Lumière et matière du vivant

Vincent SOL Colloque E2Phy 2013 Limoges, 28 aout 2013

1

Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles

UPRES EA 10.69, GDR CNRS 30.49

Université de Limoges

Ressources humaines 9 professeurs

21 maîtres de conférences 7 techniciens et administratifs

20 doctorants 3 stagiaires post doctoraux par an

1 à 2 professeurs étrangers invités par an 6 entreprises en incubation ou adossées au laboratoire

Chimie organique

Biologie, Physiologie, Microbiologie

Biochimie

Composés à finalité thérapeutique

Valorisation des co-produits

agricoles et forestiers

Modification des substances naturelles

Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles

UPRES EA 10.69, GDR CNRS 30.49

Université de Limoges

Substrats clefs

• Photosensibilisateurs tétrapyrroliques

• Glucides

• Polysaccharides

• Polyphénols

5

Santé et lumière

Les effets thérapeutiques de la lumière sont connus depuis l’antiquité

Photothérapie : Effets intrinsèques de la lumière

Photochimiothérapie : Lumière et molécule photoactivable

Thérapie dynamique :

photochimiothérapie dynamique :

Lumière visible +

photosensibilisateurs + espèces

réactives de l’oxygène

6

La grande majorité sont principalement des porphyrines, chlorines ou phtalocyanines

N

NH

N

HN

Porphyrine

N

NH

N

HN

H

H

H

H

Chlorine

Phtalocyanine

Les photosensibilisateurs

NH

N

N

NN

NH

NN

18 e- π aromatiques Stables Forte absorption

dans le visible → Colorés

Exemples de macrocycles porphyriniques naturels

Structure 3D de la chlorophylle a

7

Structure 3D de l’hémoglobine

Spectres UV-Visible de porphyrines base - libre

380.0

0.000

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

380.0

0.000

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

Abs.

420 460 500 540 580 620 660 700.0 420 460 500 540 580 620 660 700.0

Wavelength (nm)

Soret

QIV

QIII

QII

QI X 10

QI

QII

QIII

QIV

etio rhodo

oxorhodo phyllo

QI

QII

QIII

QIV

QI

QII

QIII

QIV

QI

QII QIII

QIV

8

9

Bande de Soret

Bandes Q

QIV QIII QII QI

Spectroscopie UV-Visible

QI

Porphyrine méso Chlorine

10

Principe de la PDT anticancéreuse

Injection intraveineuse

Lumière

Quelques Quelques

minutes heures

11

Mécanisme de la photothérapie dynamique

Porphyrine

État excité singulet S1

Porphyrine

État fondamental S0

Illumination

Ab

sorp

tion

Flu

ore

scen

ce

C.I.S.

T1

Porphyrine

État excité triplet

C.I.S.: Conversion inter-système

Substrat•

Réactions radicalaires

Substrat

Destruction de la tumeur

Mécanisme

de type II

Mécanisme

de type I

1O2

3O2

E

2p

2px 2py

2p

2px2py

2px 2px 2py

2p2p

*

*

*

*

*2py *

E

3O21O2

Distribution des électrons pour l’oxygène à l’état triplet et singulet.

13

NHN

NH N

CH3

CH3

CH3 CH

3

OH

O

CH3

CH3

NH N

NHN

CH3 CH

3

CH3

CH3

CH3

CH3

COOH

COOH

COOH

COOH

OH

Photosensibilisateurs de 1er génération

NH N

NHN

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

HOOC

O

NH N

NHN

CH3 CH

3

CH3

CH3

CH3

CH3

COOHCOOH

OH

O

Photofrin ®, 1996. - Porphyrines animales (mélanges complexes) - Composition variable - Sérieux effets secondaires

14

NH

N

NH

N

OH

OH

OH

OH

H

H

H

H

Photosensibilisateurs de 2ème génération

NH

N

NH

N

HO2C

HO2C

CH3OOC

CH3OOC

Visudyne® -Dérivé de la benzoporphyrine -Utilisé dans le traitement de la DMLA

Foscan® - Chlorine très efficace - Manque de sélectivité

Structures parfaitement définies

• Irradiation vers 400 nm (bande de Soret)

= pénétration de 1-2 mm

• Irradiation ≥ 650 (bande QI) = pénétration de l’ordre du centimètre

Les macrocycles tétrapyrroliques

Distance de pénétration de la lumière dans les tissus vivants

Absorption de molécules endogènes

• A 400 nm (bande de Soret), absorbance de

l’hémoglobine et de la mélanine

• Au-delà de 1000 nm, absorbance de l’eau

15 Fenêtre d’irradiation PDT : 650-850 nm

16

- De structure chimique parfaitement définie. - Non toxicité à l’obscurité. - Stable vis-à-vis des enzymes circulantes et de la lumière d’irradiation. - Forte absorption de la lumière l > 650 nm (plus pénétrante).

- Sélectivité maximale pour les cellules tumorales.

Critères pour un photosensibilisateur idéal

Ciblage tumoral

• Le ciblage passif

Vaisseau sain : Fenestrations de 60 à 80 nm

Vaisseau tumoral : Fenestrations de 856 nm

17

• Effet EPR (Enhanced Permeability and Retention)

Ciblage tumoral

18

Taille d’un vecteur permettant d’atteindre la tumeur tout en évitant sa diffusion à l’organisme : 100-300 nm

Vaisseau sain Vaisseau tumoral

Vecteurs = Nanoparticules

19

Nanoparticules

• Protection des nanoparticules par des polymères hydrophiles

20

Dextran PEG

La cellulose

Polymère végétal ~ 50% de la masse végétale

Renouvelable

OO

OO

O

O H

O H

HO

O H

HO

O H

1

235

46

23

5

6

1

4

n

Structure : O

Structure spatiale de la cellulose

OO

OO

O

HO

O

HO

O

O

O

O H

O

O H

O O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OO

O

O

O H

O

O

HO

O

O

O

OO

O

OO

- Insoluble dans l’eau et la plupart des solvants organiques - Soluble par exemple dans le DMA/LiCl

Formation de microfibrilles

Échange de solvant MeOH/DMA

Solution LiCl/DMA à 6,7%

-

-

CN

CH3

H3C

H3C

Li

Cl

O

Li

ClH H

HO

O

OH

O

O

OH

H

H

H

H

HO

OO

OO

O

OH

O

O

O

HO

O

O

O

O

C

N

CH3

H3C

CH3

O

-

H

H

H O

OOH

OO

O

O

O

HO

O

O

OHO

OH

O

O

HO

O

O

O

OH

HHCl

Li

O

H3C

CH3

H3C

N

C

+

+

+

70°C, 4 h Cellulose dissoute

Concentration : 20 g / L

Dissolution de la cellulose dans LiCl/DMA

Fixation de porphyrines

sur la cellulose

Photothérapie dynamique anticancéreuse

Nanocristaux de cellulose photosensibles

Nanocristaux de cellulose (CNCs)

25

Fibre de cellulose

Macrofibrille

Microfibrille

Fibre Elémentaire

CNCs Répulsions électrostatiques

Hydrolyse acide

(H2SO4)

Domaine

amorphe

Domaine

cristallin

OO

OH

OHO

OH2

+

OO

OH

OH

OH n

OO

OH

OHO

OSO3

-

OO

OH

OH

OH n

+ OH2

S

O O

O-

O

H

Nanocristaux de cellulose (CNCs)

26

• Objectif : obtenir des nanoparticules de 100-300 nm

• Sources de cellulose privilégiées :

bois (CNCs : L = 100-200 nm et l = 3-5 nm)

coton (CNCs : L = 100-300 nm et l = 5-15 nm)

cristallinité du coton ~ 73%

cristallinité du bois ~ 35%

Objectif du travail

27

Purpurine

Elaboration des CNCs

28

Microscopie Electronique à Transmission

l = 10-20 nm

L = 100-200 nm

Elaboration des CNCs

CrI = (I002 – IAM)/I002 = 100%

L = 0,9λ/Hcosθ = 6 nm

29

Diffraction des rayons X

Spectroscopie infrarouge

• Oxydation periodique des CNCs

Oxydation periodique des CNCs

30

- Taux d’UAG oxydables présents à la surface des CNCs = 15,9%

Synthèses de la purpurine

31

Spirulina maxima

• Synthèse de la chlorine p6 polyaminée

Couplage de la polyéthylénimine (PEI) sur la purpurine et la bactériopurpurine

32

1 éq.

Profil UV-Visible

Chlorine p6 polyaminée

33

665 nm

• Chlorines

Production d’oxygène singulet

34

Références

EtOH

0,68

CHCl3

0,55

CHCl3

0,65 EtOH 0,75

• Méthode ① : milieu dilué, défaut de photosensibilisateur

- Couplage ionique :

- Couplage covalent :

Fixation des photosensibilisateurs sur les CNCs

35

Rendement de fixation 66%

Rendement de fixation 99,3%

DS = 0,012

DS = 0,018

Fixation des photosensibilisateurs sur les CNCs

• Méthode ② : milieu concentré, sous ultrasons

36

Rendement de fixation 46%

DS = 0,46

• Irradiation laser, 660 nm, 100 mW

Photoblanchiment de la chlorine p6 polyaminée

37

Photodégradation

~ 30% de chlorine après une irradiation de 150 J

Photosensibilisateur suffisamment stable pour une application PDT

Evaluation biologique in vitro

• Lignée cellulaire kératinocytaire HaCat

- Viabilité cellulaire

38

IC50 = 5-15 nM

Photofrin® : IC50 = 25 nM

Pas de cytotoxicité en absence d’irradiation

Lignée cellulaire kératinocytaire HaCat

- Internalisation des composés

Evaluation biologique in vitro

39

A B C

1 µm

Lignée cellulaire kératinocytaire HaCat

- Voies de mort cellulaire

Evaluation biologique in vitro

40

Evaluation biologique in vitro

• Lignée cellulaire gliale U87-MG

- Viabilité cellulaire

41

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

110.0

120.0

0 0.975 1.95 3.9 7.81 15.62 31.25 62.5 125 250 500 1000

Concentration (nM)

Via

bil

ité c

ell

ula

ire

(%)

Photofrin /obscurité Photofrin /lumière

9a /lumière 9b /lumière

9a /obscurité 9b /obscurité

IC50 = 0,33-0,48 µM

Photofrin® : inactif

Lignée cellulaire U87-MG

- Internalisation des composés

Evaluation biologique in vitro

42

Photofrin®

Membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poulet

- Tumeur gliale (U87-MG)

43

Evaluation biologique in vivo

Synthèse de fluorescéine polyaminée

Greffage sur les CNCs

Evaluation biologique in vivo

44

Membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poulet

- Suivie in vivo

45

Evaluation biologique in vivo

Injection de quelques µL

Souris immunodéprimées – Lignée U87-MG

- Etude

46

Evaluation biologique in vivo

Phase I = 16 jours

Phase II = injection du PS (2,5 mg/kg)

Phase III = irradiation laser 660 nm, 100 mW, 2x5 min.

6 heures

Phase IV = mesures des tumeurs, 3 fois/semaine, durant 18 jours

Evaluation biologique in vivo

• Souris immunodéprimées

- Etude : 7 individus

2 souris témoins

3 souris traitées avec la molécule libre (Groupe I)

2 souris traitées avec les CNCs photosensibles (Groupe II)

47

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

14 16 18 21 23 25 28 30 32 34

Vo

lum

e (m

m3)

nombre de jours après la greffe des tumeurs

Souris immunodéprimées

- Résultats

Evaluation biologique in vivo

48

Groupe I : ↓ 86,1 %

volume tumoral moyen 18 jours après traitement :

Groupe II : ↓ 84,6 %

Souris immunodéprimées

- Résultats

Evaluation biologique in vivo

49

A) B)

Témoin Traitée

14 jours après le traitement PDT

Evaluation biologique in vivo

50

Souris immunodéprimées

- Résultats Effets secondaires

Cloques

Boitement (24 heures)

Hématomes + plaies (7 jours)

Paralysie de la patte (9-16 jours) Cloques

Boitement (24 heures)

Hématomes (2 jours)

Moins d’effets secondaires

→ meilleur ciblage thérapeutique

Robinier : robinia pseudoacacia (faux acacia)

Nicolas Drogat

Robert Granet

Michel Guilloton

Pierre Krausz

Jean-Pierre Mbakidi

Vincent Sol

Gaëlle Begaud

Caroline LeMorvan

N. Mac Arthur

D. Léger

B. Liagre

A. Jiblaoui

S. Qiu

Acteurs

Gare

52

Vectorisation

• Vectorisation = transport d’un principe actif

• Obstacles à la vectorisation

- opsonisation = élimination du principe actif = diminution de l’efficacité

• Le vecteur peut apporter des solutions, en étant :

- de taille suffisante

- non toxique

- hydrophile

- peu chargé

55

O

O

OO O

OO

O

Om

OO

OO

n

OO

NH

N

NH

N

CH3

CH3

O

CH3

O

O

Avec : m / n ≈ 1 / 20

COMPOSÉ SYNTHÉTISÉ

Porphyrine fixée

NH

N

NH

N

CH3

CH3

OH

CH3

Monohydroxyphényltritolylporphyrine

NH

N

NH

N

CH3

CH3

O(CH2)10

COOH

CH3

CH3

CHO

OH

CHO

NH

NH

N

NH

N

CH3

CH3

OH

CH3

24 heures

Br-(CH2)10-COOEt (10 éq.)

K2CO3 (10 éq.) , DMF anhydre , T.A1)

KOH/EtOH (1 mol/L.)

DMF , 90 °C , 3 heures2)

+ +4 3CH3CH2COOH

reflux , 2 heures.

SYNTHÈSE DES PRÉCURSEURS

Rdt = 8 %

4-TTP-OH

Rdt = 84 %

Résultats : DS porphyrine = 0,05 (RMN 1H ) DS acide laurique = 2,7 (RMN 1H ) Rendement massique = 245 %

Fixation de la porphyrine et alkylation

OO

O*

OH

OH

OHn

NH

N

NH

N

CH3

CH3

O(CH2)10

COOH

CH3

OO

OOR

RO

ROn

cellulose

+

24 heures, 80°C.Avec R = H ou 4-TTP-O-(CH2)10CO-

selon le D.Sporphyrine

TosCl, Pyridine.

DMA / LiCl

OO

OOR

RO

ROn

O

O

OOR

RO

ROn

CH3(CH2)10COOH, TosCl

DMA / LiCl24 heures, 80°C.

Pyridine

Avec R = H ou 4-TTP-O-(CH2)10CO-

selon le D.Sporphyrine ou

CH3-(CH2)10-CO- selon le D.S

0,01 éq.

Précipitation par tampon phosphate, pH=7

SPECTRE UV-VISIBLE DU FILM PLASTIQUE OBTENU

300,0 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800,0

0,00

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1,8

1,9

2,0

2,1

2,2

2,3

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,00

nm

A

651,05590,77

554,58

516,18

418,21

Abs.

l

Spectre réalisé sous forme de film sans solvant Épaisseur ~0,1 mm

Souris immunodéprimées

- Résultats

Evaluation biologique in vivo

61 Rémission des tumeurs