mémoire de fin d'étude master bbm

RRééppuubbll ii

MMiinniissttèèrree ddee ll ’’ EEnn

FFaaccuull ttéé ddeess SScciiee

En vue de l’obtention du diplôme de Master en

Option

Devant le Jury :

M. AGOUNI M.

M. BOUBENDIR A.

M. me FERROUDJ S.

Le Profil De Résistance Aux Le Profil De Résistance Aux Le Profil De Résistance Aux Le Profil De Résistance Aux

ΒΒΒΒ----lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De

PPPPseudomonas seudomonas seudomonas seudomonas

Année universitaire

iiqquuee AAllggéérr iieennnnee DDéémmooccrraattiiqquuee eett PPooppuullaaii rree

nnsseeiiggnneemmeenntt SSuuppéérr iieeuurr eett ddee llaa RReecchheerrcchhee SScc

UUnniivveerrssii ttéé MMoohhaammeedd kkhhiiddeerr--BBiisskkrraa

eenncceess EExxaacctteess eett ddeess SScciieenncceess ddee llaa NNaattuurree eett

Mémoire

En vue de l’obtention du diplôme de Master en

Option : Biochimie et biologie moléculaire

Thème:

Maitre assistante U.M.K Biskra

BOUBENDIR A. Maitre assistant U.M.K Biskra Examinateur

Maitre assistant U.M.K Biskra Promoteur


lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De

seudomonas seudomonas seudomonas seudomonas aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine

HospitalièreHospitalièreHospitalièreHospitalière

Année universitaire : 2010/2011

cciieennttii ffiiqquuee

ddee llaa VViiee

En vue de l’obtention du diplôme de Master en Biologie

: Biochimie et biologie moléculaire

Réalisé par :

Barir ouafaBarir ouafaBarir ouafaBarir ouafa

Ghilani MalikaGhilani MalikaGhilani MalikaGhilani Malika

Maitre assistante U.M.K Biskra Président

Maitre assistant U.M.K Biskra Examinateur

Maitre assistant U.M.K Biskra Promoteur


lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De lactamines Des Souches De

aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine aeruginosa D’origine

Remerciements

Louange à Dieu le tout puissant pour ce qu’Il nous a donné comme volonté, santé

et surtout patience pour pouvoir achever ce modeste travail.

Tout d’abord, nos profonds remerciements vont à nos chers parents qui sacrifient

leur vie pour rendre la notre heureuse.

Ensuite, je tiens à remercier particulièrement Madame Ferroudj SanaFerroudj SanaFerroudj SanaFerroudj Sana, notre encadreure,

pour avoir accepté de diriger ce travail et nous avoir prodigué conseils et encouragement

chaque fois que cela s'est avéré nécessaire.

Par ailleurs, nous remercions les docteurs, , , , TilichinTilichinTilichinTilichineeee AichaAichaAichaAicha, Zid SalihaZid SalihaZid SalihaZid Saliha,pour leurs

aides, leurs précieux conseils et encouragements.

Enfin, je tiens à exprimer mes remerciements infinis aux membres de jury de leurs

remarques précieuses.

Table Des Matières

Liste des abréviations …………………………………………………………………..... i

Liste des figures …………………………………………………………………………. iv

Liste des tableaux ………………………………………………………………………... v

Liste des photos…………………………………………………………………………... vi

Introduction ……………………………………………………………………………… 1

PREMIERE PARTIE : Etude bibliographique

CHAPITRE I : Pseudomonas aeruginosa

1. morphologie et structure……………………………………………………………….. 4

2. Caractères culturaux…………………………………………………………………… 5

3. Caractères biochimiques……………………………………………………………….. 6

3.1. Métabolisme………………………………………………………………………….. 6

3.2. Production de pigments……………………………………………………………… 6

4. Caractères génomiques………………………………………………………………… 6

5. Lysotypie………………………………………………………………………………. 7

6. Facteurs de virulence ………………………………………………………………….. 7

6. 1.Facteurs de virulence de surface…………………………………………………....... 8

6.2. Facteurs de virulence secrétés………………………………………………………... 9

6.3. Facteurs de virulence secrétés via le système de sécrétion de type III……………... 11

7. Pouvoir pathogène……………………………………………………………………...

13

CHAPITRE II : Les β-lactamines

1. Les β-lactamines……………………………………………………………………...... 16

2. Classification…………………………………………………………………………... 16

2.1. Les pénames ou pénicillines…………………………………………………………. 16

2.2. Les céphemes ou céphalosporines…………………………………………………… 18

2.3. Les pénèmes ou carbapénémes……………………………………………………… 21

2.4. Monobactame………………………………………………………………………… 22

2.5. Les inhibiteurs des bêtalactamases………………………………………………….. 23

5. Mécanisme d’action des β-lactamines…………………………………………………. 24

5.1. Pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane…….. 26

5.2. Traversée de l’espace périplasmique……………………………………………….... 27

5.3. Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline……………………...... 28

5.4. Lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines………………………………………. 28

CHAPITRE III : Résistance de Pseudomonas aeruginosa aux β-lactamines

1. L’antibiorésistance……………………………………………………………………... 30

2. Différents types de la résistance bactérienne…………………………………………... 30

2.1. Résistance naturelle………………………………………………………………...... 30

2.2. Résistance acquise……..……………………………………………………………. 30

3. Origine génétique de la résistance acquise…………………………………………...... 31

3.1. La résistance chromosomique………………………………………………………... 31

3.2. La résistance extra-chromosomique…………………………………………………. 31

5. Différents mécanismes de résistance de P.aeruginosa aux β-lactamines……………… 32

5.1. Mécanismes enzymatiques…………………………………………………………... 33

5.1.1. β-lactamases de la classe A………………………………………………………… 36

5.1.2. β-lactamases de la Classe B : métallo-β-lactamases (MBL)………………………. 36

5.1.3. β-lactamases de la a classe C (AmpC)……………………………………………... 36

5.1.4. β-lactamases de la classe D (Oxacillinase)………………………………………... 38

5.1.5. β-lactamases à spectre élargi ou étendu (BLSE)…………………………………... 38

5.2. Mécanismes non enzymatiques……………………………………………………. 39

5.2.1. Le système d’efflux actif………………………………………………………… 39

5.2.2. Diminution de la perméabilité……………………………………………………. 41

5.2.3. Modification de la cible « protéine de liaison à la pénicilline » (PLP)…………..

41

DEUXIEME PARTIE : Partie pratique

I. Matériels et méthodes…………………………………………………………………... 44

1. Matériels biologie……………………………………………………………………… 44

2. Réactif et petit matériel………………………………………………………………… 44

3. Méthodes……………………………………………………………………………….. 44

3.1. Isolement……………………………………………………………………………... 44

3.2. Identification…………………………………………………………………………. 45

3.2.1. Identification microscopique………………………………………………………. 45

3.2.2. Identification biochimique…………………………………………………………. 46

3.3. Culture……………………………………………………………………………...... 47

3.4. Antibiogramme………………………………………………………………………. 47

3.4.1. Réalisation d’une suspension………………………………………………………. 48

3.4.2. Ensemencement……………………………………………………………………. 48

3.4.3. L’application des disques…………………………………………………………... 49

3.4.4. Incubation et lecture ……………………………………………………………….. 51

II. Résultats et discussion……………………………………………………………….. 52

1. Isolement……………………………………………………………………………….. 52

2. Identification…………………………………………………………………………… 53

3. Antibiogramme………………………………………………………………………… 54

Conclusion

Références bibliographique

Annexe

i

Liste des abréviationsListe des abréviationsListe des abréviationsListe des abréviations

- : négatif.

+ : positif.

µm : micro mètre.

ABC : La famille ABC transporteur.

ACT: AmpC type.

Agl : aminoglycosides.

Atm : aztréonam.

ATB : antibiotique.

Azl : azlocilline.

BIL: le prénom de premier patient, découvre chez lui « Bilal ».

BMR : Bactérie multirésistance.

BLSE : β-lactamases à spectre étendu.

C1G : Céphalosporine de première génération

CARB : Active sur carbénicilline.

Carb : carbénicilline.

CMI : concentrations minimales inhibitrices

CMY: Active sur cephamycins.

Cpm : cefepime.

Cpr : cefpirome.

CTX-M: Active sur cefotaxime le premier isolés en Munich.

Czid : ceftazidime.

ii

EDTA : acide éthylène diamine tétracétrique.

EF : facteurs d’élongation.

FOX: Active sur céfoxitine.

Fq : fluoroquinolone.

G+C : Guanine + Cytosine.

GIM : German imipenemase.

I : intermédiaire.

Imi : imipénème.

IMP : Active sur imipénème.

LPS : lipoplysaccharide.

MATE : expulsion de multidrugue et de composés toxique.

MBL : Métallo-β-lactamase.

MDR : multidrug resistance.

Mero : méropénème.

Mex : multiple efflux.

MFR : membrane fusion protein.

MIR: Hôpital de Miriam

MOX: Active sur moxalactam.

NAG: N-acétyglycosamine

NAM : N-acide acétylmuramique

Nmc : Not metalloenzyme carbapenemase.

Opr : outre membrane protein.

OXA : Active sur oxacilline.

iii

P.aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa.

PER: Pseudomonas extended resistant

Pip : pipéracilline.

PL : phospholipides.

PLP : ou protéine liant la pénicilline.

Pm : polymyxines.

R : résistante.

RND : résistance-nodulaire-division cellulaire.

S : sensible.

SHV : Sulfhydryl reagent variable.

SHV : Sulfhydryl reagent variable.

SMR : résistance multiple des staphylocoques.

SPM : Sao Paulo métallo-β-lactamase.

TEM : Temoneira.

Tic : ticarcilline.

UDP-NAG : uridine diphosphate-N-acétyglycosamine

UDP-NAM : uridine diphosphate-acide acétylmuramique.

VEB : Vietnam extended-spectrum β-lactamase.

VIM : Verona integron-encoded métallo-β-lactamase.

Zn: Zinc.

iv

Liste des figuresListe des figuresListe des figuresListe des figures

Fig .1 : P. aeruginosa en microscope électrique………………………………………. 05

Fig.2: génome de Pseudomonas aeruginosa AP01…………………………………….... 07

Fig.3 : Facteurs de virulence de surface cellulaire de P.aeruginosa…………………….. 08

Fig.4 : Facteurs de virulence secrétée de P.aeruginosa………………………………… 10

Fig. 5 : Schéma représentant l’organisation du système de sécrétion de type III chez

P.aeruginosa………………………………………………………………………………

12

Fig. 6 : noyau de béta- lactame…………………………………………………………... 16

Fig. 7 : les pénicillines…………………………….......................................................... 17

Fig.8 : Les céphalosporines…….………………………………………………………… 19

Fig.9 : structure chimique de carbapénèmes……………………………………………... 22

Fig.10: la structure d’arztréome………………………………………………………….. 23

Fig.11 : Les inhibiteurs de bêtalactamases ……………………………………………..... 24

Fig.12: Mode d’action des antibiotiques inhibant la synthèse de la paroi……………….. 25

Fig.13 : Enveloppe d’une bactérie à Gram négative……………………………………... 26

Fig. 14 : Mécanisme d'action de β-lactamine (pénicilline)………………………………. 28

Fig.15 : Représentation schématique des principaux mécanismes de résistance aux β-

lactamines chez bactérie à Gram négative……………………………………………….. 33

Fig.16 : hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase…………………………..... 34

Fig. 17 : Induction de l'expression ampC par β-lactamine…............................................ 37

Fig.18: Dérépression associés à AmpD- …………........................................................... 38

Fig.19: Structure et fonction de pompes d’efflux RND chez P. aeruginosa…………...... 40

v

Liste des tableauxListe des tableauxListe des tableauxListe des tableaux

Tableau 01: Taxonomie de P. aeruginosa.............................................................................. 4

Tableau 02 : Principales pathologies causées par P. aeruginosa et classées selon le site

d’infection …………………………………………………………………………………. 14

Tableau 03 : Classification selon Ambler des principales β-lactamases …………….. 35

Tableau 04: La résistance aux antibiotiques due de mutations dans les gènes régulatrices

des systèmes d’efflux chez P.aeruginosa……………………………………………………. 41

Tableau 05 : les petits matériels et les réactifs utilisés…………………………………. 44

Tableau 06 : Profil de résistance aux β-lactamines de 12 souches de P. aeruginosa………. 55

vi

Liste des photosListe des photosListe des photosListe des photos

Photo 1: Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne…………………………….. 29

Photo 2: Isolement par la méthode de stries…………………………………………… 45

Photo 3 : l’ensemencement des strié à surface des milieux King A et B ……………… 47

Photo 4 : la préparation d’une suspension de l’antibiogramme……………………….. 48

Photo 5 :préparation de l’antibiogramme……………………………………………. 49

Photo 6: le dépôt des disques d’antibiotique sur le Muller-Hinton……………………. 50

Photo 7 : Position de disque……………………………………………………………. 50

Photo 8 : La lecture de l’antibiogramme à l’aide d’un pied de coulisse ………………. 51

Photo 9 : l’aspect des colonies de P.aeruginosa dans une boite de pétrie…………….. 52

Photo 10 : test catalase ……………………………………………………….……….. 53

Photo 11 : test oxydase………………………………………………………………… 53

Photo 12: la mise en évidence des pigments dans le King A et B……………………… 54

Photo 13: Les zones d’inhibition des antibiotiques testés……………………………… 55

Photo 14 : profils de BLSE « bouchon de champagne » ………………………………. 56

Photo 15 : profils de résistance à haut niveau …………………………………………. 56

IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction

IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction

Le phénomène de résistance aux antibiotiques est connu depuis l'utilisation de ces

molécules. Cette résistance concernait essentiellement le milieu hospitalier et certains germes.

Mais on assiste à l'heure actuelle à une dissémination des bactéries résistantes voire

multirésistantes et à l'apparition de résistance chez des bactéries connues jusqu'alors pour leur

sensibilité aux antibiotiques. De plus, de nouveaux mécanismes de résistance sont

actuellement décrits comme les protéines d’efflux, la résistance aux glycopeptides des

staphylocoques, les céphalosporinases plasmidiques…

L'accroissement du nombre des infections provoquées par des bactéries multirésistantes

et l'acquisition de nouveaux mécanismes de résistances par les bactéries posent un problème

de plus en plus préoccupant dans nos hôpitaux. En effet, les infections nosocomiales ont une

incidence sur le coût des soins, en allongeant la durée de séjour et en augmentant le coût du

traitement.

P. aeruginosa est un germe d'origine environnementale présentant des profils de multirésistance

souvent accusés et dont l'implication croissante dans les infections nosocomiales exige

la connaissance de leur sensibilité aux antibiotiques.

Les β-lactamines représentent la principale famille d'antibiotiques utilisée pour le traitement

des infections sévères à Pseudomonas aeruginosa. Du fait de résistances naturelles et acquises

nombreuses le choix de la β-lactamine à utiliser en thérapeutique est restreint et doit être

guidé par l'antibiogramme.

Notre travail réalisé dans le cadre de la préparation du mémoire de Master repose sur

l’étude de certains profils de résistance acquise des souches de Pseudomonas aeruginosa

isolées à partir de l’hôpital HAKIM SAADANE et ceci par la réalisation d'un antibiogramme

spécifique.

Etude Etude Etude Etude

BibliographiqueBibliographiqueBibliographiqueBibliographique

Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1 :

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Etude bibliographique Chapitre I

4

P. aeruginosa, autrement connus sous le nom de bacille pyocyanique, est une

bactérie versatile et ubiquitaire dans l’environnement. Elle est communément trouvée dans le

sol et d’eau (eaux douces et marines) et sur les surfaces en contact avec ces milieux.

Etymologiquement, le mot issu du grec pseudo (= simili ou imitation) et monas (= unité)

désignait les « germes » du début de la microbiologie. Le mot aeruginosa, qui signifie vert-de-

gris en latin, fait référence au pigment contenu par la bactérie, qui donne à la colonie sa

couleur caractéristique. P.aeruginosa est l’espèce type du groupe Pseudomonas, également

composé de 12 autre membres (Yétérian, 2010). Sa taxonomie est présentée dans le tableau 1

Tableau (1) : Taxonomie de P. aeruginosa (Benabid, 2009).

Règne Bacteria

Embranchement Prokaryota

Division Proteobacteria

Classe Gammaproteobacteria

Ordre Pseudomonadales

Famille Pseudomonadaceae

Genre Pseudomonas

Espèce aeruginosa

1. Morphologie et structure

P. aeruginosa, un bacille Gram-négatif en forme de bâtonnet, de 0,5 à 0,8µm de

diamètre sur 1 à 3µm de long, mobile grâce à un flagelle polaire généralement unique (Fig.1),

dépourvu de spores et de capsules (Hafiane et Ravaoarinoro, 2008).

La paroi du bacille pyocyanique est caractéristique de celle des bactéries à Gram

négatif (Sadoff et Artenstein, 1974). Elle est constituée d’une membrane externe et d’un

espace périplasmique et du peptidoglycane. La membrane externe est une bicouche

asymétrique constituée du lipopolysaccharide (LPS) et de phospholipides (PL) où se trouvent

de nombreuses protéines telle que les porines qui assurent la diffusion de divers types de

molécules à travers la membrane externe (Pagés, 2004). Chez le P. aeruginosa on distingue

plusieurs types de porines OprD (D1 et D2), OprE (E1 et E2), OprH (H1 et H2), OprG et

OprF qui présente la majorité de porines non spécifique dans cette organisme (Nikaido et al.,

1991).


5

Fig.1 : P. aeruginosa en microscope électronique (Carip, 2008).

La membrane de P.aeruginosa est aussi caractérisé par l’existante de nombreuses pompes

d’efflux tel que MexA–MexB–OprM, MexC–MexD–OprJ, qui jouent un rôle important dans

l’injection des agents antimicrobiens (Xavier et al., 2010).

2. Caractères culturaux

Le bacille pyocyanique est une bactérie à des besoins très limités, croissant sur des

milieux synthétiques simples. Elle pousse facilement en 24 heures à 37 °C. Elle peut croître

entre 5 et 42°C avec un optimum de 30 °C. Par contre, elle supporte de moindres variations de

pH (6,5 à 7,5) avec un pH optimal de 7,2. P.aeruginosa est une bactérie aérobie stricte mais

capable d’utiliser les nitrates en condition anaérobies (Souley lie, 2002). P.aeruginosa est

caractérisé par une odeur florale (Flandrois, 1997). Un milieu sélectif à base cétrimide

(ammonium quaternaire) permet la recherche et l’isolement de P.aeruginosa à partir de

produit biologiques (selles, urines, pus, liquide céphalo-rachidien…) en bactériologie

médicale (Delarras, 2007).

Selon Denis (2007) trois types de colonies peuvent être observés simultanément ou de

manière isolée sur milieux solides :

• Colonies larges « la » de 2 à 3 mm de diamètre, à bord irrégulier, rugueuses une partie

centrale bombée présentant des reflets métallique.

• Colonie plus petites lisses « S » bombées à bord régulier.

• Colonies muqueuses « M » bombées, coalescentes, filantes rencontrées chez les

souches produisant un slime composé d’un polymère d’alginate.


6

3. Caractères biochimiques

3.1. Métabolisme

Pseudomonas aeruginosa possède :

-une oxydase

- une nitrate - réductase (réduction des nitrates pouvant aller jusqu' au stade de N gazeux)

- un métabolisme oxydatif des sucres, appréciable sur milieu MEVAG (Milieu pour l' Étude

de la Voie d' Attaque des Glucides)

- une arginine - dihydrolase

- une lécithinase (qui ne peut être révélée qu'en milieu liquide)

3.2. Production de pigments

D’après (Delarras, 2007) le P.aeruginosa produit deux types de pigments (fluorescent

ou non) qui servent à son identification, ils peuvent être mis en évidence dans le milieu de

King B et King A

Pyoverdine : pigment jaune-vert fluorescent, soluble dans l’eau, insoluble dans le

chloroforme.

Pyocyanine (phénazinique) : pigment bleu-vert non fluorescence soluble dans l’eau et le

chloroforme, cette espèce est la seule à le produire.

4. Caractères génomiques

Le génome de la souche PA01 de P.aeruginosa a été complètement séquencé en 2000

(fig.3), il est plus grand génome bactérien qui comprend 6,3 millions de paires de bases. Ce

génome contenant 5570 gènes, la plupart sont riches en Guanine et Cytosine (G+C) (66,6%),

seuls 6.7 % de ses gènes ont une fonction bien connue. Le pourcentage de séquences

régulatrices est plus important dans le génome entier de P.aeruginosa (8,4%) (Stover et al.,

2000). Le chromosome de P. aeruginosa code notamment pour la plupart des facteurs de

pathogénicité de cette bactérie, environ 200 à 300 gènes ce qui représente 5% du génome

(Kohler et Delden, 2009).

Le bacille pyocyanique contient plusieurs plasmides donnant différents caractères

phénotypiques (résistance aux antiseptiques, aux antibiotique, modification du taux de

croissance, acquisition d’activités catabolique sur certains substrats) ceux-ci peut compliquer

la reconnaissance de cette espèce (Flandrois, 1997).


7

Fig.2: génome de Pseudomonas aeruginosa AP01 (Stover et al., 2000).

5. Lysotypie

Pseudomonas aeruginosa est très facilement lysé par des bactériophages et la sensibilité

des souches à l'effet lytique d'une batterie de ces phages permet de distinguer des lysotypes.

Elle est employée pour classer les différentes variétés de P.aeruginosa dans les laboratoires

spécialisés (Souley lie, 2002).

6. Facteurs de virulence de surface

P.aeruginosa est invasif et toxigene, en raison de la production de facteurs de

virulence de surface (qui lui permettent de s’attacher, de coloniser, et d’envahir les tissus), et

secrétés (qui endommagent les tissus et déclenchent des processus inflammatoires). Il est

souvent difficile de distinguer entre colonisation et invasion pathogène en l’absence d’outil

diagnostic adéquat. (Mesaros et al., 2007).

Etude bibliographique

6.1. Facteurs de virulence de surface

Les facteurs de virulence de surface incluent le flagelle, le pili, le LPS et l’alginate

� Flagelle

Unique et polaire chez

2007). Son rôle dans le pouvoir pathogène est attesté par le fait que les souches non flagellées

sont beaucoup moins virulentes. Le flagelle participe également aux phénomènes d’adhésion

aux cellules épithéliales (Fledman et

� Pili de type IV

P. aeruginosa exprime un nombre limité de pili polaires. Le pilus est une petite structure

filamenteuse d’environ 6 nm de diamètre constituée d’empilements de monomères de la

protéine appelée piline. Les pili

impliqués dans la motilité bactérienne

permettent à P. aeruginosa d’envahir les surfaces hydratées et de coloniser rapidement les

voies respiratoires. (Benabid, 2009)

Fig.3 : Facteurs de virulence de surface cellulaire de

8

Facteurs de virulence de surface

Les facteurs de virulence de surface incluent le flagelle, le pili, le LPS et l’alginate

Unique et polaire chez P. aeruginosa, le flagelle lui confère sa mobilité (Fox et

Son rôle dans le pouvoir pathogène est attesté par le fait que les souches non flagellées


(Fledman et al., 1998).

exprime un nombre limité de pili polaires. Le pilus est une petite structure


Les pili de P. aeruginosa sont parmi les rares pili procaryotes

impliqués dans la motilité bactérienne. Les pili de type IV, par leurs propriétés rétractiles,

d’envahir les surfaces hydratées et de coloniser rapidement les

(Benabid, 2009)

Facteurs de virulence de surface cellulaire de P.aeruginosa (Kipnis et

Chapitre I

Les facteurs de virulence de surface incluent le flagelle, le pili, le LPS et l’alginate (fig. 3).

mobilité (Fox et al.,

Son rôle dans le pouvoir pathogène est attesté par le fait que les souches non flagellées


exprime un nombre limité de pili polaires. Le pilus est une petite structure


rares pili procaryotes

Les pili de type IV, par leurs propriétés rétractiles,

d’envahir les surfaces hydratées et de coloniser rapidement les

Kipnis et al., 2006).


9

� Lipopolysaccharide (LPS)

Le LPS, localisé dans la membrane externe des bactéries à Gram négatif, est d'une part

connu pour son rôle protecteur contre la lyse provoquée par le sérum et d'autre part pour son

activité endotoxique. Il est également impliqué dans la stimulation de la réponse

inflammatoire et dans les interactions avec les tissus hôtes. l'endotoxine est responsable d'une

stimulation excessive du système immunitaire pouvant provoquer un choc septique et

conduire à la mort (Bricha et al., 2009).

� Alginate

L'alginate est un exopolysaccharide mucoïde composé de polymères de l’acide

mannuronique associé avec l'acide glucuronique. P.aeruginosa produit l’alginate pour adapter

dans certaines situations environnementales inappropriées au développement bactérien. C’est

le cas des infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose

(Carpentier et al., 2003). La production d’alginate par ces souches permet de la formation

d’un biofilm qui favorise l’adhésion aux cellules épithéliales (Fox et al., 2007) et protège la

bactérie de la phagocytose, des anticorps, l’action des antibiotiques et des désinfectants

(Ruimy et Andremont, 2004).

6. 2. Facteurs de virulence secrétés

Au cours de la phase d’adhésion P.aeruginosa capable de produire un grand nombre des

facteurs de virulence pour provoquer une lésion tissulaire (fig.4) (Guery et al., 2009).

� Sidérophores

Le fer est un élément essentiel à la croissance bactérienne. Ainsi, la bactérie entre en

compétition avec l’eucaryote qui l’héberge et notamment avec des molécules comme la

transferrine (Singleton, 2005). Les sidérophores, dont les principaux sont la pyoverdine et la

pyochéline, se comportent comme de véritables chélateurs du fer. Ils sont excrétés dans le

milieu environnant, puis récupérés sous leur forme complexée avec le fer ferrique grâce à

certaines protéines de la membrane externe (Carpentier et al., 2003). La pyoverdine, pigment

jaune fluorescent, responsable pour partie de la couleur caractéristique des colonies de P.

aeruginosa, est le plus puissant de ces deux sidérophores. La pyochéline a une activité

moindre, et deux molécules sont nécessaires pour chélater le fer ferrique (Bricha et al., 2009).

Etude bibliographique

� Pyocyanine

La pyocyanine est un pigment bleu sécrété par la bactérie et impliqué dans de nombreux

mécanismes de pathogénicité. Elle réprime la réponse immunitaire de la cellule hôte, induit

l’apoptose des neutrophiles et induit la production d’IL

� Protéase alcaline

La protéase alcaline peut dégrader l

Son rôle a surtout été décrit dans les lésions du tissu cornéen, il est moins clair dans les autres

types d’infection (Kipnis et al., 2006).

� Exotoxine A

Elle est secrétée par le système sécrétoire de type II (Alouf et Popoff, 2006)

L’exotoxine A agit, comme la toxine diphtérique, en inactivant le facteur d’élongation des

chaînes peptidiques EF2 des eucaryotes. Elle est inactive sur la synthèse protéique d

procaryotes (Ramos, 2004).

Fig.4 : Facteurs de virulence secrété de

10

est un pigment bleu sécrété par la bactérie et impliqué dans de nombreux


l’apoptose des neutrophiles et induit la production d’IL -8 (Khalilzadeh, 2009).

La protéase alcaline peut dégrader les interférons et les composants du complément.


Kipnis et al., 2006).

Elle est secrétée par le système sécrétoire de type II (Alouf et Popoff, 2006)

agit, comme la toxine diphtérique, en inactivant le facteur d’élongation des

chaînes peptidiques EF2 des eucaryotes. Elle est inactive sur la synthèse protéique d

Facteurs de virulence secrété de P.aeruginosa (Kipnis et al.

Chapitre I

est un pigment bleu sécrété par la bactérie et impliqué dans de nombreux


8 (Khalilzadeh, 2009).

et les composants du complément.


Elle est secrétée par le système sécrétoire de type II (Alouf et Popoff, 2006).

agit, comme la toxine diphtérique, en inactivant le facteur d’élongation des

chaînes peptidiques EF2 des eucaryotes. Elle est inactive sur la synthèse protéique des

al., 2006).


11

� Phospholipase C

Egalement sécrétées par le système de sécrétion de type II, elles présentent différentes

spécificités de substrats et ont particulièrement pour cible la partie lipidique de la membrane

des cellules eucaryotes. L’action des phospholipases est facilitée par les rhamnolipides

bactériens. (Khalilzadeh, 2009).

� Rhamnolipides

Ce sont des glycolipides extracellulaires, qui peuvent émulsionner les phosphates

membranaires grâce à leur activité détergente, les rendre plus accessibles au clivage par

phospholipase C (Delden et Iglewski, 1998).

� Elastase

L’élastase B joue le rôle principal. Son activité est particulièrement importante sur le

tissu pulmonaire. Elle détruit les jonctions entre les cellules épithéliales, dégrade la

fibronectine (Kipnis et al., 2006), stimule la sécrétion muqueuse et inactive l’inhibiteur �1

des protéases qui régule l’activité de l’élastase des polynucléaires neutrophiles humains. À

côté de cette activité, l’élastase B a un spectre de substrats étendu qui touche la fibrine et les

composants des lames basales des épithéliums (laminine, collagènes de types II et IV,

protéoglycanes) (Carpentier et al., 2003).

6. 3. Facteurs de virulence secrétés via le système de sécrétion de type III

Le système de sécrétion de type III, est certainement le système le plus étudié (fig.5), il

est composé d’une vingtaine de protéines qui rassemblent de celles de flagelle (Foulongne et

al., 2002). P. aeruginosa utilise un système de sécrétion de type III qui est un déterminant

majeur de la virulence et permet à la bactérie d’injecter ses toxines dans la cellule hôte

(Shaver et Hauser, 2004).


12

Figure. 5 : Schéma représentant l’organisation du système de sécrétion de type III chez

P.aeruginosa (Buyck, 2008).

P. aeruginosa secrète quatre exotoxines à travers le système de sécrétion de type III :

L’exoenzyme S : leur cible est le cytosquelette. Elle dépolymérise les filaments d’actine et

de vimentine. Cette activité se manifeste en particulier sur les macrophages. elle aussi

interfère avec plusieurs échelons de la défense immunitaire (Carpentier et al., 2003).

L’exoenzyme T : est impliqué dans l’infection pulmonaire. Cette exotoxine semble interférer

avec l’organisation des filaments d’actine et empêche l’exocytose, la progression du cycle

cellulaire et la phagocytose.

L’exoenzyme Y : est une adénylate cyclase, augmentant la concentration d’AMP cyclique

dans les cellules intoxiquées de l’hôte (Bricha et al., 2009).

L’exoenzyme U : toxine possède une activité phospholipase détruisant la membrane

cellulaire, Il pourrait contribuer à la mort de la cellule par nécrose, perméabilité des cellules et

la dissémination rapide des souches produisant (Ramos, 2004).


13

7. Pouvoir pathogène

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste qui provoque rarement des

infections chez les sujets en bonne santé. Il s'agit alors :

- d'infestations massives par exemple chez les nageurs de piscines contaminées

- ou d'inoculations traumatiques directes dans un tissu ou une cavité (méningites ou

ostéomyélite d'inoculation).

En fait, il est de règle que les infections à pyocyanique surviennent chez les malades fragilisés

en milieu hospitalier. L'antibiothérapie favorise l'implantation des bactéries sur la peau ou les

muqueuses de ces malades.

Le concept d'immunodépression inclut l'état consécutif aux stress, à des traumatismes divers

(brûlures, fractures, interventions chirurgicales, injections intraveineuses d' héroïne,

manœuvres instrumentales), à des chimiothérapies neutropéniantes utilisées par le traitement

des cancers ou des leucémies mais aussi les tares (diabète, mucoviscidose,....), la malnutrition

(kwashiorkor), l' âge (prématurité) ou le délabrement physiologique (vieillesse) (Souley lie,

2002). Les principales pathologies causées par P. aeruginosa sont résumé dans le tableau (1).


14

Tableau 1 : Principales pathologies causées par P. aeruginosa et classées selon le site

d’infection (Mesaros, 2007).

Site d’infection Pathologie spécifique Fréquence (dans une population à risque)

Tractus respiratoire

pneumonie aiguë infections chroniques de l’arbre

bronchique

fréquent (hôpital ; soins intensifs) mucoviscidose

Sang bactériémie et septicémie Fréquent

Tractus urinaire infections aiguës infections chroniques

relativement fréquent (complications suite à la présence de corps

étrangers)

Oreille otite externe (« oreille du nageur ») otite externe maligne otite moyenne chronique suppurative

Fréquent

Peau et tissus mous

dermatite infections de plaie infections de brûlures

relativement fréquent

(traumatismes)

ecthyma gangrenosa pyodermite folliculiteacne vulgaris résistant

patients neutropéniques

Œil kératite (ulcère cornéen) enophtalmie ophtalmie néonatale

rare (traumatisme)

Système nerveux

central

méningite abcès cérébral

rare (secondaire à une neurochirurgie ou à un traumatisme)

Cœur Endocardite (abus de drogues

intraveineuses)

Os et articulations

pyoarthrose sténo-articulaire ostéomyélite vertébrale infection de la symphyse pubienne ostéochondrite du pied ostéomyélite

rare

Tractus gastro-

intestinal

entérocolite nécrosante infections périrectales

rare

Chapitre 2 Chapitre 2 Chapitre 2 Chapitre 2 :

β-lactamines

Etude bibliographique Chapitre II

16

Les antibiotiques sont des composées antimicrobiennes naturelles ou de synthèse. Ils

sont produits par les microorganismes fongiques ou bactériens, capables de tuer ou inhiber

d’autres microorganismes (Madigan et Martinko, 2007). Généralement ce terme est réservé

aux molécules dont l’action antibactérienne. Les antibiotiques soit des bactéricides (ils

détruisent directement les microorganismes), soit des bactériostatiques (ils empêchent leurs

croissance) (Faure et al., 2007)

1. Les β- lactamines

Les β-lactamines constituent la plus vaste famille d’antibiotique (50%). Cette famille

comprend un grand nombre de molécules qui contiennent toutes un noyau β-lactame dans leur

structure moléculaire (fig.6), ce noyau confère à la molécule son activité antibiotique

(Casamajor et Descroix, 2009).

Fig. 6 : noyau de béta- lactame (Cohen et Jacquot, 2008).

2. Classification de β- lactamines

D’après Lecontrre et Libbrue (1999) la classification des β-lactamines dépend de leur

structure chimique et leur activité antibactérienne, on distingue cinq groupes :

2.1. Les pénames ou pénicillines

Le noyau de base des pénicillines, l'acide 6-aminopénicillanique, est constituée d’un cycle

thiazolidine lié au cycle β-lactame. Le noyau β -lactame peut être substitué par acylation sur

la fonction aminée pour donner naissance à des dérivés qui se différencient par leur stabilité,

leur pharmacocinétique, leur spectre d’activité et leur résistance aux β-lactamases. Selon la

nature des substituant et de leurs conséquences pour l'activité antibiotique, on distingue

plusieurs types de pénicillines (fig. 7) (Zitouni Imounachen, 2010).


17

� Pénicilline G (naturelle)

La pénicilline G ou benzylpénicilline est extraite des produits de fermentation de

Pénicillium chrysogenums (Cohen et Jacquot, 2008). Elle ne passe pas la barrière digestive

car elle est rapidement détruite par les sucs gastriques et ne peut donc pas être utilisée par voie

orale. La modification de leur structure aboutit à des composés plus stables qui sont

partiellement absorbés comme les phénoxyméthylpénicillines (pénicillines V) et qui peuvent

être utilisés par voie orale (Cavallo et al., 2004).

Le spectre de pénicilline G est étroit, elle active sur les bacilles à Gram positif

(Corynebacterium diphteriae), cocci à Gram positif (Treptocoque, souche de Pneumocoque

de sensibilité non diminuée à la pénicilline), cocci à Gram négative (Méningocoque, souche

de Gonocoque non productrices de pénicilline), anaérobies à Gram positif et Treponema

pallidum. Les dérives de pénicilline G sont : procaïne pénicilline, benzathine pénicilline

(Boulahbal et al., 2009).

Fig. 7 : les pénicillines (Prescott et al., 2007).


18

� Pénicilline M

Pénicillines M, découverte suite à l’apparition des souches de Staphylococcus aureus

productrice de pénicillinase. Les pénicillines M sont : méticilline, oxacilline, cloxacilline et

cloxypen. Ce sont des pénicillines à spectre étroit, en les utilisé contre les Staphylococcus

(Boulahbal et al., 2009).

� Pénicilline A ou aminopénicilline

Les pénicillines A comprend : ampicilline, amoxicilline, bacampicilline, proampicilline,

pivampicillines. (Gaudy et Buxeraud, 2005). Leur spectre d’activité est large : cocci à Gram

positif et à Gram négatif, bacilles à Gram positif et les anaérobies à Gram négatif de façon

variable (Casamajor et Descroix, 2009).

� Carboxypénicillines et acyluréidopénicillines

Les dérivés de ce groupe sont : ticarcilline, pipéracilline, mezlocilline. Ils sont

caractérisés par un spectre large sur les bacilles à Gram négatives naturellement résistants à

amoxicilline (entérobactéries, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, bacilles à Gram négatif

aérobies stricts tels que Pseudomonas aeruginosa), Mais ils sont inactifs si ces bacilles ont

acquis une résistance par production de pénicillinase (Perronne ,1999).

� Amidopénicillines

Mécillinam est la seul amidopénicilline actuellement disponible, son spectre d’activité

est étroit, actif sur les cocci à Gram négatif (Boulahbal et al., 2009).

2.2. Les céphemes ou céphalosporines

La famille des céphalosporines constitue indubitablement l’un des principaux groupes

d’antibiotique utilisés en milieu hospitalier. Ce choix est principalement attribuable au fait

quelle associent une puissante activité antimicrobienne et une très faible toxicité (Yernault et

Demedts, 1997).

Les céphalosporines se distinguent chimiquement des pénicillines par le remplacement du

cycle thiazolidine par un cycle dihydrothiazine. Cette structure donne une partie commune à

tous les membres du groupe, l’acide 7-aminocéphalosporanique et une partie variable (Fig.8)

(Faure, 2009).


19

On classe les céphalosporines en quatre générations essentielles, correspondant à des

différences de stabilité aux β-lactamases. La progression «historique» a effectivement évolué

vers une meilleure résistance aux β-lactamases, essentiellement des bacilles à Gram négatif

(Bégué et Astrue, 1999).

Fig.8 : Les céphalosporines. Ces sont dérivés de l’acide 7-aminocéphalosporanique

contenant un cycle β-lactamine (Prescott et al., 2007).

� Céphalosporines de 1ére génération

Selon Bustany et Chaumet-Riffand (1993), les Céphalosporines de 1ér génération sont

représentés par 11 dérivés : le céfalothine, la céfalexine, la céfaloridine, la céfadroxil, la

céfradine, le céfaclor, le céfacétrile, la céfatrizine, le céfazoline, la céfapirine, céfaprozil. Leur

résistance aux pénicillinases est variable.

La céfalothine est le chef de file de ce groupe d’antibiotique et son spectre moyen est

commun à toutes les céphalosporines « de première génération » (Moulin et Coquerel, 2002).

Les céphalosporines de première génération sont plus efficaces contre les bactéries

pathogène Gram-positives que conter les Gram-négatives (Prescott et al., 2007).


20

Le spectre couvre les cocci Gram (+) et quelques bactérie Gram (-).Les CS1 n’offrent pas

plus d’intérêt que les pénicillines envers les cocci. Le céfaclor et le céfadroxil sont actifs

envers les souches d’Haemophilus influenzoe β-lactamase (+). Cependant, les CS1

n’atteignent par le bacille pyocyanique (Bustany et Chaumet-Riffand, 1993).

Le céfadroxil, la céfalexine et la céfradine sont similaires en ce qui concerne le spectre,

une activité satisfaisante contre les germes à Gram (+) (notamment Streptococcus,

pneumoniae), mais une activité nulle ou nettement insuffisante contre Haemophilus influenzoe

(Yernault et Demedts, 1993).

� Céphalosporine de 2éme génération

Leurs propriétés sont très proches de celles des céphalosporines de première génération ;

elles en différent cependant par leur plus grande activité vis-à-vis d’un certain nombre de

souche de germes à Gram (-), mais avec une efficacité amoindrie vis-à-vis des germes à Gram

(+), D’une façon générale, elles sont inactives sur les germes fortement sécréteurs de β-

lactamases ; elles sont sans action sur Pseudomonas. Ainsi le « chef de file » le céfamandole

est une céphalosporine sensible aux β-lactamases (Vincent, 2009).

Céfoxitine et céfétan ne sont pas des céphalosporines stricto sensu, mais des

céphamycines. Cependant, leurs propriétés les font rattacher à cette famille. Elles sont

activent sur les Klebsiella produisant une β-lactamase à spectre élargi, sur les germes

anaérobies à Gram négatif.

Le Céfotétan et la Céfoxitine possèdent une activité sur les anaérobie à Gram négatif (type

bactéroides fragilis) (Mouton, 1997).

� Céphalosporine de 3éme génération

Sont des molécules de grande activité intrinsèque, et de bonne stabilité vis-à-vis de

nombreuses β-lactamases.

Bon nombre de bactéries d’hôpitaux, y compris les P.aeruginosa sont sensibles à ces

molécules (Gregory et al., 2008). Sont inactives sur Listeria, Staphylocoques, Bactéroides

fragilis (Mouton, 1997). De point de vue de Vincent (2009), Cette famille est comprend, trois

principaux éléments : le céfotaxime, la céftoriaxone et la céftazidime.


21

Céfotaxime : il est la molécule de référence de cette famille, son spectre est particulièrement

intéressent pour ; les Entérobactéries, l’Haemophilus influenzae, les Streptocoque, le

Méningocoque.

Céftoriaxone : cet antibiotique a un spectre sensiblement équivalent à celui du céfotaxime

Ceftazidime : son spectre est proche du céfotaxime et est remarquable par son excellente

activité sur le Pyocyanique, qui est nettement supérieure à toutes les autres céphalosporines

actives sur ce germe (Bégué et Astrue, 1999).

En plus de ces trois en trouve Cefsulodine, céfopérazone : sont caractérisés par un spectre

actif sur P.aeruginosa (Boulahbal et al., 2009).

� Les céphalosporines de 4éme génération (céfépime, céfpirome), cumulent une bonne

activité sur les Pneumocoques et sur de nombreux bacilles à Gram négatif d’hôpitaux

(Gregory et al., 2008).

2.3. Les pénèmes ou carbapénèmes

Les carbapénèmes contiennent en plus du cycle β-lactame, un cycle dérivé du cycle

thiazolidine des pénicillines, son spectre est plus large. Elles sont actives sur les cocci à Gram

positif (y inclut Entérocoque et Staphylocoques), les cocci à Gram négatif, les bacilles à Gram

positif et sur la quasi-totalité des bacilles à Gram négatif (y inclut Pseudomonas aeruginosa,

Acinetobacter) même ceux sécrètent des β-lactamases (Anglaret et Mortier, 2003). La figure

(8) illustre les différentes carbapénèmes qui dérivent de la thiénamycine, antibiotique produit

par Streptomyce cattleya (Khan, 2009).


22

Fig.9 : structure chimique de carbapénèmes (Khan, 2009).

2.4. Monobactame

L’aztréonam est le premier produit disponible de la famille des monobactame, qui sont

des b-lactamines monocycliques. Leur mécanisme d’action est identique à celui des autres b-

lactamines, mais la substance se caractérise par une forte résistance aux b-lactamases

d’origine plasmidique et chromosomique. Cependant, les b-lactamases plasmidique

hydrolysent le céfotaxime détruisent également l’aztréonam, ce qui explique la résistance

croisée fréquente avec les céphalosporines de troisième génération. D’autre part, on a

confirmé une résistance provoquée par des troubles de la pénétration de l’aztréonam dans la

membrane la plus externe, ainsi que par une liaison défaillante aux PLP (Yernault et Demedts,

1997)

Son activité vis-à-vis des bacilles à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa est

très proche de celles des C3G. Mais il est totalement inactif sur les bactéries à Gram positifs

(Perron, 1999 ; Mouton, 1997).


23

Fig.10: la structure d’arztréome (Harlos, 2010).

2.5. Les inhibiteurs des bêtalactamases

Sur le plan biochimique les inhibiteurs sont des β-lactamines. Cependant, n’ont qu’une

faible activité antibactérienne. Leur rôle est de fixer de manière irréversible aux β-lactamases

et d’inhiber les effets destructeurs des antibiotiques, donc ils sont utilisées toujours en

association avec une β-lactamine (Lecontrre et Libbrue, 1999).

Les principales molécules des inhibiteurs de β-lactamases sont l’acide clavulanique, le

sulbactam et le tazobactam (Fig.11). L’acide clavulanique inhibe seulement les pénicillinases

alors que le tazobactam et le sulbactam peuvent inhiber les pénicillinases mais surtout les

céphalosporinases. Ces inhibiteurs de β-lactamases ont été associés à l’amoxicilline, à la

ticarcilline et aux ureïdopénicillines. L’association amoxicilline + acide clavulanique

commercialisée en 1984 est la mieux connue et la plus utilisée. Son spectre d’activité associe

à celui de l’amoxicilline, les bactéries productrices des pénicillinases soit d’origine

chromosomique (Klebsiella, Bactéroïdes fragilis) soit d’origine plasmidique (Staphylococcus

aureus, Haemophilusi nflenzae, certaines entérobactéries : Escherichia coli) (Hammami,

1991). L’association ticarcilline + acide clavulanique active sur P.aeruginosa (Boulahbal et

al., 2009).


24

Fig.11 : Les inhibiteurs de bêtalactamases (Jollés, 2000).

3. Mécanisme d’action des β-lactamines

Les β-lactamines agissent en se fixant sur des enzymes présentes dans la membrane

cytoplasmique bactérienne appelées protéines de liaison à la pénicilline (PLP). L’inactivation

de ces enzymes entraine à l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane, constituant majeur de

la paroi des bactéries à Gram positif et à Gram négatif (Perronne, 1999).

Le peptidoglycane ou la muréine formés d’acide N-acide acétylmuramique (NAM) lié

avec de N-acétyglycosamine (NAG). Des pentapeptides sont liés aux NAM. Grace à des ponts

interpeptidique, les pentapeptide sont reliés entre eux pour former d’un réseau bi-dimension

autour de la cellule (Perry et al., 2004).

La synthèse du peptidoglycane est complexe et très sensible aux antibiotiques (Fig.12),

l’inhibition de n’importe quelle étape de la synthèse aboutit à l’altération de la paroi donc la

lyse osmotique de la cellule. Elle comporte plusieurs étapes : (1) Synthèse les précurseurs du

peptidoglycane l’uridine diphosphate-acide acétylmuramique UDP-NAM et l’uridine

diphosphate-N-acétyglycosamine UDP-NAG dans le cytoplasme. (2) Les acides amines sont

ajoutées séquentiellement à l’UDP-NAM pour former la chaine pentapeptidique (les 2 D-

alanines sont ajoutées sous forme de dipeptide). (3) Transfère l’UDP-NAM dans la membrane

cytoplasmique grâce à le bactoprénol transporteur membranaire où NAM-pentapeptide vas

lier avec l’UDG-NAG pour former le disaccharide peptide, l’unité de base du peptidoglycane

(Prescott et al., 2007). (4) L’étape finale extra -cytoplasmique de la synthèse constitue une

polymérisation par transpeptidation (liaison peptidique entre acides aminés) et par


25

transglycosylation (liaison glucidique) grâce à une transpeptidase et une transglycosylase

membranaire (Faure, 2009).

D’après Jehl et al. (2003) l’action de β-lactamines nécessite quatre étapes : (1)

pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane, (2) traversée de

l’espace périplasmique, (3) Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline, (4)

lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines.

Fig.8: Mode d’action des antibiotiques inhibant la synthèse de la paroi (Bambeke et al., 2010).


26

3.1. Pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane

Chez les bactéries à Gram positif les molécules de β-lactamines traversent facilement le

peptidoglycane, qui est perméable aux petites molécules (Moulin et Coquerl, 2002).

La membrane externe constituée une barrière hydrophobe chez les bactéries à Gram

négatives. A cause de sa nature lipidique, on pourrait s’attendre à ce que la membrane externe

exclut les composants hydrophiles également. Normalement, rien ne devrait traverser la

membrane externe. En fait, les bactéries à Gram négative, semblent avoir crée un nouveau

système de transport différent de celui de la membrane cytoplasmique et compatible avec le

rôle protecteur de la membrane externe (Schaecheter et al., 1993).Les β-lactamines qui sont

les plus souvent des molécules hydrophiles, doivent traverser la membrane externe pour

atteindre les PLP cibles par voie des porines (fig.13) (Gaudy et Buxeraud, 2005).

Fig.13 : Enveloppe d’une bactérie à Gram négative. la membrane interne(MI), membrane

externe (ME), périplasme(PE), lipopolysaccharide (LPS), phospholipides (PL), la porine

OmpF. P: protéines; PG: peptidoglycane; PLP:protéine de liaison aux pénicillines

(Pagés, 2004).


27

Les porines sont des protéines de transport. Ces molécules ont portés le nom : protéines

associées à des peptidoglycanes ou protéines de la matrice. Les porines généralement forment

des pores non spécifique à travers la membrane externe et filtrent les molécules en fonction de

leur taille, alors que les porines spécifique contiennent des sites spécifiques pour des substrats

particuliers (Reginald et al., 2000). Leur regroupement en trimères pour former des canaux

transmembranaires avec une structure en tonneau et un canal central hydrophile rempli d’eau

permet la diffusion au travers de la membrane de divers solutés hydrophiles, dont les β-

lactamines hydrophile (Cavallo et al., 2004).

Pour les bactéries non fermentaires comme P. aeruginosa, il existe également des

porines, mais dont la fonctionnalité est moins clairement élucidée que chez les

entérobactéries. Chez P. aeruginosa, deux porines semblent jouer une fonction importante

pour permettre le passage des β-lactamines, les porines OprF et OprD. La porine OprD laisse

passer spécifiquement les carbapénèmes, alors qu’OprF est la porine majeure qui laisse passer

les autres β-lactamines anti-Pseudomonas (Cavallo et al., 2004).

3.2. Traversée de l’espace périplasmique

Le système de double membrane de bactérie à Gram négatives crée un compartiment

appelé espace périplasmique ou périplasme autour de la membrane cytoplasmique. Ce

compartiment contient des enzymes, les β-lactamases, qui inactivent les β-lactamines

(Pénicillines ou céphalosporines). Les bactéries Gram positives ne possèdent pas de

compartiment périplasmique, mais elles sécrètent des enzymes similaires dans le milieu

(Schaecheter et al., 1993).

La membrane externe n’empêche pas, mais ralentis l’entrés des β-lactamines, qui être par

la suit hydrolysé par les β-lactamases périplasmique, cette étape est les plus importantes dans

la protection des bactéries contre les antibiotique. chez E-coli une modélisation d’interaction

entre le niveau de perméabilité et l’hydrolyse par la β-lactamase constitutive a pu être

proposée pour prédire les concentrations minimales inhibitrices (CMI).ce modèle s’applique

toutefois mal à certaines espèces pour lesquelles l’action naturelle des pompes d’efflux est

importante, comme P.aeruginosa (Cavallo et al., 2004).


28

3.3. Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline

Les β-lactamines présentent une analogie structurale du substrat naturel dipeptide (D-Ala-

D-Ala) (fig.10), qui termine les polypeptidique des précurseurs du peptidoglycane. Après la

pénétration dans l’espace périplasmique, les β-lactamines fixent sur différentes protéines de

liaison à la pénicilline (PLP) en particulier les transpeptidases (Nicolas et al., 2002). Ces

protéines sont des enzymes impliqués dans la phase finale de la synthèse du peptidoglycane.

L’affinité des β-lactamines pour les PLP peut varier selon les β-lactamines et selon les PLP

(Nauciel et Vildé, 2005). La fixation de β-lactamines sur les PLP ploque la synthèse du

peptidoglycane (Fig.14) et de ce fit la croissance bactérienne (Pourriat et Martin, 2005).

Fig. 14 : Mécanisme d'action de β-lactamine (pénicilline) (Zitouni Imounachen, 2010).

3.4. Lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines

L’arrêt de la synthèse du peptidoglycane, qui résulte de la fixation sur les PLP, va

entraîner un arrêt de la croissance bactérienne qui correspond à l’effet bactériostatique de

l’antibiotique (Moulin et Coquerl, 2002). L’action bactéricide des β-lactamines sur les

bactéries sensibles est lié à une dégradation du peptidoglycane qui conduit à une lyse de la

bactérie. Si la lyse bactérienne peut théoriquement survenir par l’action des forces osmotiques

sur une paroi altérée, le processus de lyse bactérienne résulte surtout de la mise en jeu d’un

système faisant intervenir des autolysines. Ces autolysines sont des hydrolases endogènes

présentes chez toutes les bactéries qui, sous le contrôle strict de mécanismes de régulation,


29

peuvent dégrader à plusieurs niveaux la structure du peptidoglycane bactérien. Elles sont

actives au cours de la phase de croissance bactérienne, ce qui explique que les β-lactamines

n’ont en règle générale pas d’action bactéricide sur les bactéries en phase stationnaire, mais

uniquement sur celles en phase de croissance (Cavallo et al., 2004).

Les β-lactamines activeraient des protéines bactériennes appelées des holines et

inactiveraient également des inhibiteurs endogènes des hydrolases bactériennes. Le système

de régulation des enzymes lytiques alors perturbé, les holines forment activement des canaux

transmembranaires, permettant ainsi des fuites membranaires, le passage des hydrolases du

peptidoglycane et la lyse de la bactérie (photo.1) (Faure, 2009).

A)

B)

Photo. 1: Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne (A) : Bacilles avant le traitement à

la pénicilline. (B) : Lyse de la bactérie à la suite d’un affaiblissement de la paroi bactérienne

imputable à la pénicilline (Tortora et al., 2003).

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre 3333 :

Résistance de Résistance de Résistance de Résistance de

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

aux aux aux aux ββββ----lactamineslactamineslactamineslactamines

Etude bibliographique Chapitre III

30

1. L’antibiorésistance

La résistance bactérienne à un antibiotique est définie comme la capacité d’une bactérie

à survivre à une concentration bien déterminée de cette molécule (Bousseboua, 2002). En

pratique, cette résistance se traduit de différentes façons. Pour le clinicien, c’est la présence

d’échec clinique d’antibiothérapie après un traitement adapté et mené selon un bon protocole

(Weiss, 2002). Pour le bactériologiste, c’est l’acquisition par une bactérie de mécanismes lui

permettant de résister à la concentration minimale inhibitrice déterminée pour des souches

sensibles. Pour l’épidémiologiste, il s’agit des groupes de souches se distinguant du reste de la

population par une concentration minimale inhibitrice plus élevée que la moyenne (Faure,

2009).

2. Différents types de la résistance bactérienne

2.1. Résistance naturelle

La résistance naturelle ou intrinsèque est un caractère d’espèce qui touche toutes les

souches de l’espèce considérée (phénotype sauvage) (Mesaros et al., 2005). Elle est stable,

transmise à la descendance lors de la division cellulaire (elle a pour support génétique le

chromosome bactérien) mais elle n'est pas transmissible sur un mode horizontal (d’une

bactérie à l’autre au sein d’une même espèce ou entre espèces différentes) (Carle, 2009).

2.2. Résistance acquise

A côté de la résistance naturelle existe aussi la résistance acquise. Cette résistance ne

concerne que quelques ou de nombreuses souches d’une espèce donnée, ces souches dérivent

de bactéries initialement sensibles (phénotype résistance) (Bousseboua, 2002). Elle résulte de

changements dans le génome bactérien par une mutation soit l’acquisition des informations

génétiques étrangères (Mulvey et Simor, 2009).

Les bactéries sont dites multirésistantes lorsqu’à la suite d’une accumulation de

résistances naturelles et acquises, elles ne sont sensibles qu’a un petit nombre d’antibiotiques.

Elles sont alors résistantes à plusieurs antibiotiques (Boulahbal et al., 2009).


31

2.2.1. Origine génétique de la résistance acquise

Une bactérie peut acquérir une résistance aux antibiotiques par deux grands

mécanismes génétiques. L’un a pour support le chromosome (mutation spontané) et il définit

une résistance chromosomique, l'autre a pour support les plasmides ou les éléments

transposables et il définit une résistance extra-chromosomique (Carle, 2009).

2.2.2. La résistance chromosomique

Elle résulte d’une mutation. C’est un phénomène rare et spontané. Il n’est pas

provoqué par la présence de l’antibiotique mais l’antibiotique révèle la mutation de résistance

en sélectionnant les bactéries mutantes résistante (ou plus exactement, en éliminant les autres

bactéries de l’espèce, celles restées sensibles à l’action de l’antibiotique). Le taux de mutation

varie de 1.10-7 à 1.10-10 (Meyer et al., 2006). La résistance par mutation se transmet

héréditairement aux cellules filles (Bockstael et Aerschot, 2009).

Toutes les mutation ayant un rôle dans la modification ou la perte d’un gène et

pouvant entraîner : (1) une modification de la cible de l’antibiotique qui peut êtres pariétale

(cas de la PLP ou protéine liant la pénicilline) ou intracellulaire (ou de l’ADN gyrase pour les

quinolones, ARN polymérase, ribosome), (2) modification de perméabilité un ou plusieurs

antibiotiques (Vaubourdolle, 2007), Par exemple, la résistance de P.aeruginosa a l’imipèneme

due à la perte d’une porine à la suite d’une mutation dans la porine OprD (Mesaros et al.,

2007).

3.1.2. La résistance extra-chromosomique

C’est le mécanisme le plus fréquent. La bactérie capable d’acquérir des gènes

exogènes qui la rendent la résistante par la synthèse de protéines additionnelles et non à une

modification des constituants normaux de la bactérie. Ces protéines modifient la perméabilité

à un antibiotique ou inactivent l’antibiotique lui-même (cas des enzymes types β-lactamases).

Les gènes sont portés par un plasmide ou un transposable (Boulahbal et al., 2009).

� Plasmide et transposable

Le plasmide R (facteur de résistance) a été découvert en 1959. C’est une molécule

d’ADN extra-chromosomique circulaire de taille environ 1 à 400 kb. Il capable de

autorépliquer et de transférer d’une bactérie à une autre même entre les bactéries d’espèces

différents (Pourriat et Martin, 2005). Beaucoup de plasmide R contiennent deux types de

gènes l’un est appelé facteurs de transfert de résistance ; code les gènes nécessaire au transfert


32

par la conjugaison (plasmide conjugatif). L’autre type appelé déterminants-r est groupes des

gènes de résistance aux antibiotiques (ampicilline, sulfamide,…) (Klug et al., 2006). Parfois

le plasmide R ne contient pas le RTF (plasmide non conjugatif) il peut être transféré à une

autre cellule par mobilisation d’un plasmide conjugatif dans la cellule (Bennett, 2008).

Les plasmides de résistance sont susceptibles d’évoluer par acquisition ou pertes

successives de déterminants de résistance portés par des éléments génétiques transposables

(Bergogne-Bérézin et Dellamonica, 1999). Les transposons sont des molécules d’ADN

capables de déplacer d’un site à un autre (mouvement intra et inter-moléculaire) grâce à des

gènes spécifiques lui permet de transférer d’un plasmide vers un autre ou d’un plasmide vers

un chromosome et l’inverse (Bennett, 2008).

4. Différents mécanismes de résistance de P.aeruginosa aux β-lactamines

Le phénotype sensibles de P. aeruginosa (que l'on appelle de type sauvage), comprend

la sensibilité aux carboxypénicillines (ticarcilline), aux uréidopénicillines (mezlocilline,

pipéracilline), à monobactame (aztréonam), aux carbapénèmes (imipénème) et à certain

céphalosporines de troisième génération (céfsulodine, ceftazidime céfopérazone, céfépime,

cefpirome) (Eyquem et Montagnier, 2000). La résistance naturelle de P.aeruginosa lie à faible

perméable de membrane externe et l’intervention d’autres mécanismes, comme la production

des β-lactamases chromosomiques inductible et l’existence d’un système d’efflux (Lahlou et

al., 2008).

P.aeruginosa est caractérisé par son aptitude d’acquérir différents mécanismes de

résistance aux β-lactamines (fig.15). Ces mécanismes peuvent être enzymatique par la

production de différents types de β-lactamases ou non enzymatique :(i) diminution de la

perméabilité des β-lactamines, (ii) excrétion des β lactamines par les systèmes d’efflux et (iii)

modification de la cible des β-lactamines (PLP) (Arsalane et al., 2010).


33

Fig.15 : Représentation schématique des principaux mécanismes de résistance aux β-

lactamines chez bactérie à Gram négative (Thomson et Bonomo, 2005).

4.1. Mécanismes enzymatiques de résistance aux β-lactamines

A l’heure actuelle, la production d’enzymes hydrolytiques appelées β-lactamases est le

mécanisme de résistance prédominant des bactéries à Gram négatif vis-à-vis des β-lactamines.

Au début des années 1980, seules quelques enzymes de type plasmidique comme TEM-1,

TEM-2 et SHV-1 étaient connues, mais rapidement après l’introduction d’antibiotiques à

large spectre tels que les céphalosporines de troisième génération, sont apparues des β-

lactamases à spectre étendu ou BLSE. Depuis, les β-lactamases ne cessent de se diversifier,

d’élargir leur spectre d’activité et leur diffusion parmi de nombreuses espèces

d’entérobactéries et de bacilles non fermentant tels que Pseudomonas spp. et Actinobacter spp

(Faure, 2009).


34

Les β-lactamases

Les β-lactamases sont des enzymes bactériennes qui hydrolysent la liaison amide du

cycle β-lactame des β-lactamines pour donner un acyl-enzyme qui sera ensuite dégradé en

acide inactif (fig.16). L’hydrolyse irréversible du noyau β-lactame entraîne alors l’inactivation

de l’antibiotique et la perte totale de son activité antibactérienne. Chez les bactéries à Gram

positif les β-lactamases sont sécrétées dans le milieu extérieur tandis que chez les bactéries à

Gram négatif ces enzymes se retrouvent dans l’espace périplasmique (Van Bambeke et al.,

2010).

Fig.16 : hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase (Dale-Skinner et Bonev,

2009).

Sur la base de leur mécanisme catalytique, les β-lactamases sont divisées en deux

types : les sérines-β-lactamases, utilisant un site actif à sérine pour hydrolyser le noyau β-

lactame et les métallo-β-lactamases nécessitant des ions Zn2+.

Selon la classification de Ambler, utilisée en pratique médicale, il est possible de définir

phylogénétiquement quatre classes de β-lactamases : les classes A, B, C ou D. Au sein de

chacune de ces classes, il existe des sous-groupes en fonction du support génétique des gènes

de résistance, chromosomique ou plasmidique (Muller et Frcpc, 2004) (tableau 2).

P.aeruginosa peut produire un nombre important de β-lactamases des quatre classes

moléculaires, mais aussi les β-lactamases à spectre élargi ou étendu appartiennent de ces

classes (Thomson et Bonomo, 2005).


35

Tableau 2 : Classification selon Ambler des principales β-lactamases d’après Faure, 2009.

Classe Localisation Spectre d’activité Types d’enzymes Organisme

A

Chromosome Spectre restreint TEM-1,2 et SHV-1 Enterobacteriaceae P.aeruginosa

Plasmide

β-lactamases à spectre étendu (BLSE)

TEM-3-29, 42, 43, SHV-2-9 PER-1,2 CTX-M, CTX-M2, MEN-1, VEB-1, TOHO-1

Enterobacteriaceae Klebsiella peunomoniae ++ P. aeruginosa

Plasmide

β-lactamases résistantes aux inhibiteurs

TEM-30-41, 44 et 45

Enterobacteriaceae E. coli ++

Plasmide

β-lactamases résistantes aux inhibiteurs et à large spectre

SHV-10, TEM-33 et 15

E. coli

Chromosome Carbapénémases

Nmc A, Sine-1, IMP-1

Enterobacter cloacae Serratia marcescens

B

Chromosome Plasmide

Carbapénémases IMP-1 Enterobacteriaceae P .aeruginosa

C

Plasmide

Céphalosporinases

MIR-1, MOX-1, CMY-1, 2 1.AT-1, BIL-1, FOX- 1, ACT-1

Enterobacteriaceae Klebsiella peunomoniae ++

Chromosome AmpC Bacille Gram négative

D Chromosome Plasmide

OXA-24- 26, 40, 51, 58, 72

Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa


36

5.1.1. β-lactamases de la classe A

La classe A constituée principalement par les pénicillinases qui sont sensibles aux

inhibiteurs de β-lactamase (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam) (Bibal, 2008).

Quatre enzymes d’origine plasmidique ont été signalés chez P. aeruginosa: PSE-1 (CARB-2),

PSE-4 (CARB-1), CARB-3 et CARB-4. Leur profil de substrat comprend les

carboxypénicillines, les uréidopénicillines et non pas la ceftazidime (Bert et al., 2002).

5.1.2. β-lactamases de la Classe B : métallo-β-lactamases (MBL).

L’importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu’elles hydrolysent

les carbapénèmes, composés qui échappent à l’activité des β-lactamases à sérine active. La

plupart des métallo-bêta-lactamases dégradent toutes les classes des β-lactamines, sauf

monobactame. Les MBL ne sont pas inhibés par l’acide clavulanique ou la tazobactam. Au

lieu de cela, ils sont inhibés par les chélateurs d'ions tels que l'EDTA (Bush et Jacoby, 2010).

Plusieurs types MBL ont été décrits chez P.aeruginosa : IMP, VIM, GIM, et SPM (Pitout et

al., 2005).

5.1.3. β-lactamases de la classe C (AmpC)

P.aeruginosa possède un gène AmpC inductible (céphalosporinase) entraînant une

résistance naturelle aux pénicillines A et G et aux céphalosporines de première et deuxième

génération (Pourriat et Martin, 2005). Mais ce gène peut subir une mutation génétique (au

niveau des gènes régulatrices), elle aboutit à une hyperproduction de céphalosporinase

indépendamment de la présence de β-lactamines. La céphalosporinase est dite alors

déréprimée. Ce phénomène donne un phénotype de résistance aux céphalosporines de

troisième génération et tous les autres β-lactamines l’imipenème (Vaubourdolle, 2007). Ce

type de β-lactamase ne détruit pas l’antibiotique mais inhibe l’accès à son site d’action (Carle,

2009) et n’est pas inhibée par les inhibiteurs de β-lactamase commercialisés : l'acide

clavulanique, le sulbactam et tazobactam (Muller et Frcpc, 2004).

Le système de régulation d’expression de gène ampC est très complexe et nécessite de

l’intervenir de plusieurs protéines régulatrices (AmpG, AmpR, AmpD). Le gène ampR, situé

en amont du gène ampC et transcrit en sens inverse, code un régulateur transcriptionnel

pouvant réprimer ou induire l’expression du gène ampC. En absence d’antibiotique inducteur

(imipénème), la protéine AmpR réprime l’expression de ampC en se liant à la région

promotrice du gène (Lister et al., 2009). En revanche, en présence d’antibiotique inducteur,

la dégradation du peptidoglycane libère dans l’espace périplasmique des molécules de 1, 6-

anhydromuropeptides (Fig. 17). Ces derniers, une fois transportés dans cytoplasme grâce à la


37

Fig. 17 : Induction de l'expression ampC par β-lactamine

perméase AmpG, jouent le rôle de molécules inductrices transformant le répresseur en

activateur transcriptionnel. Les molécules inductrices peuvent toutefois être dégradées par une

N-acéttyl-anhydromuramyl-L-alanine amidase codée par le gène ampD. Cette enzyme permet

donc, d’une part, de prévenir l’induction du gène ampC et, d’autre part, de recycler les

éléments provenant de la dégradation du peptidoglycane. La cause la plus connue d’haut

niveau d'expression d’ampC ou dérépression chez les isolats cliniques est une mutation dans

l’ampD. Cette mutation conduit à une hyperinductibilité d’ampC donc à une hyperproduction

constitutive de céphalosporinase (Fig.18) (Jacoby, 2009).


38

Fig.18 : Dérépression associés à AmpD- (Lister et al., 2009).

5.1.4. β-lactamases de la classe D (Oxacillinase)

Les enzymes de ce groupe caractérisent par leur capacité d'hydrolyser la cloxacilline

ou oxacilline et donc sont appelé oxacillinases ou OXA. Les oxacillinases sont faiblement

inhibées par l’acide clavulanique mais peuvent être inhibées par NaCl (Bush et Jacoby, 2010).

Les principes enzymes produites par le P.aeruginosa sont : OXA-1, OXA-2 et OXA-10 qui

déterminent la résistance aux carboxypénicillines et uréidopénicillines mais pas à la

ceftazidime. La résistance à la ticarcilline et pipéracilline résultant de la production d'enzymes

OXA-2 est inférieure à la résistance qui se développe lorsque les oxacillinases OXA-10 et

OXA-1 sont produites (Strateva et Yordanov, 2009).

5.1.5. β-lactamases à spectre élargi ou étendu (BLSE)

Depuis 1983 des β-lactamases ayant un spectre très large sont apparues : ce sont les β

lactamases à spectre élargi (BLSE). Elles sont présentes initialement chez Klebsiella

pneumoniae et peuvent trouver au sein de nombreuses autres espèces bactériennes,

entérobactéries et bacilles non fermentant (tels que P.aeruginosa et Acinetobacter baumannii)

(Zahar et al., 2009). Les BLSE proviennent de mutations de pénicillinases tells que TEM,


39

SHV de classe A et OXA de la classe D (Cattoir, 2008), leurs gènes portés habituellement par

des plasmides, et donc transférables (Al-Jasser, 2006).

Les mutations génétiques à l’origine des BLSE élargissent le spectre de ces enzymes

et touchent également les céphalosporines de troisième génération (ceftazidime et céfotaxime)

et la monobactame (aztréonam) (Vora et Auckenthaler, 2009). Les BLSE sont donc définis

comme des β-lactamases capables d’hydrolyser les pénicillines et les céphalosporines de

première, deuxième et troisième génération et la monobactame et n’hydrolysent pas les

céphamycines (céfoxitine) ni les carbapénèmes et elles sont inhibées par les inhibiteurs

classiques de β-lactamases (Paterson et Bonomo, 2005).

Différents types de BLSE ont été identifiés chez P.aeruginosa, qui peuvent être, soit

des β-lactamases de classe A tel que TEM, SHV, PER, VEB-1 et VEB-2… etc, soit des

oxacillinases de spectre élargi (classe D) tel que OXA-11, -14, -16, -17, -19, et -28 (Tanaz et

al., 2010).

5.2. Mécanismes non enzymatiques

5.2.1. Le système d’efflux actif

Le système d’efflux actif est efficace grâce aux protéines transmembranaires ancrées

dans la membrane plasmique mais également dans la membrane externe des bactéries Gram

négatif. Ces protéines sont spécifiques d’une classe d’antibiotiques ou au contraire

responsables de « multidrug resistance » (MDR). Pour fonctionner, les pompes à efflux

utilisent l’énergie fournie par dissipation d’un gradient de protons (familles MFS, RND et

SMR) ou d’ions sodium (famille MATE) ou encore par hydrolyse d’ATP (famille ABC)

(Poole, 2004).

Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d’efflux sont souvent des complexes

protéiques ternaires avec une pompe transmembranaire, une protéine périplasmique de

jonction et une porine de la membrane externe (fig.19) (Lister et al., 2009).


40

Fig.19: Structure et fonction de pompes d’efflux RND chez P. aeruginosa (Lister et al.,

2009).

Les systèmes les plus fréquemment rencontrées chez P.aeruginosa sont de type RND

(Li et Nikaido, 2009). Quatre systèmes de ce type peuvent conférer une résistance aux β-

lactamines: MexA–MexB–OprM, MexC–MexD–OprJ, MexE–MexF–OprN et MexX–MexY–

OprM. Ces système sont codés par des opérons distinct sur le chromosome bactérien,

comprenant de 2 à 3 gènes de structure, le contrôle négatif ou positif de leur expression est

assuré par un gène régulation situé en amont (Poole, 2004).

Les systèmes MexAB-OprM et MexXY-OprM sont exprimés de manière constitutive

et de contribuer à la résistance intrinsèque de P. aeruginosa. Bien que les systèmes d'efflux

MexCD-OprJ et MexEF-OprN sont au repos dans le type sauvage de P. aeruginosa (Xavier et

al., 2010).Tous ces systèmes peuvent être surproduits par cette bactérie sous l’effet de

mutation touchant des gènes régulateurs (tableau 3), et engendre une multirésistance acquise

vis-à-vis de nombreuse antibiotiques dont les β-lactamines (Livermore, 2002).


41

Tableau.3 : La résistance aux antibiotiques due de mutations dans les gènes régulatrices des

systèmes d’efflux chez P.aeruginosa (Livermore, 2002).

Système d’efflux

Site de mutation Agents antipseudomonas

Fq CarbTic

Pip-Azl

Czid-Atm

Cpm-Cpr

Imi Mero Agl Pm

MexAB-OprM

nalB, mexR, nalC, autres

R/R R r/R r/R r/R - r - -

MexCD-OprJ

NfxB r/R r/R r/R r/R R - r - -

MexEF-OprN

nfxC, mexT r/R r/R r/R r/R r/R r r - -

MexXY-OprM

r/R r/R r/R r/R r/R - r r/R -

Agl, aminoglycosides; Azl, azlocilline; Atm, aztréonam; Carb, carbénicilline, Czid,

ceftazidime, Cpm, cefepime; Cpr, cefpirome; Fq, fluoroquinolone; Imi, imipénème; Mero,

méropénème; Pip, pipéracilline; Tic, ticarcilline ; Pm, polymyxine; r, susceptibilité réduit; R,

résistance.

5.2.2. Diminution de la perméabilité

Le déficit en porine OprD, protéine de la membrane externe empruntée spécifiquement

par l’imipénème pour franchir la membrane externe de P.aeruginosa, se traduit par une

imperméabilité membranaire. La réduction de l’expression de cette porine conduit à une

baisse modérée de l’activité de tous les carbapénémes. Ainsi, seule la résistance à

l’imipénème est exclusivement dépendante du niveau de production d’OprD (Cholley, 2010).

5.2.3. Modification de la cible « protéine de liaison à la pénicilline » (PLP)

L’efficacité de la fixation de β-lactamines sur leurs cibles PLPs peut être diminuée à

la suite des mutations dans les gènes chromosomiques qui codent pour des PLPs normales ou

à l’acquisition de gènes étrangers codant pour des PLPs nouvelles. Ces mutations peuvent

aboutir à des altérations quantitatives et qualitatives des PLPs, avec diminution d’affinité pour

les β-lactamines, ou à une substitution dans leurs fonctions des PLP cibles par une autre PLP

moins affine (Cavello et al., 2004).

Chez le P.aeruginosa le nombre de PLPs est six à sept types, mais ces derniers ne sont

pas aussi bien étudiés comme ceux qui sont en Escherichia coli et leurs gènes n'ont pas été

caractérisés (Liao et Hancock, 1995). En 1997 Lia et Hancock ont été montrés que la

surproduction de type PLP3 chez les isolats de P.aeruginosa confère une résistance à


42

cefsulodine, la ceftazidime, céfépime, et à l'aztréonam. L’altération de PLP peut être observée

chez les souches de mucoviscidose ou la modification de PLP4 avec une faible affinité a été

rapportée après le traitement par l’imipénème et la pipéracilline. Cependant, ce type de

mécanisme reste très rare chez cette bactérie (Strateva et Yordanov, 2009).

Partie pratiquePartie pratiquePartie pratiquePartie pratique

Partie pratique Partie pratique Partie pratique Partie pratique Matériels et méthodesMatériels et méthodesMatériels et méthodesMatériels et méthodes

44

Partie pratique

Notre étude vise à identifier des profils de résistance acquise tel que les β-lactamases à

spectre élargi (BLSE).

I-Matériels et méthodes

1. Matériels biologie

Cette étude consiste en la recherche des souches de Pseudomonas aeruginosa isolées à

partir des différents produits pathogènes (urines, pus, cathéthère…….) provenant de malades

hospitalisées dans les différents services de l’hôpital HAKIM SAADAINE. Une souche de

référence de P.aeruginosa ATCC 27853 a été utilisée.

2. Réactif et petits matériels

Tableau 05 : les petits matériels et les réactifs utilisés.

petit matériel Réactif

� Boite de pétrie ;

� Pipette pasteurs ;

� Tube à essais ;

� Lame et lamelle ;

� Microscope optique

� Gélose nutritive et

de Muller Hinton

� Ecouvillons

� Anse de platine

� Bec benzène

� Eau physiologie

� Lugol

� L'alcool

� Violet de gentiane

� Safranine

� l'huile de cèdre

� King A et King B

� Disque d’oxydase

3. Méthodes

3.1. Isolement

L’isolement est une méthode qui permet d’obtenir des souches bactériennes pures à

partir d’un échantillon. La technique la plus utilisé pour l’isolement est la technique des stries,

qui consiste à étaler sur la surface d’un milieu gélosé (préalablement coulée dans une boite de

Pétri), un inoculum sous forme de stries à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée. L’isolement

est réalisé selon le protocole expérimental décrit par Delarras, 2007 :

-Diviser la surface en 4 quadrants sur le fond du biote de Pétri et les numéroter 1 à 4 ;


45

-Déposer l’inoculum (urine, pus) sur le bord de la boite dans le quadrant 1 ;

-L’étaler en large strie ;

-Effectuer à l’aide d’une pipette Pasteur des stries serrées sur les quadrants 1 et 2 ;

-Recommencer des stries perpendiculairement aux précédentes sur les quadrants 2 et 3,

puis encore perpendiculairement aux dernières sur les quadrants 3 et 4.

Après l’incubation des boites à 37°C pendant 24 h, chaque colonie bien individualisée, est

prélevée et remise en suspension dans de l’eau physiologie stérile puis repiquée dans les

mêmes conditions que précédemment.

Photo (2): Isolement par la méthode de stries

3.2. Identification

3.2. 1. Identification microscopique

� L’examen à l’état frais

L'état frais est une technique qui permet l’observation des bactéries vivantes entre la

lame et lamelle à l’objectif 40. Le but de cette étape est de déterminer la forme des bactéries

ainsi le type de leur mobilité (Joffin et Leyral, 2006).

L’observation est réalisée comme suit : une petite goutte d’eau physiologie stérile est

déposée avec la pipette Pasteur au centre d’une lame stérile. On prélève une partie d’une

colonie bactérienne pure à l’aide de pipette Pasteur boutonnée et dissociée dans la goutte.

Une lamelle stérile est ensuite appliquée sur la goutte en évitant la formation de bulles d’air.

Puis l’observation au microscope optique à l’objectif 40.


46

� Coloration de Gram

La coloration de Gram est une coloration différentielle permettant de classer les

bactéries en deux groupes selon la structure de leur paroi : Gram positif et Gram négatif

(Denis, 2007). En effet quant les bactéries est mise au contact du violet de gentiane et ensuite

soumises à l'action du lugol, il se forme un complexe colorant qui colore en violet tout le

cytoplasme des bactéries. Cependant lorsque ces bactéries colorées sont lavées à l’alcool,

seules celles à Gram négatif (présence membrane externe et couche mince de

peptidoglycane), qui perdent leur coloration et prennent la colore rose après la coloration par

la safranine. Les bactéries à Gram positif possède une couche épaisse de peptidoglycane qui

empêche la pénétration de l’alcool et donc restent en colore violet (Tortora et al., 2003).

• A l'aide d'une pipette Pasteur stérile on déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur

une lame bien propre.

• En suite on prélève une colonie bien isolée avec la pipette de Pasteur boutonnée et

dissociée dans la goutte. Le frottis obtenu est séché dans l’étuve.

• Puis il est recouvert totalement de violet de gentiane pendant 1 min .On rince ensuite à

l'eau de robinet. Le frottis est ensuite recouvert de lugol pendant 1 min.

• Puis on décolore par l'alcool. On lave rapidement à l'eau de robinet. Le frottis est enfin

recouvert de safranine pendant 30 s, puis lavé à l'eau et séché à température ambiante.

• Ensuite le frottis est examiné au microscope optique à l'objectif 100 et à l'immersion à

l'huile de cèdre.

3.2.2. Identification biochimique

� Recherche de l’oxydase

L’activité oxydase a été déterminée par la méthode des disques et selon le protocole

décrit par Guenoune, 2009. A l’aide d’une pipette pasteur boutonnée, une colonie est déposée

sur un disque oxydase placé sur un milieu solide. La réaction positive est révélée par

l’apparition d’une tache violette.

� Recherche de catalase

Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al.,

2003. Ce test consiste à mettre une colonie prélevée du milieu gélosé à l’aide d‘une pipette

Pasteur boutonné dans de l‘eau oxygénée.


47

� Mise en évidence des pigments

Les milieux King A et King B sont utilisé pour mettre en évidence successivement la

pyocyanine et la pyoverdine de P. aeruginosa. En effet la pyocyanine verdit le milieu King A

et la pyoverdine jaunit le milieu King B (Joffin et Leyral, 2006).

A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée stérile des colonies bien isolées sont prélevés et

ensemencé en stries médiane à la surface de chaque milieu. Ces tubes sont placés dans l'étuve

à 37°C pendant 1jours. La production de la pyocyanine est maximale sur le milieu King A et

celle de la pyoverdine sur le milieu King B.

Photo 3 : l’ensemencement des strié à surface des milieux King A et B

3.3. Culture

A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée on prend un clone bien isolé pour faire un repiquage.

3.4. Antibiogramme

L’antibiogramme est réalisé pour déterminer la sensibilité d’une souche bactérienne vis-

à-vis un ou plusieurs antibiogramme in vitro.

• Principe

Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les

laboratoires de diagnostic. Des disques de papier buvard, imprégnés d’antibiotiques à tester,

sont déposés à l’aide d’une pinces stériles à la surface d’un Mueller-Hinton, préalablement

ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier (Boulahbal et al., 2009).


48

• Technique :

3. 4.1. Réalisation d’une suspension :

A l’aide d’une pipette Pasteur stérile, on prélève une colonie bien isolée d’une culture de

18h à 24 h, puis nous déchargeons la pipette dans un tube contient de l’eau physiologique qui

est bien homogénéisée. Il et nécessaire de conférmer que la densité de la suspension est

équivalente à 0,5 Mc Farland.

Photo 4 : la préparation d’une suspension de l’antibiogramme.

3.4.2. Ensemencement :

L’ensemencement doit se faire dans les 15 min qui suivent la préparation de l’inoculum,

il est réalisé par le trempage d’un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne ensuite

nous l’essorons en le pressant fermement sur la paroi interne de tube afin de le décharger au

maximum. Enfin l’ensemencement est réalisé par le frottage de l’écouvillon sur la totalité de

la surface gélosée de boite de pétrie.

Cette opération se répète deux fois en tournant la boite de 60° à chaque fois sans oublier

de faire pivoter l’écouvillon sur lui-même. Nous finissons l’ensemencement en passant

l’écouvillon sur le périphérique de la gélose.


49

a)le trempage d’un écouvillon dans la

suspension bactérienne

b) le frottage de l’écouvillon sur la surface

gélosé

Photo 5 :Les étapes de l’ensemensement

3.4.3. L’application des disques :

Au bout de 15 mn de séchage, les disques choisis sont posés à l’aide d’une paire de

pinces stériles. Les disques doivent être parfaitement appliqués à plat sans glissement, une

distance de 15 mm doit séparer un disque périphérique au bord de la boîte et deux disques

doivent être éloignés au moins de 30 m entre en centre de sorte que les zones d’inhibition ne

se chevauchent pas.

• Le choix des antibiotiques

Le choix s’effectue selon l’état d’étude, dans notre travail les antibiotiques testé sont :

Ticarcilline (Tic), la pipéracilline (Pip), la ceftazidime (Caz), L’imipénème (Ipm), Ticarcilline

+ acide clavulanique (TCC).


50

Photo 6: le dépôt des disques d’antibiotique sur le Muller-Hinton

� Recherche de β-lactamase à spectre élargie

La recherche de la β-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standards de

l’antibiogramme en déposant un disque de ticarcilline + acide clavulanique (TCC) à 30mm

(centre à centre) d’un disque de céphalosporine de 3ème génération ceftazidime (CAZ). Le

test est positif s’il y a apparition d’une image de synergie ou « bouchon de champagne » entre

les disques : Ticarcilline+ acide clavulanique et la ceftazidime

Photo 7 : Position de disque


51

3.4.4. Incubation et lecture :

Avant l’incubation à 37°C pendant 18-24 heures, Il est important d’observer une

prédiffusion des antibiotiques de 30 minutes à température ambiante avant de porter les boîtes

à l’étuve.

La lecture s’effectue en mesurant le diamètre de la zone d’inhibition de chaque disque

d’antibiotique à l’aide du pied à coulisse, puis comparée aux valeurs critique (annexe)

La mesure de ses diamètres permet de classer la bactérie en 3 catégories : sensible (S)

intermédiaire (I), résistant (R).

Photo 8 : La lecture de l’antibiogramme à l’aide d’un pied de coulisse

Partie pratique Partie pratique Partie pratique Partie pratique Résultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussion

52

II-Résultat et discussion 1. Isolement

A partir des cultures les différents prélèvements, plusieurs souches bactériennes

d’aspects morphologiques différents ont été isolées et purifiées par le repiquage. L’une des

souches produit une pigmentation verte, diffusant dans toute la boite de Pétri. De plus, une

odeur caractéristique de la fleur de seringa s'exhale de ses cultures. La forme des colonies

isolées sont de grande taille avec un aspect bombé au centre présentant de reflet métallique et

au contour irrégulier (colonies la « large »).

Les caractères culturaux observés après l’isolement orienté l’identification vers le

groupe de Pseudomonas aeruginosa. Ces bactérie isolés caractérisent par une odeur

aromatique de seringa due à la production d’ortho-amino-acétophénone, intermédiaire du

métabolisme de tryptophane; leurs colonie plus souvent large et bombé au centre (œufs sur le

plat) avec un conteur irrégulier et un reflet métallique qui résulte de la production des

protéolytiques ; production une pigmentation verte de pyocyanine (Eyquem et Montagnier,

2000).

Photo 9 : l’aspect des colonies de P.aeruginosa dans une boite de pétrie


53

2. Identification

� L’examen à l’état frais

L’examen à l’état frais montre que les souches bactériennes de Pseudomonas

aeruginosa sont des bacilles mobiles grâce à un flagelle polaire généralement unique

(Hafiane et Ravaoarinoro, 2008).

� Coloration de Gram

Après la coloration de Gram les souches purifiées sont apparue sous forme des bacilles

rose. Elles possèdent des parois à Gram négative. Chez les bactéries à Gram négatif :

l’éthanol mis au contact des cellules colorés, solubilise les lipides de leur paroi, avant de

pénétrer leur cytoplasme et de dissoudre les complexes formé par le violet de gentiane le

lugol. Ces derniers sont alors perdus, à travers la paroi devenue poreuse. Les cellules ainsi

décolorées deviennent accessibles et absorbent la fuschine qui les recolore en rose

(Bousseboua, 2002).

� Recherche de l’oxydase

La zone réactionnelle sur le disque oxydase est colorée en bleu ou bleu-violette. Ce

qui suggère la présence du cytochrome oxydase (Joffin et Leyral, 2006).

� Recherche de catalase

Le dégagement de bulles de gaz signifie qu’il y a production de l’enzyme catalase et que

le test est positif. La catalase est une enzyme contenant du fer, qui catalyse la décomposition

du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène. Synthétisée par la plupart de bactéries

aérobies (Delarras, 2007).

Photo.10: test catalase Photo. 11: test oxydase


54

� Mise en évidence des pigments

Le milieu King B est coloré en jaune et King A en vert, ce qui signifie la présence de

pyocyanine dans le King A et la pyoverdine dans le King B. (Le Minor et Veron, 1989).

King A King B

Photo 12: la mise en évidence des pigments dans le King A et B.

3. Antibiogramme

Après incubation, les disques s’entourent de zones d’inhibition circulaires correspondant

à une absence de culture (photo.13). Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les

diamètres des zones d’inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe. La lecture

de l’antibiogramme consiste à déduire à partir de la mesure de ces diamètres, le caractère

sensible, résistance ou intermédiaire. Les résultats des antibiogrammes réalisés sont résumés

dans le tableau 6.


55

Photo.13: Les zones d’inhibition des antibiotiques testés.

Tableau 06 : Profil de résistance aux β-lactamines de 12 souches de P. aeruginosa.

ATB souches

TIC PIP CAZ TCC IMP BLSE

1 S S S S S - 2 R R R I S -

3 S S S S S -

4 R R R R S +

5 R R R I S -

6 S S S S S - 7 R R R R S +

8 S S S S S -

9 R R R R S +

10 S S S S S -

11 R R R R S +

12 S S S S S -

Antibiotique (ATB), Ticarcilline (Tic), la pipéracilline (Pip), la ceftazidime (Caz),

l’imipénème (Ipm), Ticarcilline + acide clavulanique (TC), cefsulodine (Cfs), ceftazidime.

(R) résistance, (S) sensible, (-) négative, (+) positif, (I) intermédiaire, (BLSE) beta-lactamase

à spectre élargie.


56

Sur les douze souches de Pseudomonas aeruginosa isolées quatre (4, 7, 9, 11) ont

présentaient un profils BLSE qui se traduit sur l’antibiogramme par un bouchon de

champagne (test de synergie) due à l’inhibition d’une céphalosporine de troisième génération

(CAZ) par l’acide clavulanique (Lahlou et al., 2007).

Deux souches (2, 5) présentant un profil de résistance à haut niveau correspondant à

la production de céphalosporinase à haut niveau (résistance à céphalosporine de troisième

génération (CAZ)). (Arsalane et al., 2010)

Photo.14 : profils de BLSE « bouchon de champagne »

Photo.15 : profils de résistance à haut niveau

CAZ TCC

CAZ

TCC

Conclusion

ConclusionConclusionConclusionConclusion

Les infections à bacille pyocyanique occupent une place importante au sein des

infections nosocomiales avec une fréquence estimée entre 20 et 30 % et possèdent un

pronostic sévère.

Depuis l'avènement des antibiotiques, les bactéries ont acquis des mécanismes de

résistance. Tous les antibiotiques peuvent sélectionner des BMR et favoriser leur persistance.

Ainsi, l'émergence des bactéries multirésistantes est étroitement liée à la consommation des

antibiotiques en médecine libérale comme dans les établissements de santé. Le non respect

des précautions d'hygiène lors des soins facilite la transmission des BMR d'une personne à

l'autre ou par contacts avec son environnement contaminé. Les bactéries, résistantes ou non,

se transmettent très facilement par manuportage.

Une infection par une bactérie multirésistante implique des traitements plus longs

avec des antibiotiques plus onéreux et d'utilisation plus complexe. Les malades infectés par

une bactérie multirésistante sont hospitalisés plus longtemps. Être porteur d'une bactérie

multirésistante ne signifie pas forcément être atteint d'une infection nosocomiale et

inversement, les infections nosocomiales ne sont pas toutes des infections à bactéries

multirésistantes. Dans les établissements de santé comme en médecine libérale, les soignants

et les patients peuvent être simplement porteurs pour une durée de quelques mois ou plus.

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50.

AnnexesAnnexesAnnexesAnnexes

Table de lecture 3* : Valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition et des CMI pour Pseudomonas aeruginosa Conditions du test : Milieu : Gélose Mueller- Hinton Contrôle de qualité : Inoculum : Colonies en suspension, 0,5 Mc Farland Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Incubation : 35°C, atmosphère ordinaire ; 18h. Antibiotiques testés

Charge des disques

Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml)

-lactamines :

Ticarcilline 75 µg

Résistant Intermédiaire Sensible Résistant Sensible

≤14 --- ≥15 ≥128 ≤64

Ticarcilline + ac.clavulanique 75/10 µg ≤14 --- ≥15 ≥128/2 ≤64/2

Pipéracilline 100 µg ≤17 --- ≥18 ≥128 ≤64

Ceftazidime 30 µg ≤14 15-17 ≥18 ≥32 ≤8

Aztréonam 30 µg ≤15 16-21 ≥22 ≥32 ≤8

Imipenème 10 µg ≤13 14-15 ≥16 ≥16 ≤4

Aminosides

Amikacine 30 µg ≤14 15-16 ≥17 ≥32 ≤16

Gentamicine 10 µg ≤12 13-14 ≥15 ≥8 ≤4

Netilmicine 30 µg ≤12 13-14 ≥15 ≥32 ≤12

Tobramycine 10 µg ≤12 13-14 ≥15 ≥8 ≤4

Quinolones

Ciprofloxacine 5µg ≤15 16-20 ≥21 ≥4 ≤1

La composition chimique des milieux de cultures

� Milieux d’isolement

Les milieux d’isolements sont des milieux qui permettent d’effectuent les testes

d’identification ou d’étudier la sensibilité aux antibiotique des bactéries d’intérêts médicale.

Seules les géloses les plus couramment utilisées seront abordées.

� Gélose nutritive

Sa composition est la suivante

- Extrait de viande de bœuf : 1 g /l

- Extrait de levure : 2g/l

- Peptone : 5g/l

- Chlorure de sodium.

- Agar :15g/l

- PH : 7,4-+ 0,2

� Gélose de Muller- Hinton

L’utilisation de cette gélose est recommandée par le comité de l’antibiogramme de la société

française de microbiologie.

Ce milieu utilisé pour tester la sensibilité des bactéries aux antibiotiques : sa composition est

la suivante :

- Infusion de viande de bœuf : 30 g/l

- Hydrolysat de caséine : 17,5 g /l

- Amidon 1,5 g/l

- Agar 17 g/l

- PH : 7,4 -+ 0,2

� King A

Mise en évidence de la pyocyanine de pseudomonas aeruginosa.

- Peptone : 20 g

- Glycérol 10 g

- Sulfate de potassium 10 g

- Chlorure de magnésium 1,4 g

- Agar purifié 12 g

- PH =7,2

� King B

Mise en évidence de la pyoverdine de pseudomonas aeruginosa.

- Polypeptone 20 g

- Glycérol 10

- Hydrogénophosphate de potassium 1,5 g

- Sulfate de magnésium heptahydrate 1,5 g

- Agar purifié 12 g

- PH 7,2

.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est l’un des principaux agents pathogènes incriminé

dans les infections nosocomiales. Les infections nosocomiales causées par cet

organisme sont souvent difficiles à traiter du fait de la résistance intrinsèque à la fois de

l’espèce et sa remarquable capacité à acquérir d'autres mécanismes de résistance à

plusieurs groupes d'agents antimicrobiens, y compris les β-lactamines. La détection des

profils de résistance acquise des souches de Pseudomonas aeruginosa isolées au

niveau des hôpitaux permet une prise en charge efficace et la mise en place des

précautions de prévention.

Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, β-lactamines, résistance, BLSE

AbstractAbstractAbstractAbstract

Pseudomonas aeruginosa is o major pathogene implicated in nosocomial

infections. Nosocomial infections caused by this organisme are often difficult to treat

because of the intrinsic resistance of both the species and its remerkable ability to

acquire additional resistance mechanisms to several groups of antimicrobial

agents,including ß- lactam antibiotics. Detection of acquired resistance profiles of

Pseudomonas aeruginosa strains isolated in hospitals enebles effective management

and implementation of preventive care.

Keywords : Pseudomonas aeruginosa, ß- lactam, resistance, ESBL

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