reconnaître la protéine ciblée (malade) afin de permettre son élimination. La protéine d’ubiquitine est décrite par une séquence de 73 acides aminés et ses propriétés ont été puisées du site Protein Data Bank, en termes de fichiers pdb.

Ce mémoire est organisé comme suit. Le chapitre 1 est consacré à une revue

des éléments de base de la biologie moléculaire ainsi qu’une rétrospective sur la biosynthèse des protéines, leurs différentes structures, leurs types, leurs propriétés et leurs fonctions.

Le chapitre 2 est quant à lui consacré à la présentation du phénomène de repliement (et de dépliement), ses aspects cinétique et thermodynamique, sa description théorique ainsi que la recherche de la stabilité des protéines.

Dans le chapitre 3, on présente le formalisme de la simulation de dynamique moléculaire, le logiciel TINKER ainsi que la protéine simulée d’ubiquitine. On présente aussi nos résultats obtenus et nos interprétations et conclusions.

Dans le chapitre 4, on présente l’importance de la protéine choisie dans le domaine médical. De même, on discute les répercussions médicales du phénomène de repliement.

MOTS CLES : Ubiquitine, TINKER, Repliement et dépliement des protéines, Protéine 1o06, Dynamique moléculaire.

Chapitre I Structure et Fonction des Protéines

1. Introduction : La protéine est reconnue comme étant l’un des principaux éléments

constitutifs cellulaires. D’ailleurs, le terme « protéine », qui a été proposé en 1838 par Mulder, vient du mot grec « proteios » signifiant : premier en position ou de première importance, [1].

En effet, les protéines sont des constituants très importants des cellules vivantes, dont la diversité et la complexité structurale sont les plus élevées, aussi bien d’un point de vue quantitatif (elles représentent en général plus de la moitié du poids sec des cellules), que du point de vue qualitatif, puisqu’on trouve des protéines ayant un rôle biologique principal à coté des protéines dites structurales, en particulier les enzymes, catalyseurs biologiques nécessaires à la suite des réactions dans les cellules des organismes vivants, [2] .

Ainsi, les protéines sont des macromolécules naturelles complexes formées par l’enchainement linéaire de résidus peptidiques-NH-CH- CO-. En milieu acide aqueux elles se dégradent en libérant des α-amines qui peuvent être reconnues par chromatographie, [3].

En général, les protéines sont une union de petites molécules (ou résidus) nommées acide aminé de série L, [1]. D’ailleurs, il existe 20 acides aminés différents qui séquencent les protéines.

Toutes les protéines contiennent les quatre éléments : C, H, O et N. Nombreuses sont celles qui contiennent du soufre, et certaines d’entre elles renferment du phosphore. La quantité en azote des protéines est en général au voisinage de 16% (en masse), [2]. De plus, les protéines sont l’un des quatre matériaux de base de tout organisme, avec les lipides, les glucides, et les acides nucléiques.

En général, les protéines possèdent de multiples fonctions structurales et fonctionnelles. Dans ce chapitre, on rappelle les éléments de base en biologie moléculaire qui nous permettront de décrire les structures et les fonctions des protéines.

2. Eléments de Base en Biologie Moléculaire : 2.1. Eucaryotes et procaryotes :

Tous les organismes vivants sont classés en deux grandes catégories : ü les eucaryotes ü les procaryotes.

En effet, à l ’intérieur de chacune de leurs cellules, les eucaryotes ont un noyau : petit sac entouré d’une membrane semi perméable enfermant les chromosomes. Ainsi, l’homme, les animaux et les plantes sont considérés comme des eucaryotes. Quant aux procaryotes, tels que les bactéries, ils ne possèdent pas de vrai noyau mais une structure beaucoup plus simple non entourée d’une membrane. C’est de ce « proto-noyau » que vient le nom générique qui les désigne.

Chez les eucaryotes, les gènes sont généralement composés de deux types de séquence nucléotidique : l’une dite codante (appelée exon) et l’autre non codante (appelée intron). Les exons portent l’information qui sera directement servie pour produire les protéines et les introns, qui se disposent entre les exons, ne sont pas lus lors de la traduction. Du fait de

cette disposition alternée exon/intron, on emploie l’expression gène mosaïque [4-5].

2.2. Acide aminé (AA) : Comme son nom l’indique, un acide aminé est une petite molécule qui

possède une fonction acide et une fonction amine primaire. En effet, les acides aminés sont des composés organiques bi-fonctionnels qui contiennent un groupe amine basique (-NH2) et un acide carboxylique (-COOH), dont l’enchainement compose les protéines : on dit qu’une protéine est un polymère d’acides aminés (les monomères). Dans la nature, il existe 20 acides aminés différents (voir tableau1), [4], et qui possèdent des fonctions et propriétés diverses en fonction de la nature de la chaîne latérale -R. Par exemple, dans l’alanine, la chaîne latérale -R est (-CH3), alors que, dans la cystéine, elle est (-CH2-SH).

Tableau1 : Les différents radicaux des acides aminés.

On traitera les acides aminés, avec un peu plus de détails dans l’étude de la structure des protéines.

2.3. Acides nucléiques, bases azotées et nucléotides : Les acides nucléiques sont des polymères formés par l’enchainement de nucléotides. Ils jouent un rôle primordial dans le stockage, le maintien et le transfert de l’information génétique, [4]. On distingue, deux types d’acide nucléique : l’acide ribonucléique (ARN) et l’acide désoxyr ibonucléique (ADN).

L’ADN, dont l’appellation dérive du mot Acide Désoxyribo-Nucléique, est une molécule de support génétique qui existe dans tous les organismes vivants. Elle contient sous forme codée toutes les informations relatives à la vie d’un organisme vivant, du plus simple au plus complexe, animal, végétal, bactérien, viral, [6]. En effet, l’acide désoxyribonucléique joue le rôle, dans chaque cellule, d’une « banque de données », [7]. L’information qui y est

amoncelé permet à chaque composant cel lulaire d’être synthétisé, rassemblé et régulé.

Une molécule d’ADN est formée de deux brins d’ADN complémentaires qui s’associent en orientation opposée et qui s’emboîtent tout en s’enroulant l’une autour de l’autre pour former une double hélice droite constituant ainsi une macromolécule composée de 150 milliards d’atomes, découverte en 1953, [6] .

En fait, l’ADN est un polymère de bases désoxyribonucléiques, plus couramment appelées nucléotides. Chaque nucléotide est constitué d'un groupe de phosphate lié au désoxyribose (un sucre), lui-même lié à une base azotée. C’est d’ailleurs le sucre qui donne son nom à l’ADN. Ces bases azotées sont au nombre de quatre : l'Adénine (A), la Thymine (T), la Cytosine (C) et la Guanine (G). Donc, Le squelette de l'ADN est formé par la répétition sucre-phosphate, [6].

(Les phosphates, en jaune, les sucres (Désoxyribose), en bleu, et les bases azotées, en vert.)

Fig1 : Squelette d’un brin d’ADN.

On distingue deux familles de bases azotées : la famille des purines (l’adénine (A) et la guanine (G)) et la famille des pyrimidines (La thymine (T) et la cytosine (C)). Un nucléotide = sucre (ose) + base azotée + groupement phosphorique, [8].

Les bases azotées sont complémentaires deux à deux (voir figure2,3,4):

l'adénine s'associant avec la thymine et la guanine avec la cytosine. Le second brin d'ADN est donc compl émentaire au premier et les bases azotées complémentaires sont reliées entre elles grâce à des liaisons hydrogènes, [6].

Fig2 : Les quatre bases azotées.

Fig3 : Liaison A=T : deux liaisons hydrogène.

Fig4 : Liaison CΞG : trois liaisons hydrogène.

L’Acide RiboNucléique (ARN) est un acide nucléique constitué d’une seule chaîne de nucléotides. C’est donc un Polymère de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters, de structure analogue à celle de l’ADN. Il existe pourtant des différences chimiques entre ces deux acides nucléiques qui donnent à l’ARN certaines propriétés particulières. L’ARN est produit par transcription de l’ADN et possède quatre bases Adénine, Guanine, Cytosine et Uracile (à la place de la Thymine), [8].

Fig5 : Sucre des nucléotides = ribose.

2.4. Structure et transformations de l’ADN et types d’ARN: L’ADN a deux brins qui ont trois propriétés primordiales, [6] :

ü Antiparallèles ü Complémentaires ü hélicoïdaux

Fig6 : Structure de l’ADN.

Fig7 : Conformation de la double hélice Fig8 : Structure générale de l’ADN de l'ADN dans sa conformation usuelle (ADN-B). Rouge: le brin phosphodiester. Bleu: Guanine. Jaune: Cytosine.

L’ADN est une macr omolécule formée de deux br ins relies par des liaisons Hydrogènes, formant une structure de double hélice à pas droit (voir figure6,7,8). On remarque que les plans des bases sont perpendiculaires à l’axe de l’hélice d’où les bases s’empilent. Il existe 10 paires de bases par pas d’hélice où le pas de l’hélice est égal à 3,4 nm et le diamètre de l’hélice est égal à 2 nm, [8].

L’ADN peut subir trois différentes transformations biochimiques : La Réplication, la Transcription et la Traduction.

En effet la biosynthèse de l’ADN est nécessaire à la multiplication des cellules, car elle permet de transmettre l’information génétique de la cellule mère aux cellules filles : on parle donc de réplication ou de duplication, [2].

L’étude de la réplication de l’ADN a débuté il y a environ 40 ans, quoique ce processus ne soit pas encore compris avec tous ces détails au niveau des mécanismes moléculaire, [2]. Alors, Meselson et Stahl ont prouvé à travers leurs expériences que la réplication du ADN se faisait selon le mode semi-conservatif. Donc, pour toute division (mitose), la molécule d’ADN double-brin est copiée en deux molécules d'ADN double brin filles dont chacune hérite un brin de la molécule d'ADN initiale ou « mère » et d'un brin néo-synthétisé à partir de nucléotides libres. Ainsi, lors de la réplication, les paires de bases sont tout d'abord séparées par la

rupture des liaisons hydrogènes de l'ADN par une enzyme appelée ARN hélicase (figure 9).Cependant, une fourche de réplication va alors se former donnant 2 brins d'ADN simple-brin différents, tel que chacun de ces brins va être copié par l'action des ARN polymérases, pour former 2 nouvelles molécules d'ADN double brin identiques à la molécule mère, [6].

Fig9 : le processus de la réplication de l’ADN.

La transcription, [9], est l’ensemble des mécanismes par lequel l’ARN messager (mARN) est synthétisé. Ainsi, le mARN est une copie d’une portion de l’ADN (figure 10). Cependant, certaines portions de l’ADN sont transcrites et ces séquences seront dites gènes. Ainsi, un gène comprend la séquence en nucléotides qui sera transcrite ensuite traduite en acides aminés, mais également des séquences admettant de réguler cette fabrication de protéine en fonction des conditions cellulaires. La longueur d’un gène peut varier de quelques centaines, à plus d’un million de nucléotides, [4]. En fait, seul l’un des deux brins d’ADN est copié en mARN. La transcription est donc la configuration de l’étape préliminaire nécessaire pour la biosynthèse protéique ou traduction.

Fig10 : Le déroulement de la transcription avec l’élément ARN polymérase.

Quoique, la transcription ne produit pas uniquement des mARN, mais aussi des tARN (ARN de transfert), des rARN (ARN ribosomique) et des snARN (ARN small nuclear). Ce dernier est un acide ribonucléique nucléaire qui se trouve uniquement dans le noyau et participe à la régulation post-transcriptionnelle, [8].

L’acide ribonucléique messager (mARN) est la copie du gène qui serait traduite en protéines (figure11).Il sert à porter l’information génétique de son lieu de stockage (le chromosome) vers le lieu de synthèse des protéines (les ribosomes), [4]. En effet le mARN est une molécule qui a une conformation de ruban, issue de la transcription de l’ADN, et porteuse du code autorisant L’élaboration des protéines par « traduction » du code génétique.

Fig11 : structure de l’ARN messager.

Le rARN est le composant principal des ribosomes, la machinerie cellulaire où a lieu la traduction en protéines de l’information qui se trouve dans les mARN, [8].

Quant à l’ARN de transfert (tARN) (figure12), il est responsable du transport des acides aminés jusqu’aux ribosomes lors de la traduction des mARN. En fait, chaque tARN transfert un acide aminé, de façon particulière. Sa séquence conçoit une série de trois nucléotides, appelée anticodon, qui reconnait le codon coïncidant à l’acide aminé qu’il transporte, [4].

Fig12 : Represente la structure generale d’un ARNt. 2.5. Ribosome : On savait déjà que la synthèse des protéines se faisait dans le ribosome, particule ribonucléoprotéique qu’on nommait alors par microsome, malgré que l’existence de l’ARN messager ne fût pas encore découverte. Ce n’est que vers la fin des années 50 et le début des années 60, que ces particules furent isolées entièrement, en particulier d’E.colli. En même temps que leur isolement était achevé, une analyse sérieuse de la composition des ribosomes a pu être établie, [10]. Ainsi, le ribosome est la plus petite structure cellulaire visible seulement au microscope électronique.

Fig13 : figure représente le ribosome.

En effet, le ribosome est formé de deux sous-unités, une petite et une grande, pour les eucaryotes 40s et 60s, et chez les procaryotes 30s et 70s (voir figure 13). Chaque unité est formée d’un mélange d’ARN (ARNr) et de protéines (environ 60% ARNr et 40% protéines), [5].

2.6. Code génétique : Le code génétique, est un système de correspondance permettant de

traduire une séquence d’acide nucléique en protéine. Dans ce système, un triplet de nucléotides, ou codon, désigne un acide aminé. Comme il existe 4 nucléotides, il y a 4×4×4=64 codons différents. À un codon donné, correspond un seul et unique acide aminé.

Par contre, il n’existe que 20 acides aminés différents dans les protéines de ce fait plusieurs codons codent avec le même acide aminé. Certains de ces 64 codons ne codent avec aucun acide aminé. Ces codons dits « non-sens » indiquent à la machinerie cellulaire la fin de la lecture de l’information qui est dans les gènes, et incitent l’arrêt de fabrication des protéines. On les nomme aussi codons-stop.

Tous les êtres vivants (à quelques variantes prés) possèdent le même code génétique, que ce soit chez l ’homme, l’animal, le végétal ou la bactérie, donc il est universel, [4].

Tableau2 : Le tableau de code génétique. 3. Biosynthèse des protéines : La difficulté qui se pose à propos de la biosynthèse des protéines, c’est de connaître comment les organismes vivants peuvent se regrouper, dans un ordre bien définit et sans faire d’erreurs, des centaines d’aminoacides .ou encore, il faut se demander comment est programmée cette biosynthèse, comment est déterminée la structure primaire (la séquence des aminoacides) d’une protéine dont on va l’étudier par suite. Nous savons simultanément que l’information renfermée dans l’ADN est transcrite, grâce à la ARN-polymérase-ADN dépendante, en ARN messager .maintenant on va voir comment cet ARN messager commande l’incorporation des aminoacides dans un ordre déterminer et permet ainsi la synthèse d’une protéine caractéristique ou de multiples protéines caractéristiques, [2].

U C A G U Phe (F)

Phe (F) Leu (F) Leu (F)

Ser (S) Ser (S) Ser (S) Ser (S)

Tyr (Y) Tyr (Y) STOP STOP

Cys (C) Cys (C) STOP

Trp (W)

U C A G

C Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L)

Pro (P) Pro (P) Pro (P) Pro (P)

His (H) His (H) Gln (Q) Gln (Q)

Arg (R) Arg (R) Arg (R) Arg (R)

U C A G

A Ile (I) Ile (I) Ile (I) Met (M)

Thr (T) Thr (T) Thr (T) Thr (T)

Asn (N) Asn (N) Lys (K) Lys (K)

Ser (S) Ser (S) Arg (R) Arg (R)

U C A G

C Val (V) Val (V) Val (V) Val (V)

Ala (A) Ala (A) Ala (A) Ala (A)

Asp (D) Asp (D) Glu (E) Glu (E)

Gly (G) Gly (G) Gly (G) Gly (G)

U C A G

Fig14 : représente la transcription et la traduction des protéines.

3.1. Mécanisme d e la traduction, [11] : La traduction se fait dans le cytoplasme pour l’eucaryote, or la traduction se passe avec la transcription dans le même endroit pour les procaryotes. Alors : ü Le passage du gène à la protéine ce fait grâce au code génétique. ü Dans le code génétique, un acide aminé coïncide à une succession de 3

nucléotides : TRIPLET ou CODON. ü Le code génétique est dégénéré, puisque plusieurs triplets peuvent avoir la

même sensation, c’est-à-dire codé pour le même acide aminé.

Fig15 : Structure de l’ARN messager avec ces codons.

En effet, la traduction est la modification d’un message contenu dans un acide nucléique, et l’ARNm, en une chaîne polypeptidique. Elle est effectue au niveau des ribosomes avec l’intervention des ARNt (t comme transfert) en trois phase. 3.1.1. L’initiation : Commençons par L’ARNt initiateur se fixe sur un codon de l’ARNm. Cet ARNt est relié à la Méthionine puisque le premier codon est toujours AUG (Adénine, Uracile, Guanine).En ce momon, les 2 sous-unités du ribosome parviennent se fixer à l’ARNm.

Fig16 :l’initiation de la traduction de protéine. Fig17 : Enchaînement de 2 AA.

3.1.2. L’élongation : Durant l’élongation, il y a Fixation d’un nouvel ARNt en face du 2ème codon de l’ARNm et formation d’une liaison peptidique entre deux acides aminés. Ainsi que une Translocation du ribosome d’un codon et mise en place d’un 3ème acide aminé. L’ARNt de la seconde retourne dans le cytoplasme et ai nsi de suite (figure 18).

Fig18 :l’étape de l’élongation.

3.1.3. La terminaison : En fin, Le ribosome vi ent à un codon STOP ou NON SENS ( UAA, UAG, UGA) auquel ne correspond aucun acide aminé, donc aucun ARNt. La chaîne protéique se détache donc du ribosome. Alors, après qu’en lisant toute la séquence d'ARN messager, le ribosome fabrique une longue chaîne d'acides aminés, qui forment la protéine (figure19).

Fig19 : Résultat final de la traduction « la protéine ».

4. Structure des protéines :

4.1. Structure générale : Les protéines se sont des polymères d’acides aminés ou des macromolécules, formées par des enchainements d’aminoacides liés entre eux par les liaisons peptidiques (fonction amide), Qui constituent le squelette de la molécule (figure20).

En effet, Une liaison peptidique se forme entre le groupe amine (-NH2) d’un acide aminé et le groupe carboxylique (-COOH) d’un autre.

Or, La formule générale d’un acide aminé est H2 N –CHR –COOH. Le groupe latéral –R peut être n’importe quoi à partir d’un simple atome jusqu’à une molécule complexe. Le terme “polypeptide” se réfère simplement à une longue chaîne d’acides aminés. Ainsi que, une fois la chaîne protéique regroupée, elle doit être repliée correctement pour affirmer sa fonction. Bien que, La structure et la conformation (c'est-à-dire repliement) de chaque protéine est spécifique.

Mais, on ne saisit pas encore entièrement la manière dont la séquence en acides aminés détermine la conformation de la protéine. Donc une “protéine” peut être constituée d’un ou multiples polypeptides séparés; elle peut être formée de feuillets (des chaînes d’acides aminés alignées ensemble) qui ont des structures en enroulements.

On distingue clairement que les Propriétés des polypeptides et protéines dépendent de leur composition en acides aminés, [12].

Généralement, en fonction du nombre d’acides aminés, on parle de protéines donc inferieure de 10 on emploie le non peptide, et de 10 à 100 polypeptide, après seulement on parlera de protéines, [13].

Fig20 : structure générale d’une protéine

4.2. Les acides aminés :

4 .2.1 Le carbone central (chiral) : Les acides amines ce sont des unités monomériques des protéines. Dans le monde de vivant, on perçoit deux groupes. La première conçoit vingt α-aminoacides constitutifs de toutes les protéines ; les fonctions amine et carboxyle sont donc tenues par le même atome de carbone dit α, ou le carbone où s’attache-la fonction amine est nommée carbone α et sera noté par la suite Cα. Or, ce carbone est lié à quatre groupes divers (COOH, NH2, H et R), il est chiral (a l’exception la glycine où R est unHydrogène) , [14].

La deuxième regroupes tous les autres aminoacides, ceux que l’on trouve à l’état libre et qui jouent souvent un rôle métabolique important et ceux recentrés dans quelque petits peptides (moins de vingt aminoacides) faits par des micro-organismes ou des plantes uniquement. Nous en s’intéresse surtout a la première classe, car comme on a dit auparavant les vingt α-aminoacides constitutifs des protéines, jouent aussi des rôles métabolise important en tant que annonci ateurs d’autres constituants cellulair es, [2].

Fig21 : représente une structure générale théorique des α-acide amines . N’existe pas en réalité.

Il faut noter qu’il ya plusieurs catégorie d’acides amines, au plus des α-acides aminés il ya types (ß, δ,..)D’acide amine ou les deux fonctions amine et carboxyle sont portées par des atomes de carbone distincts (figure 22), [2].

Fig22 : Figure représente les différentes catégories des acides aminés.

4.2.2 Propriétés physico-chimiques des acides aminés : 4.2.2.1. Ionisation : L’ionisation c’est une propriété physique et chimique à la fois. Alors, pour tous les amines acide ont au moins deus groupes ionisables, le carboxyle et l’amine ; donc ils sont amphotères, ou le groupement carboxyle d’un acide aminé peut donner un proton et il devient un anion, par cantre le groupement aminé peut immobiliser un proton et formé un cation, [2].Or, il ya trois formes possibles pour un acide aminés neutre : ü Cation NH3+ : charge nette +1 ü Anion C00- : charge nette -1 ü Zwitterion NH3+ et C00- : charge nette 0.

Forme zwitterionique : valeurs de pH Physiologique.

Remarque : On appelle « zwitterions » les composés qui possèdent une charge positive sur un atome et une charge négative sur l'autre. Or, La charge des acides aminés varie en fonction du pH. Ainsi que, il n’ya pas d’ionisation dans les protéines avec COOH et NH2 de la chaînes commune, les charges arrivent des chaînes latérales R, [13]. 4 .2.2.2. Propriétés physiques : 4.2.2.2.1.Aspect : En générales, les acides aminés on un aspect d’un Poudre blanche Des fois cristallisés, [16]. 4.2.2.1.2 Isomère optique : Tous les aminoacides ont un carbone α asymétrique, ou les quatre valences sont liées à des atomes ou à des groupements différents, à l’exception de la glycine qui a deux H sur le carbone α. Par exemple dans le cas de l’alanine on peut écrire la formule spatiale de deux isomères optiques ou énantiomères, dont le mélange forme un racémique, non applicables car l’un est l’image de l’autre par rapport à un miroir plan, et dont les propriétés physique et chimiques sont semblables, sauf le pouvoir de rotatoire. On remarque, ainsi pour chaque aminoacide un isomère D, et un isomère L, selon que la structure spatiale est semblable à celle du D ou du L glycéraldéhyde, duquel la configuration absolue est connue. Bien que, les formules spatiales sont assez compliquées à noter, et l’on favorise d’utiliser les formules planes en projection données par Fischer ; pour modalité on écrit les aminoacides de la série D avec le groupement aminé droite, et ceux

de la série L avec le NH2 à gauche ;or, il est remarquable que les aminoacides constitutifs des protéines sont tous de la série L .mais dans différents peptides bactériens, spécialement ceux qui entrent dans la composition de la paroi cellulaire, ou encore dans certains peptides doués d’activité antibiotique, on voit les aminoacides de la série D .notons que D-acides aminés c’est le symétrique de L par rapport à un miroir et l’appartenance à la série D ou L n’a rien à voir avec le sens dans le quel l’aminoacide fait dévier le plans de la lumière polariser, [2].

Fig23 : géométrie dans l’espace des types d’acides aminés.

4.2.2.2.3 Absorption dans l’ultraviolet : Les acides amines montrent une absorption importante aux longueurs d’onde moindres à 230nm (2300A) ; en effet, certains d’entre eux absorbent entre 250 et 300nm pour l’existence dans leur chaîne R de chromophores, comme le noyau phényle (Tyr) ou le noyau indole (Trp) admettant ainsi le dosage spectr ophotométrique des protéines, [2]. 4.2.2.1.5 Solubilité : La solubilité dans l’eau diminue avec le nombre d’atome de carbone de la chaîne aliphatique. Or, s’il ya un agent polaire, la solubilité augmente, [13]. En effet, en générale les acides aminés sont solubles dans l’eau Si pH très bas ou très élevé, [13]. 4.2.3 Propriétés chimique des acides aminés, [2] : Les amines acides possèdent des propriétés chimiques attribuées par le groupement carboxyle. Ainsi que, Le groupement aminé et le radiale R, mais ne citerons que les plus importantes, et surtout celles auxquelles nous ferons appel par la suite lorsqu’ on va faire l’étude sur des protéines. 4.2.3.1 Réact ions dues à la présence du carboxyle : 4.2.3.1.1 Formation des sels : La propriété de formation des sels, peut être utilisée pour désigner les aminoacides, mais à cause de la faible dissociation du carboxyle, il faut aller à des pH élevés, entre 11 et 12 pours voir la saturation totale sauf si l’on titre en présence de formol. 4.2.3.1.2 Décarb oxylation : La décarboxylation, elle peut être effectuée en laboratoire, mais elle a lieu enzymatiquement dans les cell ules vivantes.

4.2.3.2 Réact ion dues à la présence du groupement aminé : 4.2.3.2.1 N-alkylation et N-arylation :

En général, les H du NH 2 on peut les remplaces par des radicaux : ü Aliphatiques, dans le plus simple est CH3 ; on peut avoir des dérivés N-

méthylés,N-diméthylés et N-triméthylés. ü Aromatiques, comme les dérivés dinitrophénylés(DNP) que l’on utilise pour

la détermination de l’acide aminés N-terminal des protéines.

4.2.3.2.2 N-acylation : Les N-acylation, ce sont Des radicaux formyle, acétyle (facilement hydrolysable) ou carbobenzoxyle (C6H5-CH2-O-CO-, facilement éliminé par hydrogénation) sont utilisés au laboratoire en raison de permettre d’arrêter momentané la fonction aminé.Or in vivo, on distingue les dérivés N-acétylé et N-benzoyle de la glycine formés au cour de la détoxication, il faut noter que la N-formyl-méthionine qui joue un rôle principal dans l’initiation de la biosynthèse des protéines chez les bactéries et ainsi que les organites.

4.2.3.2.3 Act ion de formol : Le formol, ou formaldéhyde ou encore méthanal, réagie sur le NH2 des acides amines à température ordinaire et à pH neutre pour construire des dérivés dihydroxyméthylés qui sont des aminés tertiaire et non plus primaires, or se sont des bases plus faible, ou le pk est plus bas, et en peut neutraliser les acides amines par une base en pr ésence de phénolphtaléines, alors sans être forcer d’aller à des pH aussi grand qu’en absence de formol. C’est ce qu’en nomme le formol titration de Sorensen. 4.2.3.2.4 Action de l’acide nitreux : L’acide nitreux réagit sur le groupement NH2 en délivrant de l’azote. 4.2.3.2.5 Désamination : La désamination et la transamination, se sont deux réactions enzymatiques très importantes, dont ils provoquant la disparition du groupement aminé. 4.3 Séquence : Comme on a dit au par avant que Toutes les protéines sont formées par l’enchaînement du motif ou le groupement chimique R, nommé chaîne latérale et soutenu par un carbone nommé Cα, inclus à une liste de vingt cas.au motif coïncide l’élément monomère nommé acide aminé, dont les deux groupes terminaux ont été écrites sous leur forme chargé. 4.4 Classification des α-aminoacides selon la nature des chaînes latérales, [14] : Puisque il ya 20 acide aminés naturels donc 20 différents chaînes latérales R, qui forment les protéines. L’abréviation peut être à trois lettres, et dans le cas général les trois premières lettres du nom, ou à une lettre acceptent de les appeler de la manière générale. On peut les ordonner suivant leur réactivité chimique on trois classe :

ü Polaires ü Chargés ü Hydrophobes

4.4.1 Les acides amines polaires :

Les acides amines polaires mais non chargés se sont la thréonine, la sérine, la tyrosine, la glutamine, l’asparagine et la cystéine. Quoi que, Leurs chaînes latérales a un groupement hydroxyle, phénol, amide ou thiol. Or, Le groupement thiol de la cystéine compose souvent un pont désulfure avec une autre monomère cystéine après oxydation. Ainsi que, Les ponts désulfures jouent un rôle essentiel dans la structure des protéines en produisant une liaison covalente entre deux régions différentes de la chaîne où entre deux chaînes protéiques distinctes. 4.4.2 Les acides amines chargées : Les acides aminés chargés ce sont l’acide glutamique, l’acide aspartique, l’arginine ,la lysine, or dans quelque cas l’ arginine ,l’histidine et la lysine sont chargées positivement donc l’acide aspartique et la glutamique sont chargés négativement à pH physiologiques. Dont La charge positive de l’histidine dépend de son environnement du quel le pKa de l’acide composé de l’histidine, dont le cycle imidazole est protoné égale a 6,1. 4.4.3 Les acides aminés hydrophobes : En effet, les acides aminés hydrophobes possèdent des chaînes latérales non chargées et non polaires. Ce sont la valine, la leucine, la glycine, l’alanine, la méthionine, la Phénylalanine, l’isoleucine, le tryptophane et la proline. Or, Entre ces acides aminés, à la qualité d’avoir une fonction amine secondaire et un cycle qui exige des contraintes de forme à la chaîne capitale. Tendis que, Les chaînes latérales de la tyrosine et de la phénylalanine ont des groupements aromatiques ou la complication stérique est importante et utiles. 4.5 La liaison peptidique : 4.5.1 Formation de la liaison peptidique : L’or de la synthèse d’une protéine par une cellule vivante, le groupe carboxyle d'un acide aminé réagit avec le groupe amino d'un autre acide aminé pour former une liaison peptidique (CO—NH) ou cette liaison à deux caractéristiques principale qui déterminent les propriétés Biologiques des protéines. Quoi que, la liaison peptidique est une structure plane et rigide. Et aussi le carbone asymétrique qui porte à la fois le radical et les deux groupements -NH2 et -COOH donne une articulation libre autour de laquelle les radicaux tournent librement .en effet, la planéité de cette liaison a été observer expérimentalement par des études cristallographique sur les acides amines et les peptides, [14]. Ainsi que Le groupe carboxyle du deuxième acide aminé réagit de la même manière avec le groupe amino d'un troisième, et ainsi de suite, jusqu'à la construction d'une chaîne, ou peptide, qui peut tenir de deux à divers de centaines d'acides aminés. Les deux aminoacides aux extrémités de la chaîne sont nommés : N-terminal pour celui qui a sa fonction α-aminée libre et C-terminal pour celui qui a sa fonction α-COOH libre, [15].

Fig24 : réactions représentent la formation de la liaison peptidique. 4.5.2 Propriétés géométriques de la liaison peptidique : Les calculs de la mécanique quantique et les diagrammes de rayons X de cristaux de dipeptides (union de deux acides aminés comme une chaîne) ou d’oligopeptides, ont montrent que la distance C-N dans la liaison peptidique est 1,325A°, beaucoup plus proche de la distance dans la double liaison C=N (1,25A°) que dans une si mple liaison.par exemple, la distance N-Cα dans la chaîne peptidique est de 1,455A°. Ce qualité de double liaison de la liaison C-N et le fait que la position trans, des atomes O et H est plus stable de 4Kcal/mole que la position cis, mènent à placer les quatre atomes C, O, N, H dans en mê me plan, [16].

Fig25 : distance de liaison peptidique.

4.5.3 L’isomérie cis et trans : En réalité la liaison peptidique peut être sous deux configurations : le première est la configuration cis ou en distingue le O du C=O est de même coté de la liaison peptique que le H du NH et la configuration trans ou en voient les deux atomes sont de part et d’autre de la liaison. Or la configuration trans est énormément plus stable que la configuration cis car il y a moins de gène sur le plan stérique pou es deux groupes proches de R. alors, c’est donc particulièrement sous la configuration trans que seront partagés les atomes autour de la liaison peptidique, [17].

En générale, une liaison peptidique est dans une conformation trans, or les Cα qui s’accompagnent sont de part et d’autre de la liaison qui les unit, [18].

Fig26 : Configurations trans et cis.

Mais des liaisons peptidiques du type X-Pro peuvent exister dans les conformations cis et trans, [19].

Fig27 : Configurations trans et cis pour des liaisons peptidique du types X-pro.

4.6 Les angles de la chaîne peptidique : On distingue deux types d’angles qu’on peut les voir dans les chaines peptidique, se sont les angles de valences et les angles dièdre. Or, les angles de valence se sont les angles d’ouverture entre deus liaison successives, ainsi que les angles dièdres ou encore des angles de torsion se sont les angles entre deux pl ans autours d’une liaison. Alors, comme on a di t au par avant que La liaison peptide est plane et rigide, donc la chaîne essentielle et principales polypeptidique n'a que deux degrés de liberté de rotation autour des liaisons NH-Cα et Cα-CO. Dont, Les valeurs des angles de rotation autour de ces liaisons peuvent être évaluées par les angles dièdres φ (C'-N-Cα-C) et ψ (N-Cα-C-N'), [20].

Fig28 : les angles dièdres des chaines peptidiques.

4.6.1 Les propriétés des angles des chaines peptidiques : Tendis que le plan de la structure de la liaison peptidique est rigide, il interdit la rotation des atomes des fonctions acide et amine. Or, l’unique liaison ou l’orientation reste libre se sont celles qui enferment chacun des carbones asymétriques porteurs des chaines latérale. En général les angles dièdres est définit comme suit : Φ (phi) =CO (i-1)-NH(i)-Cα(i)-CO(i) et Ψ (psi) =NH (i)- Cα(i)- C(i)- NH (i+1).

Quoi que, la liaison (C-NH) qui se trouve à l’extrémité NH2-terminale peut pivoter librement, donc, l’angle de rotation de cette liaison est nommes angle Φ (phi). Ainsi que la liaison(C-CO) qui se trouve vers l’extrémité COOH-terminale peut aussi pivoter ou l’angle de rotation de cette liaison est nommes angle Ψ (psi). Et en remarque que la li aison peptidique (NH-CO) est de qualités proportionnellement double, ou la rotation est limité. Or, l’angle de rotation de cette liaison est nommes angle ω (oméga) et optera dans le cas général la valeur 180º (trans) ou parfois de 0º (cis). En effet, Fréquemment Les angles et subsistent eux aussi près de 180º (trans) mais avec un peu plus de changement que l’angle ω, grâce à leur qualités de liaison simple, [20].

Fig29 : les angles dièdres des chaines peptidiques.

Si en prend La représentation de Newman, on peut apercevoir ces angles dièdres dans la figure qui suit (figure30). En distingue la liaison Cα-N avec

l’azote à l’avant plan, ou l’angle φ est l’ongle qui se trouve entre deux carbones C des groupes carboxyliques. Et aussi pour l’angle ψ c’est l’angle qui se situe entre les deux azotes quand on observe la liaison Cα-C avec le carbone Cα en plan premier.

Fig30 :representation de Newman se sont troix exemples de valeur d’angles diéddres.

4.7 Diagramme de ramachandran : G.N. Ramachandran (1922–2001), c’est un chercheur qui a beaucoup

travaillé sur les peptides. Alors en nomme la carte de Ramachandran lorsqu’on prend sur un graphe les deux angles dièdre φ et ψ, on construisant un espace de deux dimensions, [14].

En effet, un diagramme de Ramachandran peut être construit de deux façon différentes, la manière la plus simple c’est le modèle de la « sphère solide » dont les atomes sont comptés comme des sphères « impénétrables »les unes par les autre tel que le rayon de Van der Waals qu’en vas l’étudier dans le chapitre suivant. Où, les sphères ne peuvent s’avancer à moins d’une distance donnée. Or, on utilise deux valeurs limites, la première c’est la limite « normale » et la deuxièmes c’est la limite « intérieure » on envisager sa dans le tableau suivant (tableau 3).

liaison limite

«normale » limite "intérieure"

C-C 2 ,8 2,7 C-O 2,8 2,7 C-N 2,9 2 ,8 C-H 2,4 2,2 O-O 2,8 2 ,7 N-N 2,7 2,6 H-H 2,0 1,9

Tableau 3 : Tableau du modèle « sphère solides » les valeurs limitent.

Or, la deuxième façon ou méthodes c’est de calculer l’énergie de la protéine pour des diverses valeurs des angles φ et ψ, [21].

Fig31 : Le graphique de Ramachandran.

Ramachandran a eu l’idée de composer un modèle limité de peptide où il pouvait faire tourner Les angles φ et ψ de 360°.Pour représenté sur un graphe les structures secondaires possibles en classées la variation de l’angle Ψ et en abscisse la variation de l’angle φ, on aura un tableau dont il montre les plus probables entre ces structure le graphique de Ramachandran. En plus en remarque que les acides aminés Gly et Proline sont éliminé parce que leurs chaines latérales ou aussi l’absence de chaîne, pour la glycine leur donnent des différentes propriétés.

En effet, la glycine le seul acide aminé sans carbone β, comme étant L’hydrogène est énormément moins encombrant qu’une chaîne latérale Carbonée, donc la carte de Ramachandran pour l’acide aminé glycine montre plus de conformations abordables que pour plus gros résidu.

Fig32 : Carte de Ramachandran représente des glycines

Ainsi que, Toutes les structures secondaires figurées par les

coordonnées de ce graphe ne peuvent pas s’effectuer par suite de l'encombrement stérique des atomes voisins. Or, il y a des zones avantagées acceptant la composition d'hélices ou de feuillets avec lequel les angles sont dévisagés habituellement dans les protéines, [20].

Alors, Ramachandran à réalisé l’analyse de forme sur des tris peptides et transcrit sur des diagrammes du même nom les valeurs des angles φ et ψ des formes les plus stable, or ces formes ou encore conformations conviennent à la convergence de plusieurs des différents critères, des critères de stériques d’encombrement de l’espace et des critères de répulsion électrostatique entre les liaisons covalentes, ce qui conduit totalement à un minimum énergétique. Dans ces diagrammes où les deux axes montrent les angles dièdres φ et ψ de part et d’autre d’un carbone α, des nombreuses zones différentes

apparaissent, spécialement les zones en hélice α, en brin ß, en hélice gauche et en triple hélice. Où, Ce diagramme est asymétrique du fait de la forme L des acides aminés. Quoi que, Les résultat expérimentales acquises par cristallographie des rayons X ou RMN des angles dièdres sont régulièrement dans les zones autorisées du diagramme de Ramachandran, sauf comme on a dit au par avant les glycines ils n'ont pas de carbone asymétrique, ainsi que les prolines, [22]. 4.8. Les différents niveaux de structure des protéines : Les protéines sont constitues de lentes chaines polypeptidique et nous connaîtrons maintenant comment la séquence des acide aminé de ces chaines peut être définie. Cependant, chaque protéines à une conformation, qui lui est spécifique, prouvée par d’autres types de liaison peptidique, on plus de la structure primaire, on affirme que la protéine « native »a une structure secondaire, tertiaires même quaternaire dans quelque cas. Mais avant d’apercevoir ces différentes structures, il faut savoir l’interaction qui lui rend possibles, [2].

Structure structure structure structure Primaire secondaire tertiaire quaternaire Fig33 : les différents niveaux de structure des protéines. 4.8.1 Liaison intervenant dans la structure spatiale des protéines, [2] : 4.8.1.1 liaisons disulfures ou pont disulfure :

C’est une liaison covalente donc forte qui est placé entre deux acides amines de cystéine appartenant soit à la même chaine peptidique, soit à deux différentes chaines. 4.8.1.2 Liaison ionique ou saline :

C’est une liaison électrovalentielle, non covalente donc plus faible, qui est placé entre un radical chargé positivement et un radiale chargé négativement, attachant ainsi soit deux parties d’une même chaines différentes .ce type d’interaction accepte même la liaison entre deux molécules différentes, or l’ exemple dans les complexes nucléoprotéiques, entre les acides nucléiques chargés négativement et les protéines basique spécialement les histones sont chargées positivement. 4.8.1.3 Liaison hydrogène :

La liaison d’hydrogène, c’est une liaison non covalente, se produit lorsque sont à proximité l’un de l’autre, d’une part un atome d ’hydrogène lié à un azote ou un oxygène, et d’autre part un doublet électronique non partagé d’un autre azote ou d ’un autre oxygène. Alors ces liaisons sont placées :

ü Entre les C=O et les N-H de la liaison peptidique

ü Entre les radicaux des monomère d’acide amine, et mêle par exemple le groupement amide de la glutamine.

4.8.1.4 Liaison hydrophobe: Quel que nombre d’acide aminé possèdent une chaine latérale hydrophobe, non polaire tel que ALa, Val, Leu, Phe…, qui ne construit pas de liaison hydrogène avec les molécules d’eau les quelles s’assemblent entre elles par des liaisons hydrogène ; or ces chaines latérales ainsi poussées disposent une aptitude à se reprocher, ce qui autorise ainsi des interactions entre des parties différents d’une chaines peptidique ces interaction sont du genre de forces de Van der waals. 4.8.2 La st ructure primaire :

C’est l’ordre dans lequel sont placés les acides aminés, ou encore la structure primaire elle coïncide à l’enchaînement des acides aminés dans la protéine avec les ponts cystéines, car les liaison peptidique ne sont pas les seules liaison malgré que se sont la base de la structure primaire, en effet, les protéines sont formes de nombreux chaines polypeptidique différents, or ces chaines sont unie entre elles par des liaisons secondaires, surtout des liaison hydrogène et par des ponts di sulfures, [23]. Cette chaîne polypeptidique est dirigée et polarisée parce qu'une des extrémités de la chaîne présente un groupement NH3+ terminal libre, quoi que l'autre extrémité à un groupement COO- libre.

Cα : blanc, C : gri, N : bleu, O : rouge

Fig34 : La structure primaire d’une protéine. 4.8.3 La structure secondaire :

La structure secondaire c’est le deuxième stade d’organisation, [16], le première correspondant à la succession linaire des acides amines c’est la structure primaire .En effet, la structure secondaire des protéines découle de la potentialité de formation de liaisons hydrogène entre l’oxygène du carbonyle et l’hydrogène de l’azote amide de la liaison peptidique :

—C= O………….H—N—. Or, l’arrangement de la chaine polypeptidique en une structure ordonnée

peut s’effectutuer selon distincts modèles duquel les caractéristiques ont été définit avec exactitude par Pauling et Corey [20].les deux structures secondaires les plus courantes se sont les hélices α et les feuillets β, [14].

4.8.3.1 Les hélices :

Les hélices ont une structure secondaire en conformation de ressort. Bien que, on peut définir sa forme par le nombre N d’unités peptidiques par tour d’hélice et par son pas P c ’est la distance entre deux tour s de vis, [14].

4.8.3.1.1 L ’hélice α :

La plus part des protéines possédant des régions ont une structure en hélice α, que l’on peut imaginer couramment comme un enroulement autour d’un cylindre imaginaire, composent une spirale régulière le pas de vis est de 5,4 A°, avec 3,6 restes d’acides aminés. Or, cette structure est stable grâce à de plusieurs liaison d’hydrogènes entre les groupements CO et NH des liaisons peptidique, [23].

En réalité, l’hélice comporte 3,7 monomères d’acide amine par tour de spire. Ainsi que, les plans des liaisons peptidiques fabriquent entre eux un angle de 80° environ, note que l’intersection entre les deux plans se retrouve toujours au niveau du carbone α. Par qu’antre, les chaines latérales sont dirigées vers l’extérieur et peuvent réagie entre elles ou avec le milieu, [2].

Généralement l’hélice α est toujours une hélice droite, ainsi que310et π sont droites on va voir ces type dans le paragraphe suivant, [22]. Elle s’éloigne en sinueux dans le sens des aiguilles d'une montre lorsque on observe dans l’axe de la chaîne principale, [14].

Alors théoriquement, les acides aminés possédant des angles de torsions construisant une hélice α sont égaux à –57° pour φ et –47° pour ψ. Mais, dans les protéines, les angles sont souvent de –62° et -41° respectivement pour l’hélice α, ce qui autorise à l'oxygène du carbonyle de s’éloigner de l'axe de l’hélice, [14].

Donc La liaison hydrogène elle est moins linéaire donnant à l'oxygène l’éventualité de construire des liaisons hydrogène concur remment avec le NH du monomère en Posi tion i+4 et avec l'eau ou des di fférents donneurs, [14].

Vue la nature des chaines latérales, sont souvent distribuées autour de l’hélice, on peut soutenir un Qualité hydrophobe si la maturité des chaînes sont hydrophobes ou amphiphile c'est-à-dire d’un côté Hydrophobe et d’un autre hydrophile, si les monomères d’une face sont hydrophobes et ceux de L’autre face hydrophile. Notons que Cette dernière obtention permet l’assemblage des structures secondaires pour donner la structure tertiaire, [14].

Fig35 : les hélices α.

4.8.3.1.2 Autres structures hélicoïdales :

Des exemples de d’autres structures hélicoïdales qui peuvent exister c’est Le ruban 2,27, les hélices 310 et Π (4,46 ) On faite, l’écriture 2,27, 310 et 4,46 montrent comment les liaisons hydrogène sont placées le long de l’hélice. Pour Le chiffre décimal donne le nombre de monomère par tour d’hélice et l’entier en montre le nombre d’atomes dans l’anneau fermé par la liaison hydrogène. Si en prend en considération ces notations, l’hélice α est une hélice 3,613.

Au sein des protéines on trouve rarement des types des hélices autres que α. Alors, en trouve aussi d’autre structures tel que quaternaires hélicoïdales elle existe surtout chez les protéines fibreuses tel que le collagène et la kératine, qui sont des fibres d’hélices. Notons que la collagène est formé de 3 hélices tordues les unes sur les autres, et pour la kératine est formée de dimères c'est-à-dire deux hélices mélangées hélicoïdalement l’une dans l’autre de manière à ce que les axes des héli ces arrangent aussi une hélice (Coiled coil rod), [14]. Remarquant, que si on étire une hélice α, de structure hélicoïdale, on arrive à la structure en feuillet plissé ß, [2]. 4.8.3.2 Le feuillet β : D’autre protéines, ou encore régions de protéines possédant une forme β, c’est une structure en feuillets consécutifs construisant un angle entre eux. Ainsi que, cette structure est stabilisée par des liaisons hydrogène, [23].

Fig36 : exemple d’un feuillet β.

En effet, le feuillet β est une hélice tout à fait spécifique avec un axe

de symétrie d’ordre deux peut être formée avec deux chaines parallèles, ou deux chaines antiparallèles. Quoi que, dans les deux cas il ya constitution d’une structure β, plissée en forme d’accordéon, les chaines latérales R étant périodiquement d’un coté et de l’autre de ruban.Or, la longueur de la liaison hydrogène dans les feuillets β est en moyenne de 3 A°, tandis que la participation de la liaison hydrogène à la stabilité de la structure secondaire est plus élevée, [16].

Fig37 : feuillets plissés β Fig38 : feuillets plissés β

Parallèles Antiparallèles

4.8.3.3 Coudes et boucles : Les coudes β sont des séquences de 4 acides aminés hydrophiles

constituant des plis de 180°stabilisés par une liaison hydrogène, à la surface de protéines, [23].

Or, on parle généralement d’épingles à cheveux β (β hairpin) parce que les deux extrémisées sont parallèles entre elles, [14].

Alors, pour les boucles Ω peuvent tenir plusieurs coudes β et possède l’aspect de la lettre grecque majuscule. En la retrouve compactes parce que leurs chaînes latérales ont l’aptitude à remplir l’intérieur de leurs creux, [14].

Fig39 : Coudes d’inversion; Reverse turn ou β turn. 4.8.4 Structure tertiaire des protéines :

La structure tertiaire c’est la structure spatiale complète d’une protéine, [23].or, la chaine polypeptidique déjà arrangée en structure secondaire se replie sur elle même pour composer une molécule assez compacte, montrant une configuration spatiale bien déterminée. C’est cette géométrie tridimensionnelle de la molécule qui forme la structure tertiaire, [24].

Notons que l’on peut trouver dans des protéines des architectures semblables, avec les mêmes substances de structure secondaire prend la même place dans l’espace, avec des différentes topologies, c'est-à-dire des différentes liaisons de ces él éments de structure secondaire.

Donc, La structure tridimensionnelle peut être décrite de façon hiérarchisée, par la catégorie de la protéine (α, β, α/β), l’architecture c'est-à-dire la distribution des éléments de structure secondaire, la topologie c'est la liaison entre les structures secondaires, ainsi que l’homologie de séquences le squelette Cα des protéines est élaboré par des flèches (brins β) et des tubes ou des hélices (hélices α), [22].

Fig40 : Exemple d’une présentation en structure tertiaire d’une protéine.

En effet, a partir des chaines latérales, se constitue un certain nombre de

liaisons intermoléculaires, des liaisons covalentes tel que les ponts disulfures et aussi grand nombre de liaisons de faible énergie : liaison hydrogène, liaison hydrophobes, liaison salines d’ailleurs on a discuté de ca dans le paragraphe (4.8.1). Dont ces différentes liaisons donnèrent à la structure tertiaire sa stabilité. Or, la nature des forces intermoléculaires et leur importance dans le maintien de la configuration « native » des protéines en solution serrant discuté en détail dans le chapitre suivant. D’ailleurs, ce sont ces forces qui mises en jeu dans tout changement de configuration des molécules protéiques, [24]. 4.8.5 Structure quaternaire des protéines :

La structure quaternaire résulte de l’assemblage de sous unités protéiques et non protéique, [2] .Or, Les places de tangence entre sous-unités sont très analogues à celles à l’intérieur d’une protéine à une seule sous-unité. Elles comportent des chaînes latérales non polaires rassemblées, des liaisons hydrogène et quel que cas des ponts disulfure inter caténaires, [14]. Ainsi que, on peut considérer comme constituant une structure quaternaire hétérogène une particule virale ou sont liés un acide nucléique et une protéine, [2].

Fig41 : Exemple d’une représentation en structure quaternaire d’une protéine.

Fig42 : Relation entre les différentes catégories de structures

5. Les types des protéines, [13] :

On distingue plusieurs types des protéines, on peut les classer suivant la forme, la fonction biologique et selon leur composi tion. 5.1 Classification des protéines suivant leurs formes: ü Protéines fibreuses ce sont le collagène, élastines et kératine α et ß. ü Protéines globulaires ce sont l’albumine, globuline et les histones qui formés

d’hélice α et de feuillets ß unis par des coudes ß ou par des pelotes statistiques.

5.2 Classification des protéines suivant leur fonction biologique : ü Protéines de structure ce sont, le collagène, élastine et Kératine.

Les enzymes. ü Protéines contractiles ce sont l’actine et myosine du muscle. ü Protéines de transport ce sont lipoprotéines c’est les lipides et hémoglobine.

5.3 Classification des protéines suivant leur composition : ü Hétéroprotéines ce sont des acides amines plusse le groupement

prosthétique qui sont des non protéique lié de manière covalente, dons les hétéroprotéines sont : chromoprotéines (hémoglobine), phosphoprotéines et glycoprotéines ….

ü Holoprotéine comporte des acides amines seulement. 6. techniques de séparation des protéines, [13] :

Il existe plusieurs méthodes d ’obtention des protéines on le situera. 6.1 Gel de filtration :

Cette méthode est élaborer en fonction de la taille .or, cette technique est réalisé à l’aide d’une colonne emplie de billes qui constitue de réseau très fins. On infiltre les protéines par le dessus de la colonne et en observe la distance qu’elles traversent. Remarquant que les petits protéines sont très vite attraper par les réseaux des billes et ne descendent que peu plus bas dans la colonne. Pour les moyennes protéines parviendront un peut plus bas avant de se perdr e dans les réseaux de bill es.

En fin les grosse protéines seront trop grosse pour entrer dans les réseaux de billes.ils passeront entre les billes et se apercevront en bas de la colonne.

6.2 Précipitation suivant leur solubilité :

Cette technique est basée sur les propriétés physico chimique ; on sert des sels qui vont faire accélérer certaines protéines et pas d’autre. Ainsi que, On rajoute pour ceci des sels qui vont entre en rivalité avec les protéines sur l’eau pour établir des liaisons avec une plus grande attirance sur le milieu aqueux. Donc, les protéines n’en plus assez d ’eau et accélèrent. Si en prend comme exemple 50% de saturation en sel dans le plasma, on remarque que la globuline précipite mais pas l’albumine.

6.3 Chromatographie d’affinité :

On utilise cette technique, quand il existe un mélange de protéines et que l’on veut avoir qu’une seule. Donc, on applique le principe d’affinité des protéines sur une résine ou sur des billes ou fixe un substrat non métabolisable de l’enzyme. Simultanément on ajoute le mélange de protéines en le faisait passer dans la colonne, elle se fixer la seul protéine recherchée, par qu’autre les autre ne font que passer. Âpres on fait changer le pH pour ôter la protéine de son substrat, que l’on reprit, alors elle est purifier on utilise l’anticorps caractéristiques, or ils vont reconnaitre exactement la protéine pour permettre le dosage de celle-ci (réaction antigène-anticorps). 6.4 Chromatographie échangeuse d’ion : C’est une méthode de séparation mécanise, identique de celle des acides aminés, or on distingue deux phase : ü Phase stationnaire : formée d’une résine avec des groupements

sulfoniques (SO3-) conçoive des charges négatives le pH est a baissé à 2, provoquant la protonation des acides amines sous la forme NH3+ qui se fixent alors sur les SO3-.

ü Phase mobile : ajoutant une plaque mobile avec lequel le pH croit doucement les protéines vont s’ôter un par un de la résine lorsque le pH de la phase mobile aura abouti leur pHi, ils arriveront alors sous forme anionique et seront dégagés de la résine et migreront alors avec la phase mobile.

6.5 Electrophorèse :

Cette méthode est baser sur la taille et de la charge. Donc, elle est en fonction de la construction en acides amines et de leur charge négative, positive ou nulle.

Or, les protéines vont partir vers la cathode (charge+) ou vers l’anode (charge-) ou ne pas migre (charge nulle) sur un gel de polyacrylamide, c’est

un tamis dans lequel les grand protéines auront du mal à migrer, quoi que le trajet est inversement relatif à la taille. En effet, le déplacement alors dépend alors de la taille. On appliquant la coloration, on persuade le poids moléculaire affectée par une échelle prévue.

7. Propriétés physiques, chimiques et biologiques des protéines: 7.1. Masse molaire, [27-2] :

On peut déterminer la masse molaire des protéines à l’aide de la technique de d’électrophorèse en gel de polyacrylamide avec SDS, (voir section précédente) ,la technique de chromatographie , et aussi la technique d’ultracentrifugation .On peut aussi déterminer la masse molaire à la température et dans une solution de concentration massique par unité de volume C ,en mesurant la pression osmotique P :

P (Pression osmotique) = RTC/M Où R représente constante de gaz parfait.

7.2. Solubilité : La solubilité des protéines représente leur tendance à se dissoudre dans

l'eau. Cette solubilité est en fonction du pH, de la force ionique et de la température du milieu, [25] elle est variable. En effet, certaines protéines sont solubles dans l’eau pure telle que l’albumine. D’autres telles que les globulines ne se dissolvent qu’en présence de sels neutres ou encore quand le milieu est légèrement acide ou faiblement alcalin. Enfin, d’autres sont insolubles telles que les scléroprotéines, [2].

En effet, un grand nombre de protéines sont solubles dans l’eau et les solutions aqueuses. Or, cette solubilité est en fonction de la composition ionique du milieu, spéci fiquement du pH et de l a force ionique µ, [23] :

Où : Ci est la concentration de chaque ion(électro-valence) et Zi la charge

électrique. Lorsque la force ionique est faible, les ions ( particulièrement les ions

monovalents) préferent la solubilation en immobilisant les groupes chargés des proteines. Or, a force ionique forte , c’est l’inverse, les ions contractent à accelere les proteines.sa se passe tout comme s’il y avait rivalité entre les proteines et les ions vis-à-vis des molécules d’eau. Ce phenoméne est nommé le relargage. Donc,la solubilité des proteines en présence de force ioniques variées se décri t par l’equation :

log S = ß—K’µ . S : la solubilité des proteines. µ : la force ionique du milieu. ß : une constante dépendan t de la proteine et du milieu. K’ :constante de r elargage. En général, la solubilité en fonction du pH est représentée par une courbe

en U avec un minimum au voisinage du point isoélectrique. Tout se passe comme si au pHi la répulsion entre molécules protéiques était minimum, les molécules visent à construire des accumulations qui s’accélèrent, [25].

Les solvants organiques, en particulier l’éthanol et l’acétone, accélère les protéines en les dénaturant. Mais, on peut éviter la dénaturation en agissant à très basse température, [23].

7.3. Propriétés électriques, [23]: Les protéines, formées d'acides aminés, ce sont des porteuses de charges électriques qui varient en fonction du pH. Quoi que, chaque protéine a un pH isoélectrique dont la mobilité dans un champ électrique est nulle c’est à dire à charge électrique totale nulle. 7.4. Sédimentation:

En sédimentation on utilise une solution de saccharose de concentration progressive vers le fond d’échantillon à la surface. C’est une solution de Séparation des molécules en fonction de leur densité quand les protéines atteignent le gradient correspondant à leur densité, [23]. De plus, les molécules protéiques en solution, mise à une centrifugation à grande vitesse (60 000 tours / minute), [26]. 7.5. Viscosité :

La viscosité d'une solution protéique est sa propriété qui vise à empêcher son écoulement quand elle est mise à l'application d'une force. En effet, les solutions de grande viscosité résistent à l'écoulement mais, les solutions de faible viscosité s'écoulent facilement. Or, la viscosité des solutions protéiques peuvent être transformé par des changements de pH, de température et de force ionique. Néanmoins, elle croit en milieu alcalin car les charges électriques négatives entraînent un déplissement et une élongation maximale de la protéine, [25]. 7.6. Propriétés optiques, [27] : Les propriétés optiques sont importantes pour l’étude et le dosage des protéines elles sont en relation avec : ü la concentration de la solution (absorption, diffusion, indice de réfaction). ü la forme et la taille la molécule (diffusion). ü la structure (absorption à 280 nm à présence de monomère d’acides aminés

aromatiques, pouvoir rotatoire).

7.7. Propriétés de la liaison peptidique, [27] : Dans l ’Hydrolyse de la liaison peptidique on a deux types : ü Hydrolyse chimique totale ou partielle ü Hydrolyse enzymatique

Réaction du biuret : solution de protéines en milieu alcalin + CuSO4 coloration violette, ainsi que des interactions des protéines avec d’autres substances . Or, il ya des Interactions caractéristiques avec des macromolécules glucidiques ou poly-osidiques, et entre des enzymes-substrat, antigène-anticorps, hormone-récepteur, et d’une façon générale, protéine-ligand. Par contre, il y a des interactions non caractéristiques tel que la fixation sur des substances minérales telles que phosphate tricalcique et hydrox apatite, et aussi adsorption de plusieurs colorants tel que le bleu de bromophénol et bleu de coomassi c.

7.8. Propriétés des chaines latérales, [27] :

Absorption des chaines latérales aromatiques à 280nm. 7.9. Propriétés biologiques, [27] :

Les propriétés biologique des protéines inclus dans leurs fonctionnement, auquel Les protéines ce sont des Enzymes, anticorps, antigènes, hormones, protéines de structures, etc…

8. Relation structure –fonction dans les protéines :

Quand on établir des arbres évolutifs pour les protéines, on distingue qu’il n’y a pratiquement pas de sélection naturelle, [31]; on voit simplement la « mémorisation » d’un processus de hasard. Le rôle de la taille de la chaine peptidique par comparaison avec celle du site actif, c’est particulièrement de « protéger »ce site des fluctuations thermiques. En effet, le site actif conserve une géométrie rigoureuse nécessaire à son fonctionnement, une fois introduit dans une structure, que ne peut être changé qu’au prix d’une variation importante d’énergie libre, on va traite ça dans le chapitre qui suit. Autrement, celui-ci ne nécessite pas une particulière de structure tridimensionnelle mais simplement une structure tridimensionnelle. Probablement Celle-ci n’est pas résolue par la fonction. Donc, un tel notion ouvre la voie à la formation de protéines tout a fait nouvelle et admet au même temps de mieux comprendre l’origine de la vie, [16].

En réalité, La variété des fonctions des protéines provient de la complexité de la structure protéique. Or, La structure tridimensionnelle des protéines est le produit direct d’interactions avec son environnement interne. En effet, on connes comment sont structurées nous informe énormément sur les fonctions qu’elles garantissent dans la cellule. Aussi, dans un environnement aqueux, les chaînes –R hydrophobes s’installent vers l’intérieur de la protéine. Donc, Des modifications de température ou pH peuvent interagir avec les liaisons non covalentes, incitant la rupture de la structure tridimensionnelle et une perte d’activité.

Cette évolution est nommée “dénaturation”, on va traiter ça avec plus de détail dans le chapitre qui suit. En conséquence, Les protéines dénaturées peuvent aussi se rassembler ensemble pour qu’elles soient insolubles au cours d’une évolution (coagulation), [12].

Alors, La fonction particulière d’une protéine est extrêmement liée à une structure moléculaire bien caractéristique, déterminée par l’installation des éléments de base (les acides aminés) qui entrent dans la constitution des protéines, [28].

9. Conclusion : Les protéines peuvent avoir distinctes structures, qui sont très liées aux

tâches qu’elles assurent dans la cellule, donc elles sont les véritables macromolécules de la vie.

D’ailleurs Ce sont elles qui vont assurer la grande différence des fonctions allant de la catalyse des réact ions à la structuration de la matière vivante. Or, La structure des protéines à haute résolution montre les détails à l’échelle atomique des si tes actifs, [29].

Alors, Les protéines jouent un rôle de premier plan dans la structure et la fonction de la cellule. Quelques unes des protéines synthétisées par la cellule définissent sa forme et sa structure. Par contre, d’autres permettent de reconnaître certaines molécules ou encore sont utilisées comme catalyseurs pour des réactions chimiques. Par exemple, les cellules des yeux et de la langue ne se ressemblent pas et assument des fonctions bien différentes. Les protéines se constituent d’acides aminés, de nombre 20 et chacun est doté de propriétés chimiques et physiques spécifiques. Pour obtenir une protéine fonctionnelle et stable, il faut impérativement disposer de la bonne séquen ce d’acides aminés, [30].

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Chapitre II Stabilité des Protéines

(Repliement et Dépliement)

1. Introduction : Les protéines, ce sont des molécules essentielles à la vie des organismes

vivants, et des polymères synthétisés à partir de l’ADN des cellules. Ainsi que, Leur fonction dépend de leur composition mais aussi de leur structure.

Ces molécules sont formées de longues chaînes linéaires d'acides aminés (précisément une centaine) ; c’est ce qu’on appelle la structure primaire des protéines. Si l’on accomplit que 20 types différents d’acides aminés présentent dans le vivant et que chacun d ’eux peut présenter plusieurs structures différentes, on saisit que cette stratégie ait donné lieu à une très grande variété de structures et de fonctions.

Donc, L’un des points clés contrôlant la structure des protéines est le processus de repliement menant le polymère linéaire à opter une structure tridimensionnelle.

ADNTranscription ARN Traduction chaîne polypeptidiqueRepliement Protéine

Alors, La première phase du repliement conduit à la formation de structures-

type, nommées structures secondaires, relatif a un nombre restreint d’acides aminés de 2 à quelques dizaines, duquel les plus connues sont les feuillets β, ou les hélices α d’ailleurs on a vue ca en détaille dans le chapitre précédent.

Le repliement se poursuit ensuite par l’agencement relatif des structures secondaires entre elles, [1].

Le repliement des protéines peut être effectué de deux façons différentes (Freedman, 1992) : l’une informative, comprise dans le code de la séquence et l’autre mécanique, avec la description de la cinétique et de la thermodynamique des processus qui exposent l’évolution de la protéine au cours du repliement.

Or, de plusieurs informations ont pu être déduites des expériences menées in vitro sur les protéines. Elles sont d ’une importance considérable pour comprendre les règles principales du repliement.

D’après Anfinsen (1973) “toute l’information nécessaire pour obtenir la conformation native d’une Protéine dans un environnement donné est contenue dans l’enchaînement des aci des aminés”.

Ceci inspire que le repliement soit sous contrôle thermodynamique (Anfinsen, Scheraga, 1975).par qu’antre, Tanford (1970) a analysé les constantes apparentes de vitesse et montre que le repliement des petites protéines constituées de mono domaine est sous contr ôle thermodynamique, [2].

En effet, on va étudier dans ce chapitre, le processus de repliement et le repliement inverse de protéines, ainsi que la stabilité, le mécanisme et la dénaturation des protéines.

2 .Stabilité des protéines et cinétique de repliement :

Une protéine est un hétér o polymère d'acides aminés; les acides aminés sont Sélectionnés parmi une petite « chimio thèque » Naturelle de vingt composés.

En effet, Le repliement produit une ségrégation de groupes alkanes au cœur de la protéine et une exposition au solvant des chaines latérales les plus polaires. Alors, cette ségrégation réduite les zones de contact alkane-eau, qui sont pénalisants du point de vue Thermodynamique. On parle de la structure repliée qui est stabilisée par .l'effet hydrophobe. (Des groupes alkanes).

Par qu’antre, L'état déplié, quant à lui, est stabilisé par le nombre énorme de conformations dépliées possibles. Ce grand nombre de conformations se interprété, dans le langage de la thermodynamique, par une grande entropie, préfère l'état déplié.

Or, en pratique, cela indique que quand la protéine s'écarte fortement de sa structure native, par exemple à la suite d'un choc avec une autre molécule, elle erre parmi les états non-natifs pendant un temps élevé, à l'échelle atomique, avant de retrouver la structure native, [3].

En générale, Il existe un équilibre entre l’état dénaturé D et l’état natif N, et la stabilité est la différence d’énergie libre ( G) entre ces deux états. En effet, l’enregistrement d’un paramètre physique de la protéine en fonction de la température ou de la concentration d’un dénaturant chimique permet d’avoir la différence des énergies libres de la molécule de la protéine entre les états natifs et dénatures:

= -T = RTln .

La, H et S correspondent aux changements d’enthalpie et d’entropie pendant la réaction D↔N, et pour c’est la constante de l’´equilibre entre les deux états. Or, pour les petites protéines la stabilité est de l’ordre 5-10 kcal/mol ce qui est faible par rapport à la stabilité d’une liaison covalente qui est de 50-300 kcal/mol, [4]. Anfinsen a proposé l’hypothèse « thermodynamique » du repliement qui postulait que la conformation native d’une protéine correspondait à l’´etat dans lequel l’´energie libre était la plus basse et que, par conséquent, cette conformation ne d´épandait que de l’ordre des acides amines dans la chaîne (structure primaire), [5]. Et au milieu des années 60, Cyrus Levinthal a pose le problème primordial du repliement des protéines. Il a démontre que si une protéine devait essayer chacune des conformations géométriquement tolérables, cela prendrait un temps beaucoup plus grand par rapport aux temps de repliement observes. Le nombre de conformations qu’une chaîne polypeptidique peut adopter devrait être égal à , avec n le nombre d’acides aminés contenus dans la séquence et m le nombre de structures possibles pour chaque acide aminé (13 structures secondaires différentes au minimum), [2].

En effet, si nous admettons que chaque acide amine ne peut opter que deux conformations (ce qui est bien inferieur à la réalité), donc le nombre de conformations que peut opter une protéine de 100 acides amines devrait être égal à . Le temps minimum pour passer d’une conformation à l’autre étant s, il faudrait un temps égal à secondes ou années pour essayer toutes ces conformations.

Alors, ce temps de repliement incertain coïncide à un temps du même ordre de grandeur que l’âge de l’Univers. On sait bien, que qu’in vitro même in vivo une protéine se replie en quelques secondes, voire même quelques millisecondes pour quelque protéines à température ambiante, [6]. Cette énigme se renomme « Paradoxe de Levi nthal » (Levinthal 1968).

Et pour résoudre le paradoxe, Levinthal a injecté l’idée du chemin de repliement, il a suppose que la protéine ne cherche pas sa st ructure native au hasard mais uniquement parmi les structures qui mènent vers un minimum local d’´energie le plus rapidement possible.

Alors, selon Levinthal la structure native de la protéine est définie par la cinétique et non par la thermodynamique. En plusse, Savoir si le repliement est déterminé par la cinétique ou par la thermodynamique n’a rien d’´evident. En trouve Cette quest ion se souvent pour la prédiction des structures tridimensionnelles à partir de la séquence en acides amines ou pour la création de protéines qui n’existent pas dans la nature.

Donc la question qui se pose est Quelle structure faut il choisir: la plus stable ou celle qui est accessible le plus rapidement? Alors, il a été toléré que le repliement des protéines soit contrôle par les paramètres cinétiques et thermodynamiques.

C’est à di re qu’une protéine recherche sa structure native qui est la plus stable au niveau thermodynamique en suivant un chemin spécifique de repliement, [7]. 2.1. Une stabilité marginale :

Généralement, la stabilité des protéines est très liée à leur repliement. Donc, Les protéines ont besoin d’être dans leur état natif pour être stables. En effet, La variation d’enthalpie libre de repliement d’un état dénaturé à l’état natif s’écrit comme la participation de l’enthalpie et de l’entropie.

U N ou U : état déplié, N : état natif ΔG = ΔH – T ΔS

Tandis que, les variations d’enthalpie et d’entropie soient grandes, la variation d’enthalpie libre de l ’état dénaturé à l’état natif est la plus part du temps fai ble (-5 à –15 kcal.mol-1).

Fig. 1 : Les protéines sont marginalement stables « Effets compensatoires ». Or, Cette énergie est comparable à celle de quelques liaisons hydrogène.

Ainsi que, La diminution d’enthalpie favorable lors du repliement est compensée par une perte d ’entropie due au passage de la chaîne étendue à une st ructure compacte.

Le terme enthalpique stabilisant la structure comprend les effets hydrophobes, les interactions de van der Waals et électrostatiques (surtout les liaisons hydrogène et les ponts salins) et aussi la formation de liaisons covalentes (les liaisons disulfure). Il est diminué par la perte des interactions qui se trouvent entre la structure dénaturée et le solvant (effet de dé solvatation), [8].

2.2. Les effets différents qui influençant la stabilité de la structure native :

En effet, la stabilité des protéines est influencée par un certain nombre de forces déjà énoncées dans le chapi tre précédent.

Or, les interactions qui stabilisent la structure tridimensionnelle des protéines sont particulièrement des interactions faibles, non covalentes : interactions électrostatiques et de van der Waals et effets hydrophobes. Ainsi que, Des

liaisons covalentes sont également mises en jeu par l’intermédiaire des ponts disulfure, [8].

Fig. 2: Représentes les différents effets qui influence la stabilité d’une protéine.

2 .2.1. Interactions électrostatiques, [8] : Pendant le repliement, les interactions électrostatiques attractives entre

charges opposées où entre dipôles sont formées et cassées. Leur participation enthalpique au repliement dépend de la balance entre les interactions crées et celles qui ont été détruites. ü Interactions de van der Waals :

Les interactions entre les nuages électroniques de deux atomes adjacents mènent à la présence d’une force attractive pour des distances de 3-4 A. Ainsi que, l’énergie de liaison est d’environ 1 kcal.mol-1, ce qui est à peine supérieur à l’énergie thermique moyenne des molécules à Température ambiante (0,6 kcal.mol-1). Néanmoins, de par leur grand nombre, ces interactions Jouent un rôle principal dans la stabilisation de la structure des protéines et préfèrent le compactage. ü Ponts salins : Quand on regarde ces interactions dans le cas d’acide amine chargés

(négativement pour Les Aspartates, glutamates et l’extrémité C-terminale, et positivement pour les lysines, arginines, Certaines histidines et l’extrémité N-terminale) on parle de ponts salins. En effet, Le fait que la construction de ponts salins soit un effet stabilisateur n’est pas évident. Cependant, Phelan et al. Ont étudié par RMN et par des expériences de thermodynamique le cas d’une protéine en fermeture éclair de 31 résidus et ont montré que la formation de ponts salins a un effet déstabilisateur. Or, la dé solvatation des chaînes latérales chargées est en effet très défavorable du point de vue énergétique et n’est pas compensée par le gain des attractions coulombiennes, [9]. ü Liaisons hydrogène : Pour les liaisons hydrogène, ce sont le résultat des interactions électrostatiques

(70%) et de van der Waals (30%), elle est entre un atome électronégatif (généralement un atome d’oxygène ou d’azote) et un atome d’hydrogène, soutenu par un atome électronégatif.et les deux atomes électronégatifs sont distants d’environ 3 Å. pour l’énergie des liaisons hydrogène est de l’ordre de 3 kcal .mol-1.

Les acides aminés polaires peuvent aussi composer des liaisons hydrogène entre eux ou avec des molécules d’eau. Ils se dissolvent alors facilement dans l ’eau :

ils sont hydrophiles. Notamment on trouve ces liaisons dans les hélices et les feuillets, stabilisant ces structures secondaires. Elles permettent aussi de lier les sous-unités d’une oligomère. Les liaisons hydrogène participent peu directement à l’énergie de stabilité mais permettent des contraintes favorisant l’état replié des chaînes polypeptidiques, [10].

2.2.2. Effets hydrophobes et solvatation, [8] :

Puisque les composés hydrophobes (c’est-à-dire apolaires) sont peu solubles dans l’eau aboutissement un effet dit hydrophobe. Or, L’optimisation des liaisons hydrogène au voisinage des groupements apolaires mène à la formation d’une enveloppe de molécules d’eau ordonnées autour de ceux-ci.

Donc, cette organisation est défavorable du point de vue entropique parce qu’elle diminue le nombre de configurations abordables ; les groupements apolaires ont alors aptitude à se rapprocher les uns des autres afin de limiter la surface de contact avec l’eau.

Alors, ce fait entropique décrit pourquoi les résidus hydrophobes des protéines solubles sont regroupés au « coeur » de celles-ci par qu’autre la « surface » est au contraire essentiellement composée d’acides aminés hydrophiles. Donc Il n’existe pas à distinctement parler de “liaison hydrophobe”. Et pour quantifier cet effet, on l’explique comme l’énergie associée au transfert d’une surface hydrophobe de l’intérieur de la protéine vers un mi lieu aqueux, [11].

Donc, cela inclut les variations d’énergie due aux modifications des interactions de van der Waals supportées par les groupements hydrophobes ainsi que les variations d’enthalpie libre (variations d’enthapie et surtout d’entropie) associées à la réorientation de l’eau. En effet, les effets hydrophobes et les liaisons de van der Waals sont responsables de l’agencement (compactage) très dense des atomes au milieu des protéines. Aussi le repliement est dirigé par les effets hydrophobes et la stabilisation enthalpique par le compactage.

Pour l’enthalpie libre de désolvatation, l’énergie de transfert pour un résidu apolaire pour passer du milieu aqueux au sein de la protéine, est de l’ordre de -25 cal.mol-1.Å-2.Or, La distinction d'enthalpie libre de solvatation entre protéine dénaturée et protéine repliée produit une évaluation empirique de l'effet hydrophobe, considéré comme la force principale responsable du repliement des protéines.

Tendis que, l’enthalpie libre de solvatation peut être calculée approximativement à partir des surfaces atomiques accostables au solvant et des paramètres de solvatations atomistiques résolus à partir des énergies libres de transfert, [12]. 2.2.3. Ponts disulfure, [8] :

La formation d’une liaison covalente S-S nommée pont disulfure, due aux rapprochements des chaînes latérales de deux cystéines et leur oxydation.

La plupart des protéines ayant des ponts disulfures ce sont des protéines extracellulaires, se repliant dans le réticulum endoplasmique (qui est un milieu oxydant) avant d’être secrétées dans le milieu extracellulaire plus oxydant que le cytoplasme et ou l e pH et la température sont moins bien surveiller.

En effet, l’énergie de liaison convenant étant d’environ 60 kcal.mol-1, un pont disulfure suggère une forte contrainte topologique à la chaîne polypeptidique. Néanmoins, cette énergie ne coïncide pas à l’énergie de formation d’une liaison disulfure à partir de deux cystéines protéinées.et cette dernière dépend de

l’environnement des deux cystéines touchées. Pareillement, le rôle stabilisateur des ponts disulfure est discuté. Par qu’autre, si certaines études sur le rôle des liaisons hydrogène et des liaisons disulfure dans la stabilité thermique, [13], présentent que celle-ci est favorisée par une plus grande rigidité, il ya d’autres études parviennent à une conclusion opposée, [14]. 3. Cœur hydrophobe, [8] :

Les facteurs les plus importants dans le repliement et la stabilité des structures protéiques, ce sont Les interactions hydrophobes.

Or, les biologistes réalisent souvent référence à l’appartenance de tel ou tel acide aminé au cœur hydrophobe d’une protéine pour définit les propriétés de ce résidu, il n’ya pas de définition ou détermination commun du cœur hydrophobe.

Quelques définitions saisissent en compte la conservation au cours de l’évolution des monomères hydrophobes « cachés » par qu’autre d’autres ne s’oppose pas sur une analyse séquentielle, [15].

Et certains algorithmes ont aussi été mis en place pour expliquer le cœur hydrophobe des Protéines de façon méthodique. Entre eux, un algorithme donné par Swindells décrit le Cœur hydrophobe comme la collection des monomères ou résidus ont une accessibilité faible au solvant, appartenant à des régions de structures secondaires régulières et ou les chaînes Latér ales non polai res interfèrent en partie entre elles, [16].

En globale, ces trois propriétés sont en effet servies par les expérimentateurs pour expliquer le cœur hydrophobe de façon expérimental. En effet, Les monomère ou résidus appartenant au cœur hydrophobe d’une protéine sont des résidus gardés dans les familles structurales et jouant un rôle important et considérable pour la stabilité de la protéine tant au moment de son repliement que dans sa structure native. 4. Dénaturation des protéines:

Une protéine dans un état non natif est dite dénaturée, donc La conformation tridimensionnelle (structure primaire, secondaire, tertiaire et le cas échéant, quaternaire) est le propre d’une protéine native. Cette conformation peut être troublée, désorganisée sans que soit rompue la moindre liaison peptidique, par rupture seulement des liaisons qui permettaient à l’édifice de soutenir sa conformation dans l’espace ; c’est ce qu’on nomme la dénaturation ; elle peut être incitée par toute une diversité d’agents physique ou chi miques : ü la chaleur (la coagulation de l’ovalbumine du blanc d’œuf est un exemple bien connu

de dénaturation) ü les radiations ultraviolettes et ionisantes ; ü les variations de pH :

Certains acides (nitrique, trichloracétique, perchlorique, etc.)Et certains solutions acides de métaux lourds (Hg, Pb) sont utilisés en analyse biologique pour rejeter des protéines du milieu (sang, par exemple) ; ce sont des déprotéinisants ou défécants . En effet, le dépliement des protéines peut se faire en augmentant ou diminuant le pH du milieu. Or, le pH influence la protonation et les charges des groupements chimiques. Généralement, le changement de pH augmente les forces électrostatiques répulsives, [8]. ü Les détergents :

Les détergents ce sont des molécules amphiphiles duquel la tête polaire reste en contact avec l’eau et la queue apolaire interfère avec les chaînes protéiques. L’ajout de déter gents dans le milieu dénature l es protéines en effaçant la stabili sation due aux effets hydrophobes au sein de la protéine. Or, les solvants organiques solubles dans l’eau telle que l’éthanol ou l’acétone font en général précipiter les protéines de par les effets hydrophobes, [8]. ü les solvants organiques (sauf à une température inférieure à 0°C) ; ü les solutions d’urée ou de guanidine :

La dénaturation avec l’urée ou l’hydrochloride de guanidine ,se fait par la création de liaisons hydrogène entre le dénaturant et la protéine. Alors, ces liaisons pouvant être plus abondantes dans l’état dénaturé, celui-ci est stabilisé par rapport à l’état natif. En général, la protéine reste soluble mais dépliée. ü La température : En général, il suffit d’un petit écart de température pour dénaturer les protéines car la

Différence d’enthalpie libre entre la structure native et les structures dénaturées est facilement abordable. La formule de l ’enthalpie libre de dépliement (N <=> U) en fonction de la température est la suivante : ΔG= ΔHref −TΔSref + ΔCp ( (T –Tref ) −−T ln ln( ))

Dont ΔHref et ΔSref les valeurs respectives de l’enthalpie et de l’entropie du dépliement à la Température de référence Tref. Où ΔCp est la variation de la capacité calorifique entre l’état natif et l’état dénaturé.

En générale, les protéines se déplient si on augmente la température et que certaines protéines se dénaturent ainsi à basse température. Aussi, les protéines ne sont stables et fonctionnelles que dans une petite fourchette de température (habituellement de quelques dizaines de degrés d ’amplitude), [8]. ü La pression, [8]: Le dépliement sous pression hydrostatique est une méthode réversible de

dénaturation qui peut être combinée avec l’ajout d’un dénaturant, [17].alors, une pression haute about isse le dépliement des protéines car le système protéine-solvant de l’état dénaturé occupe un Plus petit volume que celui de la forme native. Or, Cette approche autorise une compréhension sur l’origine de la modification de volume observé lors de la dénaturation (qui est de l’ordre de 1%). Aussi l’étude des cavités de la nucléase du staphylocoque montre que les effets de Volumes évincés dans les protéines sont la raison capitale du changement de vol ume lors du dépliement, [18]. ü Nano manipulations (exerçant une force externe sur la protéine), [8]. ü la simple dilution ou la simple agitation peuvent aussi provoquer la dénaturation des

protéines, ce qui est fort gênant lorsqu’on veut purifier une protéine. En effet, la dénaturation est parfois irréversible (par exemple dans le cas de la

coagulation de l’ovalbumine), parfois réversible, et il convient de voir ce qui se passe lors de ce processus. Or, il ya passage d’un état hautement ordonné à un état moins ordonné ; il ya un accroissement de l’entropie (l’entropie est une mesure de la probabilité d’existence d’un état, or sont les états les moins ordonnés qui sont les plus stables).

A l’état natif, du point de vue énergétique la protéine a la conformation la plus stable dans les conditions intracellulaires ;si on modifions ces conditions , la conformation de la protéine va être altérée ;il y aura rupture des liaison hydrogène et des autres liaison secondaires que nous avons étudiées , désorganisation des

structures secondaire et tertiaire avec , par effets, une sensibilité accrue aux enzymes protéolytiques, une augmentation de la réactivité de certains groupements, qui étaient soit engagés dans des liaisons secondaires, soit inabordables, et surtout une perte des propriétés biologiques (spécifiquement dans le cas des enzymes) , [19].

En générale, toute conformation de protéine est associée un niveau d’énergie libre, or L'état natif d'une protéine est l'état dans lequel cette énergie est minimale, [20].

Fig. 3 : Une protéine mal repliée peut Encore retrouver sa conformation correcte.

Fig.4 : Dénaturation et renaturation spontanée d’une petite protéine.

5. Repliement des protéines : Le repliement est le passage d’une chaîne d’acides amines vers une structure

tridimensionnelle native bien déterminée et permettant à la protéine d’appliquer sa fonction biologique. C’est la dernière étape de l’emploi de l’information contenue dans l’ADN. Or, La structure native est totalement prédéfinie par l’ordre des acides amines dans la chaîne polypeptidique, [7].

En effet, Le passage de la structure primaire à la structure tertiaire se fait par un processus physique appelé repliement, donc, Le repliement des protéines est un processus purement physique, [20], bien que Le mécanisme exact qui conduit le repliement des protéines soit toujours une énigme.

Repliement

Fig. 5 : Représentation explicite et implicite de l’eau et simulation du repliement. Une conformation dénaturée (à gauche) et repliée (à droite) de la petite protéine Trpcage.

La question –comment une chaîne d’acides amines opte-t-elle une structure

fonctionnelle? - reste un des problèmes capitaux de la biologie structurale et cellulaire. Le séquençage des génomes fait des dizaines de milliers de séquences d’acides amines correspondant à des différentes protéines. La cristallisation de

toutes ces protéines est impossible, de ce fait, la connaissance du code de repliement pourrait être très nécessaire pour la prédiction de structures tridimensionnelles des protéines à partir de leur séquence en acides amines. La solution à ce problème se retrouve à la frontière de la biologie avec la physique et l a chimie, et concerne les expérimentateurs autant que les théoriciens, [7].

Alors, La conformation la plus énergétiquement stable (la plus probable) d’une protéine est celle avec l’énergie libre la plus basse. Or, La distinction d’énergie libre provient de l’équilibre entre les interactions qu’une protéine place avec elle-même dans sa conformation native (repliée) et celles qu’elle établit avec le solvant dans sa forme dénaturée (dépliée). Donc, Si les interactions qu’une protéine établit avec elle-même dans sa conformation native sont plus propices, cette forme sera la plus vraisemblable.

ü L’entropie : La perte d’entropie conformationnelle (perte du désordre) est la force la

plus défavorable qu’une protéine doit vaincre lors de son repliement et pour rester sous sa conformation repliée.

ü L’enthalpie : généralement le repliement donne lieu à une enthalpie favorable (baisse d’enthalpie) grâce à la composition d’interactions stables de type électrostatique, composition de ponts d’hydrogène et d’effets hydrophobes, [21].

Par qu’autre des nombreux structures secondaires classiques des protéines ont pu être isolées dans la relâchement présentant bien le caractère essentiel de leur repliement, y compris en dehors de tout environnement biologique. Ce pendant, ces structures ont été déf inies avec une pr écision bien meilleure qu ’en phase condensée, acceptant de mettre à jour les interactions subies par chaque groupement NH dans chacun des accorderais observés: une échelle de force des distinctes interactions existent dans ces systèmes a pu êtr e établie. ü Les coudes β, responsables du repli des chaînes des protéines sur elles-mêmes,

sont déjà observés dans les petites chaînes à deux acides aminés malgré la rivalité avec les formes dépliées. Or, Ils sont définis par une liaison H relativement faible et doivent leur stabilité relative à un faible niveau de contrainte du squelette.

ü Les hélices 310 se forment viscéralement dans les petites chaînes comprenant trois acides aminés : cependant, elles sont très souples et sont en compétition avec des formes voisines. Cette compétition peut être étonnamment influencée par des interactions mineures entre les chaînes latérales et le squelette, comme les interactions NH-aromatique.

Une telle approche est complémentaire de la simulation par dynamique moléculaire, [1] se qui en vas traites dans les modèles du processus de repliement.

Fig.6 :(repliement) La protéine assemblée se replie pour former une structure tridimensionnelle

précise.

En générale, lorsque Une protéine commence à se replier alors qu’elle est encore en train d’être synthétisée. Et les informations essentiel les à toutes les étapes

de la maturation des protéines sont possédées dans la séquence d’enchaînement des acides aminés.et quand une protéine se replie en une structure compacte, elle enterre la plupart de ses résidus hydrophobes dans son centre.et durant le repliement Il se forme de plus un grand nombre d’interactions non covalentes entre différentes parties de la molécule.

En effet, Le type de repliement final opté par la protéine correspond à la forme de plus faible énergie libre.et Les molécules chaperons facilitent le repliement de nombreuses protéines, [22]. 6. L’Aspect cinétique et thermodynamique du repliement :

Il apparaitre que l’on puisse poser l’hypothèse que les mécanismes qui orientent le repliement des protéines globulaires sont sous contrôle mixte : cinétique et thermodynamique.

Ce pendant, le postulat de Levinthal peut aussi être revu en termes de paysages énergétiques (Energy Landscape ) par l’idée de repliement en entonnoir (Folding b F u n n e l) présenté par le groupe de Wolynes et repris plus récemment par Chan et Dill (1998). Dans cette idée, les auteurs décrivent la attitude thermodynamique et cinétique de la transformation d’un ensemble de structures correspondant à l’état dénaturé d’une protéine vers son unique état natif (Figure 7).

Fig. 7 : diagramme représente le Repliement en entonnoir schématique d’une protéine. La largeur de l’entonnoir représente l’entropie, la profondeur, l’énergie—“Folding funnel” of a pro tein. WIdth and

depth respectively represent entropy and energy. Bien que, le repliement de la structure améliore vers l’état natif, le nombre de

conformations à parcourir diminue. Or, Le processus qui mène la structure de l’état initial (structure aléatoire) vers l’état final de la protéine (état natif) est exergonique. De fait, Une variété très élevé de comportements de repliement apparaîtrait de ce paysage énergétique (Figure 7), elle dépend des paramètres énergétiques et des conditions expérimentales. Wolynes et al(1995) ont inspiré que la vitesse du repliement est diminuée par la présence de puits intermédiaires sur la surface énergétique.

Donc, Chaque puits coïncide à un minimum énergétique local peuplé par une population d’intermédiaires “stables”. Ainsi que, Les auteurs décrivent que la descente vers le fond de l’entonnoir s’accompagne d ’une diminution de l’entropie de

la chaîne polypeptidique. Alors, Plus la pente est raide, plus le repliement sera rapide. On permet à l’heure actuelle que le repliement de la Structure 3-D de la plupart des protéines est sous contrôle thermodynamique et que l’état natif est atteint grâce à la constitution d’intermédiaires partiellement structurés dont la formation est sous contrôle cinétique, [23-2].

Fig. 8 : a) Paysage énergétique plat de type trou d’un terrain de golf correspondant au Paradoxe de Levinthal b) paysage énergétique présentant un chemin de repliement de A vers l’état natif N. c) paysage énergétique idéal qui guide les conformations vers la conformation native N d) paysage

énergétique pour lequel il existe un repliement rapide de A vers N et un processus lent de B vers N avec un état intermédiaire transitoire.

En générale, Pour résoudre ce paradoxe dit de Levinthal on pouvait penser

que durant son repliement la protéine opte une suite de conformations ou d’états intermédiaires formons le chemin de repliement (Figure 8b).Or, Ces intermédiaires pouvant être ainsi bien des intermédiaires productifs, le long du chemin, que non productifs, des impasses. A partir des années 95, cette représentation du chemin de repliement a été favorite à un autre vue dite « new view ». Sont alors inclus les notions de paysage énergétique ou d’entonnoir de repliement (Figure 8).alors, L’axe vertical représente l’énergie interne de la chaîne polypeptidique.et Les axes

horizontaux représentent les conformations de la chaîne. L’extension le long de ses axes montre le nombre de conformations abordables. Pour l’état natif ce nombre est réduit (le bas de l’entonnoir) et plus les états sont dépliées plus le nombre d’états conformationell accessibles est grand et l’entropie conformationnelle élevée. Cependant le paradoxe de Levi nthal apparaît alors comme une questi on mal posée.

Bien que, Le paradoxe de Levinthal comprend le repliement comme une recherche conformationnelle dans un paysage énergétique plat (Figure 8a). Le paysage énergétique peut être plus ou moins complexe. Donc, un paysage énergétique complexe mènera à la présence de chemins de repliement multiples et à une cinétique de repliement complexe (Figure 8d), [24].

7. Approche théorique pour l’étude de repliement des protéines :

Pour étudier théoriquement le repliement des protéines, il existe plusieurs approches. Une première approche pour l’étude théorique des protéines est d’apercevoir celles-ci comme des hétéros polymères, c’est à dire des polymères, duquel les acides amines sont tirés dans un assortiment de nombreux types de résidus nommés « lettres ». La représentation des protéines en tant qu’hétéro polymères fait suite à l’approche développée dans les années 1960, qui était surtout biochimique. Or, Les scientifiques désiraient savoir la structure détaillée de chaque protéine. Donc, Quelle est la différence essentielle entre un homopolymère et un hétéro polymère ?

Alors, L’énergie d’une conformation compacte d’un homopolymère dépend surtout du nombre de contacts de la chaîne avec elle-même, et est donc semblable pour des chaînes avec même nombre de contacts. Donc, Les minima d’énergie libre possédant complètement la même valeur. Par qu’autre, pour les hétéro polymères, la situation est distincte, suite de la diversité des interactions entre les résidus. En effet, un petit décalage de la moitié des résidus, par exemple, va inférer une redéfinition des interactions et conduit à une énergie distincte. Donc, Les minima d’énergie libre obtiendront des val eurs très diverses. Alors, Une approche théorique intéressante est d’exploiter cette diversité des interactions pour relier le repliement des protéines à la physique des systèmes désordonnés. On va prendre deux exemples de modèles décrivant les hétéros polymères comme des systè mes désordonnés. 7.1. « Random Energy Model » et Protéines, [25]: 7.1. 1. Le Random Energy Model (REM):

Le modèle de Random Energy Model (REM) est introduit par Derrida en 1980. Donc, Le REM peut être aperçu comme la limite du modèle d’interactions à p spins pour p Tendant vers l’infini. En effet, C’est un modèle très simple, qui a le privilège de pouvoir être résolu analytiquement. Alors, Les hypothèses sont les suivantes : On considère un système de N spins à 2N états, dont les énergies sont d’une part indépendantes les une des autres, et d ’autre part tirées avec une loi gaussienne. Le nombre d’états d’énergie comprise entre E et E+dE est en moyenne sur le désordre :

[ ] ∝ exp(− ) =exp( ΝLn γ − ) (1)

Si on prend la limite thermodynamique N tend vers l’infini, on constate que le nombre D’états termes d’énergie supérieure en valeur absolue à une énergie critique

= est nul. Comme les flottements autour s de n(E) sont d’ordre , qui est grand pour les Énergies plus petites que E0, donc, on peut approximer l’entropie moyennée sur le désordre par

[ S(E) ]= [ln n(E) ] _ ln[ n(E)] . Donc L’entropie a la forme donnée en figure 9. Ensuite On utilise la relation

= pour trouver la température, qui s’interprète donc comme L’inverse de la pente de la courbe de la figure 9.alors, à température infinie, le système a une énergie nulle, l’entropie est maximale. Et quand T décroît, l’énergie décroît. Et Lorsque T abouti la valeur T0 correspondant à l’énergie –E0, l’entropie devient nulle, le système choisit un état de basse énergie et y reste bloqué ainsi pour les températures inférieures à T0.

Fig.9 : Entropie pour le Random Energy Model.

7.1.2. Application naïve au cas d es hétéros polymères aléato ires : A fin d’adapter ce modèle aux hétéro polymères, nous prenons à la place

des N spins N Acides aminés qui peuvent avoir conformations. Et Chaque acide aminé a z voisins. Donc, On suppose que les énergies d’interaction ont une moyenne <U> et un écart type . En réalisant ces hypothèses, on oublie la connectivité de la chaîne (ceci ne donne pas forcément des mauvais résultats, aussi les exposants de Flory sont une excellent estimation des exposants des polymères).d’ailleurs, On a de plus supposé qu’il y a suffisamment de « lettres » (types d’acides aminés) pour que distincts états soient d’énergie indépendantes les uns des autres. En exécutant le même raisonnement qu’avant, on trouve la présence d’une énergie critique

= − Ζ< > + , et donc une température critique = .

En dessous de cette température, le polymère est dans une conformation d’entropie nulle, et choisit un des états de plus basse énergie (pas forcément l’état natif). Donc, la protéine est gelée et mal repliée pour T<T0. À présent Supposons qu’il existe un état natif en plus des états du spectre continu. Alors, Cet état devrait posséder une énergie basse –EN, et une entropie nulle. Alors il devient Thermodynamiquement favorable quand l’énergie libre correspondant à la phase désordonnée Devient plus haute que –EN, ce qui se produit à une température Tr que l’on peut lire et voir Graphiquement sur la figure 3. (r signifie repliement dans Tr)

Fig. 10 : Détermination graphique de la température de repliement. Donc, dans ce modèle, la protéine se replie pour des températures T vérifiant

T0<T<Tr. Et La gamme de température pour laquelle le repliement est favorable est donc [T0, Tr]. Cette gamme est d’autant plus grande que le gap d’énergie E est grand, ce qui se voit assez intuitivement sur la figure 3 ( E est la différence entre le plus bas niveau du spectre continu et l’énergie de l’état natif, (figure 3).

L’importance de la taille du gap apparaît avec ce modèle simple, Marquons que le Gap est ici introduit artificiellement. Dans le cas d’un hétéropolymère aléatoire, EN est de l’ordre de E0, donc Tf est proche de T0 et le polymère ne trouve son état fondamental que pour une petite gamme de température : un hétéropolymère aléatoire ne se replie pas. C’est un résultat que l ’on pouvait attendre : en effet, on peut supposer que l’évolution trie des séquences qui se replient bien, cela signifie qui ont un état fondamental d’énergie bien plus basse que la plus basse énergie du spectre continu.

En effet,Le fait d’inclure artificiellement un état natif de basse énergie est fait un peu plus clairement dans l’analyse de Bryngelson et Wolynes (1994), où ils considèrent des acides aminés possédant un état natif de basse énergie et m autres états non natifs. Ainsi que, Leur Hamiltonien comprend les énergies des structures primaires, secondaires (inbteractions de proches voisins sur la chaîne) et tertiaire (interactions à longue portée). Ils citent un principe de frustration minimale, selon lequel l’énergie de toutes les structures (primaires, secondaires, tertiaire) est minimisée pour l’état natif.

Or, Le nombre d’acides aminés dans l’état natif est noté N0. L’hypothèse réductrice est encore du type REM : à N0 fixé, les énergies des états sont indépendantes. Et il existe Un point important est que l’énergie de ces états nat ifs est pris en compte pour expliquer une statistique effective (gaussienne) pour E(N0).

Alors, L’énergie libre est calculable, et l’on différencie les phases bien pliées (N0=N) des phases non pliées ; ainsi que les phases vitreuses d’entropie nulle. Dans celles-ci, la protéine est gelée dans les états de basse énergie, mais non forcément dans l’état natif. 7.1.3. Le paramètre d’ordre pertinent :

Contemplons le modèle suivant, qui compte un coût ou gain d’énergie pour chaque contact:

H= (2) Alors, On suppose que les = , )sont tirés suivant une loi gaussienne,

et on veut Cal culer l’énergie libre moyennée sur la confusion (parce qu’elle est « sel f-averaging », à la différence de Z).

En effet, l’emploi de la méthode des répliques fait apparaître des puissances de la fonction de partition Z. donc, l’intérêt de la méthode des répliques ici est de faire apparaître un paramètre d’ordre pertinent. On écri t :

(3)

Et on acquiert après avoi r effectué des intégrales gaussiennes :

= (4)

Alors, Ceci fait apparaître un Hamiltonien effectif pour les répliques, qui contient le paramètre d’ordre :

(5) Ce paramètre d’ordre calcul le nombre de contacts communs aux chaînes alpha et beta. S’il est nul, alors c’est que la phase est désordonnée. Nous ne nous étalerons pas plus sur le Traitement de ce problème compliqué. 7.2. Cinétiques de repliement des protéines, [26] : 7.2.1 Repliement : cinétique de 1er ordre réarrangement intramoléculaire : À l’équilibre les passages conformation elles, sous l’effet de distincts dénaturants, pour des domaines simples sont généralement du type tr ansition à deux états : En prend, Modèle mis en évidence pour 20 p. protéines, pas d’état intermédiaire stable ;

A l’équilibre est : ; ; 8. Modèles pour l’effet de repliement, [7] :

L’effet de repliement de plusieurs protéines a été étudié à ce jour et il paraître que d’un côte le processus de repliement pour une protéine peut être différent d’une autre, mais dans le même temps quelques particuliers communs peuvent être reconnus. Alors, Trouver un mécanisme du repliement sa veut dire répondre aux

questions suivantes: quelle force conduit le repliement, et quel est l’ordre d’apparition des différentes structures au cours de l’effet?

8.1. L’effondrement hydrophobe :

Certains modèles théoriques de repliement des protéines ont été proposes. Quelque d’eux ont été affirmes par l’expérience. Donc, Ces modèles avouent plus ou moins bien pour expliquer le repliement d’une protéine ou l’autre, [27].cependant , Le modèle d’effondrement (collapse) hydrophobe suppose que le premier événement du repliement est la formation d’un cœur hydrophobe, ayant lieu avant la formation des structures secondaires (Dill 1990)on a parler de ça dans le paragraphe 3 . Il a été prédit par Kauzmann des 1959, qui a postule que le “ collapse hydrophobe » est la force conduisant le repliement des protéines (Kauzmann 1959). Alors, les interactions hydrophobes sont parmi les indispensables facteurs de la stabilité d’une protéine. Elles apparaissent car les groupes non polaires de la protéine ont une aptitude à éviter les contacts avec les molécules d’eau, en constituons un noyau hydrophobe. Cela conduit à une diminution de l’´energie libre du système protéine-solvant grâce à l’accroissement de l ’entropie du solvant (Fersht 1999). 8.2. Le modèle de nucléation-propagation :

Ce modèle de nucléation- propagation à été propose pour expliquer les premiers résultats sur la cinétique du repliement de la ribonucléase A. Il sollicite que le repliement enferme une étape de nucléation suivie par une propagation rapide de la structure. Or, L’´etape limitant est le processus de nucléation. En effet, après des études cinétiques plus récentes, il à été remplace par le modèle de nucléation-condensat ion propose par Fersht. Ce modèle propose la composition de noyaux locaux stabilises par des interactions éloignées , [28]. 8.3. Le modèle de diffusion-collision :

Le modèle de diffusion-collision a été développe par Karplus et Weaver en 1976 et a été reconsidère en 1994 à la lumière de données plus récentes (Karplus & Weaver 1976 & 1994). D’après ce modèle, le repliement débute par la nucléation simultanée en nombreux endroits de la chaîne polypeptidique. En effet, cela conduit à l’organisation de microstructures qui diffusent et s’associent dans la molécule pour constitues des sous-structures avec la conformation native. Ces microstructures possèdent une durée de vie contrôlée par la diffusion, alors, le repliement d’un polypeptide de 100-200 acides amines peut se passer en un temps très court, moins d’une seconde. D’après ce modèle le repliement se passe à travers quelques étapes de diffusion-collision.

8.4. Le modèle « Framework » :

Ptitsyn a propose un modèle tout à fait différent qui porte le nom de « framework », signifie, modèle de charpente. Il suggère que la protéine se replie à travers quelques intermédiaires, chacun ayant un nombre plus grand de structures natives (Ptitsyn & Rashin 1973; Ptitsyn et al. 1990). Donc, ce modèle présume l’existence d’au moins deux intermédiaires: un avec une structure secondaire flottante autour des hélices et feuillets déjà formes et l’autre plus stable avec la structure secondaire et la forme native (charpente) mais sans interactions tertiaires caractéristiques. Alors, quand les structures tertiaires natives sont formées la « construction » de la protéine est finie. 8.5. Le modèle hiérarchique :

Le repliement séquentiel et hiérarchique a été ainsi propose par Baldwin et il a été admet pendant des années (Baldwin 1975; Kim & Baldwin 1982). D’après ce modèle de nombreux segments de structures sont conformations et assembles à différents niveaux suivant un chemin seul de repliement. Alors, dans ce modèle la nucléation est suivie par la formation des structures secondaires, puis tertiaire et enfin quaternaire. 8.6. Le modèle « Jigsaw Puzzle » :

Le modèle du “Jigzaw Puzzle”, [29] considère le repliement comme un assemblage en puzzle avec l’existence de nombreux chemins conduisant à une seule solution. C’est une nouvelle approche par ce qu’on à longtemps postule que le repliement suit un unique chemin. 8.7. Le modèle de « l’entonnoir énergétique de repliement » :

On a vus ce modèl e dans le paragraphe 6. 8.8. Les modèles expérimentaux de repliement :

Le schéma global de la réaction de repliement est le suivant: D→I1→. . . . →In→N, ou D est l ’´etat entièrement dénature, I1, . . . In sont les états intermédiaires, n peut être égal à zéro, N est l’´etat natif. Aussi, le repliement d’une protéine peut se passer en une seule étape, ou en nombreux étapes avec l’accumulation d’intermédiaires stables. 8.8 .1. Le repliement à deux états :

Longtemps, Les expérimentateurs ont pense que le repliement des protéines se passait d’après le principe du « tout ou rien », sans formation d’intermédiaire stable. Mais, après il a été découvert que sur le chemin de repliement il peut subsister des intermédiaires stables qui diminuent le nombre de conformations abordables et ainsi accélèrent le repliement. Alors, Les chercheurs ont essaye de trouver de tels états dans le repliement de toutes les protéines. En fin, il à été admet que le repliement des petites protéines de moins de 100 acides amines se passe sans l’accumulation d’intermédiaire et qu’il soit dans la plupart des cas beaucoup plus rapide que celui des plus grosses protéines. Dans ce cas seuls l’´etat initial (natif) et l’´etat final (dénature) sont observes. En si concerne les petites protéines, les structures tertiaires et secondaires se forment concurremment, et le modèle de nucléation-propagation expose bien leur repliement. Or, la cinétique du repliement à deux états peut être décrite avec la théorie de l’´etat de transition utilisée en chimie-physique. D’après cette théorie la vitesse du repliement est limitée par l’´etat de transition qui est le moins stable de tous les états et pour cela ne peut pas être observe. Donc la vitesse de repliement dépend de la barrière énergétique qui existe entre l’´etat dénature et l’´etat de transition. Cependant, récemment il a été prouve que la vitesse de repliement des petites protéines est reliée avec leur topologie, spécialement avec la distance moyenne entre les résidus en interaction, [30]. D’après les études expérimentales il est incontestable que les interactions locales se forment plus vite que les interactions non locales. Or, le rôle important de la topologie de l’´etat natif s’explique facilement si on prend en compte le grand cout entropique de la formation des interactions à plus longue distance. Alors, l’explication thermodynamique suivante a été proposée: « Quand les résidus qui interagissent

sont proches dans une séquence, le cout entropique de l’organisation de la chaîne est partiellement compensée par la formation du contact plus tôt dans le repliement, ce qui mène à une barrière d’´energie plus petite”, [31]. 8.8.2. Le repliement à plusieurs états :

Le repliement de protéines qui tiennent plus de 100 acides amines passe généralement par l’accumulation d’intermédiaires visibles. Or, ces intermédiaires peuvent apparaitre quand la phase prématuré du repliement en quelques millisecondes. Donc, à cause de cette rapidité il est très difficile de suivre leur formation. De ce fait, les techniques classiques de mélange rapide (“stopped-flow”,“continuous flow” et “quenched flow”) permettent d’enregistrer les événements de l’ordre de quelques Dizaines de millisecondes. Cependant, Les événements ultra-rapides sur des temps inferieurs à la milliseconde peuvent être suivis par des techniques récentes de sauts en température classiques ou associes à un laser infrarouge, de transfert optique d’´electron ou encore de flux continus, [32].

Malheureusement ces nouvelles techniques ne sont pas encore faciles d’accès et possédant beaucoup de limitations. Par conséquence, elles ne sont pas encore largement utilisées.

En effet, le modèle du collapse hydrophobe et les modèles de repliement hiérarchique montrent bien le repliement de ces protéines. Or, le premier état intermédiaire qui est accumule après les premières Millisecondes de repliement, à une compacité proche de celle de l’´etat natif et les résidus hydrophobes sont alors partiellement protèges du solvant. Une autre particulier de cet état est la présence d’une quantité de structure secondaire comparable à celle observée dans l ’´etat natif, et l’absence de la structure tertiaire. Donc, ces particuliers expliquent l’´etat molten globule (globule fondu) détecte dans les premiers étapes de toutes les protéines de plus de 100 acides amines.

Ainsi que, D’autres intermédiaires peuvent être détectes au cours du repliement de ces protéines. Ces Intermédiaires peuvent se trouver sur le chemin conduisant de l ’´etat dénaturé vers l’´etat natif ou être en dehors de ce chemin. Or, si un intermédiaire se trouve sur le chemin principal du repliement, il peut tenir des structures natives partiellement formées, le taux de structures natives dépendant de la localisation de ces intermédiaires sur le chemin du repliement, [33] .Plus l’intermédiaire est proche de l’´etat natif, plus il contient des structures natives. Si l’intermédiaire se trouve en dehors du chemin de repliement, il peut alors tenir des structures non nat ives qui devront être défaites avant de for mer les structures natives et aboutir l’´etat natif. Ces intermédiaires qui se trouvent en dehors du chemin de repliement sont souvent propices à l’agrégation de la protéine. Donc, Il peut exister une compéti tion cinétique entre un repliement correct et une agrégation, [34].

La dernière étape du repliement de ces protéines consiste en la formation et l’organisation finale des structures tertiaires à partir des structures possédées dans les intermédiaires. Or, cette étape peut être lente et limitant pour la vitesse de toute la réaction. Cette phase tient aussi l’isomérisation des prolines, l’assemblage des domaines dans les protéines multi-domaines et des sous-unités dans les protéines multimarques. Il a et prouve que le repliement des protéines multimarques se passe selon des différents schémas qui dépendent de la protéine, [35]. Pour certaines protéines, les sous-unités se replient de manière autonome et coopérative, puis s’associent [30] (Vita et al. 1989).Et pour d’autres protéines, les domaines se replient concurremment puis s’associent, [36].

Généralement, les domaines isoles se replient plus vite que lorsqu’ils sont intègres dans l’ensemble de la protéine, [37].

9. Caractérisation des différents états impliqué dans l’effet de repliement, [7] : 9.1. L’´etat natif :

L’´etat natif de la protéine est sa forme fonctionnelle ou opérationnelle, en biochimie. Il peut être obtenu Par la formation de la structure tertiaire (dans le cas des protéines monomériques) ou de la structure Quaternaire de la protéine. De plusieurs enzymes et autres protéines non structurales possédant plus d’un état natif et elles peuvent passer d’un état à l’autre. Mais couramment, le terme « état natif » est Utilise seulement pour différencier les protéines correctement repliées des protéines dénaturées ou Partiellement repliées.

En effet, dans d’autres concordances la forme repliée d’une protéine est souvent appelée « Conformation » ou « structure » native. Or, les forces qui stabilisent l’´etat natif de la protéine sont des interactions hydrophobes, des liaisons Hydrogène intramoléculaires, des interactions de Van der Waals, l’entropie de des hydratations, des ponts salins et des interactions dipolaires. Par contre les liaisons hydrogènes avec l’eau aussi la perte d’entropie conformation elles déstabilisent la structure native. Ce pendant, il est possible de différencier les interactions locales (entre les résidus proches de la chaîne) et non locales (entre les résidus éloignes dans la séquence). Dans le cas des protéines solubles, la structure tertiaire de la protéine s’organise autour d’un ou plusieurs cœur(s) hydrophobe(s) laissant les résidus polaires exposent au solvant. On peut déterminer La structure des protéines par la cristallographie des rayons X, et par la résonance magnétique nucléaire ou par la diffraction des neutrons.

9.2. L’´etat dénature – La pelote statistique :

Historiquement, l’´etat dénature (l’´etat initial de la réaction de repliement) est considère comme l’´etat de la protéine dans lequel il n’y pas d’´elements de structure secondaire ni tertiaire. Alors, dans cet état les angles de torsion des liaisons de chaque acide amine dans la chaîne principale peuvent opter un nombre de possibilités important. Donc, le nombre conformations que peut échantillonner une protéine est de ce fait grand. Alors, La protéine est décrite sous forme de pelote statistique. C’est l’´etat initial de la plupart des expériences de repliement, or la protéine peut être dénaturée par l’urée ou la guanidine à hautes concentrations, ou dans certains cas à pH extrêmes, par des hautes tempér atures ou par la pression. La spécification des propriétés conformation elles des états dénatures de la protéine est la première étape importante pour la compréhension du repliement. En effet, Pendant longtemps ces états dénatures ont été négliges, l’attention plutôt se portait sur les états nat ifs.

En effet, les états dénatures sont des assortiments dynamiques de conformations en inter conversion rapide mais d’´energie semblable, avec quelques interactions non locales le long de la chaîne, [38].L’information de basse détermination sur les propriétés conformationelles des distincts états dénatures peut être acquise par des mesures du volume hydrodynamique et du rayon de giration, par des méthodes spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire et la spectroscopie infrarouge. Or, Ces études ont montre que dans l ’´etat dénature il peut rester des structures existantes dont la nature dépend du dénaturant utilise, [39]. Mais ces techniques permettent d’avoir une information moyennée sur tout l ’ensemble des

conformations que la protéine peut opter. Donc, pour acquérir une information plus détaillée (au niveau atomique), i l faut utiliser la spectroscopie RMN. C’est sans doute la meilleure technique pour étudier les états dénatur es, [40].

Les récentes études faites par spectroscopie RMN ont porte un nouveau vue sur les propriétés de l’´etat dénature. Il ne paraître plus être si désordonne et stochastique. Cependant, Henning et ses collègues ont calcule les angles de torsion des chaînes latérales du lysozyme du blanc d’œuf dénature par l’urée en utilisant la spectroscopie RMN avec marquage et . Ils ont découver t que les résidus de la protéine dénaturée ont des préférences pour certains rots amers, [41]. En plus, les résidus aromatiques construits des clusters hydrophobes même en présence du dénaturant à haute concentration. Alors, toutes ces données affirment la persistance de quelques interactions locales et non locales dans certaines protéines dénaturées. Dans cet état, la protéine opte un assortiment de conformations avec une distribution limitée et une topologie entière qui présente quelques similarités avec celle de l’´etatnatif. Récemment il a été prouvé que l’´etat dénature peut même avoir un rôle biologique, [42].

9.3. Les états intermédiaires du repliement – Le « molten globule » :

Alan Fersht et ses collaborateurs ont propose une méthode basée sur l’ingénierie des protéines pour l’´etude des structures des intermédiaires dans le repliement des protéines, [43]. Cette approche est importante pour la spécification de l’´etat de transition qui correspond à la barrière d’´energie potentielle entre l’´etat dénature et l’´etat natif. Alors, ils ont appose au repliement des protéines la théorie qui a été développée auparavant pour étudier le rôle des énergies d’interactions entre des substrats et des enzymes durant la catalyse enzymatique, [44]. Pour vérifier si une interaction, qui est présente dans l’´etat natif de la protéine et connue grâce à la Structure déterminée par la cristallographie, est déjà présente dans l’´etat de transition, il faut ôter cette interaction par mutagenèse dirigée et observer comment cela influence les énergies libres de l’´etat de transition et de l’´etat natif.

En effet, L’influence relative de ces mutations sur l’´etat de transition est définie par le paramètre : = −∆/ Ν−∆, Où −∆est la variation due à la mutation de la distinction d’´energie libre entre l’´etat de transition et l’´etat dénature, et GN-D pour l’´etat natif. Alors, ces énergies libres peuvent être résolues par des méthodes biophysiques traditionnelles en prend par exemple, des mesures à l’´equilibre et des cinétiques par fluorescence intrinsèque en servant d’un appareil de mélange rapide.

Cependant, normalement le calcul des distinctions d’´energies libres se fait à partir des vitesses de repliement et de dénaturation pour G‡-D et GN-D, respectivement. Alors, quand la valeur de est zéro, cela désigne que la mutation ne change pas la stabilité de l’´etat De transition, contrairement à la protéine sauvage, et une valeur de

égale à 1 indique que la mutation déstabilise (ou stabilise) l’´etat de transition exactement comme l’´etat natif.

Donc, indique à quel point l’´etat de transition ressemble à l’´etat natif dans le voisinage du résidu mute. Lorsque est égale à 1, la structure autour du résidu mute est ainsi stable dans l’´etat de transition que dans l’´etat natif. Alors, quand est égale à 0 la protéine dans l’´etat de transition n’est pas organisée autour du résidu déplace. Or, L’explication des qui se trouvent entre 0 et 1 est plus difficile. Donc, Ces valeurs peuvent être interprétées soit par des interactions affaiblies dans

l’´etat de transition soit par l’existence d’un mélange d’´etats de transition avec des interactions entièrement formées ou cassées. Ce mélange peut coïncider à l’´equilibre entre distinctes conformations d’un intermédiaire ou à des voies parallèles de repliement conduisant à un mélange d’´etats de transition, [45]. Or, Les premières preuves de l’existence d’´etats partiellement replies ont été acquises en 1967 par Les groupes de Tanford et Brandts qui ont prouve que la dénaturation de certaines protéines peut Être non coopérative, [46]. En suite, l’´etude mène par Kuwajima et ses collègues sur la dénaturation des structures secondaires et tertiaires de l’α-lactalbumine à été spécialement importante. En effet les dénaturations des deux niveaux de structure ne sont pas simultanées, [47]. Alors, La dénaturation de cette protéine passe par un intermédiaire partiellement dénature avec des éléments de structures secondaires mais pas de structure tertiaire. Et, le même intermédiaire a été découvert pour cette protéine à pH acide. Cet intermédiaire a été déterminé comme un état partiellement replie stable et compact avec des structures secondai res natives, mais avec une structure tertiaire flottante. Il a été nommé « molten globule » (ou globule fondu) par Ohgushi et Wada, [48]. Aussi, dans les années 80, le modèle de « framework » propose par Ptitsyn a été réaffirme par les expériences. Le deuxième intermédiaire prédit par le modèle coïncidait bien à l’´etat « molten globule ». Il a été étudie en détail dans le laboratoire de Ptitsyn qui a découvert que cet état est semblable à l’intermédiaire cinétique qui apparaît durant le repliement des protéines in vitro, [49].

Apres, l’´etat « molten globule » a été retrouve au cours de repliement de nombreux protéines, comme’-lactalbumine (Kuwajima 1996), l’anhydrase carbonique (Jagannadham & Balasubramanian 1985), l’actine (Kuznetsova et al. 1988;Turoverov et al. 1999), l’apomyoglobine (Vidugiris&Royer 1998). Suite à ces découver tes il a été propose comme un intermédiaire général du chemin de repliement des protéines, [50].

L’´etat « molten globule » est un état prématuré du repliement dans les conditions physi ologiques. Donc, cet état apparaît durant les premières millisecondes de la réaction du repliement tandis que la reconstitution totale des interactions natives d’une protéine de 100 à 300 acides amines demande divers secondes (pour certaines protéines) jusqu’`a des dizaines de minutes (pour d’autres).alors, Il est essentiel de souligner que pour la plupart des protéines l’´etape la plus lente du repliement n’est pas la formation du « molten globule » mais sa réorganisation dans l’´etat natif. En effet, a l’´equilibre l’´etat « molten globule » peut être accumule à pH extrême, en existence de concentration modérée de dénaturant, à température élevée ou encore âpres chélation de ligands de protéines, [51]. Alors, L’´etat de molten globule est définit par la présence de structures secondaires natives, mais l’absence de compactage nat if des structures tertiaires.

Or, les chaînes latérales restent mobiles, [52] .Pour Le rayon de giration de la molécule dans l’´etat molten globule est légèrement plus grand que celui de l’´etat natif, [53] .Les résidus hydrophobes fabrique des clusters dans cet état qui sont abordables au solvant, et peuvent lier très fortement des sondes hydrophobes, [54]. Cette sonde se lie très peu sur les protéines natives ainsi que sur les protéines dénaturées, mais a une très grande attirance pour les surfaces hydrophobes présentes dans les états intermédiaires.

10. Forces de repliement :

Quatre types de forces sont particulièrement à l’origine du phénomène de repliement : les liaisons covalentes, les propriétés d’hydrophile/hydrophobie, [55], les

attraction/répulsions électrostatiques, et les forces de Van der Waals qui interdisent aux atomes de s’interpénétrer à courte distance, et tendent à les tenir faiblement au delà d’une distance optimale. 11. Chaperons et repliement des protéines in vivo, [2] :

Certaines protéines, même celles dont les ponts disulfures ont été rompues par des agents dénaturants, sont capables de se replier spontanément. Il a longtemps été sollicité que le repliement d’une chaîne se réalisait in vivo par les mêmes mécanismes que ceux prouvés in vitro. Alors, cette vue a été changée par la découver te des chaperons mol éculaires, [56].

En effet, les chaperons, par leur association transitoire avec des protéines naissantes ou déstabilisées par un stress, sont capables d’empêcher un mauvais repliement ou une agrégation (association au chaperon par des interactions hydrophobes). Or, elles ne paraître pas pouvoir interférer avec les protéines natives ou se lier à une chaîne complètement dépliée. Elles régulent la vitesse de repliement en agissant comme des catalyseurs mais ne paraissent pas mettre en question le postulat d’Anfinsen selon lequel l’information essentiel au repliement est renfermée dans la séquence primaire. Donc, il paraître qu’in vivo peu de protéines nécessitent l’existence de chaperons pour se replier correctement, [57]. D’ailleurs, d’autres molécules accessoires peuvent jouer un rôle dans le repliement, comme la protéine disulfideisomérase, la peptidyl proline cis-trans isomérase. Ces enzymes précipitent ledit processus, [58], (qui peut aussi avoir lieu en leur absence i n v i t ro sous des conditions précises). Or, d’autres modifications, tel que les glycosylations, ne paraître pas modifier le chemin de repliement, ni in vivo, ni in vitro, par contre elles augmentent la stabilité de la protéine, [59], et changent son adressage.

Finalement, inscrivons que l’étude du comportement singulier des protéines thermophiles pourrait porter beaucoup à la compréhension des mécanismes de repliement et de stabilisation des protéines, [60]. Or, les informations tant expérimentales que théoriques sur le mécanisme de repliement des protéines sont nombreuses dans la littérature. Pourtant aucun schéma consensus et prédictif n’existe en cette fin du 20e siècle. Donc, la compréhension de ce mécanisme essentiel sera assurément l e centre d’évolution de la biotechnologie des protéines au 21e siècle. 12. Modèles théoriques pour étudier le repliement, [8]:

L’étude et la compréhension théorique du repliement des protéines est reposée sur trois types différents d’approche : les modèles de réseaux simples, les modèles discrets hors réseau et les dynamiques moléculaires tenant compte de la description de tous les atomes, [61]. En effet, les modèles de simples chaînes soumises à des potentiels très simplifiés dans un réseau montrent les propriétés physiques générales du problème mais ne donnent pas d’information au niveau atomique. Aussi, on peut acquérir tous les états énergétiques et décrire toute la surface énergétique. Or, Les réseaux cubiques, dans lesquels les protéines sont indiquées par des chaînes dont seules les interactions entre paires en contact sur le réseau sont pr isent en compte, permettent de donner des indices sur la sélection des minima globaux.Par qu’antre Les modèles atomistiques traitent plus souvent la dénaturation que le repliement des protéines, [62].

Les temps de repliement protéique de l’ordre de la milliseconde sont opposés avec les simulations de dynamique moléculaire, restreintes à l’échelle de la

microseconde, [63], alors que la dénaturation des protéines à hautes températures (à 225°C) peut avoir lieu en moins d’une nanoseconde.mis à part pour les protéines qui se replient très vite comme la protéine En-HD étudiée par Mayor et al. (2000-2003).

D’ ailleurs, la structure initiale lors des études de dépliement est la structure native qui est la structure très bien définie, contrairement à une st ructure dépliée.

Ces deux évolution (dépliement et repliement) réversibles se complètent mais il vaut mieux de rester prudent quant à l’interprétation du dépliement sous de fortes contraintes, comme une température élevée, qui ne correspondent pas aux conditions de repliement physiologique, [64]. Néanmoins, la dynamique moléculaire où une contrainte impose le Dépliement de la chaîne protéique, couplée avec les données expérimentales de RMN, permet de définir les états partiellement dépliés, [65], comme par exemple, celui de l’ubiquitine dans 60% de méthanol, [66] ou celui de la barnase thermiquement dépliée, [67].

L’étude du repliement par dynamique moléculaire se développe. Les exemples du repliement d’un peptide de 36 résidus, [68], et celui d’une petite protéine de 61 résidus ou monomère, [69], présentent que la dynamique moléculaire permet d’acquérir des informations au niveau atomique non abordables expérimentalement. Pourtant, le coût en temps de calcul reste grand et seuls des petits systèmes peuvent être abor dés. 13. Une description théorique simple, [3] :

En générale, les modèles théoriques les plus importants aujourd'hui s'appuient sur une mécanique moléculaire. Ils représentent la protéine comme un groupe de Particules sphériques, incompressibles (ou à peu près: les atomes), assemblés par des Ressorts, tenant chacun une charge électrique. Or, Ces charges permettent de représenter la caractéristique électropositive ou électronégative des distincts groupes chimiques. En effet, Les ressorts soutiennent la stéréochimie et la rigidité usuelles des distincts groupes: carbones tétraédriques ou plans, liaisons covalentes simples ou doubles. Ainsi que, Les molécules du solvant peuvent être exposées de la même manière. La paramétrisation d'un tel modèle à l'aide de données expérimentales demande certaines dizaines d'années au chercheur. Pare qu’entre, Une fois en place, et nonobstant sa simplicité, alors, un modèle de mécanique moléculaire bien paramétré est un out il fort pour Étudier le repliement et la stabilité des biomolécules. 14. Dépliement des protéines :

Le repliement inverse de protéines c’est le dépliement, donc en générale le dépliement c’est l’approche inverse de repliement. En effet, L’étude du Mécanisme de dénaturation des protéines peut octroyer des informations sur le mécanisme de repliement, ses dernières étapes et ses états intermédiaires. En plus, le début du dépliement est particulier de la structure tridimensionnelle des états natifs des protéines, de leur stabilité et de leur dynamique. Il donne ainsi des informations sur les dernières étapes du repliement et même les états intermédiaires, [8]. 15. Etude du repliement des protéines par des simulations de dépliement, [24] :

15.1. Mécanismes d e repliement simple :

Il vaut mieux donc d’étudier aussi bien des systèmes simples que des protéines duquel le repliement est plus complexe afin comprendre les différents mécanismes de repliement au niveau atomique. On a vue plusieurs modèles au par avant. Selon le premier modèle, le « framework model » ou le model « diffusion-collision » les structure secondaires se constitue en premier avant de s’assembler pour former la structure native (Figure 7). Au contraire, le modèle du « collapse hydrophobe », avantage l’assemblage des résidus hydrophobes pour former le cœur de la protéine suivi de la structuration des éléments de structures secondaires.

Fig. 11 : Représentation schématique des deux modèles de repliements d’âpres, [70]. L’approche expérimentale (on a vue dans le paragraphe7.2) suivie par A.

Fersht comporte à mesurer les grandeurs thermodynamiques et cinét iques définissant le repliement d’une protéine pour la protéine native et pour nombreux mutants ponctuel s. Donc, Ces mesur es permettent de déterminer l’énergie libre de l’état natif, GN-D et celle de l’état de transition, ∆GTS-D et de calculer la quantité Φ = ( ∆GTS-D - ∆G’TS-D) / (∆GN-D - ∆G’N-D).

Alors, Si Φ est proche de 0 la structure de l’état de transition pour cette situation mutée est proche de celle de l’état déplié. Si Φ est proche de 1 la structure de l’état de transition à cette position et proche de celle de la protéine repliée. Aussi la mesure expérimentale de Φ permet de définir structuralement l’état de transition.

En parallèle V. Daggettt a réalisé des simulations du dépliement de ces protéines par dynamique moléculaire à température haute (225°C). Or, Les trajectoires sont Analysées pour reconnaître le passage par l’état de transition. Celui-ci coïncide à une portion De la trajectoire après l’échappement à l ’état natif. A par tir de cette ensembl e de Conformations correspondant à l’état de transition, un paramètre S équivalent au paramètre Expérimental Φ est calculé. Une bonne relation entre les paramètres S et Φ est trouvée.

L’ensemble des ces travaux a autorisé à ces auteurs de proposer un nouveau modèle du Repliement : le modèle « nucléation-condensation ». Ce modèle unit les modèles « framework » et « collapse hydrophobe » : ou le repliement commence autour d’un noyau de repliement (folding nucleus) et à partir de ce germe de repliement présent dans l’état de Transition, la structure secondaire et la structure tertiaire se forment en parallèle. Si le

Accouplement entre la construction de la structure secondaire et la structure tertiaire est faible on se rapproche du « framework » modèle. 15.2. Mécanismes d e repliement complexe :

Néanmoins l’étude du repliement de protéines de plus grande taille a montré que leur mécanisme de repliement peut être plus complexe.

En effet, quand la taille des protéines accroître les barrières dans le paysage énergétique seront possiblement plus grandes et le processus de repliement plus complexe.

Donc, des multiples processus différents de repliement seront possibles. En prend comme exemple une des protéines qui présente un processus de repliement complexe et qui a été considérablement étudiée est le l ysozyme de poul e. C. Dobson, [71], a présenté par divers type d’expériences, surtout des expériences RMN d’échange, que le repliement de cette molécule est complexe : une partie des molécules (environ 20%) se replie sans apparition d’intermédiaire de repliement selon une échelle de temps de l ’ordre de 100ms.

Alentour 10% des molécules se replient très lentement selon un processus qui est Limité par l’isomérie des prolines. Ainsi que, Pour la maturité des molécules (70%) apparaît un intermédiaire transitoire de repliement. Alors, l’échelle de temps est de l’ordre de 400ms. Cet intermédiaire a pu être défini. Comme exemple, La protéine lysozyme comprend deux domaines : un domaine α forme de 4 hélices alpha et d’une hélice 310, et un domaine β formé d’un feuillet β à trois brins et d’une hélice 310

(Figure 10). Il a été présenté qu’au sein de l’intermédiaire transitoire de repliement, seul le domaine α est partiellement structuré.

Fig. 12 : Représentation schématique de la structure cristalline du lysozyme. Sur la droite, le domaine α est constitué de cinq hélices (en rouge et jaune). Sur la gauche, le domaine β est constitué de trois

brins b (en bleu) et d’une hélice.

Or, afin d’appréhender au niveau atomique le processus de repliement du lysozyme nous avons accompli des simulations de dynamique moléculaire de dépliement. Un des problèmes majeurs dans la réalisation de simulations de dépliement, est l’échelle de temps des pr ocessus de repli ement ou dépliement qui est de l ’ordre de la milliseconde à la seconde, signifie d’environ 11 ordres de grandeur plus grand que les temps de simulation possible présentement par dynamique moléculaire. C’est de ce fait les simulations doivent être accomplies à des températures supérieures à la température ambiante ou ut iliser une force complémentaire qui préfère le dépliement. La première solution favorise les participations entropiques et peut donc introduire des artefacts et altérer le mécanisme de dépliement ( et donc de repli ement).

Fig.13: Représentation schématique du dépliement (a -> f) ou du repliement (f -> a) du

Lysozyme à six étapes différentes d’une trajectoire de dépliements obtenus par simulation de dynamique moléculaire. Les hélices α sont représentées par des serpentins en bleu et les feuillets

β par des flèches rouges. Pour la deuxième solution doit être appliquée avec précaution en introduisant

une force faible. Alors, B. GILQUIN et all ont choisi d’appliquer un potentiel qui dépend de l’écart de tous les atomes de la protéine par rapport à la structure native. Donc, ce type de contrainte ne suppose à priori aucun changement de volume ou de rayon de giration.de ce fait, Les mouvements aboutisses sont ceux qui demandent l e plus faible changement éner gétique. 16. Rigidité et souplesse des protéines, [8]:

La souplesse des protéines et leur stabilité peuvent être i nfluencées par des conditions envir onnementales ( température, pH, sali nité…).

Par qu’autre, une rigidité structurelle suffisante préserve la seul et spécifique forme native de la protéine. Pour la souplesse interne, elle permet son bon fonctionnement (comme l’activité enzymatique des enzymes).donc, Il est très important que les protéines conservent une certaine souplesse pour garder leur activité biologique. Alors, une protéine est stable si les conditions extérieures lui acceptent de ne pas se déplier mais aussi d’être toujours active.

16.1. Dynamique des protéines :

L’étude par diffraction des rayons X ne procure que des structures statiques des protéines. Néanmoins les protéines sont souples et leur activité biologique dépend de cette soupl esse.

Donc, la dynamique a lieu sur un large domaine temporel dont les multiples mouvements sont vi lles dans le tableau ci-dessous. Mouvements Amplitude (Å) Log10 du temps

caractéristique (s) Vibrations atomiques 0,01 à 1 -14 à –13 Vibrations élastiques de régions globulaires

0,05 à 0,5 -12 à –11

Rotations des chaînes latérales exposées

5 à 10 -11 à –10

Rotations des chaînes latérales enfouies

5 -4 à 0

Transitions allostériques 1 à 5 -5 à 0 Dénaturation locale 5 à 10 -5 à 1

Tableaux 1 : représentes des différents mouvements des protéines.

En effet, Les mouvements qui participent à la dynamique des protéines sont dus à varié mécanismes : mouvements d’ensemble de domaines, mouvements de type vibratoire, mouvements de diffusion. Or, Les vibrations atomiques sont des mouvements très rapides de l’ordre de la picoseconde ou moins. Les mouvements entre domaines sont attendus dans les protéines dans lesquelles des parties de la structure peuvent bouger les unes par rapport aux autres sur plusieurs angströms. Alors, Les régions entre les domaines forment des charnières en référence aux charnières des por tes liant deux par ties bougeant l’une par rapport à l’autre. 16.2. Facteurs de température :

Une façon de mesurer la souplesse des domaines d’une protéine est d’examiner les facteurs de température. Alors, si la détermination de structure de la protéine acquise par rayons X est suffisamment bonne, les facteurs de température de chacun de ses atomes sont disponibles dans les fichiers dispensés sur la banque de données Pr otein Data Bank , [72]. En effet, Le facteur de température est un facteur correctif qui rend compte du fait que les noyaux des atomes n’ont un endroit fixe que s’ils sont à la température du zéro absolu. À la température de l’expérience, les noyaux oscill ent autour de leur position d’équilibre.

Or, la relation mathématique entre le facteur de température Bj et la valeur moyenne du déplacement de l ’atome j est la suivante, [73] :

Bj=

Montre cette équation que les facteurs de température sont positifs et leur

dimension est celle d’une surface. Ainsi que plus le facteur de température d’un atome n’est grand, plus son noyau balance autour de sa position d’équilibre, plus cet atome change. Les facteurs de température sont des grandeurs expérimentales qui peuvent être calculées de Façon théorique avec la donnée des flottements moyennes des atomes. 17. La prédiction de structure, [74] :

Nous pourrons apprendre beaucoup sur la fonction des protéines si nous arrivons à soustraire ou à prédire leur structure. En effet, Il ya deux grandes approches de pr édiction de structure :

ü Modélisation basée sur des structures connues et une similarité détectable entre la plupart de la séquence à modéliser et la séquence d’une (au moins) structure connue.

ü Les méthodes ab initio : Elles prédisent la structure à partir de la séquence seule, sans recourir à des similarités avec des repliements connus.

§ Modélisation par Homologie : La modélisation par homologie comporte en 4 étapes

1. Trouver des structures connues qui ont un rappor t avec la séquence. 2. Aligner la séquence à modéliser sur la séquence ou les séquences connues . 3. Construire le modèle. 4. Evaluer le modèle. § Prédiction de Structure Ab initio :

La prédiction de structure Ab initio est Basée sur l’idée que la structure native correspond à un minimum globale énergétique. Or, L’hypothèse d’Anfinson Ces méthodes accomplit une recherche à grande échelle dans l’espace conformation el, et Le but des recherches est de trouver des conformations tertiaires qui ont une énergie spécialement basse pour une séquence donnée.

En effet, Les deux particuliers les plus importantes de ces méthodes sont la procédure de recherche doit être rapide et efficace et La fonction d’énergie libre doit être la plus juste possible, ainsi pour la recherche on utilise une partie des atomes, alors les Potentiels doivent enfermer des méthodes pour moyenner les effets des autres.

En revanche, Rosetta (Baker et al) combine les deux approches. Des fractions oscillent entre des structures en accord avec la séquence du segment et des structures connues. Or, La forme native est celle où les segments locaux sont orientés de telle sorte que les interactions de basse énergie libre se font à travers toute la structure.

Or, il ya D’autres approches ab initio utilisent des potentiels d’interactions entre 2,3, ou 4 types de résidus (au lieu de 20).alors, elles sont basées sur les statistiques de ces interactions dans des structures connues (Knowledge based potentials). L’authenticité des modèles issus des approches ab initio est << que les modèles par homologie lorsque l’identité de séquence est > 30%.

Par contre, la topologie entière du repliement n’est pas si mauvaise. Cependant, Dans des cas favorables des méthodes de novo accordent des indices importants sur la fonction de protéines inconnues. 18. Conclusion :

Le repliement des protéines est un domaine de recherche en pleine évolution. Après une longue période de dormance, or, les applications potentielles des connaissances sur le repliement dans le domaine médical, en biotechnologie et en génomique ont dirigé le projecteur sur ce processus complexe, adroitement ciselé par l’évolution pour permettre à une chaîne polypeptidique non seulement de procurer sa structure biologiquement active (sur laquelle s’exerce la pression évolutive), mais également de l’acquérir en un temps étonnamment court, avec une grande efficacité, là où il le faut et quand il le faut, [75].

En effet, la compréhension des mécanismes de repliement des protéines représente l’un des primordiaux enjeux de la biologie. Donc, Il s’agit d’un problème indispensable pour l’analyse des plusieurs événements compromis dans la régulation cellulaire, et pour l’utilisation de l’information renfermée dans le nombre augmentant de gènes séquencés. L’éclaircissement de ces mécanismes devrait permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la précaution et le traitement des maladies associées à des repliements incorrects, [76].

Ainsi que, L’augmentation des connaissances aussi bien sur les principes dirigeant le repliement correct et incorrect des protéines que sur la croissance d ’outils sophistiqués pour changer le patrimoine génétique des cellules ou la mécanisation des méthodes d’évolution moléculaire sont tant de voies suivies ouvrant les vues les plus encourageantes dans ce domaine, [77]. Pour mieux comprendre certaines maladies dues à des anomalies de repliement, comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Creutzfeldt-Jakob c’est le sujet à qui on va traites dans le chapitre quatre.

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Chapitre III Etude Théorique du Repliement

et Simulation Numérique

1 .Introduction : Nous allons exposer dans cette partie l’approche numérique et de simulation

de la dynamique moléculaire utilisée pour étudier les propriétés mécaniques des protéines. Suivant la taille des protéines et les informations que l’on veut avoir, on choisit une description plus ou moins fine du système (la protéine étudiée et son environnement). En particulier, on présente les modèles moléculaires confondant atomes et ressorts permettant d’accomplir des simulations sur ordinateur par la méthode de dynami que moléculaire (DM), [4].

En effet, les simulations sont un outil puissant pour modéliser et étudier à l'échelle atomique des systèmes complexes. Dans cette étude, généralement on fait trois approximations importantes : 1) les vitesses des particules sont faibles par rapport à la vitesse de la lumière, 2) le mouvement des électrons est beaucoup plus rapide que celui des noyaux (approximation de BORN-OPPENHEIMER), 3) le mouvement des atomes peut êtr e écrit par la mécanique classique.

Donc, à partir de principes simples de la Physique, spécialement les lois de NEWTON, on simule ainsi sur ordinateur le comportement des molécules au niveau atomique. On à choisir un modèle utilise une représentation de la molécule en boules-et-bâtonnets, où les atomes sont représentés par les boules, ayant un rayon, une masse et une charge atomique, et les liaisons par les bâtonnets qui sont des ressorts amenant les liaisons à leur longer la plus stable après une déformation. Cependant, Le jeu de boules et de bâtonnets qu'on utilise est caractérisé par un champ de for ces.

En effet, Les interactions physiques entre les atomes (boules) – telles que la répulsion stérique, les liaisons hydrogène, etc. – sont prises en compte et introduites dans l'équation de l'énergie potentielle. Or, du point de vue thermodynamique cette énergie est une fonction d'état.

Nous avons utilisé les lois de NEWTON à partir du modèle physique déterminé par les paramètres du champ de forces et la représentation de l'énergie potentielle choisie, pour propager les molécules dans l 'espace des phases, défini par les vecteurs associés aux quanti tés de mouvement et les vecteurs de position des atomes.

Cependant, La dynamique moléculaire nous permet aussi de générer des ensembles statistiques des formes d'atomes et molécules en phase cristalline, en solution ou en phase gazeuse , [1]. Pour accomplir ces simulations, nous avons utilisé le logiciel TINKER « étameur ambulant », version 4.2 juin 2004 développé par Jay William. Ce logiciel permet l’exécution de calculs et de simulations en Dynamique Moléculaire, [2],

[3]. Toutefois, Les détails concernant les champs de forces, la représentation de l'énergie potentielle et les paramètres de simulation sont propres aux logiciels utilisés.

Généralement on retrouve ces caractéristiques ou des paramètres similaires dans d'autres programmes de simulations moléculaires, étant donné que les lois physiques utilisées sont identiques dans tous les cas.

Dans ce chapitre, on s’intéresse en particulier à l’étude de la protéine d’Ubiquitine dont l’importance en Biologie Moléculaire et en Médecine est très relevée.

2. L'espace Cartésien et déterminations des symboles, notations, [1] :

Les vecteurs et les matrices sont écrits en gras par exemple R pour les positions ou encore F pour les forces.

En effet, Nous utilisons un système de coordonnées Cartésiennes avec les trois vecteurs de base orthonormés suivants:

…………..(1) Or, le vecteur de position d'un atome i dans cet espace 3D peut être

représenté par ses 3 composantes ( …………………… (2)

On utilisera dans la suite la notation simplifiée suivante :

)…………………………(3)

Donc, Le produit scalaire entre les deux vecteurs ( est décr it par …………………. (4)

et la longueur d'un vecteur ………………..(5)

Ainsi, la distance entre les atomes i et j est déterminée par

…………………………(6)

Notons que toutes ces définitions peuvent être généralisées à 4D. Cette

technique de simulations de DM dans l'espace Cartésien en quatre dimensions permet de surmonter des barrières énergétiques dans l'hyper-surface de l'énergie potentielle. Dans notre étude nous nous limitons aux simulations à 3D. 3. Degrés de liberté, fonction d'interaction et équations de mouvement :

À partir de toute modélisation d'un système, trois choix fondamentaux doivent être faits. D’abord, quels degrés de liberté seront explicitement traités ou simulés ? Ensuite, lesquels seront seulement traités implicitement et introduits dans la fonction qui décrit l'interaction entre les degrés de libertés traités explicitement ?

En effet, les degrés de liberté explicites peuvent être traités de manière classique ou par la mécanique quantique. Ensuite, il faut choisir une fonction d'interaction pour décrire l'énergie d'interaction du système moléculaire en fonction des degrés de liberté explicites du modèle. A la fin, il faut adopter une méthode pour échantillonner les formes ou simuler le mouvement selon les degrés de libertés explicites, ou pour rechercher les parties de l'espace de configuration dont le système moléculaire possède une énergie minimale.

Dans notre étude, nous nous intéressons seulement aux degrés de libertés de position, c'est-à-dire les coordonnées Cartésiennes des atomes. Dans ce cas, l'HAMILTONIEN du système moléculaire prend la forme suivante

………………..(7)

Le premier terme est le terme d'énergie cinétique

…………………(8)

qui dépend seulement des masses atomiques mi, et est indépendant des coordonnées R de la particule. Le deuxième terme représente l'énergie potentielle (la fonction d'interaction), qui s’exprime en fonction des coor données R des particules :

………………………..(9)

Généralement dépend de L paramètres nommés aussi paramètres du champ de force, indiqués par .

En général, la fonction d'interaction est une somme de termes qui représentent des types différents d'interactions.

Or, la force qui agit sur une particule i est donnée par l'équation ……………………………. (10)

dérivant d ’un potentiel . Cependant, la trajectoire acquise lors des simulations de DM dépend

seulement des forces qui agissent sur les atomes, pas explicitement des énergies. Pour cela, on utilise les équations de mouvement classique pour décrire l’évolution des atomes dans l' espace des phases. Alors, Les équations de NEWTON sont:

…………………… (11)

…………………………………… . (12)

…………………(13) Dans les simulations de dynamique moléculaire, les équations (11-13) sont "intégrées" numériquement dans le temps. D’autre part, le système moléculaire peut être couplé à des gr andeurs externes au système de façon di fférente.

Par exemple, on peut introduire un terme perturbatif supplémentai re , une fonction de perturbation, dans la fonction d'interaction du système qui limite le mouvement des particules de manière à ce que la valeur simulée de la quantité externe se rapproche de la valeur choisie. Or, cette valeur peut également être exigée comme contrainte au système de manière à être vérifiée pour chaque forme ou pour un ensembl e de conformations.

Donc, une équation au premier ordre peut être additionnée aux équations de mouvement des par ticules pour faire changer la valeur simulée de la quant ité externe vers une valeur donnée, il s'agit de la méthode de fai ble couplage.

Alors, les deux dernières méthodes contraintes et faible couplage entraînent un changement des équations de mouvement classiques du système moléculaire. Si l'énergie potentielle ne dépend que de la conformation instantanée, l'énergie totale sera seulement conservée lors d'une simulation de DM. Quand on met une contrainte ou la méthode de faible couplage avec des paramètres moyennés dans le temps cette condi tion n'est pas véri fiée, [1]. 4. Hamiltonien, fonction d'interaction et champs de forces utilisés:

L'Hamiltonien du système moléculaire, présenté dans l'équation (7), comporte deux termes. Le premier représentant l'énergie cinétique est donné par l'équation (8). Le deuxième correspond à l’énergie potentielle qui caractérise un certain champ de force.

Cependant , les macromolécules sont représentées comme un ensemble d’atomes ponctuels dont les interactions sont décrites par un potentiel semi-empirique ou champ de force. On nomme champ de force le modèle mathématique représentant l'énergie potentielle d'une molécule en mécanique moléculaire, [4].

En fait, sous ce terme sont rassemblés deux éléments : d'une part l'expression des différentes fonctions participant au calcul énergétique et d'autre part les valeurs des constantes di fférentes paramétrant ces fonctions, [4].

En général, l'énergie potentielle dans les champs de force prend la forme suivante, [1] :

………………. (14) : L’énergie potentielle d’interactions entre atomes liés par des liaisons

covalentes. : L’énergie potentielle d’interactions "non-liées" (Van Der Waals et

électrostatique). : L’énergie potentielle des termes spéciaux, par exemple des contraintes de

position.

4.1. Interactions entre atomes liés, [1]: Dans l'expression de , quatre termes interviennent

…………(15)

Ils montrent l'élongation des liaisons, la déformation des angles et les torsions pour les angles dièdres périodiques et "impropres". 4.1.1. Elongation des liaisons covalentes entre atomes, [5] :

Parmi les champs appliqués dans le logiciel TINKER, il y a le champ de forces d'AMBER qui s’exprime par un terme quadratique pour les Interactions d'élongation des liaisons, avec une sommation sur toutes les liaisons covalentes .

Ici, représenter la longueur instantanée de la liaison n, sa valeur à

l'équilibre et enfin la constante de force associée. Généralement, les unités qui sont utilisées pour , sont en Å et pour en .

4.1.2. Déformation des angles entre atomes liés, [1]:

Le terme de déformation des angles entre atomes liés par une liaison covalente dans le cas d’AMBER est donné par l’équation :

Généralement, les angles sont donnés en radians, en kcal .

4.1.3. Termes de torsion, angles dièdres et impropres, [5]:

La partie de la fonction d'interaction qui représente les termes d'interactions harmoniques impropres de déformation des angles dièdres (hors du plan, hors de la configuration tétraédrique) est décrite par une série de FOURIER de la manière suivante :

Dans AMBER, tiennent cette équation s’écrit avec une mul tiplicité =2 pour un plan ou =3 pour un tétraèdre, étant égal à 180° dans les deux cas.

Dans le cas général, la série ne conçoit qu'un seul terme, mais quelques cas sont connus où il en faut plus (par exemple butane, OS-CH-CH-OS ou H-N-C-O). 4.2. Interactions non-liées, [5]:

Les interactions entre atomes non-liés sont décrites par deux termes, pour les interactions électrostatiques et pour les Interactions de type LENNARD-JONES.

La somme s'étend en pri ncipe à toutes les paires d'atomes (i, j), mais en

général un certain nombre d’interactions est exclu. 4.2.1. Interactions de Lennard-Jones, [5]:

Plusieurs ensembles de paramètres sont utilisés pour décrire les interactions de type Lennard-Jones, aussi nommées interactions de Van Der Waals.

En effet, dans AMBER nous avons utilisé les paramètres en kcal et R*(la valeur de la distance pour laquelle l’énergie est minimale) (en Å) pour ce même potentiel avec en Å pareillement.

correspond à la répulsion entre deux atomes due à l'exclusion de PAULI, et le

terme indique la dispersion attractive de LONDON. Alors, dans AMBER nous utili sons les règles de LORENTZ-BERTHELOT.

……………… ..(21)

Fig.1 : Energie d'interaction (Van der Waals) en fonction de la distance de séparation entre les deux atomes d’une molécule diatomique de type X-X.

4. 2.2. Interactions électrostatiques, [5] :

Le premier terme concerne dans l’équation (23) reflète les interactions Coulombiennes et les deux autres termes le champ de réaction :

Or, la correction du champ de réaction de type Poisson-Boltzmann est une

généralisation du modèle d'ONSAGER qui prend en compte les effets de force ionique.

Ici, on considère un modèle où l'extérieur d'une sphère de rayon autour du soluté est modélisé par un milieu homogène polarisable (Figure 2). En fait, le deuxième terme représente la force agissant sur l'atome i due au champ de réaction induit par l'atome j. Donc, on part de l'hypothèse d'un continuum électrostatique caractérisé par une permittivité diélectrique relative et une longueur d'écrantage de DEBYE inverse K à l'extérieur de la distance de troncature du champ de réaction . On introduit pour chaque atome j, une charge image hors de la

sphère à une distance moyenne qui participe au potentiel électrostatique

à l'intérieur de la sphère. Alors, le coefficient sera déterminé par la relation:

…………. (24)

où =1. Le dernier terme dans l’équation 23 est constant et sert à rendre l'interaction nulle à . Or, Pour =1 et K = 0, la correction du champ de réaction est nulle.

Fig.2 : Représentation de la méthode du champ de réaction.

L'atome i au centre de la sphère de rayon est entouré de charges situées A la distance . Le champ de réaction est créé par les charges images à .

4.3. Forces spéciales dues aux contraintes, [5] :

Notons que la fonction d'interaction donnée dans l'équation (14) peut contenir des termes qui ne sont utilisés que dans des cas particuliers. Dans cette étude, nous avons fait appel aux contraintes harmoniques sur la position des atomes, sur les distances de liaison, les angles et les torsions et aux contraintes de position (option BELLY dans AMB ER) et enfin de distances de liaison (Algorithme SHAKE). 4.4. Inclusion de la polarisabilité, [5] :

En effet, dans les termes additifs par paires de l'équation (23) on néglige la contribution de la polarisation, qui par sa nature est non-additive. Donc, pour l'inclure dans la fonction d'interaction, on se sert de l'approche des polarisabilités atomiques, où on attribue une polarisabilité à chaque atome i. L'énergie de polarisation dépend du champ électrique permanent qui agit sur l'atome i et du moment dipolaire induit :

……………(25)

Alors, pour rendre compte de la polarisation, il faut déterminer par une procédure itérative. En effet, à partir d'un champ initial = , on se sert du tenseur dipolaire et de ce champ pour calculer le champ électrique du pas suivant :

…………………… ..(26)

La procédure itérative mène à un champ auto-cohérent qui obéit à un critère de tolérance bien défini. Ensuite, on calcule une contribution de ce champ à la force d'interaction entre les atomes i et j :

…………… ..(27) Ce terme sera donc ajouté comme force spéciale à la fonction d' interaction.

5. Mécanique et dynamique moléculaire : 5.1. Minimisation de l'énergie :

Le rôle de la minimisation dans les pr ogrammes de dynami que moléculaire est surtout de relaxer la structure initiale et d’éliminer les mauvais contacts Interatomiques. Ceci permet notamment d’éviter les changements de conformation trop brusques dès le début d ’une dynamique.

Généralement les structures « minimisées » correspondent au minimum local le plus proche de la structure de départ plutôt qu’au minimum global d’énergie. Donc, la minimisation correspond à la première étape d’un protocole de dynamique moléculaire, elle peut être aussi utilisée autour des phases d’équilibration (phases de dynamique sous contrainte) de façon à relaxer le solvant et à accélérer son équilibration autour du soluté.

De même, la minimisation dans les programmes de mécanique moléculaire comme LIGAND et GNMlig permet de trouver le minimum d’énergie potentielle dans le champ de force étudié et sous les contraintes imposées. Généralement, ces méthodes autorisent des changements de forme plus importants grâce à la réduction du nombre et de la nature des variables ou la simplification du champ de for ce.

Alors, les méthodes de minimisation sont basées sur le calcul des dérivées de la fonction d’énergie et utilisent des processus itératifs : à partir de l’énergie potentielle et du gradient, calculés pour un jeu de coordonnées, ces algorithmes génèrent un nouveau jeu de coordonnées correspondant à une énergie potentielle plus basse, [4].

Donc, la mécanique moléculaire nous permet de minimiser l'énergie calculée à partir de l’équation 14 afin d'avoir des conformations à basse énergie de notre

système moléculaire et de réduire des forces initiales trop grandes qui finiront à générer une trajectoire aberrante.

En effet, on peut utiliser deux méthodes de gradient faisant appel à l'énergie potentielle V(r; s) et à sa dérivée suivant r. Cependant , l'inconvénient de ces méthodes est qu'on suit à peu de choses près le gradient de l'énergie potentielle en se déplaçant de dans l'espace de con figuration :

………(28)

De cette manière on se déplace presque seulement vers le bas sur l'hyper-surface énergétique, et le minimum atteint est en général le minimum local le plus proche de la configuration initiale (Figure3). Alors, Il n'est pas possible de surmonter des barrières énergétiques.

Donc, dans ce cas la dynamique moléculaire est un moyen plus efficace de recherche de conformations de basses énergies, elle permet de surmonter des barrières de l'ordre de kBT, [5].

Fig.3 : Inconvénient des méthodes de gradient : le minimum local atteint par les deux boules a et b est différent et dépend de la position (configuration) initiale.

5.2 .Dynamique moléculaire :

Les simulations de dynamique moléculaire donnent la possibilité d’observer le comportement d’un système en fonction du temps. Aussi, elles permettent d’échantillonner un espace de conformation important, inabordable aux expériences de minimisation d’énergie.

Cependant, l’énergie totale du système se décompose en énergie potentielle décrite par le champ de force et en énergie cinétique liée à la température du système. Ainsi, L’apport d’énergie cinétique sous forme de température permet d’exciter le système et de lui faire quitter le minimum local atteint au cours de la minimisation. Alors, le système ayant accumulé suffisamment d’énergie peut explorer l’espace de conformation et accomplir des transitions de conformations par sauts de barrières énergétiques successives. D’où, nous avons utilisé les expériences de dynamique moléculaire afin d’obtenir des structures stables et de basses énergies, [4]. Nous avons pour cela utilisé la version 4 du programme de dynamique moléculaire TINKER. 5.2.1. Principe :

À partir d'une fonction d'énergie empirique comme celle donnée dans l'équation (14), Les simulations de dynamique moléculaire sont largement utilisées pour étudier la structure, la dynamique et certains aspects thermodynamiques des systèmes moléculaires à l'équilibre et hors équilibre. En effet, les équations de mouvement des atomes issues de la mécanique classique sont intégrées dans le

temps. Donc, dans un système de coordonnées cartésiennes, ces équations sont celles de NEWTON (11-13), avec les forces égales au gradient de l'énergie potentielle mais de signe opposé.

Alors, dans une simulation de DM standard, l'énergie totale E du système moléculaire est une constante. Généralement, on garde également le nombre d'atomes N et le volume de la boîte de simulation fixe. Or, ces simulations se déroulent dans l'ensemble micro-canonique (NVE).

Souvent il est préférable de maintenir la température constante plutôt que l'énergie, il s'agit alors de simulations (NVT).

Dans d'autres cas, il peut être avantageux de simuler à pression constante plutôt qu'à volume constant, ce so nt des simulations (NPT).

Pour les simulations (NVT) ou (NPT) il est nécessaire de coupler le système moléculaire à un bain thermique ou un bain de pression, respectivement, [1]. 5.2.2. Résolution de l’équation du mouvement, [4]:

Comme on a dit au paragraphe précédent, en dynamique moléculaire, les formes successives du système étudié sont générées grâce à la résolution des équations du mouvement de Newton. Donc, Il en résulte la trajectoire qui indique les positions (coordonnées cartésiennes) et les vitesses des atomes qui décrivent le système au cour s du temps.

Alors, la force s’appliquant sur l’atome i est calculée en dérivant la fonction d’énergie potentielle par rapport aux coordonnées car tésiennes de cet atome :

………. (29) Donc, pour chaque atome i de masse la force exercée par l’ensemble du système sur cet atome vérifie l’équation du mouvement de Newton :

……………… ..(30)

En effet, l’équation ci-dessus est un système d’équations différentielles du deuxième ordre pour laquelle une solution discrétisée peut être obtenue à l’aide d’un développement de T aylor.

A partir de la connaissance des positions et de toutes leurs dérivées à l’instant t, les positions à l’instant (t±Δt), où Δt représente le pas d’intégration, sont données par :

…………… (31) 6. Systèmes dans le vide, [1] :

Notons que la simulation d'un système in vacuo (ou dans le vide) correspond à la phase gazeuse à pression zér o.

Lorsque ce protocole est utilisé pour une molécule "en solution", les propriétés des atomes proches de la surface du système sont altérées, et l'effet d'écrantage du solvant sur les interactions électriques entre charges et dipôles de la molécule ne peut être négligé en général. La molécule elle-même peut également être déformée à cause de sa tendance à mi nimiser son aire de surface.

Alors, les quantités de mouvements associés à la translation et à la rotation sont conservées, et il est d'usage de supprimer le mouvement de translation du centre de masse et la r otation autour de ce centre au début d'une telle simulation. Or,

la température d'un système in vacuo peut être calculée par l'équation de CLAUSIUS :

……………… ..(32) avec la constante de BOLTZMANN =8.31441·10-3 kJ et est le nombre de degrés de liberté du système donné par :

………………………… (33) où : Nombre d'atomes, le nombre de contraintes et une variable qui dépend des condi tions de simulation.

En effet, pour un système dans le vide avec suppression du mouvement de translation et de la rotation du centre de masse, =6. 7. Système dans un milieu solvate (non vide), [4] :

On a vu dans le dernier paragraphe que les calculs de modélisation et de dynamique moléculaire peuvent se réaliser pour des molécules placées dans le vide. C’est le cas de notre présente étude. Néanmoins, il est très intéressant de tenir compte des effets du solvant lors de l’étude des molécules biologiques (surtout des protéines), ceux-ci jouant un rôle essentiel dans la structuration de ces dernières (voir Chapitre 1).

Dans ce cas, Il existe aussi deux façons de tenir compte de ces effets, à savoir l’approche explicite consistant en l’utilisation de molécules d’eau explicitement ou l’approche implicite consistant en l’utilisation des fonctions énergétiques représentant les interactions avec le solvant. 7.1. Approche explicite, [4] :

On peut utiliser le solvant (ici l’eau) de façon explicite. Dans ce cas, chaque molécule d’eau est modéli sée.

• Modèles : On prend par exemple le modèle en 3 points TIP3P ("Transferable

Intermolecular Potential 3 Points") développé par JORGENSEN et al. Pour le liquide pur, [4], [1].

En effet, ce modèle conçoit trois atomes (un oxygène et deux hydr ogènes) liés par trois liaisons (deux liaisons O-H de 0,957 Å et une liaison H-H de 1,514 Å) de constante de force de 553 kcal.mol-1. L’oxygène est chargé négativement de –0,834 e (e est la charge élémentaire égale à 1,6.10-19 C) et les charges des hydrogènes sont de +0,417 e. L’atténuation des interactions électrostatiques par le solvant est intrinsèque au modèl e (ε = 1) ainsi que la polarisation.

D’autres modèles existent dans la littérature. On citera par exemple celui nommé SPC ("Simple Point Charge") qui diffère du modèle TIP3P dans la prise en charge des charges atomiques utilisées, des paramètres de Van Der Waals et de la géométrie. On peut aussi citer les modèles SPC/E, TIP4P ainsi que le tout récent modèle TIP5P qui incorpore une représentation explicite des deux paires libres sur l'oxygène de l'eau a été mise au point tout récemment.

• Limite : Notons que le nombre de molécule d’eau à ajouter pour simuler un

environnement aqueux est important et augmente avec la taille de la protéine. Donc, il en résulte un accroissement considérable du nombre de variables du système et du temps de calcul, [4]. 7.2. Approche implicite (modèle de Born généralisé) , [4]:

Pour étudier les systèmes de grande taille, il est souvent très utile d’utiliser un solvant implicite. Cependant, ce traitement du solvant est plus rapide que les représentations explicites du solvant.

Ainsi, le modèle de Born généralisé (« Generalized Born », GB) traite le solvant comme un continuum diélectrique. Donc, la contribution électrostatique à l’énergie de solvatation est donnée par l’équation suivante :

……..(34)

Avec ……. (35)

où :

- est la constante diélectrique du solvant (la constante diélectrique de l’eau étant égale à 78,5) ;

- Κ est une constante calculée d’après le modèle de Debye-Hückel permettant de représenter l’effet d’un sel. En effet, elle est égale à la constante de Debye-Hückel multipliée par 0,73 pour prendre en compte la surestimation de l’effet du sel due au fait que rien n’empêche les contres-ions d’avancer très près du soluté ;

- sont les charges partielles des atomes i et j respectivement ;

- est une fonction telle que fGB→Ri quand →0. Or, cette fonction minimise le

calcul de l’énergie de deux charges en interactions coulombiennes écrantées par Debye-Hückel quand les deux charges sont éloignées, étant la distance entre

les deux atomes i et j ; - sont les rayons effectifs de Born des atomes i et j respectivement. En fait,

ces rayons dépendent non seulement des rayons atomiques intrinsèques ou

des deux atomes considérés mais aussi des rayons et des positions relatives des autres atomes par le biais d’une fonction positive notée g. Ils sont calculés

avec la méthode de Hawkins, Cramer et Truhlar, [28], qui donne un rayon de Born plus grand que le rayon atomique :

……..(36)

Remarquant que les paramètres utilisés sont ceux de Tsui et Case, [29], qui ont montré que l’ADN restait stable sur 12 ns de dynamique moléculaire avec l’utilisation de ces paramètres. Ils ont montré aussi que, pour les protéines, cette modélisation du solvant permettait un gain important de temps par rapport à l’utilisation d’un solvant explicite tout en représentant raisonnablement des effets de solvant, [30].

Cependant, l’avantage de ce modèle continu est de pouvoir limiter le nombre d’atomes du système par rapport à l’utilisation d’un solvant explicite tout en tenant compte des effets él ectrostatiques du solvant.

En effet, pour une protéine d’environ 2000 atomes, le remplacement du solvant explicite par l’approche de Born généralisée représente un gain d’environ 30% de temps de cal cul (sans autres simplifications). 8. Modélisation de la dynamique de la chaîne peptidique des protéines en solution par RMN à travers les couplages dipolaires, [15] :

Observer la structure tridimensionnelle d’une protéine à l’échelle atomique est très important pour comprendre sa fonction et son mécanisme. Or, cela n’est pas suffisant pour une compréhension totale de son fonctionnement. Donc, pour que l’étude soit complète, il est indispensable de s’intéresser à sa dynami que.

De ce fait, comme hétéro-polymères comprenant un grand nombre de degrés de liberté, les protéines présentent une dynamique interne riche et complexe étroitement associée à leur réactivité à travers différentes catégories de mouvements. On prend comme exemple, les fluctuations conformationnelles de surface permettant la reconnaissance, les interactions entre partenaires, l’entrée et la sortie de ligands ou de substrats, les fluctuations structurales du site actif engendrant une distribution des vitesses de r éaction et la relaxation conformationnelle successive à la réaction.

En effet, la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) occupe une position particulière parmi les méthodes biophysiques de part sa grande sensibilité aux mouvements intramoléculaires des protéines. Cependant, les mouvements rapides, avec un temps spécifique allant jusqu’au temps de corrélation de la réorientation de la molécule, autour de 10 ns pour les protéines de taille moyenne en solution aqueuse à température ambiante, peuvent être étudiés directement par les mesures de relaxation de spin, une technique bien établie maintenant.

Ces méthodes expérimentales, combinées avec une analyse intuitivement simple en termes d’amplitude dynamique et de fréquences du mouve ment, font par tie du parcours classique des expériences généralement réalisées dans une étude de protéine par RMN. Or, dans des échelles de temps plus importantes, l’échange conformationel entre des sites ayant des comportements chimiques différents peut participer significativement au terme de relaxation transverse.

En effet, Il est habituellement observé lors de l’expérience de relaxation, une dispersion qui met en évidence l’équilibre conformationnel sur une échelle de temps de l’ordre de la microseconde. Ces échelles de temps sont notamment très intéressantes dans ce cas car un grand nombre de processus biologiques fonctionnellement importants sont supposés s ’y produire.

Récemment, l’utilisation de cristaux liquides dilués permettant un léger alignement des protéines par rapport au champ magnétique et introduisant, aussi, une faible anisotropie dans l’espace d’orientation de la molécule étudiée a suscité un vif intérêt. Ainsi, les couplages dipolaires résiduels mesurés donnent une information très précise de l’orientation des liaisons internucléaires relativement à un repère attaché à la molécule. Ceci rend ces couplages très puissants permettant ainsi de déterminer la structure des biomolécules. Puisque ces mesures proviennent de moyennes faites sur des échelles temps relativement longues (jusqu’à la milliseconde) et sur l’ensemble de la population, l’information dynamique qu’elles détiennent est complémentaire à celle acquise par l’étude de la relaxation de spin et de ce fait potentiellement très intéressante pour reconnaître des modèles spécifiques de mouvements.

Notons, que de récentes contributions, [31], employant des couplages dipolaires résiduels pour étudier les moyennes conformationnelles ont utilisé des approches sans contrainte géométrique (model free) pour définir les propriétés de réorientation des vecteurs N-NH.

La direction et l’amplitude de l’échantillonnage angulaire du vecteur internucléaire sont décrits : soit uniquement à partir d’harmoniques sphériques moyennées de deuxi ème ordre <Y2M>, qui sont ensui te résolues explicitement ; soit à partir de matrices décrivant aussi bien l’information structurale que dynamique à déterminer.

Ainsi, les deux méthodes ont été appliquées à partir des données expérimentales des couplages dipolaires résiduels N-NH, mesurées dans 11 milieux d’alignement distincts, de la protéine d’Ubiquitine. Toutefois, la première méthode permet d’apercevoir un degré de mobilité qui n’est pas visible à partir des études de relaxation, possiblement dans la gamme de la nano à la milliseconde. Dans ce dernier cas, les auteurs n’exposent pas l’amplitude absolue des mouvements, mais uniquement les paramètres d’ordre qui y sont relatifs.

Abordant le problème différemment, une étude récente, [32], a prouvé en considérant dans chaque peptide plusieurs couplages dipolaires résiduels mesurés dans 5 milieux orientant, qu’une seule forme, en accord avec tous les couplages, peut être déterminée. En effet, une analyse de cette structure a conclu que l’amplitude des mouvements des vecteurs N-NH était moindre que celle déduite par l’approche décrite plus haut, l’origine de cette distinction reste inconnue.

De ce fait, un des avantages des approches citées ci-dessus est de montrer l’utilité, expérimentalement délicate, de trouver un grand nombre (>5) de milieux d’alignement distincts. Pour arriver à ce but, chaque milieu doit déduire une orientation résiduelle de la molécule par rapport au champ magnétique significativement distincte (voir section §.8.3), qui, en pratique, suppose que l’interaction entre le soluté et le milieu soit différente dans chacun des cas. Donc, Il est intéressant de développer des méthodes alternatives, peut-être plus générales, pour détecter la moyenne conformationelle à partir des couplages dipolaires résiduels.

Alors, dans cette étude une autre approche différente a été développée, qui au lieu d’essayer de déterminer explicitement les composantes des harmoniques sphériques, et la moyenne du couplage dipolaire, des modèles géométriques simples ont été testés pour décrire les mouvements locaux. Ainsi, ils ont pu réduire le nombre de paramètres indépendants essentiels à caractériser les mouvements, tels que ceux de la chaîne peptidique qui sont des processus complexes. Trois modèles intuitifs ont été proposés : le modèle à symétrie axiale, les fluctuations du plan peptidique autour d’un axe défini par les carbones alpha et un modèle de saut entre deux conformations autour de ce même axe et un modèle de réorientation à symétrie cylindrique du vecteur N-NH. 8.1.1. L’interaction Dipôle-Dipôle Directe :

Notons que chaque spin nucléaire est associé à un moment magnétique de spin et engendre un champ magnétique dans l’espace environnant. Donc, deux spins nucléaires se trouvant dans un même voisinage interagiront chacun avec l’autre, le premier « voyant » le champ magnétique créé par le second et inversement. L’interaction est mutuelle.

Toutefois, inversement aux couplages scalaires, l’interaction dipolaire ne nécessite pas de liaison électronique entre les deux atomes mis en jeu pour exister. Alors, elle s’effectue sans intermédiaire entre les deux noyaux. C’est pur cela qu’elle est nommée « interaction dipôle-dipôle directe ». De plus, les couplages dipolaires peuvent être aussi bien intramoléculaires qu’intermoléculaires.

L’expression complète de l’Hamiltonien d’interaction dipôle-dipôle entre les spins Ij et Ik est donnée par :

où ejk est le vecteur unitaire colinéaire à la droite joignant le noyau j au noyau k, sont respectivement les moments linéaires des sites j et k, et enfin l’amplitude de l’interaction dipolaire est donnée par la constante de couplage dipolaire :

où et sont les rapports gyromagnétiques des deux spins (en rad.s-1), µ0 la permittivité du

vide, avec h la constante de Planck et rjk la distance entre les deux spins (en m). Par exemple, pour la paire de spin 15N-1H, en considérant la distance rjk = 1.02 Å, l’amplitude de l’interaction est égale à bjk/2π = 23 KHz.

Quand les spins sont placés dans un champ B0 intense, seule la composante des spins selon la direction du champ est significative dans l’Hamiltonien de l’interaction dipôle-dipôle direct. Ainsi, dans l’approximation des hauts champs, seule cette composante est prise en compte, les autres sont négligées. Alors, si l’on suppose que le champ B0 est colinéaire à l’axe z alors l’Hamiltonien se réécrit de la manière suivante :

où djk vaut :

et θjk est l’angle que fait le vecteur internucléaire avec la direction du champ magnétique (Figure 4),

Fig. 4 : Schéma représente les deux spins, de l’orientation du champ magnétique B0 et de l’angle θ.

Remarquant que le cas particulier des liquides isotropes est important parce qu’en général les mesures en RMN des biomolécules se réalisent dans ce type de milieu. Or, dans un liquide isotrope, les molécules se réorientent uniformément et avec une vitesse suffisamment grande pour que seule la moyenne des couplages dipolaires intramoléculaires soit mesurable. L’isotropie de la réorientation rend cette moyenne nulle. Donc, aucun couplage dipolaire intramoléculaire n’est mesurable dans ces milieux.

De ce fait, la probabilité p(Ω)dΩ que la molécule s’oriente selon l’angle solide unitaire dΩ = sinθjkdθjkdϕjk (θjk et ϕjk étant les angles polaires du vecteur internucléaire par rapport au champ B0) est donnée par :

p(θ jk ,ϕ jk )dΩ =

14π

sinθ jkdθ jkdϕ jk ………… (42)

Donc :

θ B0

3cos2 θ jk −1 =1

4πdϕ jk dθ jk 3cos2 θ jk −1( )sinθ jk0

π

∫0

2π

∫ = 0 ………

(43) D’où :

Hjk

DD(θ jk ) =0 ……………………… ... (44)

De manière analogue, les interactions dipôle-dipôle intermoléculaires à courte distance sont moyennées à zéro du fait du mouvement de translation des molécules. Les interactions dipôle-dipôle à plus grande distance ne sont pas moyennées, mais sont trop faibles pour être mesurées.

De ce fait, dans un liquide isotrope, en solution aqueuse par exemple, les couplages dipolaires ne sont pas mesurables. Donc, cela à l’avantage de rendre les raies de résonance d’un spectre de RMN en solution plus fines et plus lisibles. Néanmoins, il n’est aussi pas possible d’avoir accès aux précieuses informations de l’interaction dipôle-dipôle direct.

A l’opposé, en RMN du solide, les couplages sont si importants qu’ils rendent rapidement illisible le spectre d’une protéine.

Or, entre ces deux extrêmes, un compromis a été trouvé dans les liquides anisotropes. En effet, ceux-ci grâce à leurs caractéristiques singulières permettent l’exploitation des couplages dipolaires directs en RMN en solution.

8.1.2. Couplages Dipolaires Résiduels (CDR) en milieux orientant :

Une des avancées les plus récentes dans le monde de la RMN haute résolution est venue de l’introduction des milieux orientant pour le calcul de structure et de dynamique. Or, Dans de tels milieux, les protéines sont partiellement orientées. Alors, leur espace d’orientation devient suffisamment anisotrope pour permettre la mesure précise de couplages dipolaires résiduels (CDR). L’anisotropie induite par ces milieux reste suffisamment faible pour ne pas perturber le comportement des protéines et préserver au spectre RMN sa lisibilité.

Donc, nous supposerons, dans un premier temps, la molécule comme une entité rigide. De même, les distances et les orientations en son sein seront supposées constantes et seule son orientation par rapport au champ magnétique B0 varie.

Alors, la valeur du couplage dipolaire entre deux spins Ij et Ik de la molécule s’écrit:

Djk = bjk

3cos2θ jk −12 ………………… (45)

où les crochets représentent la moyenne temporelle ou d’ensemble (le phénomène est ergodique) de la réorientation de la molécule.

Notons que, l’orientation de chaque vecteur internucléaire ejk, dans n’importe quel repère lié à la molécule, peut être défini par les angles αx, αy et αz que fait le vecteur avec les axes du système de coordonnées. De la même façon, les angles βx, βy et βz définissent l’orientation instantanée du champ B0 dans le repère lié à la molécule (Figure 5).

z

z

y

x

B 0

β x

β z

β y

α y

α z

α x

B

A

Fig.5 : Représentation des orientations du champ B0 et du vecteur internucléaire

dans le repère lié à la molécule. Alors, d’après l’équation (41), cosθ peut être réécrite sous la forme suivante :

cosθ =

cosαx

cosαy

cosαz

.

cosβx

cosβy

cosβz

= cosαx cosβx +cosαy cosβy +cosαz cosβz ……..(46)

D’où :

3cos2 θ jk − 12

=32

cosα x cos β x + cosα y cos β y + cosα z cos β z( )2−

12

…………..(47)

En prenant ci = cosα i et Ci = cosβi , on obtient :

3cos2θ jk −12

=32

Cx2 cx

2 + Cy2 cy

2 + Cz2 cz

2 + 2 CxCy cxcy + 2 CxCz cxcz + 2 CyCz cycz

−

12

………(48)

Soit S la matrice définie par : Sij =

32

CiC j −12

δ ij où δ ij est la fonction de

Kronecker. Alors, l’équation (48) s’écrit aussi :

3cos2 θ jk − 12

= Sij cosα ii , j= x, y,z

∑ cosα j……..(49)

La matrice 3×3 S est couramment nommée la matrice de Saupe ou simplement la matrice d’ordre. Comme <Cx

2> + <C y2> + <C z

2> = 1, la matrice S est de trace nulle et, comme

<CxCy> = <CyCx>, S est aussi symétrique. Donc, elle ne contient que cinq termes indépendants. Si la structure de la molécule est connue, c’est-à-dire que les cosαi sont connus, la

valeur des cinq termes indépendants de la matrice en général peut être déterminée à partir des valeurs du couplage dipolaire d’au moins cinq vecteurs internucléaires distincts.

Généralement, dans l’étude d’une macromolécule biologique, beaucoup plus de couplages sont mesurés et S est surdéterminé.

La matrice S est réelle et symétrique, donc il est toujours possible de trouver un repère lié à la molécule dans lequel S est diagonale. Dorénavant, on travaillera toujours dans ce repère dont on caractérisera la position dans le repère de la molécule par les angles d’Euler (ξ1,ξ2,ξ3). Alors l’équation (48) devient :

où <Ci

2> correspond à la probabilité de trouver l’axe i colinéaire au champ magnétique. Seule la différence relative entre les valeurs <Ci

2> participe au couplage dipolaire résiduel.

Alors, en écrivant

Ci2 =

13

+ Aii , où A est le tenseur d’alignement, et en

utilisant les coordonnées polaires θ = α z ; cz = cosθ cx = sinθ cosφ ; cy = sinθ sinφ ; l’équation (50) peut être réécrite sous la forme :

Djk (θ ,φ ) =

32

bij Azz cos2 θ + Axx sin2 θ cos2 φ + Ayy sin2 θ sin2 φ ……. (51)

On suppose que |Axx| < |Ayy| < |Azz|. Il est d’ailleurs toujours possible de s’amener à ce cas.

En utilisant le fait que : Axx + Ayy = -Azz ; 2cos2φ = 1 + cos2φ ; 2sin2φ = 1 - cos2φ ; la formule précédente se réécrit :

Djk (θ ,φ) =

32

bij Azz

3cos2 θ − 12

+ Axx − Ayy( )1

2sin2 θ cos2φ

………. (52)

Si on définit la composante axiale Aa et rhombique Ar du tenseur d’alignement A comme :

Aa =

32

Azz et Ar = Axx − Ayy

alors, l’équation précédente devient :

Djk (θ,φ) = bij Aa

3cos2 θ − 12

+

34

Ar sin2 θ cos2φ

……………. (53)

Une des particularités propres aux couplages dipolaires résiduels est leur dégénérescence (voir Figure 6). Ceci veut dire qu’une valeur donnée ne correspond pas à une seule orientation du vecteur internucléaire étudié. Alors, on lève ces dégénérescences en introduisant une cohérence entre les distinctes données en considérant des motifs structuraux spécifiques ou en utilisant des mesures relativement à deux tenseurs dont les orientations et les valeurs propres diffèrent.

Fig.6 : A gauche : Coordonnées d’un vecteur internucléaire dans le repère principal du tenseur d’alignement. A droite : Iso-contours des CDR par rapport à un tenseur d’alignement ; la

valeur des CDR va croissant du gris au noir en passant par le blanc.

Il existe maintenant beaucoup de milieux orientant qu’on à coutume de classer selon leur conformation, leur mode d’interaction et leur comportement physique, (voir figure7). Donc, pour qu’il soit possible d’étudier une macromolécule dans ces milieux, l’ordre imposé à la molécule doit être très petit, précisément moins de 0,002. En effet, l’ordre des particules

du cristal liquide est, quant à lui, grand ; il se situe entre 0,5 et 0,85. D’où, il est clair que les interactions des macromolécules avec le cristal liquide doivent être faibles. Ainsi, les milieux doivent être aqueux pour que les protéines soient dans un environnement proche de leur milieu naturel. Ces conditions sont satisfaites en utilisant des solutions aqueuses de cristaux liquides fortement diluées ou les milieux avec les cavités anisotropes.

Fig.7 : Milieu orientant.

8.2. Utilisation des CDR dans l ’étude dynamique :

Pour l’instant, on suppose que les macromolécules étudiées sont rigides. Toutefois, comme on l’a précisé précédemment, il est maintenant bien établi que les macromolécules en solution possèdent une dynamique interne qui est sans doute très importante sur le plan biologique.

En effet, les CDR forment une autre voie d’étude de la dynamique alternative à la relaxation. Bien que les phénomènes physiques mesurés dans les deux cas soient distincts, l’objet d’étude, lui, est semblable et concerne la réorientation des mêmes vecteurs. Or, les spécificités de chacune des méthodes sont autant de visions distinctes d’un même mouvement, les deux méthodes sont donc complémentaires. Alors, l’utilisation des CDR permet d’étudier les mouvements qui s’échelonnent sur une gamme de temps plus importante jusqu’à la milliseconde. Remarquant que malgré ce potentiel important pour étudier les mouvements plus lents, très peu d’études utilisant des modèles géométriques de mobilité locale dans les protéines ont été décrits dans la littérature. C’est à ce dernier point que s’intéressera la présente partie, où trois modèles de dynamique moléculaire seront présentés ainsi que la formulation analytique du CDR qui leur est associé. 8.2.1. Traitement théorique :

Les couplages dipolaires mesurés en présence de dynamique intramoléculaire, correspondent à une moyenne conformationnelle. Donc, la valeur des couplages dipolaires mesurée est donnée par :

Djk (θ ,φ) = bij Aa

3cos2 θ − 12

+34

Ar sin2 θ cos2φ

………(54)

où les crochets représentent la moyenne angulaire. Donc, l’équation (54) suppose que les mouvements intramoléculaires n’interfèrent

pas avec le processus d’alignement, ceci veut dire que le processus d’alignement n’est pas étudié de manière significative par les mouvements internes.

On peut également l’exprimer à l’aide d’harmoniques sphériques moyennées :

Djk (θ ,φ) =

16π5

bij Aa Y20(θ,φ) +38

Ar Y22(θ,φ) + Y2− 2(θ ,φ)( )

………. (55)

Cette expression a l’avantage d’être facilement convertible d’un repère à un autre en usant des propriétés relatives aux rotations d’Euler des harmoniques sphériques. En effet, pour une rotation de repère d’angle (α,β,γ), notée R(α,β,γ), on a :

R(α,β,γ )Y2,M(θ,φ) = e−iαM 'dM ' M

(2) (β)M '=−2

+2

∑ e−iγ MY2,M '(θ,φ) ………. (56)

où dM ' M(2)

est la matrice de Wigner d’ordre 2. En suivant la logique précédente, on écrit d’abord, la moyenne des harmoniques

sphériques dans un repère lié au plan peptidique pour qu’ensuite on la transpose dans le repère lié au tenseur d’alignement en employant la rotation d’Euler appropriée au plan peptidique considéré (voir Figure 8).

Fig. 8 : Illustration du mouvement FAG et du passage du repère peptidique au repère principal de la molécule par la rotation d’angle (α,β,γ). Le vecteur N-NH est en jaune.

Il s’ensuit que :

Djk (θ,φ) =16π

5bjk

Aa e− iα M 'dM ' 0(2) (β)

M '= −2

+2

∑ Y2, M '

+

38

Ar

e− iα M 'dM ' 2(2) (β)

M '= −2

+2

∑ e− i2γ Y2, M ' +

e− iα M 'dM '−2(2) (β)

M '= −2

+2

∑ e+ i2γ Y2, M '

…….(57)

Dans ce cas, la rotation (α,β,γ) décrit le passage du repère principal du tenseur d’alignement au repère local lié au plan peptidique considéré. En général, on a 16 conventions différentes pour définir les angles d’Euler. On utilisera toujours la convention Z-Y-Z. Ceci permet de traiter la dynamique de toute la molécule de manière analytiquement identique.

Notons que, l’équation (57) est linéaire par rapport à la moyenne dynamique des cinq harmoniques. Si les couplages <Djk> d’une même paire de spin étaient mesurés dans cinq (ou plus) tenseurs d’alignement connus Aa, Ar, ξ1, ξ 2, ξ3, les cinq valeurs <Y2,M’> pourraient être déterminées en résolvant le système linéaire constitué à partir de l’équation (57), sans recours aux modèles géométriques. Pourtant, il est difficile d’obtenir la mesure d’un couplage dans plus de 5 milieux distincts et le cas de l’ubiquitine reste rare.

Un des buts des chercheurs dans ce domaine est de diminuer le nombre de paramètres nécessaires à la description du mouvement grâce à des modèles géométriques caractéristiques. Il est aujourd’hui peu probable qu’un seul modèle de dynamique puisse

suffire à la description du mouvement de la chaîne polypeptidique d’une protéine. Dans ce qui suit, trois modèles distincts seront développés qui représentent les modes du mouvement les plus inspirés.

Ainsi, dans le développement des trois modèles de dynamique moléculaire suivants, seule la paire nucléaire N-NH de chaque peptide sera traitée, d’où l’intérêt particulier que suscite ce couplage se justifie par sa facilité de mesure et sa grande dynamique, la plus importante de tous les couplages du plan peptidique. 8.2.2. Modèle à symétrie axiale :

Ce modèle à symétrie axiale a été introduit, d’abord, pour son côté intuitif et sa grande simplicité. Il est censé représenter le mouvement d’une paire atomique en l’absence d’anisotropie.

En effet, Il se caractérise par une distribution à symétrie axiale du vecteur internucléaire autour d’une position moyenne. De ce fait, les angles d’Euler (α,β,γ) seront choisis de telle sorte que l’axe z du repère lié au plan peptidique soit le long de la position moyenne du vecteur internucléaire considéré. Analytiquement, cela se traduit par :

e± iφ = e±2iφ = 0 …………… ..(58)

D’où :

Y2,±2(θ ,φ) = Y2,±1(θ ,φ) = 0 ……………… (59)

Ainsi, l’équation (57) se simplifie en :

Djk (θ ,φ) =

16π5

bij Y2,0(θ,φ) Aad00(2) (β) +

38

Ar d02(2)(β)e− i2γ + d0− 2

(2) (β)e+ i2γ( )

……..(60)

En explicitant les termes de la matrice de Wigner, nous obtenons :

Djk (θ ,φ) = bij

3cos2 θ − 12

Aa

3cos2 β − 12

+

34

Ar sin2 β cos2γ

………..(61)

où β = -θstatique et γ = -φstatique avec (θstatique, φ statique) l’orientation de l’axe de symétrie du mouvement. L’équation (61) peut aussi être réécrite sous la forme :

Djk (θ,φ) = S.Djk ,statique(θstatique,φstatique) …………… ..(62)

où S est le paramètre qui définit le mouvement et Djk,statique le couplage qui serait mesuré en l’absence de dynamique.

Donc, l’effet de la dynamique dû aux mouvements de symétrie axiale ne dépend pas de l’orientation du vecteur internucléaire, mais seulement de l’amplitude du mouvement. Le paramètre, noté S, est à rapprocher du paramètre d’ordre issu des études de relaxation. Donc, ce dernier s’écrit de manière générale :

S 2 =

4π5

Y2, M (θ ,φ) Y2, M* (θ ,φ)

M = −2

+2

∑ ……………… ..(63)

qui se simplifie, dans notre cas tel que :

S 2 =

4π5

Y2,0 (θ ,φ)2

=3cos2 θ − 1

2

2

……………………… (64)

8.2.3. Modèle des Fluctuations Axiales Gaussiennes (FAG) :

Bien que la dynamique de la chaîne principale d’une protéine soit compliquée, des simulations de dynamique moléculaire, à partir des peptides et de l’ubiquitine, ont montré que des mouvements anisotropes de la forme de Fluctuations Axiales Gaussiennes (FAG) autour d’une position moyenne, étaient particulièrement aptes à représenter le mouvement fondamental de la chaîne polypeptidique.

En effet, Brüschweiler et son équipe, [31], ont montré que le mouvement d’un peptide (supposé plan et rigide) pouvait être décrit par un mouvement FAG tridimensionnel défini par trois rotations aléatoires et indépendantes autour de trois axes orthogonaux, l’axe principal étant le long de l’axe Cα

i-1-Cαi.

Une simplification du modèle FAG-3D peut être raisonnablement faite en ne prenant en compte que cette composante et en négligeant les autres. En effet, il a été montré que la convolution d’un mouvement FAG-1D avec un mouvement à symétrie axiale équivalait, de façon presque parfaite, à un mouvement FAG-3D.

Alors, pour décrire l’effet de moyennement de ce mouvement sur les CDR du couple N-NH, nous supposerons, pour la suite, que le vecteur N-NH est perpendiculaire au vecteur déterminé par le couple Cα

i-1-Cαi. Il a été montré que cette approximation reproduit de façon

acceptable les amplitudes simulées à partir du modèle FAG-1D. On le nommera le modèle ortho-FAG.

En fait, les angles d’Euler utilisés dans l’équation (57) nous place dans la configuration suivante : l’axe z est le long de N-NH et l’axe y est dans le plan peptidique, approximativement le long de Cα

i-1-Cαi (Figure 8).

Notons que l’équation (61), devient :

DNH = bij

Aa

4s1 3cos2 β − 1( )+ 3s2 sin2 β cos2α +

38

Ar s1 sin2 β cos2γ + 2s2 cos4 β2

cos2δ1 + sin4 β2

cos2δ2

………………… . (65)

en présence de fluctuations axiales gaussiennes par rapport à l’axe y du repère peptidique (φ = 0), et en utilisant :

cos(mθ ) = p(θ)cos(mθ)d

−∞

+∞

∫ θ = exp−m2σ 2

2

………. (66)

où : p(θ) =

1

2πσ 2exp

−θ 2

2σ 2

………………… . (67)

et avec :

δ1 = α + γ ; δ2 = α − γ ; s1 = 1+ 3e−2σ 2

; s2 = 1− e−2σ 2

…………… . (68) L’expression analytique du paramètre d’ordre S relatif à un mouvement ortho-FAG

d’amplitude σ est la suivante :

S 2 = 1−

34

1− e−4σ 2( ) ……………… (69)

8.2.4. Modèle du saut à deux sites :

Le modèle du saut à deux sites décrit les sauts de formes entre deux sites, chacune des formes étant équiprobable. De la même façon que pour le modèle FAG-3D, il est raisonnable de considérer le saut à deux sites d’un peptide comme étant une rotation par

rapport à l’axe Cαi-1-Cα

i d’angle 2θ centrée sur la position d’équilibre de N-NH. On supposera, comme pour le FAG, que le vecteur N-NH est perpendiculaire à l’axe Cα

i-1-Cαi.

Donc, dans le repère lié au peptide i considéré, la loi de probabilité angulaire s’écrit :

p(x) =

12

δ (x + θ) + δ (x − θ)( ) ……………………… ..(70)

Alors, Les harmoniques sphériques sont moyennées de la mani ère suivante :

Y2−2 =

14

152π

sin2 θe−2iϕ , Y2−1 = 0

,

Y20 =

14

5π

3cos2 θ − 1( ) ,

Y21 = 0 ,

Y22 = −

14

152π

sin2 θe+2iϕ

…………………… ..(71)

où θ représente la demi-amplitude du saut. L’expression du couplage dipolaire dans le repère principal du tenseur d’alignement A

s’obtient en réécrivant l’équation (57) et en explicitant les harmoniques sphériques moyennées :

DNH = bij

Aa

4s1

, 3cos2 β − 1( )+ 3s2, sin2 β cos2α +

38

Ar s1, sin2 β cos2γ + 2s2

, cos4 β2

cos2δ1 + sin4 β2

cos2δ2

………(72)

avec :

δ1 = α + γ ; δ2 = α − γ ; s1, = 2(3cos2 θ − 1) ; s2

, = 2sin2 θ ………. (73) Donc, l’expression analytique du paramètre d’ordre S relatif à un saut à deux sites

d’amplitude 2θ est la suivante :

S 2 =

3cos2 2θ + 14

………(74)

Notons que la formule liée au saut à deux sites est remarquablement proche de celle du modèle de l’ortho-FAG. Une étude plus poussée montre qu’elle se comporte aussi de façon très analogue. Aussi, jusqu’à une amplitude 2θ de 43.5° (0,76 radians), il est impossible de différencier le modèle du saut à deux sites du modèle FAG, parce que, jusqu’à cet angle, les deux modèles balayent les mêmes valeurs de CDR, (Voir Figure 9).

Fig.9: Comparaison entre le modèle FAG (trait plein) et saut à deux sites (pointillés), D étant la valeur du couplage (pas à l’échelle) (α = β = γ = 60°, Aa = 20.10-4, Ar = 13.10-4).

8.3. Méthodes numériques : 8.3.1. Le Tenseur d’Alignement A:

On a vu précédemment que le tenseur d’alignement caractérise l’orientation des macromolécules en solution. C’est une matrice réelle d’ordre 3, de rang 2, symétrique et de trace nulle. Donc, elle ne possède que cinq paramètres indépendants et est toujours diagonalisable dans une base orthonormée. Or, on a l’habitude de l’expliquer à l’aide des trois angles d’Euler (ξ1, ξ2, ξ3) définissant son repère principal (dans lequel il est diagonal) par rapport au repère absolu (dans lequel sont données les coordonnées des atomes de la protéine), et de même à l’aide de sa composante axiale Aa et rhombique Ar (Voir la section §8.1.2).

En fait, le calcul du tenseur d’alignement peut être réalisé à partir de la structure de la protéine et des couplages dipolaires disponibles grâce au logiciel MODULE. La structure permet de préciser les coordonnées des vecteurs internucléaires associés aux valeurs des CDR.

Donc, le tenseur possédant cinq paramètres indépendants, cinq couplages au moins, et leur vecteur internucléaire associé doivent être connus pour déterminer complètement le tenseur.

En pratique, un maximum de couplages est utilisé. Cela permet de minimiser les erreurs dues au bruit contenu dans la valeur des couplages mesurés et dans la structure utilisée.

Or, l’algorithme de détermination réalise une régression par la méthode des moindres carrés. Spécialement, il minimise, en jouant sur les paramètres de la matrice, la fonction χ2 suivante :

χ 2 ξ1,ξ2 ,ξ3, Aa , Ar( )=

Diexp − Di

calc

σ i

i∑

2

………(75)

où Diexp est la valeur expérimentale du couplage dipolaire i, Di

calc est la valeur du couplage

dipolaire i calculée via l’équation (53) et σ i représente l’erreur sur la mesure du couplage dipolaire i. Par conséquent, plus l’erreur sur un couplage sera grande moins celui-ci aura de poids dans le χ2. Donc, la méthode de minimisation s’appuie sur deux algorithmes : un algorithme de recuit simulé et l’algorithme de Levenberg-Marquardt. En effet, les deux algorithmes travaillent de façon complémentaire, celui de Levenberg-Marquardt étant particulièrement bien adapté à la recherche d’un minimum de l’espace paramétrique, par contre celui de recuit simulé permet d’identifier les distincts minima de ce même espace. Donc, L’association des deux est spécialement efficace pour déterminer le minimum de l’espace paramétrique défini par le χ2. Pour cela, on peut choisir d’utiliser le couplage dipolaire statique du résidu « i ».

Ce choix se justifie par le fait qu’on ne connait pas, à priori, la dynamique liée à ce résidu. Néanmoins, un des points indispensables de cette étude est de montrer que la dynamique influe de manière non négligeable sur la valeur des CDR. Donc, Il est important de mentionner que les paramètres du tenseur d’alignement résolus par la méthode « classique », sans prendre en compte les effets de la dynamique locale, seront influencés par un effet de moyennement complexe de tous ces mouvements et que les amplitudes

locales extraites grâce à ce tenseur seront aussi affectées. Il existe deux approches pour résoudre ce problème. La première consiste à employer les couplages N-NH et de remplacer l’expression du couplage statique par la formule (65) du FAG-1D en optimisant un paramètre supplémentaire, <σ> représentant une amplitude moyenne des mouvements ortho-FAF de tous les sites considérés. Il a été montré que cela progresse significativement la justesse des calculs. D’ailleurs, cette amélioration constitue une preuve supplémentaire que le mouvement FAG est bien une composante de la dynamique de la protéine. La seconde, valable si l’on considère un mouvement FAG, consiste à prendre pour calculer le χ2 seulement les couplages des paires nucléaires qui subissent le moins de dynamique, c’est à dire les couples Cα

i-1-Cαi de chaque peptide.

8.3.2. Calcul du paramètre de dynamique : Notons que, une fois acquise l’expression des tenseurs d’alignement et les angles

d’Euler (α,β,γ), tous les paramètres des différents modèles de dynamique sont connus sauf le paramètre de dynamique. Alors, il est relativement facile de le déterminer en l’ajustant par rapport aux données expérimentales. Pourtant, ce paramètre peut être mal défini s’il est calculé à partir d’un seul tenseur d’alignement. De ce fait, on peut prouver que certaines orientations du plan peptidique rendent l’effet d’un mouvement FAG presque ou complètement inobservable (par exemple, si le vecteur est placé sur un iso-contour, (voir Figure 6), c’est à dire qu’avec ou sans FAG, dans ces directions, la valeur du CDR calculé est identique. Donc, il est nécessaire, pour une analyse consistante de la dynamique, d’ajuster le paramètre de dynamique à partir de données issues de plusieurs milieux orientant dont les tenseurs d’alignement sont suffisamment distincts les uns des autres.

De la sorte que nous combinerons les données découlant de m milieux d’alignement distincts, pour extraire le paramètre de dynamique (S, σ ou θ) du résidu r. Dans ce dessein, ils ont utilisé la méthode des moindres carrés qui consiste à minimiser la fonction :

χr2 S,σ ,θ ( )=

Dr ,mexp − Dr ,m

calc

σ r ,m

m

∑2

……………… . (76)

où Dr,mexp est le couplage dipolaire expérimental du résidu r dans le milieu m, Dr,m

calc est le couplage dipolaire du même résidu calculé par la formule du modèle qui nous intéresse et σr,m l’erreur relative à la mesure du couplage de ce résidu.

Il faut bien marquer la distinction majeure entre les deux fonctions χ2 (75, 76)

définies ci-dessus. En fait, l’équation (75) se calcule avec tous les couplages d’un même milieu, alors que l’équation (76), elle, ne prend en compte que les couplages relatifs à un seul résidu résultant des distincts milieux d’alignement.

Le calcul de l’incertitude est réalisé à l’aide de simulations Monte-Carlo basées sur l’estimation de l’erreur des mesures expérimentales des CDR (la fonction erreur associée aux mesures de CDR est supposée être de type gaussien, la valeur communément appelé « erreur » étant l’écart type de la gaussienne associée). 9. Logiciel TINKER :

TINKER ou « L'ÉTAMEUR AMBULANT », est une collection de programmes particulièrement adaptée à la construction et à la manipulation des peptides et des oligonucléotides.

Ainsi, le logiciel TINKER est un programme de modélisation moléculaire avec un package général et complet de la mécanique et la dynamique moléculaire, particulièrement les bio-macromolécules.

TINKER peut fonctionner sous WINDOWS, MAC, UNIX ou LINUX, son code de source écrit en Fortran77 est disponible pour tous les chercheurs.

Ce logiciel a la capacité d'employer n'importe lequel des ensembles de paramètre commun ou des variétés de champ de force, tels qu’AMBER (ff94, ff96, ff98, ff99), de CHARMM (19 et 27), Allinger le millimètre (MM2-1991 et MM3-2000), OPLS (Opls-uA, Opls-AA et Opls-AA/l), water, aussi bien que le champ multipolaire atomique polarisable de force d'AMIBE, [7], [9].

Le logiciel que nous avons utilisé permet la visualisation en 3D moléculaire de base (wireframe, spacefill ing, boule et bâton, etc..) avec usages spéciaux pour des paramètres spécifiques de champ de force tels que des rayons de Lennard-Jones et des grandeurs partielles de charge.

10. Description des algorithmes :

On va donner une courte description des composants principaux de chaque algorithme, y compris quelques algorithmes qui sont appliqués dans le programme TINKER, [8].

Pour une molécule n des atomes nous employons les notations sui vantes : est la fonction d'énergie potentielle , où est le vecteur à

coordonnées cartésiennes à la itération, est le vecteur gradient de taille , et est la matrice symétrique formée des deuxièmes dérivées partielles de par rapport aux différentes coordonnées. Donc, dans tous les algorithmes les itérations se font comme sui t :

……. (77) où est le vecteur de di rection de descente, et est la longueur de l’étape.

Alors, les itérations seront terminées quand : ,……. (78)

où || || indique la norme Euclidienne. Les changements nécessaires des programmes ont été réalisés afin de

s'assurer que chacun des algorithmes emploie le même critère d'arrêt. En outre, ils employent la même ligne de recherche qui est basée sur l'interpolation cubique, et est sujet à ce qui est appelé Conditions de strong Wolf :

……..(79)

où , et l'indice supérieur T indique la transposée.

• Algorithme conjugué non-linéaire de gradient : Le CG emploie les dérivées analytiques de f, définies par . Une mesure le long

du vecteur négatif courant de gradient est prise lors de la première itération. Des directions successives sont construites de sorte qu'elles forment un ensemble de vecteurs mutuellement conjugués. A chaque étape, les nouveaux réitèrent sont calculés à partir de l'équation (77) et des directions de recherche sont exprimées périodiquement comme :

……(80)

Le calcul de avec l'algorithme incorporé dans CONMIN est décrit par Shanno. La remise en marche automatique est employée pour préserver un taux de

convergence linéaire. Pour des itérations de relance ment, direction de recherche . D'autre part, pour des itérations de non restart,

……..(81)

• L'algorithme tronqué de Newton, [8]:

Dans l’algorithme Tronqué de Newton (TN) en trouvant une solution approximative aux équations de newton

…………(82)

L'utilisation d'une approximative est justifiée car une solution exacte de L'équation de newton à un point loin du minimum est inutile et informatiquement inutile dans le cadre d'une méthode de base de descente.

Ainsi, pour chaque itération externe équation (82), il y a une boucle d'itération intérieur se servant de la méthode conjuguée de gradient cela calcule cette direction approximative . Le produit de vecteur de toile de jute pour donné requis par le conjugué intérieur l'algorithme de gradient est obtenu par une approximation de différence finie,

……………..(83) Une issue importante est comment choi sir en juste proportion . L'algorithme intérieur est terminé en utilisant l'équation quadratique essai de troncation, qui surveille une diminution suffisante du modèl e quadratique

:

Où est le compteur pour l'itération intérieure et est une constante, . L’algorithme de l'intérieur est également terminé si une limite supérieure imposée sur le nombre d'itérations intérieures, M est atteint, ou quand une perte de positif-définit est détectée dans la toile de jute (par exemple quand ).

Des méthodes de T N peuvent êtr e prolongées à des pr oblèmes plus généraux, qui ne sont pas corps convexe plus ou moins de la même façon comme méthode de newton.

Comprenons la méthode libre de newton de toile de jute (HFN), considèrent un inexact Newton-type itération pour résoudre le problème, où est une longueur d'étape et direction de recherche, est un minimiser approximatif du modèle quadratique,

. Ici indique le gradient de la fonction objective , et est définie une

matrice symétrique et positive. La minimisation approximative du l'équation quadratique est exécutée par la méthode de CG.

On le suppose que, si la courbure négative est rencontrée, l'itération de CG Se termine immédiatement sans explorer cette direction de courbure négative. Une

méthode inexacte de Toile de jute-libre de newton est un exemple particulier de ceci, méthode dans laquelle B est prévue pour être la toile de jute, ,mais n'est pas calculé explicitement.

Tous les produits de la forme sont l'un ou l'autre rapprochée par des différences finies, , où h est un petit paramètre, ou est calculé par des techniques automatiques de différentiation. Il n'y a aucun consensus sur le meilleur essai d'arrêt pour l'itération de CG., et les diverses règles sont utilisé dans la pratique.

• NEWTON.EXE, [12]: La routine de newton.exe est un algorithme de solution qui peut de manière

adaptative incorporer plusieurs différentes méthodes de minimisation (Newton-Rhapson, courbure négative, etc.).La routine de newton.exe exige de la matrice de toile de jute (deuxièmes dérivés) de fonctionner qui peut deviennent un problème pour les systèmes très grands. Pour beaucoup de simulations c'est une routine plus rapide parce qu'il n'oscille pas bien autour de l'énergie minimum.

• Algorithme de VERLET:

Parmi les algorithme qui sont utiliser par TINKER, algorithme gaussien, Jorj Nocedal, algorithme de minimisation de Monte Carlo, algorithme de William Davidon, BEEMAN, STOCHASTIC ,RIGIDBO ,BERENDEN , ANDERSEN ,NOSE HOOVER ,algorithme d’Elber, et Dans ce qui suit nous décrivons l'algorithme Verlet, qui est simple et le plus utiliser dans les différent logiciel ,La particularité de cet algorithme est que la vitesse des atomes n'apparaît pas explicitement dans l'équation, et ainsi un couplage avec un bain thermique par ajustement des vitesses deviennent impossibles, [1].

…………… . (85) Or, Le temps de calcul nécessaire est directement proportionnel au pas

d'intégration Dt. Ainsi que, Le pas Dt doit rester petit devant la période de vibration la plus courte dans le système afin de pouvoir montrer ce mouvement. Généralement, ce sont les vibrations X-H qui limitent t à s=1 fs ,[1]. 11. Analyse des repliements, [14] :

Une étude des repliements est menée par Gerstein et al, [33], sur le génome du ver C.elegans, en utilisant des méthodes de comparaison de séquence 2 à 2 et multiples (FASTA (Families of Structurally Similar Proteins) et PSIBLAST). Ils trouvent alors qu’environ 250 repliements présentent des similarités avec environ 8000 domaines dans environ 4500 ORFs (Open Reading Frame) c’est une séquence contenant une série de triplets codant pour les acides aminés, non interrompue par un codon de terminaison, ainsi Cette séquence est potentiellement traduisible en protéines, [40]. Environ 32 similarités locales ("matches") par repliement impliquant un quart du total des ORF. De ce fait, Ils ont confrontés les repliements dans le génome de ce ver à ceux d’autres organismes modèles (en particulier E.coli) et trouvèrent que le ver C.elegans partage plus de repliements avec la levure (phylogénétiquement plus proche) qu’avec E.coli. Donc, Il y a environ 36 repliements uniques au ver comparé aux 2 autres organismes modèles. Énormément de ceux ci sont impliqués dans des aspects de la vie multicellulaire. En effet, le plus commun est le repliement immunoglobuline, et beaucoup des repliements communs sont répétés en combinaisons et permutations dans les protéines multi-domaines.

Cependant, les auteurs constatent également une prévalence des protéines avec 7 segments transmembranaires (en comparaison à d’autres génomes de non-métazoaires).

D’autre part, David Lee et al, [34], ont pu reconnaître et analyser les familles de protéines sur 120 génomes. Ces familles de protéines ont été constituées d’abord grâce à un algorithme de classification Markovien, suivi d’un regroupement sur la base de l’identité de séquence. Les domaines sont reconnus pour chaque famille de séquences, en utilisant une librairie de HMM contenant des domaines CATH et PFAM. Ensuite les domaines ont été caractérisés par Domain Finder. Ce dernier se base sur un calcul simplifié des modes normaux pour déterminer les domaines dynamiques des protéines, [35]. Lee et ses collègues, comme les autres auteurs, trouvèrent que la distribution des familles suit une loi de puissance. De ce fait, les 2000 familles de domaines les plus larges peuvent être attribuées à environ 70% des séquences génomiques non singleton (non unique). Le reste est attribué à de bien plus petites familles. Cependant, 50% des annotations en domaines d’un génome sont attribuées à 219 familles universelles de domaines, uniquement 10% des protéines le sont à une famille universelle de protéines. Donc, Ceci affirme l’idée que l’évolution se ferait par duplication et mélange des domaines ("domain shuffling") pour donner de nouvelles architectures qui étendrait le répertoire fonctionnel d’un organisme.

Pour étudier l’évolution des structures, Abeln et Dean, [36], ont aussi examiné l’usage des repliements sur des génomes complets. En effet, la présence ou l’absence de repliements sur les génomes donnent une idée des relations entre repliements, de leur âge et de leur évolution. Ainsi, 157 génomes complets ont été analysés. Cependant, les auteurs ont recherché le nombre de copies d’un repliement par génome, le nombre de famille par repliement, et le nombre de génome dans lesquels existe un repliement donné. La recherche a été faite en se basant sur la classification SCOP((Structural Classification Of Proteins) et PSIBLAST. Les cas des domaines structuraux de SCOP ont été cherchés sur les génomes grâce à PSIBLAST. En se servant de PSIBLAST, les auteurs découvrent un (ou plus) domaine de SCOP pour 37.4% des gènes dans l’ensemble des génomes (cela va de 66% dans des symbiontes comme Buchnerasp à 22.7% dans Plasmodium falciparum. En revanche, environ 10% des familles, superfamilles et repliements de SCOP n’ont pas été trouvé sur aucun des 157 génomes (principalement des structures de protéines appartenant à des virus). Par contre, les bactéries possèdent relativement plus de repliements différents que les archaebactéries. D’autre part, les eucaryotes ont eux plus de copies d’un repliement sur leurs génomes. Lorsqu’on prend en compte les classes de repliements, la classe a/b a moins de repliements distincts sur les grands génomes, plus de copies sur les génomes bactériens, et plus de repliements dans les trois règnes. D’où la supposition faite par les auteurs que la plupart des repliements a/b sont parvenus plus tôt que les autres repliements. En effet, une loi de puissance (attendue) est observée pour les copies d’un repliement par génome, et une loi de puissance est également observée pour le nombre de familles peuplant un repliement. Néanmoins, une distribution moins claire est observée pour les occurrences d ’un repliement parmi les génomes.

Donc, Il n’y a pas non plus de relation claire entre les 3 mesures d’usage des repliements : un repliement qui existe dans beaucoup de génome n’a pas nécessairement beaucoup de copies sur un génome, et vice-versa.

Enfin, la loi de puissance est du type où et sont des constantes. Vu que les données sont lacunaires, la loi de puissance a été montrée

grâce au fait que les rangs provenant d’une loi de puissance suivent aussi une loi de puissance. Les auteurs calculent le rang descendant de x, , en sommant sur tous les éléments x. Cette somme peut être approximée (pour ) par une intégrale, par exemple le nombre d’observations (N) multiplié par la surface sous la distribution de probabilité de représente le nombre d’observations supérieures à :

……. (86) 12. Banques de structures et Classifications:

Notons qu’il ya deux techniques physiques majeures permettant la détermination expérimentale de la structure des protéines : la diffraction des rayons X sur des cristaux de protéines et la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) sur des protéines en solution.

En effet, le but final de ces techniques est la reconnaissance de l’ensemble des coordonnées dans l’espace de tous les atomes de la protéine étudiée, c’est à dire sa structure tridimensionnelle (tertiaire ou 3D), [13].

La banque principale de structures est la PDB (Protein Data Bank). C’est une banque de données concernant les structures protéiques ou nucléiques (ou les deux) obtenues par cristallographie aux rayons X ou par RMN. Elle contenait environ 6000 structures en 2000, 13000 en 2006. Actuellement, environ 16000 structures ont été résolues et rendues accessibles publiquement, elles sont répertoriées et stockées dans la PDB. Toutefois, elle est très redondante (par exemple, il y a plus de 100 lysozymes, dont beaucoup de mutants ponctuels dont la structure 3D ne change pas). Néanmoins, pour rechercher les structures il est souvent pl us agréable d’utiliser le site PDB-Sum qui contient plus d’informations sur les structures et leurs séquences ainsi que des liens avec d’autres banques. Il existe beaucoup d’autres banques contenant des informations sur les structures, [14]. Alors, parmi les 16000 structures actuellement connues, nombreuses sont celles qui se ressemblent. Cette observation a motivé le développement de méthodes permettant de les confronter automatiquement par superposition de leurs structures 3D. Parmi ces méthodes, on tr ouve les programmes VAST, Dali, CE et Pro Sup, [39]. Ainsi, après comparaison de toutes ces structures entre elles, il est possible de regrouper celles qui se ressemblent et ainsi constituer une base de données de repliements. Cela peut être fait manuellement comme pour SCOP [39], semi-automatiquement comme pour CATH ((Class Architecture Topology Homology), [39] ou bien automatiquement comme pour DDD [39] et MMDB ((Molecular Modeling Data Base), [39].

D’après ces bases de données, le nombre de repliements différents connus semble se placer entre 600 (selon SCOP) et 1200 (selon CATH). En effet, en se servant de VAST pour comparer toutes les structures présentes dans la PDB, nous avons trouvé environ 700 groupes ayant des structures globales différentes.

Cependant, une question importante relative à la diversité des protéines est de savoir combien il existe de repliements différents dans la nature. Ceci est une question difficile, pour preuve, nous venons de voir qu’en connaissant les structures des Protéines, les appréciations du nombre de repliements connus varient du simple au double. Puisque ces structures sont inconnues, l’estimation est encore plus floue. Cependant, plusieurs études ont essayé de répondre à cette question, portant sur une fourchette variant de 700 à 10 000 repliements, [13].

13. Réalisation d’une dynamique moléculaire

Plusieurs étapes sont nécessaires avant de réaliser une simulation de dynamique moléculaire. 13.1. Structure initiale de la molécule :

En premier lieu, il faut construire la molécule, ce qui consiste à établir les positions des atomes du système dans un espace tridimensionnel. La construction de cette structure initiale se fait soit en dessinant à l’écran de façon interactive, soit par assemblage de fragments moléculaires contenus dans une base de données, où les positions des atomes en 3D sont obtenues à partir des données expérimentales dérivées de la RMN, Rayon X ou autre. En effet, ces données expérimentales nous renseignent par exemple sur les valeurs des longueurs de liaison, des angles de liaison et des angles dièdres. On aboutit ainsi à une conformation générale de la molécule.

Dans notre travail, on extrait la structure de notre protéine à partir du fichier 1o06(PDB) contenu dans la PDB, qu’on injectera par la suite dans le logiciel TINKER afin de l’étudier.

13.2. Paramétrisation :

Les structures simulées et les propriétés calculées dépendent particulièrement de la fonction énergie potentielle et des autres paramètres utilisés. La fiabilité du champ de forces de dynamique moléculaire est reliée à sa capacité à reproduire le maximum de grandeurs expérimentales.

Il faut également que le champ de for ce soit transférable d’une molécule à une autre et soit aussi utilisable dans un grand nombre de domaines. La paramétrisation est donc une étape essentiel le pour le développement du champ de for ces, [27].

Divers procédés sont employés pour la paramétrisation de la fonction énergie potentielle empirique. Les paramètres (X, Y, Z,…) doivent être déterminés pour chaque atome ou groupe d’atomes. Si on veut développer un potentiel assez complet distinguant les différents types de carbone, d’oxygène ou autre, le nombre de paramètres devient rapidement impressionnant et n’est pas toujours justifié pour le système étudié. La détermination de ces paramètres peut se faire par ajustement d’une autre valeur de références, celle-ci étant calculée empiriquement. L’observable de référence peut être de nature géométrique (liaison, angle, paramètre du réseau cristallin), énergétique, thermodynamique (chaleur de formation ou sublimation), électronique (moment dipolaire) ou de toute autre nature.

Elle peut être aussi une valeur calculée théoriquement par mécanique quantique (différence d’énergie ∆E, moment d’inertie µ). Les spectres de vibration sont également utilisées mais simplement pour vérifier le champ de force avec des écarts typiques entre fréquences vibrationnelles observées et calculés de l’ordre de 30 à 100cm-1.

Dans notre cas on n’a pas besoin de paramétrisation car tous ces renseignement sont contenues dans le fichier PDB. 13.3. Minimisat ion de la structure :

Apres la construction de la molécule, le système obtenu est minimisé par les procédures de minimisation, qui seront décrites par la suite, afin d’enlever les mauvais contacts ou les contraintes locales qui pourraient gêner la dynamique moléculaire très sensible à la configuration initiale.

Donc, la minimisation permet d’obtenir la conformation de départ pour la dynamique moléculaire ou Monte-Carlo. Il s’agit de la conformation la plus stable, c’est à dire celle qui possède l’énergie la plus basse.

En général, la fonction d’énergie potentielle présente un minimum absolu ou global et un grand nombre de minima locaux. Toutes les méthodes de minimisation permettent de se déplacer sur la surface de l’énergie potentielle afin de trouver un minimum. Donc, il faut commencer par un point donné de cette surface et choisir la direction et la longueur de pas, l’espace des coordonnées pour laquelle l’énergie potentielle est minimale.

Ce choix se fait en fonction des informations locales au point de départ (gradient de l’énergie, matrice de dérivées secondes) et aussi en fonction de pas précédents.

Il existe de multiples méthodes pour la minimisation de la structure d’une molécule. Les critères d’efficacité de ces méthodes sont la capacité de faire diminuer rapidement en peu de pas l’énergie, un rayon de convergence ( qui permet d’éviter de retourner à un même minimum), une bonne convergence (faculté à toujours s’approcher du minimum), la rapidité d’exécution (temps de calcul) et la place mémoire occupée par le calcul, [27]. 14. Ensembles appliqués à la dynamique moléculaire :

Les propriétés du système modélisé sont reliées aux positions et impulsions des particules par la mécanique statique. Celle-ci permet le calcul des moyennes prises sur l’ensemble de tous les états possibles du système en respectant la conservation du nombre de particules N, du vol ume V (ou parfois de la pression P) et soit de l’énergie total E, soit de la température T pour les principaux ensembles utilisées en simulation. Les ensembles appliqués à la dynamique moléculaire opèrent le plus souvent dans l’ensemble NVE, dit micro-canonique, qui correspond à un système isolé ou l’énergie est fixée au départ, la température fluctuant pendant le calcul jusqu’à atteindre une valeur d’équilibre.

Depuis une dizaine d’années, de nouveaux algorithmes ont permis d’étendre cette méthode à des ensemble différents, tels que NVT (l’ensemble iso-thermique, iso-chorique), NPT (l’ensemble isobarique, iso-thermique) et enfin µPH (l’ensemble grand-canonique), [25]. Ainsi, en plus de l’ensemble NONE (aucun paramètre fixé), les différents ensembles qui peuvent être adaptés sont :

ü L’ensemble micro-canonique NVE : le nombre de particule N, le volume V et l’énergie sont fixes.

ü L’ensemble canonique NVT : le nombre de particule N, le volume V et la température T sont fixes.

ü L’ensemble iso-thermique, isobarique ou l’ensemble NPT : le nombre de particules N, la température T et la pression P sont fixes. Cet ensemble est devenu le plus commun pour les dynamiques moléculaires des systèmes protéiques et nécessaire pour les simulations de lipides et de protéines membranaires, [26].

ü L’ensemble iso-enthalpique, isobarique NPH ou NPE : le nombre de particules N, la pression P, et l’enthalpie H sont fixes.

ü L’ensemble grand-canonique ou l’ensemble µPH : le potentiel chimique µ, la pression P et l’enthalpie H sont fixes.

15. Topologie du système :

Pour que les programmes de simulation reconnaissent les molécules en tant que telles, il faut leur fournir des informations sur les liaisons entre atomes, la constitution de chaque molécule, les masses et charges à utiliser, etc. Il s'agit de la topologie moléculaire. Le logiciel TINKER possède des modules qui permettent de générer cette topologie, soit à partir d'une bibliothèque de fragments déjà existants, soit à partir des coordonnées dont on dispose, ou en créant une nouvelle structure. Une fois établie, cette information est une caractéristique du système et ne change pas pendant la simulation, [5].

Pour faciliter la mise en œuvre de l’étude nous avons choisi le cas de protéine dans le vide. 16. Protéine d’Ubiquitine : 16.1. Protéine d’ubiquitine, [6]:

L'ubiquitine est une protéine employée, elle-même, comme marqueur de protéines à éliminer. Elle est ainsi nommée car elle est localisée dans tous les compartiments subcellulaires de toutes les cellules des organismes, elle est dite ubiquitaire.

Alors, l’ubiquité est la capacité d'être présent en plusieurs lieux simultanément. Le terme est dérivé du latin « ubique » qui signifie « partout ».

Donc, l’ubiquitination indique la fixation spécifique et régulée d'ubiquitine sur une protéine cible. Ceci a pour conséquence la reconnaissance puis la destruction de la protéine marquée par le complexe protéolytique du protéasome. 16.2. Structure de l’ubiquitine, [6] :

L'ubiquitine comprend 73 acides aminés et a une masse moléculaire d'environ 8500 Da. Sa structure est très conservée parmi les distinctes espèces d'eucaryotes : l'ubiquitine humaine et celle d'une levure partagent 96 % d'identité pour leur séquence protéique. En effet, l'ubiquitine est une petite protéine présente dans toutes les cellules des eucaryotes.

Fig.10 : Représentation de Fig.11: surface moléculaire de l'ubiquitine La structure de l'ubiquitine.

16.3. Mécanisme d 'action, [6] :

Il existe trois systèmes de protéolyse ou destruction des protéines : ü une destruction par des enzymes (protéases) digestives non spécifiques :

trypsine, pepsine, chymotrypsine des protides alimentaires ; ü le système lysosomial, non spécifique, permettant la dégradation et le

recyclage des protéines cellulaires par des protéases intra-cellulaires ; ü le système ubiquitine-protéasome, toujours intra-cellulaire, mais cette fois

hautement spécifique par un système de marquage des protéines à dégrader.

La fonction principale de l’Ubiquitine est de marquer d'autres protéines en vue de leur destruction, que l'on appelle la protéolyse. De multiples molécules d'ubiquitine sont liées de manière covalente à la protéine cible (polyubiquitination), grâce à l'action de trois enzymes, E1, E2 et E3-ligases. Ce pendant, la protéine ainsi changée est ensuite dirigé vers un protéasome, une structure en forme de baril dont l'activité est régulée par l'ubiquitine, et dans laquelle la protéolyse se déroule. Alors, L'ubiquitine est libérée de son substrat et peut être réutilisée, (Pour plus de détails, voir Chapitre 4).

Il existe des actions séquentielles des enzymes permettant la fixation à d'autres protéines :

ü Activation : carboxylation terminale de l'ubiquitine par l'enzyme activatrice E1 ü Conjugaison : transfert de la molécule activée d'ubiquitine sur un groupe

sulfure de l'enzyme conjugante E2. ü Transfert : transfert de la molécule d'ubiquitine via une ubiquitine-ligase E3 à

un groupe amyle d'une lysine acceptative de la protéine à dégrader. Cette protéine s'étant auparavant liée à la ligase.

Ce processus peut se répéter plusieurs fois jusqu'à former un polymère. Donc, Il faut au moins quatre molécules d'ubiquitine fixées à la protéine pour que celle-ci soit adressée au protéasome et dégradée.

Alors, E1 fixe l'ubiquitine; E1-Ubiquitine se fixe sur E2 puis transfert l'ubiquitine sur E2; E2-Ubiquitine se fixe sur E3. Le complexe E3-E2-Ubiquitine est actif.

E1 (enzyme d'activation de l'ubiquitine) serait unique. Cependant, Il existerait près d'une centaine de types d'E2 (enzyme de conjugaison d'ubiquitine) et plus de 1000 types d'E3 (ligase ubiquitine-protéine), cette dernière expliquant la spécificité de la réaction. E2 et E3 sont souvent associées l' une à l'autre dans le cytoplasme.

L'ubiquitine également peut marquer des protéines transmembranaires comme exemple des récepteurs pour les retirer de la membrane. 17. Théorie et méthodes, [8] :

Les interactions interatomiques des biomolécules, tels que les protéines et les acides nucléiques sont habituellement décrits par une fonction empirique ou énergie potentielle (champ de force). Ceci dépend de la structure (la géométrie) de la molécule et mène typiquement à une surface d'énergie, comportant un nombre énorme de minima locaux.

En effet, l’identification de la plus basse énergie (les minima), en particulier le minimum global, est le but des études de repliement de protéine. Un critère plus rigoureux est de considérer l’énergie libre harmonique minimale, Fhar, obtenue à partir du minimum de l'entropie harmonique, Shar.

• Modèles de protéine et fonctions d’énergie, [8]: Dans ce travail, on a considéré l’exemple de la protéine d’Ubiquitine qui

comprend 73 résidus. Pour l’étudier, on a puisé nos informations à partir du fichier pdb 1o06 de PDB (Banque de Données de Protéines). Les simulations ont été effectuées avec le programme de dynamique moléculaire TINKER, ce programme qui fournit des champs de forces et ainsi des énergies potentielles définis par AMBER, ainsi que des énergies potentielles de torsion qui dépendent des angles dièdres , et celle des interactions électrostatiques et des interaction de Lennard-Jones :

……. (87)

où r, sont les valeurs des longueurs et des angles, ainsi que leurs valeurs d'équilibre, respectivement. étant la distance entre l’atome i et l’atome j. Enfin,

, , , n, , , sont des constants. Notons que l’énergie totale dans le cas où il existe un solvant est donnée par :

………(88) où est l’énergie de solvatation, est la superficie accessible du dissolvant de l’atome i, est le paramètre atomique de la correspondance de solvatation dérivé par Das et Meirovitch pour les boucles de protéines. 18. Modèle de protéine à simuler, [37-38] :

Comme précisé précédemment, on s’intéresse dans notre étude à la protéine d’Ubiquitine. Dans la PDB (Protein Data Bank), on retrouve actuellement jusqu’en Février 2009, 735 structures d’Ubiquitine et parmi ces structures, on a choisit la structure 1o06, car c’est la petite molécule qui contient le moins d’atomes par rapport aux autres, et afin de faciliter l’étude de dynamique moléculaire avec le logiciel TINKER, sachant que ce logiciel peut effectuer des calculs de simulation de molécules contenant jusqu’à 10000 atomes, [17], [16]. 18.1. Protéine d’Ubiquitine choisie (VPS27)1o06 :

La structure cristalline de l’ubiquitine, répertoriée dans Protein DataBank sous le code de base de données 1o06, a été découverte expérimentalement par Ficher et al le 20 Février 2003 en utilisant la méthode de diffraction des rayons X en résolution de 1,45 Å.

La protéine est une macromolécule polymérique portant le nom de protéine vacuolaire assortissant la protéine associée (VPS27 : Vacuolar protein sorting-associated protein n°=27), composée de 622 résidus. Il existe dans cette macromolécule plusieurs régions. Notre protéine d’Ubiquitine se localise précisément dans le fragment de résidus 301-320.

Notre protéine d’Ubiquitine, qui est une protéine de transport, est structurée en une seule chaine nommée chaine A. Elle comporte un nombre de non-atomes d'hydrogène de 172, 33 hétéro-atomes, 20 à 29 groupes et 179 liaisons.

Notons que cette structure existe naturellement dans les saccharomyces cerevisiae vps27p et a été synthétisée par des méthodes standard de synthèse de peptide, et le poids de structure étant égal à 2441,52Da.

Fig.12 : la structure de l’ubiquitine (VPS27)1o06.

• Cellule en crist al :

Longueur (Å.)

a : 34.967 b : 34.967 C : 64.243

Angle 90.00° 90.00° 120.00°

• La séquence de la protéine 1O06 : a.a Glu(E) Asp(D) Pro(P) Leu(L) Lys(k) Ala(A) Ile(I) Ser(S) Arg(R) Gln(Q)

6 2 1 2 1 4 1 1 1 1

9 8 7 8 9 5 8 6 11 9 N : nombre d’atomes total : N= =6.9+2.8+1.7+2.8+1.9+4. 5+1.8+1.6+1.11+1.9=156 at oms

: Nombre d’acide amine : Nombre d’atome par acide amine

• Chaine A : Chaine A est de type polypeptide L, sa longueur est de 20 résidus, sa structure

secondaire est de 75% Hélicoïdal (1 hélice; 15 résidus).

Fig.13 : Séquence de la chaine A d’après les clase de scop,DSSP ,PDB.

Fig.14 : structure secondaire de la chaine A.

18.2. Régions de 1o06, [19], [20]: Feature

key Position(s) Length Description Graphical

view Feature identifier

Molecule processing

Chain 1 – 622 622 Vacuolar protein sorting-associated protein 27

PRO_0000065893

Regions

Domain 18 – 149 132 VHS

Repeat 258 – 277 20 UIM 1

Repeat 301 – 320 20 UIM 2

Zinc finger 170 – 230 61 FYVE-type

L’UIM ((Ubiquitin Interaction Motif) se trouve dans un nombre de protéines différentes qui fonctionnent dans une variété de la diversité biologique. Ces séquences analysées ont également fourni une définition plus précise de l'UIM en tant qu ’une séquence de 20 résidus :

X-AC-AC-AC-AC-? -- X-X-Ala-X-X-X-Ser-X-X-Ac-X-X-X-X, Et où ? représente un grand résidu hydrophobe (généralement Leu), Ac représente un résidu acide (Glu, ASP), et X représente des résidus qui sont moins bien conservés, [18].

P40343 [301-320], Vacuolar protein sorting-associated protein 27, Saccharomyces cerevisiae

10 20 30 40 50 60

MSVSTPSELD ALIEQATSES IPNGDLDLPI ALEISDVLRS RRVNPKDSMR CIKKRILNTA

70 80 90 100 110 120

DNPNTQLSSW KLTNICVKNG GTPFIKEICS REFMDTMEHV ILREDSNEEL SELVKTILYE

130 140 150 160 170 180

LYVAFKNDSQ LNYVAKVYDK LISRGIKFPE KLTLSNSPTA MFDSKTPADW IDSDACMICS

190 200 210 220 230 240

KKFSLLNRKH HCRSCGGVFC QEHSSNSIPL PDLGIYEPVR VCDSCFEDYD LKRHDDSKKS

250 260 270 280 290 300

KKHRHKRKKD RDYSTPEDEE ELIRKAIELS LKESRNSASS EPIVPVVESK NEVKRQEIEE

310 320 330 340 350 360

EEDPDLKAAI QESLREAEEA NVRSERQKAS RQMQPQQPSP QPQPIHSVDL SDEEKDSIYM

370 380 390 400 410 420

FASLVEKMKS RPLNEILEDS KLQNLAQRVF ASKARLNYAL NDKAQKYNTL IEMNGKISEI

430 440 450 460 470 480

MNIYDRLLEQ QLQSINLSQQ YTLPQVPSDP YNYLTENVQN PAESYQTPPL QQLSSHQYKP

490 500 510 520 530 540

QQDVSRQQSV KANSSPTTNI DHLKTIDVTP HAQQKPQSHV ELAPSDPPYP KEEAEDEGTQ

550 560 570 580 590 600

AVQDEESSTQ ESRERPYPVE TENGETSINK RPQGITRYDF PTVPARKFVQ PESTVPLPAS

610 620

SSEIPIKEER PPSPQEELLI EL

19. Résultats et discussion :

Comme on l’a déjà signalé, les informations concernant la structure 3D native

de notre protéine d’Ubiquitine 1o06 utilisée pour notre étude de simulation de dynamique moléculaire ont été puisées de la banque de données de pr otéine (PDB).

Notons que notre modèle de protéine 1O06 contient 156 atomes. Elle est liée à 29 résidus dont 3 atomes de Zi nc (Zn) et 26 molécules d’eau.

Fig. 15: Interface TINKER (Keywords set (Édition des paramètres) à gauche, visualisation graphique à droite

de la protéine 1o06.

Fig.16 : Structure native de l’Ubiquitine (1o06), prise par TINKER.

La structure native est ensuite analysée par TINKER (voir Fig. 16). La structure obtenue est ensuite utilisée pour la simulation de dynamique moléculaire dans les différents ensembles.

Fig.17 : Structure de l’ubiquitine (1o06) analysée par PDB XYZ.

v Simulation dans l’ensemble NONE : Ø Dynamique moléculaire pour un temps de simulation de 50

picoseconde :

Fig.18 : Evolution dynamique de la structure de l’ubiquitine (1o06) sous le champ de force AMBER99, TINKER. Photos prises toutes les trois mn.

On obtient les résultats suivants concernant l’évolution de l’énergie potentielle en fonction du temps et en fonction de la température :

0 10 20 30 40 50

0

50

100

150

200

250

300En

ergi

e po

tent

iel V

(Kca

l/mol

e)

temps t (pico second)

DM Protéine 1o06 (pour 50 picosecond)

Fig.19 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 00

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

Ener

gie

pote

ntie

l V (K

cal/m

ole)

T e m p é ra tu re T (K e lv in )

D M P ro té in e 1 o 0 6 (p o u r 5 0 p ic o s e c o n d )

Fig.20 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T.

Ø Dynamique moléculaire pour un temps de simulation de 100

picoseconde :

Fig.20 : les phases de la dynamique de l’ubiquitine (1o06), champ de force AMBER99, TINKER.

Dans ce cas, on obtient les résultats suivants concernant l’évolution de l’énergie potentielle en fonction du temps et en fonct ion de la température :

0 20 40 60 80 100

0

50

100

150

200

250

300

Ener

gie

pote

ntie

l v (K

cal/M

ole)

Tem ps t (picoseconde)

DM Pro té ine 1o06 pour 100 picoseconde

Fig.21 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

280 290 300 310 320 330 340 3500

50

100

150

200

250

Ener

gie

pote

ntie

l V (K

cal/m

ole)

Température T (Kelvin)

DM Protéine 1o06 pour 100 picoseconde

Fig.22 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 02 6 0

2 8 0

3 0 0

3 2 0

3 4 0

3 6 0

Tem

péra

ture

T(k

elvi

n)

te m p s t (p ic o s e c o n d e )

D M P r o té in e 1 o 0 6 e n s e m b le N O N E

Fig.23 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t,

Dans cette simulation, on a pensé à ajouter un graphe concernant l’évolution de la température en fonction du temps (voir Figure 23).

v Simulation ensemble NPE :

Fig.24 : L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NPE chaque 100picosecande.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

- 2 0 0

- 1 5 0

- 1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntie

l V (k

cal/m

ole)

te m p s t ( p ic o s e c o n d e )

D M P ro té in e 1 o 0 6 e n s e m b le N P E ,V (t )

Fig.25 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

2 4 6 8 1 0 1 2

-2 0 0

-1 5 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntie

l V (k

cal/m

ole)

T e m p é ra tu re T (k e lv in )

D M P ro té in e 1 o 0 6 e n s e m b le N P E ,V (T ) ,

Fig.26 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T.

0 20 40 60 80 1002

4

6

8

10

12

Tem

péra

ture

T K

ELVI

N

temps t (picoseconde)

DM Protéine 1o06 ensemble NPE, T(t)

Fig.27 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t,

v Simulation ensemble NPT:

Fig. 28 : L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NPT chaque 100picosecande.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0- 2 5 0

- 2 0 0

- 1 5 0

- 1 0 0

- 5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntie

l V (K

cal/m

ole)

t e m p s t ( p i c o s e c o n d e )

D M P r o t é i n e 1 o 0 6 e n s e m b l e N P T , V ( t )

Fig.29 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0- 2 5 0

- 2 0 0

- 1 5 0

- 1 0 0

- 5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntie

l V (k

cal/m

ole)

T e m p é r a t u r e T ( k e l v i n )

D M P r o t é i n e 1 o 0 6 e n s e m b l e N P T , V ( T ) ,

Fig.30: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température T.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Tem

péra

ture

T (k

elvi

n)

te m p s t (p ic o s e co n d e )

D M P ro té ine 1 o 0 6 en s e m b le N P T , T (t)

Fig.31 : Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t,

v Simulation ensemble NVE:

Fig.32: L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NVE chaque 100picosecande.

0 20 40 60 80 10 0

-2 00

-1 50

-1 00

-50

0

50

1 00

1 50

Enér

gie

pote

ntie

l V(k

cal/m

ole)

tem p s t (p icoseco nde )

D M P ro té in e 1O 0 6 ,N V E ,V (t)

Fig.33 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-2 0 0

-1 5 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntei

l V (k

cal/m

ole)

T e m p é ra tu re T (k e lv in )

D M P ro te in e 1 o 0 6 e n s e m b le N V E ,V (T ),

Fig.34 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température.

0 5 10 15 20 25 30 350

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tem

péra

ture

T(k

elvi

n)

temps t (picoseconde)

DM Protéine 1O06,NVE,T(t)

Fig.35: Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t.

v Simulation ensemble NVT:

Fig.36 : L’évolution de la DM de la protéine 1o06 sous l’ensemble NVT chaque 100picosecande.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

-2 0 0

-1 5 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ener

gie

pote

ntei

l V (k

cal/m

ole)

t e m p s t (p ic o s e c o n d e )

D M P ro té in e 1 o 0 6 e n s e m b le N V T ,V (t ) ,

Fig.37 : Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction du temps t.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

Ener

gie

pote

ntie

l V (k

cal/m

ole)

Te m p érature T (kelv in )

DM Proté in e 1o 06 en se m b le N VT,V(T)

Fig.38: Graphe représentant la variation de l’énergie potentielle V en fonction de la température.

0 20 40 60 80 1001

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Tem

péra

ture

T (k

elvi

n)

tem ps t (picoseconde)

D M Protéine 1o06 ensem ble N VT ,T (t),

Fig.39: Graphe représentant la variation de la température T en fonction du temps t.

Ø Interprétation :

Notre simulation de dynamique moléculaire (DM) a été réalisée pour deux pas temporels différents : celui de 50 picoseconde et celui de 100 picoseconde pour l’ensemble NONE. Pour les autres ensembles (NPE, NPT, NVE et NVT) le pas temporel a été choisi comme étant égal à 100ps.

Au cours de la première simulation avec un pas de 50ps et qui a été réalisée durant vingt quatre minute, on a pris une photo de la protéine toutes les trois minutes pour suivre l’évolution de la structure de la protéine (Voir Figure17). Les résultats obtenus ont été traités par Origin pour traiter les variations des différents paramètres (Voir 18-19).

Concernant le graphe 18, on remarque que l’énergie potentielle diminue au cours du temps jusqu’à se stabiliser à la valeur de 26Kcal/mole. Par contre, la Figure19, on remarque que la température fluctue autour de la valeur ambiante 300 kelvin (27c°).

La deuxième simulation de pas temporel de 100ps, a duré 30mn, où à chaque six minutes on a pris une photo pour suivre l’évolution dynamique de la structure de la protéine étudiée (Voir Figure 20).

Les résultats obtenus ont été aussi traités en utilisant le logiciel Origin. Ils ont été représentés par les Figures 21-23.

Concernant la Figure 21, on remarque que l’énergie potentielle diminue au cours du temps jusqu’à se stabiliser autour de la valeur de 25kcal /mole. Par contre, la Figure 22 représente la variation de l’énergie en fonction de la température. Dans ce cas, on remarque que l’énergie fluctue autour de la température 300kelvin (27c°). Enfin, la Figure 23 représente la variation de la température en fonction du temps. Ici , on remarque que la température se stabilise rapidement autour de la valeur de 300kelvin (27c°).

La simulation de dynamique moléculaire sous les autres ensembles a été réalisée et les résultats obtenus ont été traités de la même manière que pour l’ensemble NONE et représentés dans les Figures 24-39.

Grossièrement, les mêmes conclusions peuvent être déduites à partir de ces ensembles concernant l’étude de la dynamique moléculaire de notre protéine.

Essentiellement, on en déduit que notre protéine d’Ubiquitine est une macromolécule biologique assez stable sur le plan énergétique. Ce qui justifie son utilisation à des fins médicales. 20. Conclusion :

Le repliement des protéines est un domaine d’un intérêt capital. Il concerne les mécanismes moléculaires par lesquels une chaîne polypeptidique naissante, résultant de l’information génétique, acquiert sa structure tridimensionnelle, condition essentielle à l’expression de sa fonction, [22].

En effet, contrairement aux polymères artificiels, les protéines optent pour une conformation tridimensionnelle bien caractéristique, associée à une fonction biologique déterminée.

Alors, à chaque protéine correspond une structure donnée, une stabilité et une dynamique propre, déterminées par la séquence primaire en acides aminés, laquelle est le résultat de l’évolution.

Or, pourquoi et comment se plient les protéines, et pourquoi certaines séquences ont été sélectionnées et pas d’autres restent des problèmes principaux en biophysique, [23]. Quoique, les simulations de dynamique moléculaire tentent de comprendre ce processus de repliement au niveau atomi que, [24].

Ainsi, la dynamique moléculaire permet de décoder ces informations à travers un modèle facilitant l'interprétation des résultats, [21].

Le repliement des protéines possède aussi des applications pratiques en médecine, en particulier, dans la compréhension des différentes maladies associées aux repliements incorrects à l’agrégation subséquente , [22]. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus complexe ont fait l’objet de nombreuses études.

Le chapitre 4 est consacré justement à l’aspect usage médical de la protéine d’ubiquitine dans le traitement des protéines malades sous le phénomène de mauvais repliement.

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Chapitre IV Conséquences Médicales

1. Introduction : Une bonne structure protéique assure un bon fonctionnement des protéines.

En effet, le repliement des protéines est un processus qui leur fait prendre une forme tridimensionnelle précise, laquelle est nécessaire à l’expression de leur fonction dans l’organisme, [1]. Alors, avant de pouvoir être fonctionnelles dans l'organisme, les protéines doivent opter pour une structure particulière nommée pliage, et c’est cet auto-assemblage des protéines qui est nommé repliement. Donc, Un repliement anormal de certaines protéines peut être à l'origine de beaucoup de maladies dont celles d'Alzheimer Parkinson ou de Creutzfeldt-Jakob (ou encéphalopathie spongiforme bovine - ESB). Or, dans ce dernier cas, c'est un prion qui serait responsable du repliement défectueux , [2].

Dans ce chapitre, on présente les différentes maladies résultant du mauvais repliement des protéines et l’importance du choix opéré et concernant l’étude de la protéine d’Ubiquitine. 2. la protéine prion et prion pathogène :

Le terme prion est un mot, venant de l'anglais « PRoteinaceous Infectious particle ONly » (particule infectieuse protéinique) à partir de leur description par Stanley Prusiner dans les années 80. Toutefois, Les prions jouent un rôle utile dans le bon (ou le mauvais) repliement des protéines, qui permettra de les rendre fonctionnelles ou non.

En effet, La protéine prion Prp-c est présente à l’état naturel et est impliquée dans le fonctionnement normal de la cellule, au sein de laquelle, ses fonctions, ne sont pas encore parfaitement connues mais on les soupçonne indispensables. En effet, la protéine Prp-c est présente avant la spéciation, ce qui explique que tous les mammifères (y compris l'homme) sont susceptibles de développer des maladies à prions. Cependant, la protéine Prp-c est impliquée dans le développement du système nerveux chez l'embryon. Chez l'adulte, elle est présente essentiellement dans le cerveau et la moelle épinière (neurones et glie). De plus, elle est impliquée dans les processus de distinction et d’adhésion des cellules. Elle aurait pareillement un rôle protecteur antioxydant ainsi que vis-à-vis de la mort cellulaire programmée (apoptose). Enfin, cette protéine aurait également un rôle dans le repliement d’autres protéines, [3].

Fig.1 : Modèle de la protéine prion PrP2.

Le prion pathogène est une protéine prion Prp-c mutée. Toutefois, on ignore la cause réelle de cette mutation qui incite des maladies à prions (telles que la maladie de la vache folle, ou encéphalopathie spongiforme bovine, maladie de Creutzfeldt-Jakob, Chronical Wasting Disease ou maladie du dépérissement chronique des cervidés). Or, lors de l'infection, l'agent prion, agent pathogène responsable de l'infection, pénètre le neurone, où pour des raisons particulières et par un mécanisme encore mal compris, il se "multiplie" de façon exponentielle, en déformant les protéines prion saines en protéines prion mutées allant jusqu'à provoquer littéralement l'explosion de la cellule nerveuse, [3].

En effet, la maladie de la vache folle, la forme de maladie de Creutzfeldt -Jakob qui lui est associée chez l'homme et la tremblante du mouton sont provoquées par le repliement anormal d'une protéine présente à la surface des neurones, c’est la protéine prion. Ainsi, sans que l'on sache comment, la présence de cette protéine prion dénaturée change le cerveau en éponge, d’où l’appellation « encéphalopathies spongiformes ». L'étude

et la compréhension de ces encéphalopathies spongiformes transmissibles, qui sont des maladies incurables, se heurtaient jusqu'ici à un obstacle. Les scientifiques n'avaient aucune idée précise sur la fonction du prion et aucune piste pour la découvrir. De ce fait, l'étude de la protéine prion normale est indispensable si l'on veut saisir comment les prions pathogènes modi fient les fonctions neuronales, [4]. 3. L’ubiquitine et la protéine chaperonne:

Une protéine chaperonne est une protéine dont la fonction est de par ticiper à la maturation d’autres protéines en leur assurant un repliement tridimensionnel approprié. La plupart des protéines chaperonnes sont des protéines de choc thermique (Heat Shock Proteins: Hsp), c’est à dire des protéines s’exprimant en réponse à des changements de température, ou d'autres types de stress cellulaire. En effet, la structure des protéines est sensibles à la chaleur, elles se dénaturent et perdent leur action biologique. Alors, le rôle des protéines chaperonnes est de prévenir les dommages potentiellement provoqués par une perte de fonction protéique causée par un mauvais repliement tridimensionnel. Or, d'autres protéines chaperonnes sont impliquées dans le repliement de protéines néo-synthétisées alors qu'elles sont extraites du ribosome. Quoi que la plupart d'entre elles aient la capacité de se replier correctement sans intervention des protéines chaperonnes, certaines d’entre elles en sont incapables. Enfin, notons que les protéines chaperonnes ont été co-découvertes récemment par A. Horwich et U. Hartl , [5].

En général, les molécules chaperonnes sont des protéines qui se lient aux protéines naissantes à la sortie des ribosomes pour leur permettre de prendre une configuration spatiale caractéristique. De la même manière, elles défendent certaines liaisons protéine-protéine indésirables pour la fonction. Ainsi que, el les permettent de transconformer certaines protéines pour assurer le passage au travers des membranes comme la membrane interne des mitochondries.

En général, les protéines chaperonnes aident à l'acquisition et au maintien de la structure tertiaire des protéines cellulaires. Dans des conditions normales, elles favorisent le repliement des protéines néo-synthétisées. En fait, la cellule synthétise des protéines chaperonnes appelées "Heat Shock Protein" ou Hsp, lorsqu’’elle est soumise à un stress. Ainsi, le complexe formé par la protéine Hsp70 (Heat Shock Protein 70) et la protéine CHIP (Carboxy Terminus of Hsp70 binding Protein) reconnaît les protéines transformées ou endommagées et choisit de les restructurer si cela est possible ou bien s'en débarrasse dans le cas contr aire.

Quoique, la protéine CHIP est une co-chaperonne, c'est-à-dire qu'elle est associée à Hsp70 et qu'elle régule son activité, néanmoins, la protéine CHIP a une autre fonction. Elle joue le rôle de l’Ubiquitine-Ligase, qui reconnaît et marque les protéines anormales par un signal protéique : l'ubiquitine.

En effet, L'ubiquitine est une petite protéine qui, fixée en grand nombre sur la protéine-cible, peut la diriger vers le complexe poly-protéique "protéasome", afin qu'elle soit dégradée.

Notons que l'équipe de Cam Patterson de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill., avait déjà cloné le gène codant pour la protéine CHIP en 1999. Or, l'étude publiée le 23 mars 2006 dans Nature décrit comment la cellule détermine le devenir de ces protéines mal repliées et des protéines Hsp afin de reprendre une activité physiologique classique.

Cependant, il a été vérifié que des souris mutées au niveau du gène CHIP sont plus sensibles aux conditions de stress comme la fièvre ou les infarctus. Par contre au niveau cellulaire, ils ont prouvé que, lorsque la restructuration des

protéines n'est pas suffisante voire infructueuse, la protéine CHIP marque les protéines à dégrader. Alors, une fois que toutes les protéines-cibles sont éliminées, CHIP marque par l’Ubiquitine les Hsp pour les protéolyses. Ainsi, la cellule n'a plus de "symptômes" de stress et peut revenir à un état physiologique compatible avec son activité.

Donc, ces résultats représentent un espoir pour les maladies à stress ou impliquant des protéines mal-repliées telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la Chorée de Huntington. Alors, Selon Patterson, CHIP joue un rôle très important dans l'adaptation cellulaire et accroître son activité pourrait être une approche pour traiter de telles maladies, [2].

Fig.2 : Structure cristalline de l'ubiquitine. Enfin, l’ubiquitine (figure2) est une petite protéine comporte 76 acides aminés

dont la séquence est hautement conservée chez les eucaryotes.Comme on a dit précédemment, l'ubiquitine est une petite protéine de structure simple qu'on trouve dans toutes les cellules eucaryotes, ces cellules qui ont une membrane nucléaire séparant le noyau du cytoplasme. D’ailleurs Comme son nom le montre, il s'agit d'une protéine très commune, présente chez la plupart des êtres vivants, des organismes les plus simples aux formes de vie les plus complexes.

En fait, l'ubiquitine a tout d'abord été connue pour son rôle de vidangeuse dans le processus de dégradation des protéines. Notons qu’au sein des cellules, les protéines possèdent un cycle de vie en fonction de leur utilité, elles sont synthétisées, employées à différentes fins, ensuite elles se dégradent. Donc, l'ubiquitine a pour fonction de repérer les protéines inutiles ou désuètes et de s'y attacher par un lien chimique, servant alors de marqueur qui entraîne la dégradation de la protéine ainsi «ubiquitinée».

De plus, l'ubiquitine participe au système de contrôle de qualité des protéines produites à l'intérieur de la cellule. Ainsi, au cours de la synthèse de ces protéines, il faut être sûr que celles-ci sont formées convenablement. Or, le système de contrôle de qualité qui implique de multiples processus dont celui de l'ubiquitination, s'assure que la protéine est bien formée et bien repliée, et qu'elle va pouvoir jouer le rôle qui est le sien dans la cellule. En effet, lorsque des protéines n'arrivent pas à se replier correctement, elles sont ciblées par l'ubiquitine, qui vient s'y fixer, montrant au système qu' il faut s’en débarrasser, [6]. 4. Le système d’ubiquitination :

L’Ubiquitine se fixe de manière covalente aux protéines cibles par une liaison iso-peptidique entre le groupement COOH de sa glycine C-terminale, et le groupement εNH2 d’un résidu lysine du substrat. En effet, L’ubiquitination des substrats est effectuée par une série de réactions mettant en jeu plusieurs familles d’enzymes, [7].

En schématisant alors, l’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée sur l’une des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine, E2s. Ces derniers catalysent la liaison de l’ubiquitine aux substrats protéiques soit directement soit en

présence d’une des protéines ubiquitine-Ligases, E3s, qui reconnaissent les protéines cibles. Toutes les réactions résultant des E3s mènent à la formation de conjugués poly-ubiquitinés. En général l’ubiquitine se fixe sur le résidu lysine 48 de l’ubiquitine précédemment l iée au substrat, [8]. 4.1. Enzyme act ivant l’ubiquitine, E1 :

Alors, deux iso-formes de E1 (110 et 117 kDa) dérivant d’un seul gène trouvent dans le cytoplasme et le noyau des cellules eucaryotes. Chez la levure, la délétion de E1 est létale malgré l’existence de protéines « E1-like », [9]. Donc, E1 active l’ubiquitine en présence d’ATP en formant une liaison thiol ester entre un résidu cystéine de son site catalytique et l’ubiquitine puis transfère l’ubiquitine activée sur l’une des E2s, [8] . 4.2. Enzymes conjuguant l’ubiquitine, E2S :

Généralement, ces enzymes assemblent une superfamille de protéines apparentées ayant un poids moléculaire compris entre 14 et 35 kDa. Alors, Il existe quatre classes d’E2s qui ont un domaine catalytique central enfermant également un résidu Cystéine critique pour la constitution d’une liaison thiol ester avec l’ubiquitine, et des extensions N et/ou C-terminales variables, [10]. Or, onze enzymes E2s existent chez la levure, et les mammifères auraient au moins 25 iso-formes différentes, [11], parmi lesquels un nombre limité d’enzymes E2s participe directement dans la formation des signaux de poly-ubiquitination et donc dans la protéolyse (trois sur onze chez la levure). De ce fait, il est très important de noter que l’ubiquitination des substrats n’est pas seulement un signal de dégradation. Il s’agit d’un changement post-traductionnelle dirigeant les protéines vers d’autres fonctions. Les protéines mono-, di- ou tri-ubiquitinées sont généralement des protéines stables qui ne sont pas dégradées, [8]. En effet, le marquage de ces protéines par l’ubiquitine semble servir essentiellement à leur adressage et à la régulation de leur localisation, on prend comme exemple l’internalisation de certains récepteurs hormonaux, [8].

Par ailleurs, seules les protéines conjuguées à au moins 4 molécules d’ubiquitine sont reconnues par le protéasome 26S et dégradées. La formation de ces protéines poly-ubiquitinées peut être exécutée seulement en présence de l’enzyme E1 et de l’une des enzymes E2s, [8]. 4.3. Les ubiquitines-Ligases E3S et leur classif ication, [12] :

La dégradation des protéines par la voie ubiquitine-protéasome est effectuée en deux étapes consécutives. Dans un premier temps, les protéines devant être dégradées sont sélectionnées par des enzymes particuliers, les ubiquitines-Ligases, qui les marquent en leur ajoutant une "étiquette" caractéristique, formée d’une chaîne de poly-ubiquitines. Dans un deuxième temps, les protéines ainsi étiquetées sont identifiées et dégradées par le protéasome 26S. Le protéasome est un vaste complexe rassemblant de multiples activités protéases qui écartent les protéines ubiquitinées en les transformant en petits peptides inactifs.

Donc, les ubiquitines-Ligases sont de véritables arbitres de la survie des protéines en assurant la sélectivité et l’efficacité de leur dégradation par la voie ubiquitine-protéasome. Les analyses récentes de séquence montrent que le génome humain code pour plus de 150 ubiquitines- Ligases, qui se distribuent en plusieurs classes structurales.

En effet, dans leur grande majorité, les protéines poly-ubiquitinées sont formées en présence d’une E1, une E2 et une E3, [7]. Or, Certaines E2s interagissent avec de multiples E3s, et inversement. Ainsi, un substrat donné peut aussi être poly-ubiquitiné par plusieurs combinaisons d’enzymes E2 et

E3 distinctes. Il demeure que l’intérêt probable de ces combinaisons multiples est de générer diverses voies de poly-ubiquitination d’un substrat spécifique susceptible d’être différentiellement régulé en réponse à des stimuli donnés, [13]. En plus, comme les enzymes E3s tiennent des sites de reconnaissance des substrats, [7], l’abondance de ces combinaisons permet de cibler spécifiquement vers la dégradation un nombre très élevé de différentes protéines.

Néanmoins, ce phénomène est encore augmenté par le fait qu’une enzyme E3 donnée peut reconnaître des protéines différentes, [14]. Les enzymes E3s montrent une très grande hétérogénéité de structure, mais appartiennent à deux classes différentes [7].

L’ubiquitine-Ligase (ou l’enzyme E3s) appartient, selon la composition du complexe enzymatique, à l'un des trois groupes suivants : ü une seule unité possédant un motif RING-finger, ü plusieurs sous-unités dont l'une a un motif RING-finger, ü protéine possédant un domaine HECT.

5. protéasome-ubiquitine, [15] :

Les protéasomes sont des complexes enzymatiques multi-protéiques que l'on retrouve chez les eucaryotes, les archées et chez quelques bactéries de l'ordre Actinomycetales.

Dans les cellules eucaryotes, ils se situent dans le noyau, le cytosol et associés au réticulum endoplasmique. La fonction principale du protéasome est de dégrader les protéines mal repliées, dénaturées ou obsolètes de façon ciblée. Donc, cette dégradation se fait par protéolyse, une réaction chimique qui coupe les liaisons peptiques et qui est effectuée par des enzymes nommées protéases. Ainsi, la protéine est découpée en peptides long de 7 à 9 acides aminés qui seront ensuite hydrolysés hors du protéasome et recyclés. Notons que les protéines sont marquées pour la dégradation par une protéine nommée ubiquitine. Cependant, ce marquage est fait par l'action coordonnée de trois types d'enzymes. Alors, une fois le marquage par une première molécule d'ubiquitine réalisé, d'autres ubiquitines vont être rajoutées à sa suite. Donc, Il faudra une chaîne d'au moins quatre ubiquitines pour que le protéasome 26S reconnaisse la protéine à dégrader.

En effet, Le protéasome a une forme de baril et a une cavité en son centre cernée par quatre anneaux, fournissant ainsi un espace clos pour la digestion des protéines. Or, Chaque anneau est composé de sept protéines où les deux anneaux intérieurs sont formés de sept sous unités β qui contiennent le site actif de la protéase. Par contre les deux anneaux extérieurs contiennent sept sous-unités α dont le rôle consiste à maintenir l'ouverture par laquelle les protéines à dégrader pénètrent dans le baril où ces sous-unités α sont capables d’identifier les marqueurs de poly-ubiquitine qui régulent le processus de dégradation. L'ensemble est connu sous le terme de complexe protéasome-ubiquitine.

Fig.3 : Représentation du protéasome obtenue par Diffractométrie de rayons X après cristallisation. Le cœur catalytique 20S est en bleu. Les deux complexes régulateurs 11S sont en rouge.

Donc, La dégradation protéasomale est un élément indispensable d’abondant processus cellulaires, surtout le cycle cellulaire, l'expression génétique et la réponse au

stress oxydatif. Notons que l'importance de la dégradation protéolytique et du rôle de l'ubiquitine lors de celle-ci a été off icialisée par la remise du Prix Nobel de chimie 2004 à Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose . Ainsi que, La régulation du protéasome fai t encore de nos jours l'objet de recherches intensives.

6. La voie ubiquitine–protéasome: En général, La vie cellulaire repose sur l’activité des protéines. Donc dans

toute cellule, l’abondance et l’activité de chaque protéine dépend de l’équilibre de deux processus : sa synthèse à partir du génome, et sa dégradation par protéolyse. Lorsqu’on dit Protéolyse, on entend la fragmentation d’une protéine en plusieurs morceaux sous l ’action d’une enzyme.

Fig.4 : Interaction entre la voie « loi N-terminale » et le système ubiquitine protéasome. Une protéine en voie de dégradation est associée avec l’enzyme E3α qui

reconnaît ses motifs NH2-terminaux spécifiques. En association avec l’enzyme E214k, l’ubiquitine activée est transférée vers un résidu lysine. Lorsqu’une chaîne d’au moins 4 molécules d’ubiquitine est formée sur le substrat protéique, la reconnaissance par le protéasome 26S est possible, et aboutit au clivage en petits peptides, qui seront par la suite dégradés en acide aminés par des peptidases.

La voie ubiquitine-protéasome est le mécanisme primordial de dégradation des protéines de toutes les cellules humaines. Donc, Il s’agit d’un mécanisme très caractéristique, étroitement régulé et contrôlé dans le temps, qui joue un rôle essentiel dans tous les aspects les plus fondamentaux de la vie cellulaire. Il est aujourd’hui bien établi que la dégradation des protéines par la voie ubiquitine-protéasome joue un rôle majeur dans la réparation de l’ADN, le contrôle de l’expression des gènes, la régulation de la progression du cycle cellulaire, l’apoptose ou la réponse immunitaire, [12].

Fig.5 : Représentation de la dégradation des protéines par l’ubiquitine-protéasome.

En effet, la voie ubiquitine-protéasome (ubiquitination) régule un grand nombre de fonctions cellulaires critiques, le plus fréquemment en déterminant la dégradation sélective de certaines protéines clés par le protéasome. Or, l’amélioration du cycle cellulaire, [16], l'induction de la réponse inflammatoire, [17], et la présentation antigénique [18] particulièrement sont quelques uns des processus régulés par la voie ubiquitine-protéasome. Donc, Il n'est pas étonnant de constater qu'une dérégulation de la protéolyse dépendante de l'ubiquitine a été reconnue comme étant une cause du cancer, [19] et de plusieurs maladies héréditaires, [20] . Toutefois, la dégradation n'est pas la seule issue possible pour des protéines liées à l'ubiquitine. L'ubiquitination régule également certains processus par des mécanismes qui ne paraîssent pas nécessiter de protéolyse. Cependant, ces processus incluent notamment l'initiation de la réponse inflammatoire, [21] et le fonctionnement de certains facteurs de transcription [22]. Ainsi, parmi les protéines concernées par l'ubiquitination, on trouve notamment p27, p53, p300, les cyclines, E2F, STAT-1, c-Myc, c-Jun, IKB, NFKB et la p-caténine, [23].

7. Maladies pathologiques impliquant l'ubiquitine:

L’ubiquitine est récemment apparue comme un important régulateur de la fonction et de la stabilité des protéines, aussi bien chez la levure que chez les mammifères. Or, elle reconnaît et se lie spécialement aux protéines mal repliées ou incomplètes, constituant aussi un signal de dégradation qui envoie les protéines anormales dans la poubelle de la cellule, le protéasome, [24].

En effet, parmi les maladies impliquant l’ubiquitine, on cite le syndrome de Liddle qui est une maladie rare découverte pour la première fois en 1960 par Grant Liddle et caractérisée par une hypertension artérielle grave. Une des causes de la maladie parmi d'autres et une mutation d'un gène codant une des sous-unités du canal sodique ENaC, qui empêche la fixation de l'enzyme E3 spécifique nommée NEDD4 et aussi la dégradation d'ENaC .

Ainsi que, la maladie de Parkinson pourrait être également causée par l'accumulation de certaines substances secondaires à un déficit en certains enzymes E3.

Certains cancers pourraient être provoqués par une dégradation excessive de protéines inhibitrices, ou par une accumulation d'autres protides en raison de changement de l'enzyme E3.

Bien que, Le système ubiquitine-protéasome aurait identiquement un rôle lors de certaines infections virales, [25].

Vu la différence des processus cellulaires contrôlés via la dégradation des protéines, il n’est pas surprenant de constater que des altérations de la voie ubiquitine-protéasome soient à l’origine, ou profondément liées à certains maladies génétiques et à d’abondantes pathologies humaines, comme : ü les cancers (colorectal, lymphomes…) ü les syndromes inflammatoires ü les maladies neuro-dégénératives (maladies de Parkinson, Alzheimer,

Huntington). En plus, le détournement de la voie ubiquitine-protéasome par des virus et

microorganismes pathogènes de l’homme (induisant la dégradation anormale de protéines humaines) est à la base de certaines maladies infectieuses, [12].

On distingue plusieurs maladies associées à des dérèglements du processus d’ubiquitination, telles que des cancers et des maladies génétiques comme le syndrome de Down.

Or, ces maladies, dites «conformationnelles», découlent du mauvais repliement des protéines lors de leur formation dans la cellule. Par contre, la liste de

ces maladies croît continuellement et inclut entre autres des affections comme la rétinite pigmentaire, le diabète néphrogénique congénital, la fibrose kystique et des multiples maladies neuro-dégénératives.

En effet, deux types de dérèglements de l'ubiquitination liés aux maladies conformationnelles peuvent être observés. Dans un premier cas, le système de contrôle, censé écarter les protéines faussement formées, finit par être dépassé par l'ampleur de la tâche. Alors il apparaît dans les cellules une agrégation de protéines mal formées dont l’accumulation toxique cause la maladie. Le deuxième cas repose sur l'activité inverse, c’est le contrôle de qualité, au lieu d'être dépassé, fonctionne alors «trop bien». Alors, des protéines, dont le code génétique a subi une mutation mineure, sont reconnues par le système comme étant incorrectement repliées et sont donc dégradées par ubiquitination. Donc, on a une perte de fonction de cette protéine qui, malgré sa mutation, aurait été fonctionnelle si elle n'avait pas été jugée inadaptée et dégradée.

En saisissant mieux les mécanismes d'action de l'ubiquitine, il sera possible de les réguler et de favoriser ou d'éviter la dégradation de certaines protéines. Selon cet objectif, les travaux des lauréats du prix Nobel de chimie 2004 ont mené a la fabrication du premier médicament dont l 'action consiste à intervenir sur le processus d'ubiquitination, c’est le Velcade, destiné à traiter certains cancers, [6].

Notons que, si elle a d'abord été connue pour sa fonction de vidangeuse, l'ubiquitine énonce depuis peu aux chercheurs la diversité de ces rôles dans le bon fonctionnement des cell ules.

Les chercheurs ont récemment observé que l'ubiquitination, en tant que changement «post-traductionnelle» de la protéine, est employée pour réguler, moduler et contrôler la fonction de certaines protéines. Donc, L'ubiquitine est utilisé pour réguler les interactions protéines-protéines, faisant en sorte que deux protéines qui doivent interagir le font dans une plus grande ou une moindre mesure. Elle participe également lors du déplacement des protéines, qui modifient parfois de «compartiment» à l 'intérieur de la cellule, selon leur activité.

Toutefois, ces fonctions de l'ubiquitine restent encore méconnues, elles devraient cependant ouvrir de nouvelles perspectives de recherche très promettantes , [6].

La question qui se pose, c’est quels sont les stimuli résultant à la perte des protéines musculaires au cours des maladies rénales? Il est peu probable que l’insuffisance rénale en soi puisse accélérer la perte des protéines musculaires, car les mécanismes compensateurs favorisant le renouvellement des protéines sont intacts chez les suffisants rénaux tant qu’il n’y a pas de complications surajoutées, [26-27].

En effet, dans le cas de syndrome néphrotique, les mécanismes nutritionnels sont préservés et les patients sont capables de supporter un régime limité en protéines sans perdre de masse musculaire, tant qu’il n’y a pas de difficultés cliniques surajoutées [28]. Néanmoins, certaines complications de l’insuffisance rénale peuvent inhiber ces mécanismes compensateurs. Or, L’acidose métabolique, par exemple, stimule la dégradation des acides aminés essentiels et des protéines dans le muscle de rat [29-30-31] ; des effets semblables ont été observés chez les adultes sains et des insuffisants rénaux en hémodialyse ou en dialyse péritonéale (Tableau1). Nouvellement, il A été montré que le système ubiquitine-protéasome était activé chez les insuffisants rénaux. Quoique, des biopsies musculaires ont été effectuées à cet effet chez des patients en dialyse péritonéale continue ambulatoire, avant et après traitement d’une acidose

Métabolique modérée. L’accroissement des bicarbonates était associé à une diminution significative de la transcription de l’ubiquitine [32], rappelant les résultats acquis en expérimentation animale [29].

L’insulino-résistance associée à l’insuffisance rénale pourrait pousser le système musculaire ubiquitine-protéasome [33, 34]. Ce pendant, chez le rat, l’induction d’un diabète aigu précipite la dégradation protéique musculaire [35,36], et accroître la Transcription de l’ubiquitine et de la sous-unité E2 14k du protéasome. En effet, ces anomalies sont indépendantes de l’acidose associée au diabète aigu [36]. Par ailleurs Il existe une augmentation de la liaison de l’ubiquitine aux protéines musculaires du rat diabétique in vitro, qui dépend de la présence des enzymes E2 14k et E3α, suggérant une activité de la loi N-terminale au cours du diabète [37].

Donc il est possible que l’insulino-résistance associée à l’insuffisance rénale soit un stimulus pour une dégradation précipitée des produits musculaires, via une anomalie dans la voie de signalisation stimulée par l’insuline, [38].

En général, les virus ont obtenu des stratégies efficaces pour mettre à profit la machinerie cellulaire d’ubiquitination qui permet d'étiqueter les protéines destinées à être dégradées par le protéasome. Martin Scheffner, par ses études défricheuses, a mis en lumière un mécanisme par lequel une protéine virale assure le ciblage caractéristique d’une protéine cellulaire vers la dégradation par le protéasome, pour le bénéfice du virus. Or des études antérieures de d’autre chercheures ont identifié un mécanisme analogue pour la protéine Vpu du virus VIH1. Alors, Vpu recrute betaTrCP, la protéine à boîte F du complexe ubiquitine ligase SCFbetaTrCP et se lie concurremment à la protéine CD4, le récepteur cellulaire au virus synthétisé par la cellule au niveau du réticulum endoplasmique (ER). Or, la protéine CD4 intracellulaire est-elle ciblée, de façon anormale, vers la dégradation par le protéasome, [39].

Fig.6 :Modèle de dégradation de CD4 en présence de Vpu , [63] .

De ce fait, les protéines virales d'enveloppe destinées à la fabrication des nouvelles

particules virales fuient à une rétention dans le compartiment ER, [40]. À parti des exemples de ce type de stratégie virale de piratage des ubiquitines ligases cellulaires se sont accroîtrais. Donc, on peut citer la protéine V des paramyxovirus qui induit la dégradation de la protéine STAT1 pour échapper à la réponse interféron, les protéines E7 du papillome, pp71 du virus CMV et EBNA3C du virus Epstein-Barr qui ciblent les protéines de type Rb pour l’altération du cycle cellulaire, et la protéine Vif du virus VIH qui cible la protéine APOBEC3G pour fuir à un "éditing" létal du génome viral. Alors, le mécanisme général qui se dégage de ces distincts exemples est le recrutement par la protéine virale d’une E3 ubiquitine ligase et de la protéine cellulaire cible qui devient un substrat de la machinerie d’ubiquitination, aboutissant à sa dégradation par le protéasome.

Comme on a dit précédemment, Vpu forme un complexe avec la betaTrCP pour induire la dégradation de CD4. Cependant, la betaTrCP participe dans la progression du

cycle cellulaire. De ce fait, elle assure la destruction au moment opportun, des régulateurs du cycle cellulaire, tels que Cdc25, Wee1 ou encore, Emi1. Donc, les chercheures demandent si la protéine Vpu pourrait modifier le déroulement du cycle cellulaire en empêchant la reconnaissance par la protéine betaTrCP de ses cibles naturelles qui régulent le cycle cellulaire.

Au cours de ces études, ils ont mis en lumière un mécanisme de dégradation de la protéine Vpu elle-même. Où, Vpu est dégradé de manière principale dans les cellules arrêtées en mitose. En effet, ils ont identifié le déterminant de Vpu responsable de son ciblage vers la dégradation et montré que la mutation de ce déterminant entraîne une accumulation plus forte de Vpu dans la cellule. Ainsi Vpu stimule le relâchement des virions dans le milieu extracellulaire, une activité indépendante de sa fonction de dégradation de CD4. Quoique, Les résultats en cours inspirent que le mécanisme de dégradation opérant sur Vpu serait désavantageux pour le virus. Malgré cela, une étude comparative exhaustive des isolats viraux VIH1 montre un taux de conservation très élevé du déterminant de dégradation de Vpu. Or Ceci suggère une pression sélective en faveur du maintien du mécanisme de dégradation. Les chercheures évaluent actuellement l'hypothèse qu'une efficacité optimale de production virale à l'échelle de la cellule infectée aurait pour revers un effet pathogène exagéré, dommageable à long terme à la persistance et à la transmission du virus à l'échelle des organismes.

Fig.7 : figure représente une cellule en début de mitose, et une cellule en interphase, et la protéine

Vpu, visualisée grâce a un anticorps couplé à un fluorochome vert, est présente dans des compartiments péri-nucléaires (Golgi, réticulum).

8. Maladies neuro-dégénératives, [41] : Une maladie neurodégénérative est une maladie qui affecte le fonctionnement du

cerveau ou plus généralement le système nerveux de manière graduelle au cours de son évolution. Celle-ci peut être plus ou moins longue, de quelques semaines à quelques années. Généralement, Le processus en cause consiste en une détérioration du fonctionnement des cellules nerveuses, surtout les neurones, voire à leur mort cellulaire. Donc, la conséquence pour le malade est une altération progressive souvent irréversible des fonctions nerveuses qui peut mener à son décès.

Cependant , en fonction des régions du système nerveux atteintes par la maladie, les troubles pourront concerner la motricité, le langage, la mémoire, la perception, la cognition... De ce fait, on distingue les maladies atteignant le système nerveux central de celles touchant le système nerveux périphérique. Une autre différenciation porte sur l'étiologie suivant que la pathologie soit génétique ou non. Toutefois, dans d’abondant cas, les causes exactes du déclenchement de la maladie restent inconnues.

Parmi ce type de maladies neuro-dégénératives, on cite la maladie d’Alzheimer, celle de Parkinson, celle de Creutzfeldt-Jakob (ETB).

8.1. Maladie d'Alzheimer : La maladie d'Alzheimer, autrefois nommée gâtisme, est la démence sénile la plus

fréquente dans les pays développés, [42]. En effet, La maladie d'Alzheimer c’est une maladie neuro-dégénérative du tissu cérébral qui entraîne la perte graduelle et irréversible des fonctions mentales. D’ailleurs, c'est la cause principale de démence chez les personnes âgées, touchant environ 24 millions de personnes à travers le monde, [43].

Où, Le premier cas de la maladie d’Alzheimer a été découvert par Alois Alzheimer en 1906. Alors, La maladie d’Alzheimer est une démence neurodégénérative à dominante corticale qui touche en premier lieu les fonctions cognitives et se reflète sur le comportement et l’adaptation sociale des patients. Donc, elle se détermine par la mort des neurones cholinergiques du système limbique spécialement ceux de l’hippocampe c’est la zone mémoire du cerveau, [44].

La maladie d’Alzheimer présente trois types capitaux de lésions que sont l’atrophie corticale (le cerveau peut perdre de 8 à 10% de son poids tous les 10 ans), les dégénérescences neurofibrillaires (écheveaux de filaments anormaux à l’intérieur des neurones) et les plaques séniles (dépôts extracellulaires de substances amyloïde), [44].

L’ubiquitine joue un rôle important dans le turn-over des protéines au niveau du protéasome 26S mais elle participe aussi au niveau du contrôle du cycle cellulaire, de la régulation de la transcription, dans la réponse au stress, [45.46].

La fonction de l’ubiquitine dans la dégradation par le protéasome, se fait au travers d’une liaison entre le C-terminal de l’ubiquitine et le C-terminal d’une lysine de la protéine de fusion. Cependant, en plus de cette liaison iso-peptidique, le C-terminal de l’ubiquitine peut former des liaisons peptidiques sur les groupements amines des carbones α (figure 12) [47]. Or, le clivage naturel de la fusion est accompli par des protéases dé-ubiquitinylantes. Les fusions à l’ubiquitine, réalisées dans différentes autres expériences, ont montré une expression allant de 20 à 50% des protéines totales d’Escherichia coli, [45].

Fig.8 : Schéma de la structure cristalline de l’ubiquitine avec la

Représentation des feuillets β (4) et de la longue hélice α (résidus 23 à 34).

Fig.9 : Représentation schématique de la famille De gènes ayant une fusion naturelle à l’ubiquitine UBI1, 2,3 sont constitués de la séquence de l’ubiquitine en fusion avec une queue de 52 acides Aminés pour UBI1 et 2 et de 76AA pour UBI3, cette Fusion contient un site de liaison à un ion

Métallique et un site de liaison à l’ADN. UBI4 est une répétition de 5 séquences d’ubiquitine, [47].

Le diagnostic de la maladie d’Alzheimer pour le moment ne peut être posé qu’a l’examen du cerveau, à partir de l’autopsie. Alors cet organe présente des modifications structuraux importants (atrophie de l’écorce cérébrale localisée surtout dans les régions pariéto- temporo-occipitales, lésions de l’hippocampe, dilatation des ventricules cérébraux, présence d’abondante plaques séniles dont des dépôts extracellulaires et de l’angiopathie cérébrovasculaire). En fait, les plaques séniles sont des dépôts extracellulaires compacts et assez bien délimités des substances amyloïdes retrouvés aussi dans l’angiopathie cérébrale.

Où, cette béta-amyloïde existe aussi dans le plasma et le liquide cérébro-spinal. En revanche, les embrouillements neurofibrillaires apparaissent plutôt a l’intérieure de la cellule nerveuse.ils sont majoritairement composés de protéine tau qu’une phosphorylation insuffisante rendrait inactive de même que l’ubiquitine .donc, ces protéines qui s’accumulent particulièrement dans le cytoplasme, serait liées a la morts des neurones .le degrés de la dégradation des fonctions intellectuelles est en étroite relation avec leur densité.

Alors, Les troubles fonctionnels et comportementaux examinés chez la personne seraient liés aux sites des atteintes cérébrales. Ainsi, les atteintes du lobe frontal seraient responsables de trouble de la parole, de l’écriture, du contrôle de soi, de la gestion des émotions et des difficultés relationnelles.

Fig.10: Aspect des lésions observées dans la maladie d’Alzheimer à l’examen microscopique.

Toutes les photographies ont été prises avec un objectif x100 ; le trait de l’image A représente 20 μm. A. Plaque sénile ; immunohistochimie du peptide Aβ. Un dépôt dense de peptide Aβ (grande flèche) occupe le centre de la plaque sénile. Elle est entourée d’une couronne claire (correspondant aux prolongements nerveux de l’image C), puis d’un halo de dépôt diffus (petites flèches). Un noyau de macrophage est marqué par une tête de flèche. B. Plaque sénile colorée par le rouge Congo, colorant qui se fixe sélectivement sur les substances amyloïdes. La partie amyloïde de la plaque sénile (correspondant au centre dense de la photo A) est indiquée par une flèche. La tête de flèche marque le noyau d’un macrophage. C. Plaque sénile ; immunohistochimie de la protéine tau. Le centre de la plaque (grande flèche) est à peine visible. Il est entouré de prolongements nerveux dégénérés, marqués par l’anticorps anti-tau (petites flèches). Le noyau de deux macrophages est indiqué par des têtes de flèches. D. Dégénérescence neurofibrillaire ; immunohistochimie de la protéine tau. Deux neurones sont visibles (marqués a et b). Le noyau est indiqué par une grosse tête de flèche, le nucléole par une petite tête de flèche. La dégénérescence neurofibrillaire est constituée par des fibrilles de protéine tau dans le corps cellulaire du neurone à (flèches), [48].

Or, Les dommages causes aux lobes pariétaux léseraient à l’interprétation sensorielle de la douleur, du toucher, de la température et des mots écrits de même qu’a la mémorisation.

Finalement, les dommages occasionnés au lobe occipital seraient dommageables au centre de la vision et a la compréhension de l’écriture, [49]. De manière générale, il ya une destruction massive de certaines neurones menant a la démence et a la mort. Quand la mort survient, le cerveau a perdu environ le tiers de sa masse. Quoique, les chercheurs n’arrivent pas a déterminer avec conviction si ces lésions ont une influence étiologique ou si elles sont

le résultat de la maladie, d’ailleurs, c’est là le véritable talon d’Achille dans la recherche sur la maladie d’Alzheimer. 8.2. La maladie de Parkinson :

La maladie de Parkinson c’est une maladie neurologique chronique atteignant le système nerveux central responsable de troubles surtout moteurs d'évolution graduelle. Cependant, ses causes sont mal connues. Habituellement la maladie débute entre 45 et 70 ans. Donc, elle est la deuxième maladie neuro-dégénérative, après la maladie d'Alzheimer. La maladie de Parkinson se différencie des syndromes parkinsoniens qui sont couramment d'origines différentes, plus sévères et répondent peu au traitement, [50]. Décrite de façon scientifique et précise pour la première fois en 1817 par Sir James Parkinson sous le nom de «paralysie agitante», découverte de 2 des principaux symptômes : l’akinésie et le tremblement. Alors, jusqu'au l’année 1861-1862 Charcot décrit le 3ème symptôme important c’est la rigidité et appelle la maladie en exprimant son respect à Sir Parkinson pour son travail, [51].

En effet, La maladie de Parkinson est définie par la mort graduelle et élective des neurones dopaminergiques de la substantia nigra et la présence d'inclusions protéiques ubiquitinylées, les corps de Lewy. Cependant, durant ces six dernières années, quatre gènes impliqués dans de rares formes familiales de maladie de Parkinson ont été identifiés: des mutations des gènes de l'α-synucléine et de l'ubiquitine hydrolase UCH-L1 (ubiquitin carboxyterminal hydrolase L1) sont associées à des formes autosomiques dominantes, tandis que des mutations des gènes de la parkine et de DJ-1 sont responsables de formes autosomiques récessives. Quoique, Un gain de fonction toxique, associé à l'assemblage de l'α-synucléine en fibrilles insolubles de type amyloïde, pourrait rendre compte de la mort neuronale dans les syndromes parkinsoniens dus à des mutations du gène de l'α-synucléine. En revanche, une perte de fonction serait à l'origine de la maladie de Parkinson incitée par des mutations des gènes de la parkine et d'UCH-Ll, deux enzymes clés de la voie protéolytique ubiquitine-protéasome. Où, La présence d'α-synucléine, de parkine et d'UCH-Ll dans les corps de Lewy suggère qu'un dysfonctionnement des voies de repliement et de dégradation des protéines pourrait jouer un rôle non uniquement dans les formes familiales de maladie de Parkinson, mais aussi dans la forme sporadique, plus habituelle, [52].

Notons que les causes de la maladie de Parkinson ne sont pas exactement connues, mais trois principaux facteurs sont mis en jeu, [51] : ü Le vieillissement cérébral : n’est qu’un facteur facilitant, ü Les facteurs génétiques : neuf gènes dont la mutation est responsable de maladies

de Parkinson familiales ont été identifiés. Or, trois protéines connues sont présentes dans l es corps de Lewy : • l’ -synucléine, • l’ubiquitine C-terminale hydrolase (gènes sur le chromosome 4) transmission

autosomale dominante, • la parkine (gène sur le chromosome 6) transmission autosomale récessive. Dans de plusieurs cas, le facteur génétique serait particulièrement une

prédisposition à la maladie. ü Les facteurs environnementaux :

o le MPTP o Neurotoxines MPTP-like (b-carbolines, tétrahydroisoquinolines) o Neuroleptiques o Pesticides (roténone, paraquat, carbamates, organochlorés) o Métaux (Fer, Manganèse)

Fig.11 : schéma représente le Mécanismes mis en jeu dans la mort des neurones dopaminergiques. Précisément en 1997, le gène de l’α-synucléine fut le premier à être reconnu

responsable d’un aspect rare de maladie de Parkinson, transmise selon le mode autosomique dominant, quand’ il porte l’une des deux mutations faux-sens, [53]. En fait, Les patients porteurs de ces mutations présentent une maladie de Parkinson sévère, dont le début se place entre la 4e et la 6e décennie.

Alors, L’α-synucléine est une protéine neuronale de 140 acides aminés, très conservée chez les vertébrés. Elle est enrichie dans plusieurs régions cérébrales (néocortex, hippocampe, gyrus denté, bulbe Olfactif, striatum, thalamus, cervelet) dans lesquelles elle se concentre au niveau des terminaisons synaptiques. Sa fonction est loin d’être éclaircie, [54]. In vivo, l’α-synucléine est étroitement associée aux vésicules synaptiques. Or, in vitro, elle s’associe avec des vésicules de phospholipides synthétiques ou purifiées à partir de cerveau.

Une apparition importante a été franchie au Japon, en 1998, avec la découver te de l’implication du gène de la parkine dans un syndrome Parkinsonien familial à début précoce, transmis suivant le mode autosomique récessif, [53]. Aujourd’hui, le gène de la parkine paraît intervenir dans près de 50 % des cas familiaux transmis suivant le mode autosomique récessif, avec un début avant 45 ans, mais aussi dans plus de 15 % des cas isolés de maladie de Parkinson à début précoce, dans des populations de différentes origines ethniques. Plusieurs combinaisons de mutations ponctuelles, délétions ou reproductions d’exons dans le gène de la parkine rendent compte d’un tableau clinique changeant, parfois semblable à celui de la maladie de Parkinson idiopathique, [55].

En effet, La parkine est une protéine ubiquitaire de 465 acides aminés, définie par la présence d’un domaine homologue de l’ubiquitine à son extrémité amino-terminale et de deux domaines riches en cystéines de type RINGfinger dans la région carboxy-terminale. Alors, comme d’autres protéines de type RING finger, la parkine participe dans l’une des voies majeures de dégradation des protéines cellulaires, la voie ubiquitine-protéasome (Figure 16). Donc, grâce à son activité E3 ubiquitine-ligase, elle reconnaît des protéines substrats caractéristiques et induit leur poly-ubiquitinylation, signal de ciblage vers la voie de dégradation par le protéasome, [56].

Cependant, La perte de cette fonction entraînerait une accumulation irrespirable de substrats non ubiquitinylés qui serait à l’origine de la dégénérescence neuronale chez les patients porteurs de mutations du gène de la parkine. Par cantre, l’absence de corps de Lewy chez la plupart de ces patients insinue que la parkine joue un rôle central dans la formation de ces inclusions ubiquitinylées. Quoique, La présence fréquente de la parkine dans les corps de Lewy de patients atteints de maladie de Parkinson idiopathique, ou due à une mutation du gène de l’α-synucléine, est en faveur de cette hypothèse, [57]. L’existence d’une neuro-dégénérescence en l’absence de corps de Lewy en cas de mutations du gène de la parkine suggère

aussi que l’existence de corps de Lewy dans la maladie de Parkinson idiopathique pourrait n’être qu’un simple marqueur phénotypique d’un dysfonctionnement, et non la cause de la mort neuronale, [55].

Notons que, Une isoforme minoritaire O-glycosylée d’α-synucléine (αSp22) a été reconnaîtrai, dont le taux est accroître dans le cerveau de patients porteurs de mutations du gène de la parkine, [57]. Normalement L’αSp22 est associ ée à la parkine dans le cerveau humain, est ubiquitinylée in vitro par la parkine normale, tandis que des formes mutantes de celle-ci sont incapables d’inciter cette réaction. Par cantre, la synphiline, une protéine partenaire de l’α-synucléine dont on ignore la fonction, est aussi ubiquitinylée par la parkine, [58]. Toutefois, le rôle délétère d’une éventuelle accumulation de l’αSp22 et de la synphiline reste à prouver. Néanmoins, l’interaction fonctionnelle entre la parkine et l’α-synucléine - directe via l’αSp22 ou indirecte via le partenaire synphiline de l’α-synucléine - est en faveur d’un rôle biologique des deux protéines dans une même voie moléculaire impliquée dans la pathogénie de la maladie de Parkinson (figure 15), [55].

Fig.12: Voies moléculaires impliquées dans la pathogénie de la maladie de Parkinson. Notons qu’un second gène témoigne du rôle clé d’un défaut de la voie

d’ubiquitinylation dans la dégénérescence neuronale observée au cours de la maladie de Parkinson. Précisément en 1998, une substitution Ile93Met fut identifiée dans le gène codant pour UCHL-1 chez deux membres d’une famille allemande atteints d’un syndrome parkinsonien transmis suivant le mode autosomi que dominant, [53]. Alors, UCH-L1, l’une des protéines les plus nombreuses dans l e cerveau, est une ubiquitine hydrolase qui permet de recycler des monomères d’ubiquitine indispensables à l’adressage de protéines cellulaires vers la voie de dégradation par le protéasome (Figure 16), [55]. Cependant , le rôle pathogène d’UCHL-1 reste à prouver, puisqu’à ce jour aucune autre mutation dans son gène n’a été retrouvée dans la maladie de Parkinson. Tandis, l’activité hydrolase du variant Ile93Met paraît diminué de 50 %.

Fig.13 : Maladie de Parkinson et voie protéolytique ubiquitine-protéasome. L’ubiquitinylation est un signal de dégradation permettant de cibler les protéines cellulaires vers leur dégradation par le

protéasome. Ce processus dépendant de l’ATP requiert l’action séquentielle de trois enzymes, nommées respectivement E1, E2 et E3, qui conduisent à l’addition covalente de molécules

d’ubiquitine sur des protéines spécifiques de substrats. Dans cette voie interviennent également des enzymes de désubiquitinylation (ubiquitine hydrolases) qui permettent de recycler des monomères

d’ubiquitine indispensables à l’adressage de protéines cellulaires vers la dégradation par le protéasome. Une altération de la voie ubiquitine-protéasome peut conduire à une dégénérescence de

la voie dopaminergique nigro-striatale. Ainsi, la mutation Ile93Met du gène codant pour l’ubiquitine hydrolase UCH-L1 rend compte d’un syndrome parkinsonien transmis selon le mode autosomique

dominant dans une famille allemande. De plus, une grande variété de réarrangements d’exons et de mutations ponctuelles du gène codant pour l’E3 ubiquitine ligase parkine est associée à une maladie

de Parkinson autosomique récessive dans des populations de diverses origines ethniques, [55]. Dans un test in vitro, laissant apercevoir la possibilité que cette mutation

pourrait compromettre la dégradation de protéines cellulaires par le protéasome en diminuant la quantité de monomères d’ubiquitine disponibles. Quoique, à côté de son activité ubiquitine hydrolase, la protéine UCH-L1 a in vitro une activité ubiquitine ligase non classique qui mene à la formation de chaînes de poly-ubiquitine non canoniques, résistantes à la dégradation par le protéasome, [56].

Récemment, une délétion génomique et une mutation ponctuelle (L166P) du gène DJ-1 ont été reconnaître comme responsables d’une maladie de Parkinson transmise suivant le mode autosomique récessif, dans une famille hollandaise et une famille italienne, respectivement, [59].

Où, DJ-1, une protéine ubiquitaire de 189 acides aminées, est un protagoniste de variés interactions protéine-protéine par lesquelles elle semble intervenir dans d’abondantes voies moléculaires. Cependant, seule la détermination précise de sa fonction, notamment à travers l’étude des résultats de l’inactivation du gène DJ-1 chez l’animal, permettra de relier cette protéine à la pathogénie de la maladie de Parkinson, [55]. 8.3. Maladie de Creutzfeldt-Jakob :

La maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) c’est une dégénérescence du système nerveux central définie par l'accumulation d'un prion c’est la forme anormale d'une protéine qui peut transmettre la maladie. Cependant, La période d'incubation se compte en années, voire en décennies avant qu'apparaissent des troubles de l'équilibre et de la sensibilité, puis une démence. L'issue est systématiquement fatale à échéance d'approximativement un an, [60].

En revanche, La maladie du Kuru a été montrée dans le peuple des Fores de Nouvelle-Guinée par D.C. Gajdusek (Prix Nobel de médecine 1976). Bien que différent de la

maladie de Creutzfeldt-Jakob, le kuru est aussi une encéphalopathie spongiforme transmissible. Ainsi, son mode de transmission a pu être associé une habitude funéraire anthropophage. L'insomnie fatale familiale est aussi une EST, [60].

En effet, la maladie Creutzfeldt-Jakob elle touche 1 personne sur 1 million par ans et jamais avant 60 ans. Quoique, une nouvelle forme a pu apparaitre, [61].

Une nouvelle forme de la maladie est apparue en 1996 en Angleterre, éventuellement provoquée par l'ingestion de produits bovins infectés par l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB : vache folle) ; parfois elle est notée vMCJ, pour « variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob ». Alors, elle apparue en 1985, l'épidémie d'ESB, d'abord britannique puis continentale, est la conséquence d'une augmentation de la transmission d'un agent pathogène avec le recyclage des déchets d'abattoir au sein de l'alimentation animale (ruminants et autres mammifères).

L'ESB s'attaque aux cerveaux de certains primates, et donc a fortiori des hommes. La maladie peut être transmise à l'homme s'il consomme de la viande ou des tissus issus d'animaux contaminés. Alors, l’ESB transmise à l'être humain est nommée variant(e) de la maladie de Creutzfeldt-Jakob et, comme chez les bovins, s'attaque de même au système nerveux central (cerveau et moelle épinière).Bien que, personne n'a aujourd'hui d'idée précise quant à la durée d'incubation de la maladie.

Notons que le profil génétique des individus joue un rôle essentiel dans l'infection par voie alimentaire. Or, La nature du codon 129 de la protéine prion normale (PRNP) (chromosome 20, locus 13) est au centre de plusieurs recherches parce que tous les cas de vMCJ par voie alimentaire sont 129Met/Met alors que seul 40% de la population générale présente ce profil génétique. Par ailleurs, On ne sait pas si le fait d'avoir le codon 129PRNP autre que Met/Met (càd Val/Met ou Val/Val) permet d'être protégé contre l'infection ou si cette particulier prolongerait la durée d'incubation (tel que la maladie de Kuru par exemple), dans ce dernier cas, on aurait de nouveau une épidémie de vMCJ dans les années à venir.

Jusqu’à présent on connait des multiples causes la maladie de Creutzfeldt-Jakob, or la plupart des cas sont dits sporadiques, parce que l'origine est inconnue. ainsi que , Il existe une transmission héréditaire (10 % des cas) et des contaminations iatrogéniques (sa veut dire dues à un processus opératoire) reliées à l'emploi d'hormone ou de greffes de tissus cérébraux (dure mère) issus de cadavres de malades, ou également par l'utilisation d'instruments de chirurgie mal décontaminés (électrodes).

Ainsi que, la maladie est causées par une protéine anormalement repliée : PrP (infectius protein) : Prion protéine. Notons que son rôle en tant que forme normale n’est pas établi. Alors, La PrP normale a un repliement en hélice α ; la PrP anormale a un repliement en feuillet β, elle impossible à dégrader. Ainsi, La PrP patho va imprimer sa conformation à d’autres protéines c’st la Formation d’agrégats, [61].

9. Conclusion :

L’ubiquitine est une petite molécule récemment apparue l’un des régulateurs de la fonct ion et la de la stabilité des protéines.

En effet, des travaux récents ont montres l’importance de cette petite mol écule, où leurs résultats ouvrent la voie vers une meilleure compréhension des différents rôles joués par cette petite molécule qu’est l’ubiquitine. Alors que le prix Nobel de chimie a justement été décerné en 2004 à Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose pour leurs travaux sur le rôle de l'ubiquitine dans les systèmes de dégradation des protéines, [6], dont l’importance de notre choix du modèle de l’ubiquitine dans notre étude.

De plus, ces dernières années, beaucoup de chercheurs s’intéressent à ce sujet portant sur l’instabilité des protéines et leurs conséquences médi cales.

Donc, l’objectif est double : D’abord mettre au point une grille d’analyse descriptive des protéines avec des mutations connues, et ensuite élaborer un outil prédictif pour faciliter la compréhension de ces mutations dans les maladies humaines. Or, ce projet s’inscrit dans le contexte fondamental de la compréhension des mécanismes qui contrôlent la fonction des protéines. La manière dont une protéine se replie dans l’espace détermine ses interactions avec l’environnement cellulaire, y compris la façon dont ell e va interagir avec les molécules thérapeut iques, [62].

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Conclusion général

Conclusion général

Les protéines sont des chaines de quelques centaines d’acides aminés. Dans les conditions physiologiques, elles parviennent presque toujours à se replier jusqu’ à l’état natif où elles sont fonctionnelles, et ce malgré le nombre astronomique de configurations accessibles. En fait, les protéines jouent un rôle de premier plan dans la structure et la fonction. Certaines protéines produites par la cellule déterminent sa forme et sa structure.

Alors, la fonction particulière d’une protéine est intimement liée à une str ucture moléculaire bien spécifique, définie par l’agencement des éléments de base qui la composent. Donc, on compte 20 acides aminés dotés de propriétés chimiques propres. Or, la combinaison de ces 20 unités fournit une incroyable diversité de protéines. Quoique, pour former une protéine fonctionnelle et stable, il faut avoir la séquence exacte d’acides aminés. Notons que puisque les acides aminés sont susceptibles de s’attirer ou de se repousser de façon prévisible, il résulte de leur assemblage une structure tridimensionnelle stable.

Or, Les protéines peuvent avoir différentes structures (primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire), qui sont très liées aux tâches qu’elles assurent dans la cellule, donc elles sont les véritables macromolécules de la vie. En effet, Le passage de la structure primaire à la structure tertiaire se fait par un processus physique appelé repliement. Cependant le repliement des protéines est un domaine d’un intérêt fondamental . Il concerne les mécanismes moléculaires par lesquels une chaine polypeptidique naissante, résultant de l’information génétique, acquiert sa structure tridimensionnelle, condition nécessaire à l’expression de sa fonction. Alors, le repliement est le passage d’une chaîne d’acides aminés vers une structure tridimensionnelle native bien déterminée et permettant à la protéine d’appliquer sa fonction biologique. C’est la dernière étape de l’emploi de l ’information contenue dans l’ADN. Or, La structure native est totalement prédéfinie par l’ordre des acides aminés dans la chaîne polypeptidique. En effet, la simulation ou « l’expérimentation par ordinateur » représente aujourd’hui un aspect supplémentaire à considérer parallèlement au coté théorique et expérimental des disciplines scientifiques. De ce fait, Les simulations de dynamique moléculaire ont permis d’aborder la compréhension du processus de repliement au niveau atomique. Cependant l’échelle de temps des processus de repliement (de l’ordre de la milliseconde) n’est pas accessible aux simulations numériques (de l’ordre de la nanoseconde) .quoique la dynamique moléculaire est une méthode d ’étude des mouve ments et l ’évolution de la configuration spatiale des systèmes moléculaires. En pratique, on opère par résolution des équations classique du mouvement de Newton étant donnés une fonction énergie potentiel et son champ de force associ é. Pour effectuer ces simulations, nous avons utili sé les logiciels TINKER version 4.2 /2004, qui est un programme de modélisation moléculaire avec un package général et complet de la mécanique moléculaire et la dynamique moléculaire. Cette simulation de DM a été faite pour la protéine « Ubiquitine », ces base de donner et emportes de site Protein Data Bank, sous forme fichier de (PDB).Ceci nous permet d’étudier l’énergie potentiel en fonction du temps et minimiser ses énergies en

utilisons son comportement thermodynamique et cinétique, avec des différents ensemble essentielle pour la DM tel que NVE, NVT, NPT. Alors, la compréhension des mécanismes de repliement des protéines représente l’un des principaux enjeux de la biologie. Il s’agit en effet d’un problème essentiel pour l’analyse des divers événements impliqués dans la régulation cellulaire, ainsi que pour l’utilisation de l’information contenue dans le nombre croissant de gènes séquencés .L ’élucidation de ces mécanismes devrait permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prévention et le traitement des maladies associées à des repliements i ncorrects. Nous présenterons un exemple de ce qui a été réalisé dans le cas de l’étude de protéines de petite taille (Ubiquitine) suivant un repliement simple. L’ubiquitine est récemment apparue comme un important régulateur de la fonction et de la stabilité protéines, aussi bien chez la levure que chez les mammifères. Elle reconnaît et se lie notamment protéines mal repliées ou incomplètes, constituant ainsi un signal de dégradation qui envoie protéines anormales dans la poubelle de la cellule, le protéasome. Où la protéine male replier provoque des maladies D’où l’importance de du modèle de protéine choisie à simuler, et sa relation avec différentes maladies tel que celle d’Alzheimer, de Parkinson, de Jacobi …..ect. Alors ce travail, reste à compléter et a pour suivre dans le cadre de la recherche interdisciplinaire actuelle.