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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2002, 141, 15-38

LA N-ACÉTYL-DL-LEUCINE,MÉDICAMENT SYMPTOMATIQUE DES ÉTATS

VERTIGINEUX (*)

E. NEUZIL (1), S. RAVAINE (2) et H. COUSSE (3)

La N-acétyl-DL-leucine, dont l'action sur le vertigeexpérimental de la Souris a été découverte en 1957, est utiliséedepuis avec succès en clinique humaine comme médicamentsymptomatique des états vertigineux. Les principales publicationsportant sur la chimie de cet acide aminé et son utilisationthérapeutique, ainsi que les travaux expérimentaux concernant sonmécanisme d'action, sont passés en revue. Nous rapportonsensuite les essais que nous avons réalisés pour mettre en évidenceune éventuelle interaction avec des phospholipides présents dansles membranes biologiques.

INTRODUCTION

La N-acétyl-DL-leucine, largement prescrite en France par lesmédecins, spécialistes ou généralistes, bien connue des pharmaciens sous lenom de Tanganil et dont l'efficacité est appréciée par de nombreuxpatients atteints de vertiges, est un médicament dont le mécanisme d'action,après plus de quatre décennies, reste encore peu connu.

(*) Manuscrit reçu le 9 octobre 2002.

(1) Membre correspondant de l'Académie nationale de Médecine, I6, rue Bonaparte,75272 Paris Cedex 06.

(2) Centre de Recherche Paul Pascal, avenue Albert Schweitzer, 33600 Pessac.ravaine@crpp.u-bordeaux.fr

(3) 94, chemin de Las-Tinos, 81100 Castres.

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Le but de cet article est de fournir au chimiste, au biologiste et authérapeute une large documentation bibliographique et de présenter lesinvestigations préliminaires que nous avons réalisées dans le but de préciserle mode d'action de ce médicament.

La N-acétyl-DL-leucine est une petite molécule de structurechimique particulièrement simple, on serait tenté de dire assez banale. Ils'agit en effet d'un produit optiquement inactif, résultant de la N-acétylationde l'acide α-amino-isocaproïque, dont l'isomère de la série L, la leucine , estun acide-α-aminé naturel très répandu.

CH3

O H

O

H3C

N H2

N-acétyl-DL-leucine

La N-acétylation

La N-acétylation est un processus du métabolisme azoté très courant,qui touche de nombreuses molécules d'intérêt biologique. Dans le domainedes acides aminés, le N-acétyl-glutamate intervient dans l'uréogenèse ;l'acide N-acétyl-aspartique, après l'acide glutamique, est le deuxièmeaminoacide libre le plus répandu dans les neurones des Mammifères [8] ; denombreuses protéines, en particulier le cytochrome c [52] et plusieursprotéines cérébrales [65], sont N-acétylées sur l'acide aminé en position N-terminale. Plusieurs oligopeptides, possédant une N-acétyl-leucine enposition N-terminale, sont des inhibiteurs enzymatiques, notamment de latachykinine, de caspases ou de diverses protéases (*). Signalons encore laprésence, dans les glycosaminoglycannes, de dérivés N-acétylés de laglucosamine, de la galactosamine ou de la mannosamine. Dans le domainepharmaceutique, la N-acétyl-DL-leucine se place dans notre arsenalthérapeutique aux côtés de l'acide N-acétyl-aspartique, déjà cité, de laN-acétyl-cystéine, agent mucolytique, de la N-acétyl-méthionine,médicament lipotrope, tandis que l'α-N-acétyl-glutamine, dont le complexealuminique montre des propriétés anti-ulcéreuses, est un nootrope sous saforme acide ; les N-acétyl-amino-acides ont été récemment proposés pour letraitement des affections cutanées [81]. Rappelons enfin que la N-acétylationintervient aussi dans les bio-transformations que subissent in vivo plusieursmédicaments, en particulier le sulfanilamide et l'isoniazide.

(*) Consulter à ce sujet le catalogue "Peptides and biochemicals" de la firme BACHEM AG,2001, Bubendorf, Suisse.

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La leucine

La leucine a été l'un des premiers acides α-aminés à avoir été isolédans la première moitié du XIXème siècle, grâce aux travaux d'éminentschimistes français (*). Proust l'a décrite le premier en 1819 [62], sous laforme très impure de son oxyde caséique. L'année suivante, Braconnot [10]isole de divers hydrolysats sulfuriques de fibres musculaires ou de laine unproduit blanc pour lequel il crée le nom de leucine (leyk¿q = blanc). Il fautattendre 1848, avec Laurent et Gerhardt [47], pour que soit proposée laformule brute C6H13NO2 pour la leucine, encore parfois appelée à l'époqueaposépédine (Æpo shpedˆn, provenant de la putréfaction). L'identificationde la leucine à l'acide α-amino-isocaproïque n'a finalement été réaliséequ'en 1891 par Schulze et Likiernik [67].

La leucine fait partie du groupe des dix acides aminés essentiels,acides aminés indispensables dont l'organisme humain est incapabled'effectuer la synthèse et qui doivent donc être apportés quotidiennementpar l'alimentation, principalement sous forme de protéines. Les besoins enleucine, d'environ 2 grammes par jour, sont particulièrement élevés.

La leucine est l'un des acides aminés les plus sensibles à ladésamination par la L-amino-acide déshydrogénase. La L-leucine peutperdre aussi son groupement azoté au cours d'une réaction de transaminationet figure en troisième position, après l'acide aspartique et l'alanine, parmi lesacides aminés les plus facilement transaminables.

La leucine est un acide aminé cétogène, son catabolisme aboutissantà l'acide acétylacétique : on peut remarquer que ce produit de dégradationpeut fournir, indirectement, les radicaux acétyle susceptibles de transformerla leucine en N-acétyl-leucine.

LA N-ACÉTYL-DL-LEUCINEI. Aspects chimiques

Préparation

La première description de la N-acétyl-DL-leucine est due à EmilFischer, très célèbre professeur de chimie de l'Université de Berlin dont lesimportants et nombreux travaux de biochimie et de chimie organique

(*) Pour l'historique détaillé de la découverte des acides aminés et particulièrement de laleucine, consulter la revue de Vickery et Schmidt [74].

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biologique furent récompensés en 1902 par le prix Nobel de chimie. C'estl'année précédente, en 1901, qu'il publie la préparation du dérivé acétylé dela leucine racémique [26], obtenu en faisant agir une solution d'anhydrideacétique dans l'acide acétique sur l'ester de l'acide aminé. Le produit estcristallisé (F = 161 °C), légèrement soluble dans l'alcool ; ses sels alcalinssont solubles dans l'eau.

Karrer et al. décrivent en 1926 la N-acétyl-L-leucine [42]. On montreplus tard que le chauffage d'un acide α-aminé dans le seul acide acétique oudans un mélange d’anhydride acétique et de soude conduit au dérive acétylésans perte de son activité optique, avec un rendement de 75 % pour laL-leucine [3,21]. En présence à la fois d'acide et d'anhydride acétiques, laréaction est plus complexe : une racémisation se produit, permettant àGreenstein et Winitz de transformer la L-leucine en acétyl-DL-leucine avecun rendement de 85-95 % [35].

Le mécanisme de cette racémisation a été étudié dès 1928 parBergmann et Zervas [7], deux chercheurs du Kaiser Wilheim-Institut fürLederforschung de Dresde qui se sont illustrés dans la chimie des acidesaminés. Un acide α-aminé optiquement actif (I ), traité par un équivalentd'anhydride acétique en solution dans l'acide acétique pur à 100 °C, conduitau dérivé N-acétylé (II ) sans perte de son activité optique ; en présenced'une quantité double ou plus grande d'anhydride acétique, il se formel'azlactone de stucture oxazolinonique (IV ) que l'on peut isoler et qui est enéquilibre avec le dérivé racémique acétylé (IVa ). Une autre voie possible deracémisation passe par les intermédiaires cycliques (III ) et (IIIa ), quiparticipent à un réarrangement céto-énolique. La racémisation ne se produitpas si l'on neutralise l'acidité qui se développe dans le milieu réactionnel.

COOHC H

NH2

R COOHC H

N H

R CC H

N

R

C O C H3

O

C

C H3

O

CC H

N H

R

O

C

CH3

O CC

N H

R

O

C

C H3

O H

CC

N

R

O

C

CH3

O H

O HO H

** *

*

I.II.

IV. IVa.

III. IIIa.

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D'autres préparations de N-acétyl-leucines optiquement actives ou duracémique, ont été publiées :

• Certaines utilisent le cétène comme agent d'acétylation [6,78], cequi ne supprime pas pour autant la réaction de racémisation [12,40].

• D'autres synthèses reposent sur une réaction d'amidocarbonylation[38,68], favorisée par l'utilisation de palladium comme catalyseur [4,36].

• Signalons enfin une synthèse en phase solide, par additionradicalaire sur l'acide 2-acétamido-acrylique [80].

Quelques données physico-chimiques

La N-acétyl-DL-leucine, à l'état cristallisé, est-elle un conglomérat,simple mélange d'antipodes, ou un véritable racémique, dans lequel denouvelles liaisons relient les deux antipodes optiques ? Pour répondre à cettequestion, Jacques et Gabard [41] ont utilisé la méthode des diagrammes defusion. La N-acétyl-L-leucine (F = 189 °C) présente une chaleur de fusionde 7,5 kcal/mole ; le thermogramme de la N-acétyl-L-leucine, fondue puisresolidifiée, montre que ce produit se racémise avec une grande rapidité.Dans les mêmes conditions, le pic de fusion de la N-acétyl-DL-leucine (F =158 °C) est anormalement large, ce qui paraît indiquer l'existence deplusieurs transitions se produisant à des températures très rapprochées ; ceschimistes du Collège de France en déduisent que la N-acétyl-DL-leucinepeut exister sous deux formes cristallines, un conglomérat et un racématevrai.

L'existence d'un racémique vrai pourrait être confirmée par uneétude radio-cristallographique de la N-acétyl-DL-leucine, étude non encoreréalisée à notre connaissance : seule a été publiée la structure de la N-acétyl-L-leucine [77]. Des méthodes indirectes tendent à démontrer la réalité d'unracémique vrai :

• Il existe des différences appréciables entre le spectre infra-rouge dela N-acétyl-L-leucine et celui de la N-acétyl-DL-leucine [17,41], toutcomme pour les énantiomères non acétylés [79].

• Des variations très importantes de solubilité dans différents solvantsentre les énantiomères ont été notées par Huffman et Ingersoll [39].La solubilité dans l'eau, de 0,81 g/100 ml pour le dérivé acétylé de laL-leucine, atteint la valeur de 1,88 pour la N-acétyl-DL-leucine. Ilest intéressant de comparer ces résultats avec ceux obtenus dans lasérie de la valine, acide aminé qui ne diffère de la leucine que parune chaîne carbonée plus courte, mais qui est également ramifiée : lasolubilité dans l'eau des N-acétyl-valines, avec les valeurs de 6,94(série L) et de 3,73 (série DL), décroît donc pour le racémique [59].

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• Seuls les dérivés N-acétylés de la leucine (et de la proline)manifestent une reconnaissance chirale importante, c'est-à-dire unenette différence d'énergie d'interaction entre les associations LL etDL [1].

La résolution de l'acétyl-DL-leucine en ses formes actives peut êtreréalisée grâce à l'emploi de la (-)-α-fenchylamine [39], de cyclodextrines[45] ou d'un dérivé carbamoylé de la quinine [43].

La partition des N-acétyl-leucines entre solvants non miscibles a étéutilisée sur le plan analytique [16,33,53,70]. Pour leur séparationchromatographique sur papier ou sur couche mince, ou encore pour étudierleur comportement électrophorétique, ces dérivés N-protégés d'aminoacidesne se révèlent pas par la ninhydrine ; on les met en évidence en lumièreultra-violette ou avec le colorant Echtblausalz B [15]. Les N-acétyl-leucines,transformées en oxazolin-5-ones par action de la dicyclohexylcarbodiimide,peuvent être identifiées en chromatographie gazeuse associée à laspectrométrie de masse [34].

Notons encore que la N-acétyl-leucine se lie facilement à lasérum-albumine [46], à divers ions métalliques, en particulier au cuivre [51]et au sodium [24] et que le carbone γ de cet acide aminé, carbone tertiaire dela partie isobutylique de la chaîne carbonée, est sensible à l'attaque par lesrayons X [66], par les rayons γ [56] ou par le groupement hydroxyle [37].

II. La N-acétyl-DL-leucinedans les états vertigineux

Depuis 1901, année de sa première préparation, et pendant plus d'undemi siècle, on ne trouve aucun travail de pharmacologie ou dethérapeutique mentionnant la N-acétyl-DL-leucine.

1957-1960 : les premières publications

En 1957, Leau et Ducrot, du Laboratoire de Recherches de la Sociétédes Usines chimiques Rhône-Poulenc, décrivent une nouvelle techniqueexpérimentale permettant de provoquer chez la Souris un syndromeapparemment comparable au vertige de l'Homme ; elle consiste àimmobiliser l'animal dans un tube cylindrique en rhodoïd et à le soumettrependant 15 secondes à une rotation autour de son axe antéro-postérieur, le

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tube étant calé sur l'arbre d'un moteur tournant à 1000 tours / minute ; aprèsun arrêt brusque, on sort la souris du tube et on la pose sur une surfaceplane, où elle tourne sur elle-même pendant 10 à 12 secondes avant dereprendre un comportement normal. Ces chercheurs utilisent ce test pourrechercher l'action antivertigineuse éventuelle de nombreux produits.L'administration préalable (per os) de leucine et surtout de N-acétyl-DL-leucine (7452 R.P.) ou de son sel hydrosoluble de monoéthanolamine réduitnettement le temps de récupération [48]. Ce dernier produit, dont lasolubilité dans l'eau est élevée (>20 %), fournit des solutions aqueuses bienadaptées à l'administration parentérale (pH voisin de 6 pour une solution à10 %).

Le 7452 R.P. et le N-acétyl-DL-leucinate de monoéthanolamine, quifait l'objet d'un brevet [30], sont rapidement expérimentés à Paris dans lesservices de M. Aubry (Hôpital St.-Antoine) et de P. Pialoux (HôpitalHérold), où l'on obtient des résultats favorables, dans plusieurs types devertiges, résultats qui seront publiés en 1958 [13,23]. Le nom de Tanganilest retenu par les Laboratoires Specia qui obtiennent, en 1957, l'AMM 327225 9 pour le produit injectable et, en 1963, l'AMM 310 337 3 pour lescomprimés. Un brevet a été également déposé pour le sel de morpholine dela N-acétyl-DL-leucine [31], mais ce produit ne semble pas avoir fait l'objetd'essais thérapeutiques.

Chinellato, de la clinique oto-rhino-laryngologique de Padoue,rapporte en 1960 [14] son expérience sur 20 patients atteints de troublesvertigineux qui sont améliorés par l'administration de N-acétyl-DL-leucine(F.I. 5741, S.A. Farmitalia). Les publications de Baloh [2] et de Zee [82]confirment cette action favorable.

Recherches de pharmacologie clinique

Quelques années plus tard, en 1974, Oosterveld, au Département derecherches vestibulaires du Wilhelmina Gasthuis d'Amsterdam, réalise chezl'Homme (et aussi chez l'animal) des stimulations sinusoïdales délivrées parun fauteuil pendulaire ; il montre que l'administration d'acétyl-DL-leucinediminue significativement la durée du nystagmus ainsi induit [58].

Léger et des médecins du laboratoire de médecine aérospatiale duCentre d'essais en vol de Brétigny ont examiné, en 1985, chez desvolontaires sains l'effet de l'acétyl-DL-leucine, à dose thérapeutique, sur lescaractéristiques du réflexe vestibulo-oculaire per et post rotatoire [49-50].Ces chercheurs n'ont pas pu confirmer les résultats d'Oosterveld et,reconnaissant l'action anti-vertigineuse cliniquement bien établie duTanganil , pensent que les paramètres étudiés ne reflètent pas la totalité des

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interactions complexes survenant au sein du système vestibulaire : lamolécule expérimentée agirait plus au niveau central qu'à celui de lapériphérie.

Résultats thérapeutiques

Plusieurs publications médicales récentes confirment l'intérêt queprésente le Tanganil pour le traitement symptomatique des étatsvertigineux : ce produit, qui s'était montré très peu toxique chez l'animal(LD50 d'environ 8 g/kg chez la Souris [48]), est efficace et bien toléré chezl'Homme : après administration par voie orale de 1 g, la N-acétyl-DL-leucine apparaît dans le sang avec un retard d'environ 15 minutes ;l'absorption s'effectue avec une vitesse relativement lente (demi-vie de1,83 h) par rapport à l'élimination. L'injection intraveineuse d'un gramme dece médicament montre une cinétique bi-compartimentale : une phase dedistribution très rapide (demi-vie moyenne de 0,11 h) est suivie d'une phased'élimination rapide (demi-vie moyenne de 1,08 h) [57]. Le Tanganiln'entraîne que rarement quelques effets indésirables (gastralgies).

Freyss et al. [29] ont remarqué que la prescription précoce deTanganil permet plus facilement la mobilisation active des patients, basede leur rééducation.

Rascol et al., dans deux mémoires sur le traitement médicamenteuxdes vertiges [63-64], assignent une place particulière à la N-acétyl-DL-leucine et émettent l'hypothèse que le Tanganil pourrait agir commeprécurseur d'un neuromédiateur vraisemblablement peptidique, responsablede la dépolarisation de la fibre vestibulaire afférente.

Depuis 1991, les Laboratoires Pierre Fabre (*) gèrent la fabrication etla distribution du Tanganil . Le succès thérapeutique en France de cetantivertigineux est attesté par l'augmentation régulière de sa vente enpharmacie, qui dépasse légèrement celle de la betahistine, autre médicamentdes états vertigineux :

Année Unités (x 1000)------ -----------

• Tanganil 2000 2692,82001 2812,3

• Betahistine (Cerc ) 2000 1945,92001 1637,7

(*) Pierre Fabre médicament, La Chartreuse, 81106 Castres Cedex (les AMM de 1957 et de1963 ont été validées en 1992).

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Bien que les caractéristiques et les indications du Tanganil soientrappelées dans les ouvrages d'audience internationale que sont le MerckIndex [55], le manuel de Martindale [54] et l'ouvrage récent de Milne [55a],le produit reste peu connu (*) et peu utilisé à l'étranger [27]. La N-acétyl-DL-leucine [25] et même l'acide aminé non acétylé [22] pourraient êtreégalement prescrits dans le traitement de tremblements.

À la recherche du mécanisme d'action du Tanganil

Si l'intérêt thérapeutique du Tanganil est maintenant bien établi etque cette spécialité pharmaceutique rencontre un accueil favorable auprèsdes prescripteurs, le mécanisme d'action de la N-acétyl-DL-leucine reste peuconnu, notamment à l'échelle moléculaire. Le niveau de l'action duTanganil semble toutefois faire l'unanimité : action préférentielle auniveau central (tronc cérébral) plutôt qu'à la périphérie (labyrinthe) [60].

Sun, du département de physiologie et de biophysique de l'Universitéde Pékin, a montré en 1997 [69] qu'après une neurotomie vestibulaireunilatérale, l'administration journalière per os d'acétyl-DL-leucine (28mg/kg par jour) favorise chez le Chat la récupération de l'équilibrelocomoteur et que son action porte sur les neurones du noyau vestibulairelatéral.

La distribution tissulaire et la connaissance des sites cellulairescapables de fixer l'acétyl-DL-leucine après son introduction dansl'organisme par voie intraveineuse ou intramusculaire, ou encore par voiedigestive, représentent des questions majeures. Une première réponse estapportée par Bénard et al., du Laboratoire de radioéléments et d'étudesmétaboliques de l'École nationale vétérinaire de Toulouse [5]. Les auteursont injecté par voie intraveineuse une solution aqueuse d'acétyl-DL-leucine,marquée au

14C sur le carbone 2, à deux macaques (Macaca fascicularis).

Deux prélèvements de sang, effectués deux, puis cinq minutes aprèsl'injection, précèdent le sacrifice des animaux qui sont rapidement congeléset soumis à l'autoradiographie. La marque isotopique est présente dansl'ensemble du cortex pariétal, y compris dans l'aire 7 où se terminent lesnerfs vestibulo-corticaux ; on la trouve également dans les noyauxvestibulaires et dans les noyaux du thalamus. Au niveau de l'oreille interne,la concentration isotopique est faible, s'opposant ainsi à la concentrationintense des tissus voisins, concentration importante que l'on retrouveégalement au niveau des ventricules latéraux, du quatrième ventricule, dutractus uvéal, de la glande pinéale et de l'hypophyse. On peut penser que des

(*) Il n'est pas indiqué dans le "Dictionary of pharmacological agents" (Gamellin (C.R.) etTriffle (D.J.) ed., Londres : Chapman & Hall, 1997).

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essais supplémentaires, réalisés avec une quantité plus faible de l'acideaminé acétylé marqué, permettraient de mieux mettre en évidence laspécificité de la fixation.

Depuis plusieurs années, des études neurophysiologiques ont étémenées à Paris, à la demande de Pierre Fabre Médicament, dans leLaboratoire de Neurobiologie des Systèmes Sensorimoteurs. Cesrecherches, qui portent sur les neurones du noyau vestibulaire médian, ontdonné lieu à plusieurs notes préliminaires [71-72,75] et à un importantmémoire [73].

Les premières expériences, effectuées in vitro sur des tranches detissu nerveux provenant du tronc cérébral, ont montré que l'acétyl-DL-leucine agit directement sur les neurones vestibulaires centraux pour desconcentrations voisines de celles obtenues en clinique humaine au cours dutraitement de la crise vertigineuse par le Tanganil : bien que l'effet sur cesneurones reste modéré, l'acétyl-DL-leucine montre une action plusimportante sur les neurones placés dans des conditions anormales dedépolarisation ou d'hyperpolarisation. On peut donc penser que leTanganil tend à ramener les neurones vestibulaires centraux vers leurpotentiel de repos normal, voisin de 60 mV. Au cours d'un syndromevestibulaire aigu, l'acétyl-DL-leucine contribuerait à repolariser les neuronesvestibulaires du côté lésé tout en réduisant l'augmentation des décharges desneurones contra-latéraux.

Cette hypothèse a été testée par de nouvelles expériences au coursdesquelles la perfusion d'acétyl-DL-leucine a été réalisée sur despréparations de cerveau entier isolé, provenant de cobayeshémilabyrinthectomisés qui présentent donc une importante asymétrievestibulaire. L'acétyl-DL-leucine réduit significativement cette asymétriesans modifier les paramètres restés symétriques. De plus, l'action plusimportante du Tanganil sur les neurones placés en condition extrêmed'hyper-polarisation est confirmée par des enregistrements intracellulaires.

Par ailleurs, la société Nova Screen a effectué en 1997 uneévaluation de l'affinité de l'acétyl-DL-leucine pour certains sites de liaisonspécifique de neurotransmetteurs largement présents dans les neurones desnoyaux vestibulaires : récepteurs glycinergiques sensibles à la strychnine etrécepteurs glutamatergiques activés par l'acide 1-aminocyclopropane-trans-1,3-dicarboxylique. Les résultats suggèrent que l'acétyl-DL-leucine pourraitêtre un agoniste partiel de ces deux types de récepteurs ; leur co-activationsur un même neurone pourrait expliquer pourquoi les effets de l'acétyl-DL-leucine seraient fonction du potentiel de membrane des neuronesvestibulaires considérés et seraient plus importants sur les cellulesanormalement dépolarisées ou hyperpolarisées.

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N-ACÉTYL-DL-LEUCINEET PHOSPHOLIPIDES MEMBRANAIRES

Le biochimiste qui examine la formule développée de la N-acétyl-leucine ne peut qu'être frappé par le caractère amphiphile de cette molécule,qui présente deux parties très différentes sur le plan physico-chimique :

• à une extrémité, une tête hydrophile, où la charge négative dugroupement carboxylique ionisé attire les dipoles que constituent lesmolécules d'eau tandis que, par ailleurs, ces molécules d'eau, grâce à laformation de liaisons hydrogène avec les atomes d'azote et d'oxygène,hydratent le groupement amide -NH-CO- ;

• à l'extrémité opposée, l'enchaînement isobutanique représente unerégion totalement hydrophobe.

Nous avons signalé plus haut que la caractérisation de la N-acétyl-leucine en chromatographie de partage repose sur ce caractère amphiphile,partagé également par la leucine non substituée. La N-acétyl-leucine, bienque de structure chimique très différente, ressemble donc, sur le planphysico-chimique, à la molécule d'un savon alcalin, dont on connaîtl'affinité pour les constituants lipidiques des membranes biologiques.

Ces considérations conduisent à proposer une hypothèse sur lemécanisme d'action du Tanganil , hypothèse directement liée aux résultatsexpérimentaux de l'équipe de Vidal. L'action "régulatrice" de la N-acétyl-leucine, qui repolarise les neurones de potentiel abaissé et réduitl'augmentation de décharge des neurones hyperpolarisés, pourrait certess'expliquer par une action du Tanganil sur deux systèmes deneurotransmetteurs à action opposée ; on peut aussi penser que laperturbation de ces systèmes, qui conduit à la crise vertigineuse, pourraitprovenir de modifications membranaires localisées aux emplacements oùces systèmes sont enchassés. La N-acétyl-leucine, en se fixant sur lesphospholipides de ces membranes, corrigerait ces modifications. L'action duTanganil serait comparable à celle du cholestérol, dont la concentrationdans les membranes biologiques apparaît un facteur de stabilisation de lafluidité : ce stérol augmente la rigidité des membranes fluides, riches enacides gras désaturés, tandis qu'il fluidifie les membranes riches enphospholipides plus saturés.

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Avant d'entreprendre des recherches sur les membranes neuronaleselles-mêmes, nous avons réalisé quelques essais préliminaires destinés àmettre en évidence une fixation éventuelle de la N-acétyl-DL-leucine surdes lames monomoléculaires de phospholipides du type de ceux présentsdans les membranes biologiques.

Technique d'étude

C'est à Bordeaux qu'Henri Devaux, voici presque un siècle, a montréque des substances amphiphiles, déposées à l'interface eau / air, pouvaientformer des couches minces [19] dont la limite d'étalement est une lamemonomoléculaire [20]. Ces recherches ont été par la suite considérablementdéveloppées par Langmuir.

Nous avons utilisé dans nos expériences la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC), molécule zwitterionique, et le1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol (DPPG), dont le seulgroupement ionisé est anionique. Les étalements ont été réalisés avecl'appareillage classique mis au point par Langmuir, cuve munie de barrièresmobiles et capteur de pression superficielle [18,32].

La DPPC, en solution très diluée dans un solvant volatil(chloroforme), est déposée à la surface d'une phase aqueuse dans laquellel'acide aminé acétylé est dissous à une concentration variable selon lesexpériences. Les molécules de DPPC, qui ne développent que peud'interactions entre elles, sont d'abord très distantes les unes des autres(Fig. 1a) : c'est la phase appelée phase "gaz". En diminuant la surfacecomprise entre les barrières, les molécules se rapprochent, donnant unephase "liquide expansé", puis une phase "liquide condensé" (Fig. 1b), quicorrespond à un minimum de l'aire moyenne allouée à chaque molécule.Une compression supplémentaire entraîne l'expulsion de molécules hors dela monocouche et la perte du caractère purement bi-dimensionnel de laphase.

L'enregistrement de l'aire moléculaire (Å2/mol) en fonction de la

pression de surface (isotherme de compression) est effectué sur l'eau pure etsur différentes solutions aqueuses du produit dont on veut étudier lapénétration dans la monocouche lipidique bidimensionnelle [76].

Résultats

À la concentration de 10-4 M, les trois N-acétyl-leucines nemanifestent aucune interaction avec le DPPC : les isothermes decompression sont les mêmes que ceux obtenus sur l'eau pure (Fig. 2).

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Fig. 1 : Formation du film de Langmuir

(a) Début de l'épandage : phase "gaz"(b) Compression de la couche : phase "liquide condensé".

Fig. 2 : Isothermes de compression de la DPPC

sur eau pure (a) ou sur une solution aqueuse 10-4 Mde N-acétyl-DL-leucine (b), de N-acétyl-L-leucine (c),

ou de N-acétyl-D-leucine (d).

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Des expériences effectuées avec des concentrations en N-acétyl-leucines plus élevées (10

-3, 10-2 et 5.10

-2 M) se sont également montrées

négatives, comme celles effectuées avec la DL-leucine (non acétylée), ainsiqu'avec les trois N-acétyl-valines, DL-, L- et D-.

Dans un autre type d'expériences, on injecte une solution concentréede N-acétyl-DL-leucine sous une monocouche de DPPC préalablementcomprimée sur une sous-phase d'eau pure et maintenue à une aireconstante : nous n'avons constaté aucune variation notable de la pression desurface. Le remplacement de la DPPC par le DPPG, comme leremplacement des acétyl-leucines par les acétyl-valines conduit également àdes résultats négatifs.

Les dérivés N-acétylés de la leucine – et la leucine elle-même – sontdonc incapables de s'intercaler dans les couches monomoléculaires desphospholipides étudiés. Il semble donc que dans ces composés amphiphiles,le caractère hydrophile de la tête polaire l'emporte sur l'hydrophobie de lacourte chaîne isobutylique. Remarquons que les solutions aqueuses de cesdifférents produits ne moussent d'ailleurs pas lorsqu'elles sont soumises àune agitation.

Une dernière série d'expériences confirment nos résultats. Grâce à latechnique de Langmuir-Blodgett [32], il est aisé de transférer un filmmonomoléculaire comprimé sur un support solide hydrophile (Fig. 3), enparticulier sur une lame de fluorine, qui permet une étudespectrophotométrique ultérieure.

Fig. 3 : Transfert d'une couche monomoléculaire

(a) L'émersion du support entraîne une première couche monomoléculaire(b) Formation d'une bi-couche par nouvelle immersion du support

(c) Émersion de la bi-couche hydrophile.

29

La Figure 4 montre que les spectres infra-rouge du filmphospholipidique sont identiques, quelle que soit la sous-phase aqueuse, eaupure ou solution d'acide aminé : l'acide aminé, N-acétylé ou non, est doncincapable de se lier au film lipidique.

Fig. 4 : Spectres infra-rouge de couches de DPPC transférées(a) À partir d'eau pure(b) À partir d'une solution aqueuse de N-acétyl-DL-leucine (10

-2 M)(c) Spectre infra-rouge de la N-acétyl-DL-leucine.

Cristallisation de la N-acétyl-DL-leucine en présence de DPPC

Les travaux récents de Brisson et al. [11] sur la cristallisation deprotéines sous une monocouche de lipides nous ont conduit à les étendre à laN-acétyl-DL-leucine. La Figure 5 représente des images de cristallites deN-acétyl-DL-leucine en microscopie électronique de transmission ; les uns(a) ont été prélevés sous une monocouche de DPPC, les autres (b) sontobtenus par simple évaporation d'une solution aqueuse concentrée de l'acideaminé acétylé.

Les premiers apparaissent en majorité formés d'aiguilles, tandis queles seconds présentent une forme plus globuleuse. Ces différences dans lacristallisation sont le témoin d'une certaine "épitaxie", qui traduit unminimum d'interactions entre les deux entités. La spécificité de cesinteractions est faible, puisque la N-acétyl-DL-valine (Fig. 5c et 5d) etmême la DL-leucine, étudiées dans les mêmes conditions, nous ont montrédes images très comparables.

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Fig. 5 : Cristallisation de la N-acétyl-DL-leucine (a) et de la N-acétyl-DL-valine (c) sous une couche de DPPC comprimée à 30 mN/m à partir d’une

sous-couche aqueuse (5.10-2 M) et de ces mêmes composés (b et d) par

simple évaporation de la solution aqueuse (5.10-2 M).

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Si le site d'action de la N-acétyl-DL-leucine a pu être précisé, lemode d'action du médicament à l'échelle moléculaire demeure toujoursinconnu. Nos travaux n'ont pu mettre en évidence une pénétration de cetamino-acide acétylé dans les monocouches phospholipidiques, maisseulement une faible interaction se limitant à une orientation épitaxique deses cristallites. On peut espérer que de nouvelles recherches apporteront uneréponse aux importantes questions suivantes :

• Quel rôle assigner à l'acétylation dans l'action du Tanganil ? Ceprocessus transforme un acide aminé en un N-acétylamino-acide etremplace une structure zwitterionique par une molécule anionique : ilfavorise ainsi le franchissement de la barrière hémo-méningée et l'entréedans la cellule neuronale. On ignore cependant encore si la N-acétyl-DL-

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leucine constitue une simple forme de transport qui libérerait, sur le site oùse réalise l'action antivertigineuse, l'acide aminé qui serait alors la véritablemolécule pharmacologiquement active. On a pu montrer, en effet,l'existence dans de nombreux tissus d'acylases susceptibles d'hydrolyser lesN-acétylamino-acides [9,28,44,61].

• Y a-t-il des différences dans les propriétés antivertigineuses entreles dérivés L, D ou DL des N-acétyl-leucines ou encore des leucines nonsubstituées ? D'autres produits (*), apparentés au Tanganil , mériteraientd'être inclus dans des études sur les relations structure / activité.

• L'action de la N-acétyl-DL-leucine, dont on connaît l'affinité pourcertains d'ions métalliques, implique-t-elle la participation des ions sodiumou cuivre ?

• Le Tanganil , en raison de la sensibilité de son carbone γ, peut-ilagir comme protecteur vis-à-vis des radicaux libres ?

Remerciements : nous remercions les Laboratoires "Pierre FabreMédicament" pour leur soutien dans la réalisation des travauxexpérimentaux et la parution de cet article. Nos remerciements vontégalement à Mme B. Agricole : nous avons bénéficié de sa pratique expertedans le domaine des couches monomoléculaires.

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(*) En particulier la N-méthyl-leucine ainsi que les produits suivants et leur dérivéN-acétylé, dans les séries L, D et DL : ester méthylique (ou éthylique) de la leucine ;leucinamide; leucinol ; isoleucine ; allo-isoleucine; norleucine ; valine ; tert-leucine,[α-tert-butyl-glycine] ; γ−méthyl-leucine, [α-néopentyl-glycine]. De nombreuxreprésentants de cette liste sont disponibles commercialement.

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ABSTRACT

N-Acetyl-DL-LeucineA symptomatic medication of vertigo

The beneficial influence of N-acetyl-DL-leucine on the experimentalvertigo induced in mice has been shown in 1957. This product issuccessfully used since in humans as a symptomatic medication of dizzinessand vertigo.

We first present a review of the major papers devoted to thechemistry and therapeutic use of this acetylated derivative of a naturalamino acid ; the researches undertaken to explain its action are alsoanalysed. A report is finally given of our investigations on a possibleinteraction between N-acetyl-DL-leucine and some phospholipids present inbiological membranes.

Key-words: N-Acetyl-DL-leucine, phosholipid monolayers, vertigo.

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