les techniques histologiques ou…les principes fondateurs

Les techniques histologiques

Ou…les principes fondateursOu…les principes fondateurs

Les principes fondateursLes principes fondateurs

1 - Histologie = microscopie !…

• Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet.• Une lentille est un focalisateur de rayonnement

Mais qu’est ce qu’un microscope ?…

De particules subatomiques :lentille électromagnétique

Photonique :lentille en verre

Convexe Concave

Mais qu’est ce qu’un microscope ?…

• Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet.• Une lentille est un focalisateur de rayonnement• Un microscope fournit une image, perçue par l’œil. Il faut donc obtenir en sortie du microscope des rayons lumineux.• Pour fournir une image perceptible, il faut que l’objet modifie le rayonnement. Il peut modifier son amplitude (intensité), sa longueur d’onde (couleur), ou sa phase.

Le premier « microscope… »

Janssen, 1595

Robert Hooke : l’acte de naissance de la cellule

Micrographia (1665)

« De la structure du liège et des cellules ou des pores de quelques corps

spongieux du même genre »

Antonin van Leeuwenhoek

1830 à 1860 : la théorie cellulaireBrown (1831) : noyau cellulaire des cellules d’orchidéeSchwann (1839) : « Recherches microscopiques sur la concordance dans la structure et dans la croissance des animaux et des végétaux »

1674 : « animalcules »1683 : bactéries

REFLECTION

TRANSMISSION

Le premier Nikon (1900)

Un Olympus récent… (1998)

Source de lumière

Condensateur

(Objet)

Oculaire

Objectif

Rétine

Quel est donc le principe du microscope ?…

Loupe

GROSSIR…GROSSIR…

Rétine

Quel est donc le principe du microscope ?…

Oculaire

GROSSIR…GROSSIR…

Objectif

Grossissement = Objectif x OculaireGrossissement = Objectif x Oculaire

Mais comment grossir ?…

10 x 100 = ?…

Mais comment grossir ?…

RESOLUTION

Le grossissement peut se faire sans résolution...

Photode

journal

Photode

livre d’art

100X

…si l’information initiale est insuffisante !

Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope

Pour un microscope utilisant le rayonnement photonique, un grossissement de plus de 1500 fois donne une image trouble : Quelle que soit la qualité des lentilles, la résolution d’un microscope est limitée.

Rayon directsRayonréfractés

• La « quantité d’information » est donc d’autant plus importante que des spectres de diffraction d’ordres supérieurs peuvent participer à la formation de l’image.• Les spectres secondaires sont répartis dans l’espace ; le fait de capter un plus grand nombre de rayons doit donc donner une meilleure image...


• Abbe utilise une théorie à la mode : il admet que l’image créée par un microscope est liée à des interférences entre les rayons non modifiés par l’objet, et les rayons diffractés par l’objet.

Et ça marche...

Le nombre de spectres secondaires récupérés par un objectif dépend de son :

ouverture numériqueouverture numérique

n car cela permet de modéliser les performances des objectifs à immersion…O.N. =n.sinα

L’ouverture numérique est le sinus de l ’angle que fait le dernier rayon qui pénètre dans l’objectif avec l’axe de celui-ci, multiplié par l ’indice de réfraction du milieu traversé par les rayons lumineux.

Sinus car fonction croissante

et de comprendre le prix de ces objectifs (pensez aux bords…) ou des objectifs à grande distance frontale (pourquoi ?….) !


Dans ce modèle, la distance minimum entre deux points pour qu’ils soient détectés peut alors être évalué

Grosso modo, la résolution est limitéeà la moitié de la longueur d’onde du rayonnement

d=kλ

n.sinα

n.sin = ouverture numérique de l’objectif = longueur d'onde de la lumière incidentek = coefficient variant entre 0,5 et 1,22(en fonction des capacités de l'œil, en particulier à distinguer les différences de luminosités, et de l’orientation de la source lumineuse. En règle générale, on prend k = 0,61)

Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique de 1,4 ( = 70°, huile à immersion d’indice 1,15 ) :D’où d = 194 nm pour les radiations bleues (450 nm)… C’est la limite de résolution théorique du microscope optique

Université de Toronto (1938)

Porter KR, Claude A & Fullam EF (1945) J. Exp. Med. 81 : 233-246

RCA scope (1956) JEOL (années 1980)

UHV-TEM de JeolLe petit dernier de Philips...



2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste

Problème : transmission….Il faut passer au travers de l’objet !

D’où l’idée de le couper en tranches fines

- couper implique de durcir… par congélationpar inclusion paraffine

plastique

- inclure implique de maintenir...

- observer implique de contraster...

par fixation chimique

par coloration généraleélective

par histochimiepar immunocytologie

D’où le déroulement classique :

• Fixation de l’objet• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste et enfin… Observation

qui sera adapté - en fonction des contraintes des techniques microscopiques- en fonction du but recherché...

- fixateurs coagulants (précipitants)- fixateurs non coagulants (pontants)- fixateurs coagulants (précipitants)

• Fixation : le pari impossible• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste / observation

Stabiliser la structure sans l’altérer…

Formaldehyde Glutaraldehyde Tétroxyde d’osmium

- Méthanol, éthanol, acétone- Acide acétique, acide picrique- Composés mercurés

- fixateurs coagulants (précipitants)

- fixateurs coagulants (précipitants)- fixateurs non coagulants (pontants)

• Fixation : le pari impossible• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste / observation

Stabiliser la structure sans l’altérer…

Et leurs mélanges : Formol, liquide de Bouin, de Carnoy, de Zencker, ...

Gray (1954) dresse un liste de 700 mélanges fixateurs … et précise qu’elle est très incomplète !

Fixer est un art aussi difficile que la cuisine...

Milieu liquide qui peut se solidifier… suffisamment pour être coupé fin !

• Fixation : le pari impossible• Inclusion : réussir le melting pot• Coupe• Coloration / contraste / observation

Enrober la structure sans la déformer…

• Paraffine• Résines plastiques (Araldite, Epon, Métacrylates…)

Problème… : ce sont des milieux hydrophobes !Nécessité de déshydrater après fixation : alcool, acétone,...

Inclure demande de la patience...

• Fixation : le pari impossible• Inclusion : réussir le melting pot• Coupe : jouer avec le fil du rasoir• Coloration / contraste / observation

Optique :

5 à 20 µmMicrotome

couteau acier

Trancher la structure suffisamment fin…

Couper demande du doigté...

Electronique :

50 à 80 nmUltramicrotome

rasoir verre / diamant



2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste- couper implique d’inclure

- inclure implique de fixer

- observer implique de contraster...

3 - Les principaux types de microscopie

Fond clair

Contraste de phase

Nomarski(contraste d’interférence différentielle)

Fond noir

Optique

Optique

Microscopie à fond clair : colorations

Des recettes de cuisine !!!

Hémalun - Eosine

Azan

Optique

Microscopie à fond clair : colorations électives


Optique

Microscopie à fond clair : histochimie


Problème particulier :Comment préserver l’activité enzymatique

Optique

Microscopie à fluorescence

& al. : F-microscopies (FRAP, FLIP, FRET…)microscopies à effet tunnel, ...

Problème particulier :Comment préserver à la fois l’antigénicité et la structure...

Remarques techniques…Colorants :• Affinité pour les molécules chargées négativement (acides nucléiques…) :

- Les colorants sont chargés positivements (« bases »)Exemple : Hématoxyline, Hémalun,

- Les structures sont dites basophilesExemple : noyau, ribosomes (donc REG…)

• Affinité pour les molécules chargées positivement :- Les colorants sont chargés négativement (« acide »)

Exemple : éosine- Les structures sont dites acidophiles

Exemple : cytoplasme

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Remarques techniques…Artéfacts… :• Rétraction :

- espaces non colorés- lié à la fixation / déshydratation

REMARQUE : tout espace non coloré…… n’est pas forcément un artéfact !



• Stries / plis :- lié à la coupe / étalement



• Stries / plis :- lié à la coupe / étalement

• Crapoteries variées et diverses… :- lié à la poussière ambiante, aux colorants, ….

Electronique : transmission

Coupes Ultrafines(50 à 80 nm = 10 fois la membrane plasmique…)

Contraste :Sels de métaux lourds(Acétate d’uranyl, citrate de plomb)

Apparté : Tomographie...

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Electronique : balayage

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Electronique : balayage

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