LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES

NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION

S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen

SOMMAIRE

- Définition des cellules souches

- Transdifférenciation : polémiques

- Ontogénèse

- Méthodes d’exploration

- Régulation

- Expansion

Les Cellules Souches

Intestin Peau CerveauTissu

HématopoïétiqueMuscle

EctodermeMésodermeEndoderme

Foie

TOTIPOTENTES

PLURIPOTENTES

MULTIPOTENTES

PROGÉNITEURS

¢ MATURES

« TRANSDIFFÉRENCIATION » DES CELLULES SOUCHES

Nombreuses études in vivo et in vitro chez la souris

Transdifférenciation = phénomène rare + contexte de régénération post-lésionnelle

Mise en évidence du phénomène de transdifférenciation (1999-2003):

Controverses surle concept de transdifférenciation

Fusion cellulaire ?Reprogrammation ?

Homing ectopique?Populations hétérogènes de ¢ souches ?

Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle

through myeloid intermediatesFD Camargo, R Green, Y Capetenaki, KA Jackson & MA Goodel. Nat Med Dec 2003, 9: 1520-27

Semaines degestation

Début de la circulation sanguine

Colonisation du Foie par les précurseurs CD34+

3 5 117 9

SacVitellin

HématopoïèseIntravasculaire(aorte, artère vitelline)

Foie

Thymus

Moelle Osseuse

Ontogénèse de l’hématopoïèse chez l’homme

Fibroblastes Myofibroblastes

Cytokines

Macrophages

Protéoglycannes

Adipocytes

Chimiokines

CSH

Endothélium

Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines,

collagènes, TSP)

La « niche » hématopoïétique

Moelle osseuse

Thymus

Tis

su p

érip

hériq

ue

Cellules souches

Progéniteur Myélo-érythroïde

CFU-GEMM

Progéniteurlymphoïde

Pro-B

Pro-NK

Pro-T

Pré-B Lymphocyte BPlasmocyte

NK

Cellule dendritique

Pré-T

T auxiliaire

T cytotoxique

Compartiment des cellules souches

Compartiment des progéniteurs

Compartiment de maturation Précurseurs et cellules matures

sang

Cellules dendritiques

CFU-GM

CFU-M Pro-Monocyte Monocyte

Macrophage

CFU-G neutrophile neutrophile

éosinophileCFU-Eo éosinophile

basophileCFU-Baso basophileMastocyte

BFU-MK

BFU-E

Mégacaryocyte Plaquettes

Érythroblaste Érythrocyte

Myé

locy

tes

Gra

nulo

cyte

s

ProgéniteurLympho-myéloïde

Représentation schématique des différents compartiments du système hématopoïétique

Caractéristiques fonctionnelles

Caractéristiques phénotypiques

MÉTHODES D’EXPLORATION DES CSH

Différenciation MaturationDifférenciation

MARQUEURS IMMUNULOGIQUES

MARQUEURS FONCTIONNELS

CSH

CD34+ ou -

CD38-

Lin-

Thy-1-

QuiescenteRésistante au 5-FU

Rhod 123 faible

ProgéniteurImmature

CD34+

CD38-

Lin-

Thy-1+

QuiescenteRésistante au 5-FU

Rhod 123 faible

ProgéniteurMature

CD34+

CD38+

Lin±

Thy-1±

En cycleSensible au 5-FU

Rhod 123 fort

PrécurseurDifférencié

CD34-

CD38+

Lin+

Thy-1-

En cycleSensible au 5-FU

Rhod 123 fort

I- Caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques humaines

Séquence d’expression des marqueurs

Cellules MaturesPrécurseursProgéniteurs

Lignée Myéloïde

Lignée Lymphoïde

Megacaryocyte/Plaquettes

Monocyte

Erythrocyte

Eosinophile

Granulocyte

Cellules souches

CD34 HLA-DR, CD38…

Ag lin (CD13, CD41, GpA,

CD71, CD61…)

II - Tests fonctionnels pour l’étude de l’hématopoïèse

CSH humaines?

CS

H

SRC

Cultures à long terme

Pro

géni

teur

s

LTC-ICMy, Ly

Tests clonogéniques

CFC

Cel

lule

s en

cou

rsde

mat

urat

ion

Caractéristiques phénotypiques

1- Tests in vivo de transplantation xénogénique

SCID-RC(SRC)

3 - 4 mois

NOD-SCID

Irradiation sub-létale

(+ anti-CD122)

5 - 12 sem

2 sem

En pratique : identification des cellules souches humaines

Milieusemi-solide+ cytokines

2- Tests in vitro de culture

LTC-IC

Milieu+ sérum+ stroma

CFC

Fréquence des progéniteurs hématopoïétiques humains dans le sang de cordon ombilical

¢ mononucléées ¢ CD34+CD38-

SRC SRC 1 / 5x101 / 5x1055 1 / 6001 / 600

LTC-ICLTC-IC 1 / 2x101 / 2x1044 1 / 201 / 20

CFCCFC 1 / 250 1 / 3

Progéniteurs présents au sein desProgéniteurs présents au sein des

REGULATION DES CSH

Auto-renouvellement

Détermination

Différenciation

Facteurs extrinsèques

Facteurs intrinsèques

et / ou

Représentation schématique du rôle des facteurs de transcriptionhématopoïétiques aux différents stades de la différenciation

HoxB4Bmi1

C/EBP

Représentation schématique des principales étapes ciblesdes facteurs extrinsèques

ShhWntJagged/Delta

Comment expandre les CSH ?

X

X

QuiescenceAuto-renouvellement

DifférenciationApoptose

DélaiInhibition

StimulationMise en cycle

Approches expérimentales pour l’expansion des CSH humaines

- CYTOKINES :FLT3-L + TPO + SCF (Kobari et al; Piacibello et al)

± IL-6 + sIL-6R (Ueda et al)

- AUTRES FACTEURS SOLUBLES:Shh (via BMP4) (Bhardwaj et al)

FGF-1 (de Haan et al)

Wnt-5A (Murdoch et al); Wnt-3A (Willert et al)

- CELLULES FEEDER (co-cultures + cellules stromales) :(Connealy et al; Miller & Eaves; .... Dexter)

- FACTEURS DE TRANSCRIPTION :

Homéoprotéines : HOXB4 (HOXC4, B3, A9, A10, ...),bHLH : Tal-1/SCL, polycomb : Bmi-1, ...

Voie Wnt/Catenine/GSK3 dans les cellules souches

(Dishevelled)

(Glycogen synthase kinase-3)

6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO)

X

Différenciation

Auto-renouvellement

HOXB4

Contrôle

Progéniteurs clonogénique

s

d 12 CFU-S Cellulesmatures

CRU

Sauvageau et al., 1995

Effets de sa surexpression sur l’hématopoïèse murine

HOXB4 :

Les homéoprotéines agissent sousforme de complexes transcriptionnels

1310998811 22

MEIS1

PBX1Coopération

Paralogues Hox

HOXPBX1

TGAT NNATFixation à l'ADN (Chang et al 1996; Shen et al 1997)

HoxB4 + Knock-down de PBX1 CSH « ultra-compétitives » (x 20 par rapport aux cellules surexprimant HoxB4 seul) (J. Krosl et al, 2003)

Effets de HoxB4 dans les CSH humaines(Buske et al. Blood, août 2002; Schiedlmeier et al. Blood, mars 2003)

Expression ectopique par transduction rétrovirale

(= expression constitutive du transgène)

Augmentation du nombre des cellules greffant

dans les souris NOD-SCID (SRC) et des CRU (x 3-4)

Comment expandre les CSH humaines

Sans utiliser de cytokines exogènes* perte de potentiel (?)

Sans transfert de gènes * mutagenèse insertionnelle

* leucémogénène à long terme ?

* dérégulation de l’hématopoïèse terminale ?

Transduction de la protéine HOXB4

Propriété des homéodomaines

Transport intercellulaire atypique : sécrétion spontanée et internalisation indépendante de récepteur

(formation de micelles inverses)

La 3ème hélice de l’homéodomaine :

- permet la liaison à l’ADN

- nécessaire et suffisante pour l’internalisation

de la protéine

Résumé de notre travail

• La PROTEINE HOXB4 est capable de pénétrer passivement dans des cellules hématopoïétiques

• Ce système permet une expansion des cellules hématopoïétiques

humaines primitives, sans manipulation de leur génome, par passage

passif (et réversible) de la protéine

Nouvelle approche pour des protocoles d’expansion ex vivo des

CSH humaines

Dans un système de co-culture de CSH humaines avec des cellules stromales sécrétant HOXB4

Amsellem et al, Nat Med, nov 2003