1

Lecture interprétative de l’antibiogramme

Jean-Didier CAVALLO

Ecole du Val-de-Grâce

2

Pourquoi un antibiogramme ?

• Intérêt thérapeutique (individu) – Mesurer la sensibilité d’une souche bactérienne à un ou

plusieurs antibiotiques et dépister les résistances acquises ----> orientation des décisions thérapeutiques

• Intérêt épidémiologique (collectif)

– Suivi épidémiologique des résistances bactériennes ---> évolution des spectres cliniques des antibiotiques ---> adaptation de l’antibiothérapie probabiliste

3

Délai entre introduction des antibiotiques et apparition des résistances acquises

Antibiotique Années mise sur le marché résistances acquises pénicilline 1943 1945 (S. aureus)

streptomycine 1947 1947 tétracycline 1952 1956 méthicilline 1960 1961 (S. aureus)

acide nalidixique 1964 1966 gentamicine 1967 1969 vancomycine 1972 1987 (entérocoques)

céfotaxime 1981 1981-1983 linézolide 2000 1999 (E. faecium) daptomycine 2003 1991 (S. aureus)

4

Pression de sélection antibiotique « les effets collatéraux »

Traitement antibiotique bactérie cible

Résistant

Sensible

Flores commensales

guérison

échec Hôte

5

Sélection des résistances

• Micro-organismes naturellement résistants – Clostridium difficile, Bacilles à Gram négatif naturellement

résistants, entérobactéries du groupe 3, Pseudomonas aeruginosa, entérocoques, Candida spp

• Résistances acquises

– mutant préexistant

– acquisition de gènes par transfert génétique

6

La prévalence des résistances acquises dépend de trois facteurs

• Pression antibiotique – Homme, animal…

• Transmission clonale de souches résistantes

– Directe (homme, animal) – Indirecte (rôle de l’environnement)

• Bactéries résistantes dans l’environnement

• Transmission de mécanismes de résistance – Entre bactéries même espèces ou espèces différentes – Chez un même individu

7

Apparition de résistance acquise pendant une monothérapie (infections sévères à BG-)

Antibiotiques nb ttt % R acquise Bactéries % échecs ttt

Ticarcilline 27 22 % P. aeruginosa 7,4 % Pipéracilline 71 7 % P. aeruginosa, Serratia 4 % Céfotaxime 25 4 % P. aeruginosa 4 % Ceftriaxone 103 8 % P. aeruginosa, Serratia 4 % Acinetobacter, Enterobacter Ceftazidime 166 10 % P. aeruginosa, Enterobacter 4 % S. maltophilia Imipénème 277 5 % P. aeruginosa 2,5 % Ciprofloxacine 322 12 % P. aeruginosa, Serratia 4,4 %

Acinetobacter,

Milatovic D et al. Eur J Clin Microbiol 1987; 6: 234-244

8

Sensibilité (%) des E. coli isolés d’IUC en fonction des antécédents d ’antibiothérapie

Traitement antibiotique < 6 mois Antibiotique non β-lactamine quinolone

n = 212 66 56

Amoxicilline 68 41* 54 Amoxicilline + AC 72 41* 59 Ac nalidixique 92 83 63* Ciprofloxacine 97 94 78* * différence significative Source AFORCOPI-BIO, 1999

9

Emergence de résistance sous traitement par β-lactamines ou fluoroquinolones

Pseudomonas aeruginosa

Analyse multivariée Résistance à un des 4 Ab dont l’Ab utilisé RR p RR p Pipéracilline 1,7 NS 5,2 0,01 Ceftazidime 0,7 NS 0,8 NS Imipénème 2,8 0,02 44 0,001 Ciprofloxacine 0,8 0,6 9,2 0,04

Carmeli Y et al Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:1379-1382

10

Association résistance - antécédent de traitement par β-lactamines chez S.

pneumoniae

Fréquence résistance β-lactamines Antécédent traitement > 5 jours OR p Aminopénicilline 10,3 < 0,001

Céphalosporines 5,6 < 0,05

Guillemot D et al. Clin Microbiol Infect. 1999; 5: 4S38-4S42

11

Des mécanismes de résistance et outils génétiques variés

1.Imperméabilité 2. Hyperexpression efflux actif

4. modification ou protection de la cible

3. Hydrolyse enzymatique

Antibiotique

Mutation préexistante

intégron

plasmide

transposon

transformation

13

Mécanismes de résistance (1)

Antibiotiques Imperméabilité - efflux

Enzymes d’inactivation

Modification ou altération de la cible

Beta-Lactamines Mutation porines

Efflux Mutation LPS (rare)

Beta-lactamases Pénicillinases

céphalosporinases, carbapénémases

PLPs mutées, recombinées ou supplémentaires (PLP2a SARM)

Aminosides Défaut de transport

Efflux

Acetyltranférases Phosphotransférases

Nucleotidyl transférases

Méthylation ARN 16 S (rare)

Quinolones Efflux

Porines Acétylase (rare)

Mutations ADN gyrase, topoisomérase IV

Cible protégée (qnr)

Glycopeptides

Gram (-): naturelle peptidoglycane

remanié surproduit (S. aureus)

- Acquisition gènes van

14

Mécanismes de résistance (2)

Antibiotiques Imperméabilité- efflux

Enzymes d’inactivation

Modification de la cible

Macrolides Lincosamides

Streptogramines

Gram (-): naturelle Efflux (cocci G+)

Estérase ou phosphotransférases

(rare)

Acquisition méthylase de l’ARN

23S ou mutation ARN 23S

oxazilidones Gram (-): naturelle - Mutation ARN 23S (rare)

Fosfomycine Déficit transport

(systèmes GlpT ou UlpT)

Glutathion-S- transférase (rare)

Rifampicine Gram (-) : naturelle ADP-ribosyl transférase (rare)

Mutation ARN-polymérase

Acide fusidique Gram (-): naturelle Mutation EF-6

15

Mécanismes de résistance (3)

Antibiotiques Imperméabilité- efflux, autres

Enzymes d’inactivation

Modification de la cible

Tétracyclines Mutation porines

Efflux TetX (Bacteroides) Protection de la cible

Chloramphénicol Efflux Chloramphénicol acetyl transférase

Sulfamides -

- Mutation DHPS

DHPS additionnelle faible affinité

Triméthoprime - -

Mutation DHFR DHFR additionnelle

faible affinité Surproduction DHFR

Polymyxines Imperméabilité

membranaire (LPS) (rare)

Métronidazole Défaut d’activation Nim (Bacteroides)

16

Antibiotique sélecteur

• Peut induire des résistances croisées – à la même famille d’antibiotiques – à d’autres familles d’antibiotiques

• hyperexpression de l’efflux • défaut de perméabilité

• Peut induire des résistances associées – sélection de souches portant plusieurs mécanismes de

résistance • intégrons multirésistants • cumul de mécanismes indépendants

17

Hyperexpression des systèmes d’efflux résistances croisées chez P. aeruginosa

Système d’efflux Antibiotiques touchés MexAB-Opr M ß-lactamines, Fq, Tmp, Cm, Tet MexCD-Opr J Fep, Cfp, Fq, Tmp, Ery, Cm, Tet MexEF-Opr N Fq, Tmp, Cm, Tet, (Ipm, Mpm) MexXY-Opr M Fep, aminosides, Ery, Tet, (Fq)

18

Résistances associées exemple de P. aeruginosa

Tic Pip Caz mécanisme (fréquence) % de souches I+R Imp Tm An Cip S S S aucun (62 %) 5 5 3 14 I/R S S/I RNE (16 %) 27 22 15 46 I I/R S Case BN (6 %) 25 50 29 68 R R R Case HN (4 %) 75 69 62 75 R I I Case BN + RNE 36 36 14 64 R R S Pase (2 %) 30 100 80 80 R R I Pase + Case (5 %) 59 77 50 77

19

Méthodes d’étude au laboratoire en routine

Etude de la sensibilité aux antibiotiques / mesure directe de la CMI

– dilution en gélose – dilution en milieu liquide – E-test® / mesure indirecte de la CMI – méthode de diffusion en gélose – galerie antibiogramme

+ lecture interprétative Conclusion S, I, R

20

CMI par dilution en milieu liquide

CMI par dilution en milieu solide

Boîtes avec dilutions antibiotiques 0,007 512 mg/L

Exemple Neisseria meningitidis

boîte pénicilline 0,03 mg/l

Macrodilution Microdilution

Ab 1 Ab 2 AB3 Ab4 Ab 5 AB6 Ab7 Ab8

0,25mg/l 64 mg/L

0,125mg/l 64 mg/L

21

Mesure des CMI par E-test

CMI

S. pneumoniae : CMI de 0,75 mg/L pour la ceftriaxone

22

Antibiogramme par diffusion Courbes de concordance CMI - diamètres

0 CMI (mg/l)

D (mm)

D

d

C c

23

Valeurs critiques des diamètres d’inhibition (mm) par antibiotique – espèce

0 D

≥ D < d Intermédiaire Résistant Sensible

Diamètre (mm) d

disque Ab

disque Ab

disque Ab

24

Pseudomonas aeruginosa

TIC IPM

PIP

CFS

ATM TCC

FEP AN TM

FOS

CAZ PTZ SXT CIP

CS

Ticarcilline R Cefsulodine R Imipénème S

Pipéracilline R

Fosfomycine S

Gentamicine R

Pipé+Tazo R

Tobramycine R Amikacine R Céfépime I

Ticar + ac Clav R Aztréonam S Colistine S

Ceftazidime S Cotrimoxazole R Ciprofloxacine R

25

Galerie antibiogramme

Photo Monique Couture

26

Galerie Antibiogramme mise en évidence de la croissance bactérienne

en milieu liquide

0 3 5 18 heures

lecture rapide automatisée

DO

lecture automatisée ou visuelle

DO

Permet un rendu en 6 heures

27

Rôle du microbiologiste

1. Connaître les résistances intrinsèques – « naturelles »

2. Dépister des phénotypes de résistance acquise exceptionnels

– Exemples • Résistance à la pénicilline chez S. pyogenes • Résistance à la vancomycine chez S. aureus • Entérobactéries résistantes aux carbapénèmes

3. Lecture interprétative – Règles d’expertise

• CA-SFM et EUCAST

28

Choix des antibiotiques à tester

• Recommandations CA-SFM – Par espèce ou groupe bactérien – Antibiogramme standard (liste 1)

• antibiotiques nécessaires à l ’orientation thérapeutique, en fonction des indications cliniques (type d ’infection) et de la prévalence de la résistance acquise

– Tests complémentaires (liste 2) • Intérêt épidémiologique, aptitude à détecter un mécanisme de résistance

ou antibiotique de recours

29

S. pneumoniae

Liste standard

Pénicilline G Ampicilline ou amoxicilline

Oxacilline* Cefotaxime ou ceftriaxone

Erythromycine Telithromycine

Lincomycine ou clindamycine Pristinamycine Norfloxacine*

Vancomycine ou teicoplanine

Liste complémentaire

Autres β-lactamines Gentamicine 500 µg

Streptomycine 500 µg Kanamycine 1000 µg

Chloramphénicol Linézolide

Rifampicine Cotrimoxazole Fosfomycine

30

Antibiotiques marqueurs

• Dépistage mécanismes de résistance +/- exprimés • Molécule qui au sein d’un groupe d’antibiotiques est le

plus régulièrement touchée – Cefoxitine et résistance à la méthicilline pour staphylocoques – Oxacilline et résistance aux pénicillines pour S. pneumoniae – Ertapénème pour les carbapénémases chez les entérobactéries

31

Equivalence

• Certaines molécules sont représentatives d’un groupe d’antibiotiques

• Justifie l’utilisation d’un nombre restreint d’antibiotiques à l’antibiogramme

• Les résultats S,I,R obtenus pour ces molécules peuvent être étendus à d’autres antibiotiques du groupe – ex: une fluoroquinolone répond pour les toutes les autres chez

les staphylocoques et Acinetobacter

32

Résistances naturelles chez les entérobactéries

Espèce AM AMC TIC/PIP

C1G FOX CTT MA CXM GM TET COL FT

Klebsiella spp. C. koseri C. freundii E. cloacae E. aerogenes S. marcescens P. mirabilis P. vulgaris M. morganii P. stuartii Y. enterocolitica

R R R R R R

R R R R

R R R R

R R R

R R

R

R R R R

R R R R

R R R

R

R R R

R

R R

R

R

R R

R

R

R R R R

R R R R R

R R R R

R : résistance naturelle AM : aminopénicillines ; AMC : amoxicilline + acide clavulanique ; TIC : ticarcilline ; PIP : pipéracilline C1G : céphalosporines de 1ère génération ; FOX : céfoxitine ; CTT : céfotétan ; MA : céfamandole ; CXM : céfuroxime ; GM : gentamicine ; TET : tétracyclines y compris la tigécycline ; COL : colistine, polymyxine B ; FT : nitrofuranes.

33

Démarche interprétative du microbiologiste

• Phénotype de résistance observé in vitro – lecture des CMI, diamètres ou galeries – cohérence avec l’identification (Rn) – connaissance des mécanismes R acq. – tests complémentaires éventuels

• Mécanismes R peu exprimés

• Déduction du mécanisme de résistance probable – validation/ corrections résultats

Rendu de l’antibiogramme en S, I, R Commentaires (équivalence, conseils)

34

Méthode de détection des mécanismes de résistance

• Méthodes indirectes – évoquent la présence d’un mécanisme de résistance

• antibiotiques marqueurs • synergie entre deux antibiotiques

• Méthodes directes – mécanismes biochimiques

• ex: production de β-lactamase chez N. gonorrhoeae, H. influenzae – support génétique de la résistance

• ex: mise en évidence des gènes mecA (staphylocoques), vanA,vanB (entérocoques), rpoB (M. Tuberculosis)

35

Staphylocoques

• Résistance aux β-lactamines – Pénicillinase : péni A et G, carboxy, uréido – PLP2a (mecA) : toutes β-lactamines sauf ceftobiprole

et ceftaroline

Pénicillinase Pénicillinase + PLP2a

MOX MOX

FOX CIP

PG PG

CIP FOX

36

S. aureus et β-lactamines

SASM SASM SARM (Pase) (PLP-2a -mecA)

Péni*,AMX S R R FOX*,AMC,OXA S S R Autres β-lactamines** * Ab marqueurs ** Sauf ceftaroline, ceftobiprole

37

SARM “typique”

K

FOX

PG MOX

CIP

E L

TEC VA

GM

38

SARM “communautaire”

MOX

FOX CIP

VA

PG

TEC

PCR mecA

positive

39

S.epidermidis

K GM

TEC VA

RA

FA

SXT

E L

CIP

MOX PG

FOX

DO

RA

PT

40

Aminosides et lecture interprétative chez les cocci à Gram +

Phénotype Mécanisme Phénotype observé inferré prédit KaRTmSGmSANS APH(3’)-III KaRTmSGmSANI/R

KaRTmRGmSANS ANT(4’) KaRTmRGmSANI/R

GmR AAC(6’)-APH(2”) R tous aminosides sauf streptomycine

41

S. pneumoniae et β-lactamines

• Résistance liée à des PLP mosaïques • Dépistage / disque oxacilline 5 µg

– OXA ≥ 26 mm : rendu S aux β-lactamines – OXA < 26 mm et infection sévère

• Confirmation / CMI à péni G – S ≤ 0,06 mg/L, R > 1 mg/L

• Infection sévère – Faire CMI AMOX et/ou C3G (CTX, CRO)

42

Macrolides et streptocoques

Phénotype Mécanisme Phénotype observé inferré prédit EryRLinS Efflux R aux macrolides à Sans antagonisme 14/15 carbones

EryRLinR rRNA méthylase R aux macrolides à 14/15/16 carbones

43

S. pneumoniae OXA R NOR S

OXA

NOR

LIN ERY

44

S. pneumoniae OXA R E-test

PG : 1 mg/L

CTX : 0,5 mg/L AM : 0,38 mg/L

CRO : 0,25 mg/L

45

Glycopeptides et entérocoques

46

Glycopeptides et entérocoques

S Van A Van B Van C*

Vancomycine S R R R Teicoplanine S R S S * Résistance naturelle: E. gallinarum et E. flavescens

47

Enterococcus

AM

CRO

VA TEC

FUR GM 500

L

E. faecalis sauvage

E. faecium sauvage E. faecium vanA et GM R

AM

CRO

VA TEC

FUR GM 500

L

AM

CRO

VA TEC

FUR GM 500

L

48

Haemophilus influenzae

• Stratégies pour les β-lactamines – test chromogénique (β-lactamases) +

• Résistance toutes pénicillines • Sensible pénicilline + inhibiteur

– dépistage résistances non enzymatiques (PLP 3 mutée)

• disque ampicilline 2 µg diamètre < 20 mm • et/ou céfalotine 30 µg diamètre < 17 mm

49

Haemophilus influenzae

Sauvage Pase PLP3

Amoxicilline S R R Amox + Ac Clav S S R Céfalotine* S S R Céfotaxime S S S * Ab marqueurs pour PLP

50

H. influenzae – mutation PLP3

AM

AP

CEF

AMC

51

Entérobactéries

• Méthode de diffusion en gélose – gélose MH

• Dépistage des BLSE – si pénicillinase

• Dépistage des carbapénémases – ertapénème

52

β-lactamines et entérobactéries

Phénotype Mécanisme Phénotype observé inferré prédit AMRTicR TEM-1/2 PipI/R MecR

ou SHV-1

AMRTicR BLSE R à toutes β-lactamines

Synergie AC+CTX sauf céphamycine, carbépénèmes ou CRO ou CAZ ou ATM moxalactam

53

Dépistage des BLSE Synergie C3G – acide clavulanique

Images de synergie

C3G et acide clavulanique

54

E. coli produisant CTX-M

ERT

IPM

FOX

AMX CRO

AMC

CTX

FEP

ATM TIC

PTZ

PIP TCC

KF

CFM

CAZ

55

PCR positive CTX-M

56

K. pneumoniae OXA 48 (carbapénémase)

ERT

IPM

FOX

AMX CRO

AMC

CTX

FEP

ATM TIC

PTZ

PIP TCC

KF

CFM

CAZ

57

P. aeruginosa ß-lactamases à spectre étendu et carbapénémases

Enzymes TIC PIP CAZ ATM IPM AC/EDTA

BLSE PER-1 R I R R S + / - VEB-1,3 R I R R S + / - TEM 4, 42 R R R R S + / -

SHV 2a R I R S S + / -

OXA R I R I S -* / - 11,14, 15,16,18,19,28 Carbapénèmases IMP 1, 7 R I R S I/R - / +

VIM 1, 2, 3 R R R S I/R - / + * Sauf OXA 18 : + / -

58

Pseudomonas aeruginosa BLSE

TIC IPM

PIP

CFS

ATM TCC GM

AN TM

FOS

CAZ PTZ

CS

SXT CIP

FEP

59

CAZ

PIP

TIC

TCC

TZP

ATM

FEP

SYNERGIE

P. aeruginosa avec BLSE PER-1

60

ATM

FEP

CAZ

TCC

P. aeruginosa Synergie avec l’acide clavulanique mieux

vue sur MH + Cloxacilline

61

Pseudomonas aeruginosa avec carbapénamase VIM-2

CAZ TZP

CS

SXT

TIC IPM

PIP

CFS

ATM TCC

FEP AN TM

FOS

CIP

TM

Aztréonam moins touché

62

IPM = 12 mg/L IPM + EDTA = 2 mg/L

Carbapénémases métallo-enzymes

Inhibition par l’EDTA

Mais Attention à la spécificité

Faux positifs avec OprD2 Confirmer par PCR ++

63

Conclusion

• Rôle du biologiste – Identifier les résistances acquises

• Antibiotiques à visée thérapeutique – Lecture interprétative de l’antibiogramme

• Aide pour le clinicien – Dépister les mécanismes sous surveillance

• Isolement des patients • Dialogue biologiste-clinicien ++