le facteur de croissance vasculaire endothéliale induit les protéines de la matrice...

Sciences fondamentales

Le facteur de croissance vasculaireendoth�eliale induit les prot�eines de la matriceextracellulaire et l’ost�eopontine dans l’artereombilicale

Manfred Infanger,1 Jirka Grosse,2 Kriss Westphal,2 Annekatrin Leder,2 Claudia Ulbrich,2

Martin Paul,2 Daniela Grimm,2 Berlin, Allemagne

Le facteur de croissance vasculaire endoth�eliale (VEGF) est un m�ediateur mitogene, an-giog�enique, et puissant de la perm�eabilit�e vasculaire. Il joue un role dans les l�esions, contribuea l’oedeme pendant la phase aigue des l�esions tissulaires, et favorise le remodelage pendant lar�ecup�eration. Nous avons r�ecemment montr�e que les taux s�eriques de VEGF des brul�es pr�esen-tant un nombre important de l�esions vasculaires �etaient significativement augment�es. Ici, nous�etudions les effets de VEGF sur des vaisseaux sains trait�es avec une concentration de VEGFcomparable a celle des brul�es graves. Du VEGF 165 (0,2 mL d’une solution a 10 ng/mL) ou unesolution de transport (s�erum physiologique a 0,9%) �etaient mis en contact avec des arteres om-bilicales pendant 90 min a 37 �C. Le cordon �etait ensuite perfus�e pendant 4 hr. Pendant la per-fusion, les parametres fonctionnels et biochimiques �etaient maintenus dans les margesphysiologiques. Les vaisseaux �etaient ensuite analys�es en morphom�etrie, apres coloration aurouge sirius, en microscopie a polarisation, par analyse Western blot, et en immunohistochimie.Par ailleurs, des cellules endoth�eliales humaines cultiv�ees de veine ombilicale (CEVOH) �etaienttrait�ees avec du VEGF ou su s�erum physiologique pendant 90 min et 5,5 hr pour �etudier lesprot�eines de la matrice extracellulaire (MEC) et les r�ecepteurs de la tyrosine kinase. Les arteresombilicales trait�ees au VEGF avaient un oedeme tissulaire significatif et une facilitation de la la-minine et du collagene de type I, III, et IV par comparaison avec les arteres controle. Nous avonsd�etect�e une augmentation de Flt-1, de Flk-1, de l’ost�eopontine, et de la ß1-int�egrine. En cytom�etriede flux, VEGF induisait pr�ecocement la laminine dans les CEVOH. De meme, VEGF induisait unequantit�e plus �elev�ee d’ost�eopontine, de ß1-int�egrine, et des deux kinases du r�ecepteur de latyrosine par les cellules endoth�eliales en 90 min. L’application endoluminale de VEGF augmenteles prot�eines de MEC, l’ost�eopontine, et la production de ß1-int�egrine par l’endoth�elium, tout enentraınant un oedeme tissulaire. VEGF initie le remodelage vasculaire des qu’il produit del’oedeme, meme si le vaisseau cible n’est pas l�es�e. L’ost�eopontine et la ß1-int�egrine, tous deuxinduits par VEGF, peuvent jouer un role important dans le processus de remodelage vasculaire.

DOI of original article: 10.1016/j.avsg.2007.11.002.

M. I. and J. G. ont contribu�e �egalement a ce travail.1Department of Trauma and Reconstructive Surgery, Charit�e-

Universitatsmedizin, Berlin, Allemagne.2Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charit�e-

Universitatsmedizin, Berlin, Allemagne.

Correspondance : Daniela Grimm, MD, Institute of ClinicalPharmacology and Toxicology, Charit�e-University Medicine Berlin,CBF, Garystrasse 5, D-14195 Berlin, Allemagne, E-mail: [email protected]

Ann Vasc Surg 2008; 22: 273-284DOI: 10.1016/j.acvfr.2008.05.001� Annals of Vascular Surgery Inc.�Edit�e par ELSEVIER MASSON SAS

296

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

Vol. 22, No. 2, 2008 VEGF et ost�eopontine 297

INTRODUCTION

Le facteur de croissance vasculaire endoth�elial

(VEGF) est un mitogene sp�ecifique de la cellule

endoth�eliale in vitro et un m�ediateur principal de

l’angiog�enese et de la perm�eabilit�e vasculaire in

vivo.1-6 La prot�eine de 45 kDa se compose de deux

sous-unit�es, qui induisent presque exclusivement la

prolif�eration des cellules endoth�eliales. Cinq iso-

formes humains avec diff�erents nombres d’acides

amin�es (VEGF 121, 145, 165, 189, 206) ont �et�ed�ecrits.7 VEGF 121 et VEGF 165 sont des isoformes

solubles et sont les plus abondants. VEGF 165 est un

stimulateur important de la prolif�eration des cellules

endoth�eliales,8 et VEGF 121 est responsable de

l’augmentation de la perm�eabilit�e vasculaire.9

L’expression de VEGF est control�ee par la

diff�erentiation, la transformation, et la fourniture

d’oxygene. L’effet de VEGF est m�edi�e par deux

kinases du r�ecepteur de la tyrosine, VEGFR-1/flt-1

(fms-like tyrosine kinase-1) et VEGFR-2/flk-1

(kinase de foie foetal)/KDR, qui sont presque

exclusivement sur les cellules endoth�eliales.

Les cellules endoth�eliales de l’intima sont haute-

ment sp�ecialis�ees, avec des fonctions endocrines, exo-

crines, d’adh�esion des cellules, de coagulation, et des

fonctions de transport, et jouent un role important

dans les m�ecanismes du flux sanguin, de la r�egulation

de la coagulation, de l’adh�erence des leucocytes, et de

la croissance des cellules musculaires lissesvasculaires

; elles servent �egalement de barriere a la diffusion

trans-vasculaire des liquides et des corps dissous. Elles

peuvent s’adapter rapidement aux changements

d’environnement.7,10 Quand, par exemple, les tissus

avoisinants sont l�es�es par des brulures ou par l�esions

c�er�ebrales traumatiques, la perm�eabilit�e vasculaire

est augment�ee, avec pour r�esultat un oedeme tissu-

laire local et g�en�eral. VEGF semble impliqu�e dans ces

processus, et Harrigan et coll.11 ont montr�e que la

perfusion intraventriculaire de VEGF favorise l’an-

giog�enese avec un oedeme c�er�ebral minime. Notre

groupe a montr�e que le niveau de VEGF est si-

gnificativement augment�e chez les patients pr�esen-

tant une brulure grave.12

En plus du VEGF, des int�egrines et des consti-

tuants de la matrice extracellulaire (MEC) sont

impliqu�es dans les fuites vasculaires et le remode-

lage. Nous avons montr�e que l’application endolu-

minale de VEGF est salutaire au processus de

cicatrisation en microchirurgie vasculaire et qu’une

augmentation des prot�eines de la MEC accompagne

la cicatrisation d’anastomoses microvasculaires.13

Beaucoup de prot�eines de la MEC, y compris divers

types de collagene, la fibronectine, la laminine, et la

vitronectine, sont d�etectables dans les vaisseaux

sanguins.14-16 Certaines sont des ligands pour les

int�egrines, qui sont des mol�ecules h�et�erodim�eriques

transmembranaires qui se composent de sous-unit�es

a et b. Les r�ecepteurs d’adh�esion de la ß1-int�egrine

controlent la fixation des cellules endoth�eliales a la

MEC et facilitent leur croissance, leur migration, et

leur capacit�e a d�eposer des prot�eines de matrice. Ils

sont des facteurs importants de la rest�enose et de

l’ath�eroscl�erose.17 Le mode d’action de VEGF sur

l’expression des int�egrines et les diff�erents compo-

sants de la MEC reste inconnu.

On sait cependant que les l�esions d’un nombre

consid�erable de vaisseaux, comme cela est observ�echez les patients ayant une brulure d’au moins

30% de leur surface corporelle, d�eclenchent une

expression majeure de VEGF.12 Entre les premiere

et troisieme semaines apres l’accident, les taux

s�eriques de VEGF sont au moins octuples du niveau

normal. Ceci peut etre une raison importante du

d�eces de beaucoup de patients. Par cons�equent,

nous �etions int�eress�es a �etudier les effets des

concentrations �elev�ees de VEGF sur un vaisseau

normal.

Pour �etudier les effets de concentrations patholo-

giques de VEGF sur un vaisseau sain, nous avons

appliqu�e une perfusion ex vivo, qui s’est d�eja av�er�ee

etre un modele utile de perfusion pour un coeur

h�emoperfus�e isol�e fonctionnant ex vivo.18,19

L’appareil permet des �etudes dans des conditions

physiologiques d’�ecoulement et permet l’enregis-

trement en ligne du d�ebit et des pressions. Nous

avons ensuite recherch�e l’oedeme et �evalu�e le

remodelage potentiel. Nous avons d�etermin�e l’ex-

pression des int�egrines, des prot�eines de la MEC, et

des kinases du r�ecepteur de la tyrosine dans l’artere

ombilicale sous l’influence de VEGF. Par ailleurs,

nous avons �etudi�e les effets du VEGF sur les cellules

endoth�eliales humaines de veine ombilicale (CE-

VOH) pour �etudier les changements des prot�eines de

la MEC et prouver que l’agent agit sur l’endoth�elium

ombilical ex vivo et in vitro.

METHODES

Obtention et transport des sp�ecimens

Vingt cordons ombilicaux ont �et�e obtenus de l’Unit�ede N�eonatologie de l’Hopital Universitaire de la

Charit�e (Berlin, Allemagne). Ces cordons ombilicaux

ont �et�e obtenus de femmes en bonne sant�e et normo-

tendues (tension art�erielle normale, absence d’infec-

tion ou de diabete) apres accouchement a terme par

c�esarienne et employ�es pour les exp�eriences de perfu-

sion. Les criteres d’exclusion �etaient les l�esions vascu-

laires et les anomalies du cordon ombilical. Seuls les

298 Infanger et al. Annales de chirurgie vasculaire

segments d’une longueur de 12 cm �etaient choisis.

Juste apres la naissance, le cordon ombilical �etait

soigneusement pr�epar�e et plac�e dans une solution

isotonique. Les cordons ombilicaux �etaient trans-

port�es au laboratoire dans un d�elai de 1 hr (pr�eserv�es

du s�erum physiologique froid [4 �C]).

Pr�eparation des cordons

Apres examen (exclusion d’anomalies, par exemple

une artere ombilicale simple, une plicature ou un

noeud, partiels ou complets), 20 cordons ombilicaux

ont �et�e pr�epar�es. Une partie de ces sp�ecimens a �et�epr�elev�ee en tant que controles non perfus�es (Cnp,

n¼ 20). A l’aide de la microscopie, une artere om-

bilicale et la veine �etaient pr�epar�ees et canul�ees

(cath�eter d’alimentation p�ediatrique). Les cath�eters�etaient fix�es aux vaisseaux avec des sutures (Vicryl

3-0 ; Ethicon, St-Stevens-Woluwe, Belgique). Puis

0,2 mL de VEGF 165 (groupe VEGF n¼ 10, 10 ng/

mL ; Chemicon, Hofheim, Allemagne) ou d’une

solution v�ehicule (groupe Cp n¼ 10, s�erum a 0,9%)

et 0,2 ml de bleu d’Evans (Merck, Darmstadt, Alle-

magne ; 2% dilu�es dans du s�erum physiologique)�etaient inject�es dans le cath�eter art�eriel (groupes

perfus�e). Ensuite, les arteres de cordon ombilical�etaient incub�ees a 37 �C pendant 90 min dans une

chambre de perfusion (temps d’adaptation).

Modele de perfusion du cordon ombilical

Apres adaptation (90 min), le groupe Cp et les cor-

dons ombilicaux du groupe VEGF �etaient reli�es a

l’appareil de perfusion r�ecemment d�ecrit, 18,19 tan-

dis que les 20 sp�ecimens de cordon ombilical non

perfus�es (controles z�ero) servaient de controles

(Cnp). Ensuite, une temp�erature de 37 �C �etait

r�etablie et la perfusion commencait avec une solu-

tion de dialysat humain (1872,3 mL d’eau bidistill�ee

st�erile, 57,1 mL de solut�e d’h�emodialyse SW 239 A9

; Braun, Melsungen, Allemagne) et 70 mL d’une

solution de bicarbonate pour h�emodialyse (Bic

8,4%, Braun). La solution (pH 7,4) contenait

140 mmol/L Na+, 2 mmol/L K+, 1,75 mmol/L Ca2+,

0,75 mmol/L Mg2+, 112 mmol/L Cl-, 32 mmol/L

HCO3-, 84 g/L NaHCO3, 3 mmol/g/L CH3COO-, et

2 g/L de glucose. Selon le protocole, la circulation de

perfusion contenait 750 ml de dialysat et la circu-

lation de dialysat 1250 ml de solution de dialysat.

Tandis que la solution de perfusion �etait perfus�ee

dans le cordon ombilical pendant 4 hr, elle �etait

maintenue a 37 �C par un �echangeur de chaleur

reli�e a un bain d’eau et oxyg�en�e par un d�ebitmetre

(DK800R ; Krohne, Duisburg, Allemagne) avec un

m�elange d’oxygene et d’anhydride carbonique

(95% d’O2 et 5% de CO2). Les donn�ees

h�emodynamiques �etaient surveill�ees avec un mi-

crocontroleur reli�e a un PC avec un logiciel adapt�e(Mediport Biotechnik, Berlin, Allemagne), �evaluant

sans interruption ces parametres : d�ebit, pressions de

perfusion art�erielles et veineuses. Nous avons men�eune analyse continue de la solution en ce qui con-

cerne son pH et sa temp�erature (37 �C), ainsi que des

analyses des gaz en solution pendant l’exp�erience

(ABL 555 ; Radiometer, Copenhague, Danemark).

Par ailleurs, les taux de sodium, de potassium, de

calcium, et de bicarbonate �etaient d�etermin�es dans

le milieu de perfusion.18,19 A 1, 2, et 3 hr, 1 ml de

bleu d’Evans �etait inject�e dans l’artere ombilicale

par l’interm�ediaire d’un robinet a trois voies.

Exp�eriences de culture de cellules

Les CEVOH et le milieu de culture complet pour cel-

lules endoth�eliales (pret a employer) �etait achet�echez Promocell (Heidelberg, Allemagne). Trente

cultures de cellules ont �et�e trait�ees avec le v�ehicule

(s�erum a 0,9%) ou du VEGF 165 (10 ng/mL)

pendant 90 min ou 5,5 hr. Cinq �echantillons de

chaque groupe ont �et�e fix�es avec de l’�ethanol

(70%), et cinq autres �etaient congel�es rapidement

pour l’analyse Western blot.

Etude histologique et microscopie a

polarisation

Pour l’histologie, des coupes transversales du cor-

don ombilical (n¼ 10, chaque groupe) �etaient fai-

tes et color�ees a l’h�ematoxyline �eosine et au rouge

sirius. Une coloration sp�ecifique du tissu conjonctif�etait �egalement faite.13,20 Les coupes �etaient

immerg�es dans du fixatif methacarn, incluses en

paraffine, et sectionn�es en coupe de 3 mm

d’�epaisseur. Une coloration normalis�ee �etait r�ealis�ee

grace a un systeme de Robot-Stainer (Robot-Stainer

HMS 760 ; Microm International, Walldorf, Alle-

magne). Les vaisseaux �etaient examin�es dans un

microscope Zeiss Axiophot (Oberkochen, Allema-

gne). L’endoth�elium, la structure vasculaire, la gel�ee

de Wharton, et l’�epith�elium amniotique �etaient

document�es. La microscopie a polarisation a �et�eex�ecut�ee selon Junqueira et coll.20 Le collagene de

type I apparaıt jaune, orange, ou rouge, alors que le

collagene de type III semble vert.

Immunohistochimie

Les anticorps utilis�es pour cette �etude �etaient dirig�es

contre le collagene de type IV (1:100 ; Dako,

Hambourg, Allemagne), la laminine (kit pr�edilu�ede Sigma, Taufkirchen, Allemagne), le VEGF-A

(1:50, Chemicon), Flk-1, Flt-1 (1:50 pour les deux


; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Etats-

Unis), et l’ost�eopontine (1:100 ; Developmental

Studies Hybridoma Bank, Department of Biological

Sciences, Universit�e de l’Iowa, Iowa City, IA,

Etats-Unis). Les complexes antigene/anticorps�etaient visualis�es par la technique d’immunopero-

xydase indirecte.21,22

Analyse d’image automatique

L’analyse d’image automatique a �et�e appliqu�ee pour�evaluer quantitativement les changements intersti-

tiels de l’oedeme des tissus de cordon ombilical per-

fus�e et la distribution des prot�eines de MEC avec un

analyseur d’image assist�e par ordinateur (Olympus

Optical, Hambourg, Allemagne).18,19,21,22

Analyse de la laminine en cytom�etrie de

flux

Dans chaque test, des anticorps monoclonaux�etaient ajout�es a 105 cellules qui avaient �et�epr�epar�ees et fix�ees a l’�ethanol (70%) comme

pr�ec�edemment d�ecrit.23 Les cellules �etaient incub�ees

avec les anticorps non-conjugu�es de la laminine

(laminin, Sigma) pendant 60 min a temp�erature

ambiante dans l’obscurit�e et lav�ees trois fois avec une

solution de tampon phosphate contenant du s�erum

foetal de veau a 2%. Les cellules �etaient ensuite

trait�ees pendant 60 min a temp�erature ambiante

avec un antis�erum conjugu�e avec de l’isothiocyanate

de fluoresc�eine anti- immunoglobulines G de lapin

(Dako) et lav�ees. Les suspensions de cellules �etaient

analys�ees avec un cytometre de flux Facscan (Becton

Dickinson, Heidelberg, Allemagne) �equip�e d’un laser

a argon comme pr�ec�edemment d�ecrits.23 Les cellules

exercant des intensit�es de fluorescence au-dessus de

la limite sup�erieure de la distribution controle

n�egative �etaient consid�er�ees positives.

Teneur en eau

Les coupes de cordon ombilical �etaient pes�ees et

s�ech�ees pendant 24 hr a 95 �C. Apres pesage des

coupes seches, le pourcentage de teneur en eau du

cordon ombilical �etait calcul�e comme suit :

%H2O¼ ½ðpoids humide� poids secÞ� 100�=poids humide

Analyse Western blot

A la fin de la perfusion, les arteres �etaient soigneuse-

ment diss�equ�ees de la gel�ee de Wharton avec des

instruments de microchirurgie. L’extraction de

prot�eine, l’�electrophorese sur gel de dod�ecyl

sulfate-polyacrylamide de sodium, et l’immuno-

blotting �etaient effectu�es selon des protocoles

courants.18,19,22,24 Le test �etait fait six fois. Des

anticorps contre les antigenes suivants ont �et�eemploy�es pour cette �etude : collagene de type IV

(1:1.000, Dako), laminine (1:1000, Chemicon), ß1-

int�egrine (1:1000 ; BD Transduction Laboratories,

San Jose, CA, Etats-Unis), ost�eopontine (1:1000,

Developmental Studies Hybridoma Bank), glyce-

rald�ehydes-3-phosphate d�eshydrog�enase (GAPDH,

1:1000 ; Affinity BioReagents, Golden, CO), VEGF

(1:1000, Chemicon), Flk-1, et Flt-1 (1:1000, tous les

deux de Santa Cruz Biotechnology).

Analyse statistique

L’analyse statistique a �et�e faite avec SPSS 11.5

(SPSS, Inc., Chicago, IL, Etats-Unis). Toutes les

donn�ees ont �et�e exprim�ees en tant que moyenne ±�ecart type. Nous avons examin�e tous les parametres

pour des d�eviations de distribution gaussienne par le

test de Kolmogorov-Smirnov et avons compar�e les

cas en employant le test t ou le test de Mann Whit-

ney (en fonction des r�esultats du test de normalit�e).

Les diff�erences �etaient consid�er�ees significatives au

seuil de p< 0,05.

RESULTATS

Apres 90 min d’incubation avec VEGF ou le

v�ehicule, suivie d’une p�eriode de perfusion de 4 hr,

le cordon ombilical �etait imm�ediatement employ�epour d�eterminer la morphologie, la teneur en eau,

les prot�eines de MEC, la ß1-int�egrine, l’ost�eopontine,

et le VEGF et ses kinases du r�ecepteur de tyrosine.

Morphologie, oedeme tissulaire etteneur en eau des cordons

Les �echantillons trait�es avec VEGF montraient un

oedeme tissulaire significativement augment�e avec

extravasation du bleu d’Evans ( p< 0,018, Fig. 1A-

C). Il y avait une diff�erence nette dans l’espace

interstitiel des arteres de cordon ombilical trait�ees

avec le v�ehicule ou avec VEGF et perfus�ees pendant

4 hr. Afin de montrer que l’agrandissement de l’in-

terstitium est du au d�epot d’eau, la teneur en eau des

cordons ombilicaux �etait d�etermin�ee. Les r�esultats

montraient que les cordons ombilicaux trait�es au

VEGF avaient une teneur en eau accrue (groupe

VEGF 94 ± 1%) par comparaison avec les controles

(groupe Cnp 91 ± 1%, groupe Cp 93 ± 1%).

Apres 4 hr de perfusion, la coloration a

l’h�ematoxyline �eosine montrait une morphologie


VEGFCp2 mm2 mm Cp VEGFS

urface d

'extravasatio

n d

u

bleu

d

'Evan

s (cm

2)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 P<0,018A B

C

D E

Cnp

50 µm

400 µmCp

50 µm

400 µm VEGF

50 µm

400 µm

I I

IF

Fig. 1. Extravasation du bleu d’Evans de l’artere ombi-

licale trait�ee par solution v�ehicule (A) et de l’artere

trait�ee par VEGF (B). L’oedeme tissulaire a �et�e mesur�epar analyse d’image quantitative et est sensiblement

augment�e par VEGF (C). La coloration a l’h�ematoxyline

�eosine montre une histologie normale de l’artere ombi-

licale au temps z�ero (D) et apres 4 hr de perfusion (E). Le

traitement de F VEGF induit un oedeme tissulaire

mod�er�e dans l’espace interstitiel ( fleches). Grossissement

original �100, encart �400. I, intima.

normale de l’artere ombilicale (Fig. 1D, E). L’en-

doth�elium �etait inchang�e, et les structures de la

gel�ee de Wharton et de l’�epith�elium amniotique

n’�etaient pas chang�ees par la perfusion ou le trai-

tement au VEGF. Cependant, l’oedeme tissulaire�etait �evident dans l’espace interstitiel (Fig. 1F) des

parois art�erielles ombilicales humaines perfus�ees

avec le milieu contenant VEGF.

VEGF change les prot�eines de la MEC

Collagene de types I et III. Pour d�eterminer le

contenu en collagene de type I et III, nous avons

utilis�e la coloration au rouge sirius selon Junqueira

et coll.20 La microscopie optique montrait une artere

ombilicale non perfus�ee (Fig. 2A), une artere per-

fus�ee avec un oedeme interstitiel mod�er�e (Fig. 2B),

et une artere trait�ee au VEGF avec un oedeme in-

terstitiel marqu�e (Fig. 2C). La microscopie en pola-

risation montrait du collagene de types I et III sur des

cordons ombilicaux fraıchement pr�epar�es (Fig. 2D).

La quantit�e et le rapport du collagene de types I et III

n’�etaient pas affect�es par la perfusion (Fig. 2E). Du

collagene de type III �etait visible dans toute la paroi

de l’artere ombilicale dans les groupes Cnp et Cp

(Fig. 2D, E), la gel�ee de Wharton contenant une

quantit�e importante de collagene de types I et III.

Par comparaison avec Cnp et Cp, VEGF avait clai-

rement augment�e le contenu de la paroi art�erielle en

collagene de type III (Fig. 2F), alors que le collagene

de type I (jaune, orange) �etait augment�e dans le

secteur p�erivasculaire (Fig. 2F) et dans la gel�ee de

Wharton apres l’application du VEGF (Fig. 2F).

Collagene de type IV. Du collagene de type IV, autre

prot�eine de la MEC et constituant des membranes

basales, �etait �egalement �elev�e apres traitement par

VEGF ( p< 0,05 vs les controles Cnp et Cp), en

analyse Western blot (Fig. 3A, B) et en analyse

d’image quantitative (Fig. 4A-D). Du collagene de

type IV �etait �egalement d�etect�e dans l’�epith�elium

amniotique (Fig. 4C).

Laminine. La laminine est normalement localis�ee

dans les membranes basales des cellules en-

doth�eliales et dans la m�edia art�erielle. Sa distribu-

tion est rest�ee semblable dans tous les cordons,

ind�ependamment du traitement. Cependant, sa

quantit�e �etait significativement �elev�ee apres traite-

ment par VEGF par comparaison avec les controles

( p< 0,05, Fig. 3A, C). Elle �etait d�etectable dans la

gel�ee de Wharton et l’�epith�elium amniotique du

cordon ombilical (Fig. 4E-H).

Impact de VEGF sur l’ost�eopontine et la

ß1-int�egrine

L’ost�eopontine �etait d�etect�ee sur tous les cordons om-

bilicaux examin�es, ind�ependamment de la perfusion

(Fig. 4I-L). Cependant, sa quantit�e �etait augment�ee


Fig. 2. Coloration au rouge sirius du cordon ombilical. A

Controle sans perfusion (Cnp, artere ombilicale). B Per-

fusion de quatre heures de l’artere : seul un oedeme

mod�er�e est d�etectable dans l’interstitium. C Artere om-

bilicale trait�ee par VEGF avec oedeme de l’espace in-

terstitiel ( fleches). D La microscopie en polarisation

montrait du collagene de types I et III dans le cordon

ombilical. La gel�ee de Wharton repr�esente une quantit�e

importante de collagene de types I et III. Le collagene de

type III est d�etectable dans toute la paroi de l’artere

ombilicale des groupes Cnp et Cp. La quantit�e de colla-

gene n’est pas affect�ee par la perfusion (E). F VEGF

augmente clairement le collagene de type III contenu

dans la paroi art�erielle ( fleches). Le collagene de type I

(jaune, orange) est augment�e dans le secteur

p�erivasculaire ( fleches).

Cnp Cp VEGF

Co

llag

én

e T

yp

e IV

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

**

10

20

30

40

50

60

0

A B

Collagène de Type IV Cnp Cp Cnp CpVEGFVEGF

Cnp Cp VEGFCnp Cp VEGF

Laminine

Ostéopontine

ß1-Intégrine

0

10

20

30

40

50

60

70

Ostéo

po

ntin

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

**

Cnp Cp VEGF

βββ 1-In

tég

rin

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

0

10

20

30

40

50

60

70*

*

Cnp Cp VEGF

Lam

in

in

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

**

Cnp Cp VEGF

10

20

30

40

50

60

0

C ED

Fig. 3. Analyses Western blot et �evaluation densitom�e-

trique. L’application endoluminale de VEGF induit le

collagene de type IV, la laminine, l’ost�eopontine, et la ß1-

int�egrine (A) compar�ee a Cnp et a Cp. Les r�esultats

de l’�evaluation densitom�etrique sont donn�es (B-E).

*p< 0,05.

dans la m�edia des arteres trait�ees par VEGF com-

par�ees aux controles correspondants ( p< 0,05,

Fig. 3A, D). La coloration immunohistochimique et

l’analyse d’image quantitative montraient une aug-

mentation nette de l’ost�eopontine dans toute la paroi

des vaisseaux trait�es par VEGF (Fig. 4L), comportant


A B C

E F

JI K

G

Cnp Cp VEGF0

20

40

60

80

Su

rface co

llag

èn

e

Typ

e IV

[%

]

P<0,002P<0,003

D

Cnp Cp VEGF0

20

40

60

80

Su

rface L

am

in

in

e [%

]

P<0,001

P<0,002

H

S

urface O

PN

[%

]

0.00.10.20.30.40.50.60.7

P<0,009P<0,004

Cnp Cp VEGF

L

VEGF 400 µmCnp 400 µm

VEGF

VEGF400 µm

Cp400 µm

Cnp400 µm

400 µmCp

400 µm

Cp 400 µm

Cnp

I

II

III

I

I

I

400 µm

Fig. 4. Etude immunohistochimique sur le collagene de

type IV (A-D). Aucune diff�erence n’existait entre les

arteres ombilicales perfus�ees et non perfus�ees. L’ap-

plication de VEGF augmentait mod�er�ement le collagene

de type IV. La prot�eine laminine �etait semblable dans les

arteres perfus�ees et non perfus�ees. Le traitement par

VEGF augmentait la quantit�e de laminine (E-H). L’ap-

plication de VEGF augmentait l’ost�eopontine dans l’ar-

tere ombilicale (I-L) par comparaison avec Cnp et Cp. I,

intima. Grossissement �100, encart �400.

les cellules endoth�eliales de l’intima et les cellules

musculaires lisses vasculaires de la m�edia. En outre,

l’ost�eopontine devenait d�etectable dans la gel�ee de

Wharton et l’�epith�elium amniotique apres traite-

ment par VEGF.

De meme, la ß1- int�egrine �etait pr�esente a un

meme niveau dans les arteres ombilicales humaines

fraıchement pr�epar�ees (Cnp) et perfus�ees. Ce-

pendant, ces arteres ombilicales, qui avaient eu du

VEGF endoluminal, montraient une accumulation

de ß1-int�egrine ( p< 0,05, Fig. 3A, E), indiquant la

participation des int�egrines dans la signalisation de

VEGF.

Effets de l’application de VEGF sur les

kinases du r�ecepteur de la tyrosine

Il �etait �egalement int�eressant de voir quel effet le

VEGF ajout�e a l’ext�erieur exercait sur la production

intracellulaire de VEGF et les kinases du r�ecepteur

de la tyrosine. Par cons�equent, la quantit�e de Flk-

1, de Flt-1, et de VEGF a �et�e �etudi�ee.

Flk-1. Flk-1 �etait pr�esent sur les cellules en-

doth�eliales de l’intima, ind�ependamment de leur

perfusion. Apres traitement par VEGF, sa quantit�edoublait mais les r�ecepteurs restaient restreints

aux cellules endoth�eliales de l’intima art�erielle

( p< 0,05 ; Fig. 5A, C, Fig. 6A-C).

Flt-1. En revanche, les mol�ecules Flt-1 �etaient plu-

tot rares sur les cellules endoth�eliales des arteres

perfus�ees et non perfus�ees. Ceci a �et�e montr�e par

les analyses Western blot (Fig. 5A, D) ainsi que sur

les coupes des arteres de cordons ombilicaux Cp et

Cnp (Fig. 6D, E). Cependant, le traitement par VEGF

augmentait la quantit�e de Flt-1 ( p< 0,05 vs Cnp et

Cp). Les Western blots montraient une augmenta-

tion de 7 fois de l’antigene (Fig. 5D), et sur les coupes

color�ees par les anticorps anti-Flt-1, Flt-1 devenait

d�etectable dans l’endoth�elium de l’intima ainsi que

dans ses environnements imm�ediats (Fig. 6D-F).

VEGF. La prot�eine intracellulaire VEGF �etait

d�etect�ee dans l’artere ombilicale dans une quantit�esemblable dans les �echantillons non perfus�es

(Cnp) et perfus�es (Cp) (Fig. 5A, B). L’�etude


Cnp Cp VEGF0

10

20

30

40

50

60*

Flk-1

(u

nité

s d

en

sito

mé

triq

ue

s) *

C

Cnp Cp VEGF0

20

40

60

80

100

Flt-1

(u

nité

s d

en

sito

mé

triq

ue

s)

**D

*

Cnp Cp VEGF0

10

20

30

40

50

60

70

VE

GF

(u

nité

s d

en

sito

mé

triq

ue

s)

*

VEGF

Flk-1

Flt-1

A B

Cp VEGFCnp Cp VEGF

Cnp Cp VEGFCp VEGF

CnpCnp

Fig. 5. Analyses Western blot et �evaluation densitom�e-

trique. VEGF augmentait les deux kinases du r�ecepteur

de la tyrosine (Flk-1 et Flt-1) dans l’artere ombilicale.

VEGF �etait d�etect�e dans les arteres de Cnp et Cp et

augment�e par l’application endoluminale de VEGF (A).

Les r�esultats de l’�evaluation densitom�etrique sont donn�es

(B-D). *p< 0,05.

immunohistochimique sur le cordon ombilical

montrait peu de VEGF dans l’intima des arteres

ombilicales perfus�ees et non perfus�ees (Fig. 6 G-I).

En revanche, les cellulesdes coupes des arteres

trait�ees par VEGF montraient une fixation forte des

anticorps anti-VEGF (Fig. 6 G-I). Ceci �etait confirm�epar analyse Western blot. Les cellules franchement

color�ees ne semblaient pas etre limit�ees a l’en-

doth�elium de l’intima mais pouvaient �egalement

comporter des cellules musculaires lisses de la m�edia

(Fig. 6I).

Prot�eines de la MEC induites par VEGF

dans les CEVOH

Afin de v�erifier le role important des cellules en-

doth�eliales dans notre systeme, nous avons �etudi�eles effets de l’application de VEGF sur le CEVOH.

La laminine �etait augment�ee apres 90 min de trai-

tement par VEGF. Ceci a �et�e mesur�e par cytom�etrie

de flux et analyse Western blot ( p< 0,05 vs la

solution v�ehicule, Fig. 7).

Le collagene de type IV et l’ost�eopontine �etaient

rapidement significativement augment�es par VEGF

en 90 min ( p< 0,05 vs la solution v�ehicule). Ceci

s’accompagnait d’une augmentation significative de

la ß1-int�egrine. Il y avait �egalement une �el�evation

pr�ecoce des deux kinases du r�ecepteur de la tyrosine

Flt-1 et Flk-1 ( p< 0,05 vs la solution v�ehicule,

Fig. 8).

DISCUSSION

Cette �etude est la premiere analyse complete des ef-

fets de VEGF sur l’artere ombilicale. Nous avons

appliqu�e un modele de perfusion r�ecemment �etabli

pour un coeur fonctionnant h�emoperfus�e isol�e ex

vivo et prouv�e le role des cellules endoth�eliales.

Les caract�eristiques et les avantages de la machine

de perfusion ont �et�e d�ecrits.8,19 Comme d�eja

publi�e, notre modele de perfusion a permis des�etudes pharmacologiques et de biologie vasculaire

sur des organes fonctionnant encore de maniere

similaire a ce qui est observ�e in vivo. Ici, nous avons

utilis�e la machine pour perfuser des arteres ombili-

cales pendant 4 hr, apres qu’elles aient �et�er�echauff�ees a 37 �C pendant 90 min. Tout en per-

fusant une artere dans des conditions stables, les

parametres chimiques fonctionnels et cliniques ont

pu etre gard�es dans la marge physiologique, comme

d�ecrit dans la litt�erature.25 Ceci a augment�e la pro-

babilit�e que les changements des vaisseaux observ�es

apres la perfusion soient �egalement survenus in vivo

sous la meme influence du VEGF circulant.


Fig. 6. Des cellules endoth�eliales positives pour Flk-1

�etaient d�etect�ees dans l’intima de toutes les arteres dans

tous les groupes (A-C). En parallele, nous avons

�egalement trouv�e des cellules endoth�eliales positives

pour Flt-1 dans l’intima du groupe VEGF mais pas dans

les arteres Cnp et Cp (D-F). La prot�eine VEGF �etait

d�etectable dans les cellules endoth�eliales de toutes les

arteres mais clairement augment�ee apres application de

VEGF (G-I). I, intima. Grossissement �400.

Impact de VEGF sur la perm�eabilit�evasculaire

Les diverses �etudes ont montr�e que l’ARNm et la

prot�eine VEGF sont largement distribu�es dans les

tissus, les organes, ou les s�erums normaux. Elles

soutiennent le concept que VEGF peut jouer un

role important dans l’entretien et le controle de la

fonction vasculaire.12,26 Dans cette �etude, nous

avons appliqu�e une solution physiologique de VEGF

a l’artere ombilicale. Le temps d’incubation �etait de

90 min. L’application endoluminale de VEGF a in-

duit un oedeme tissulaire du cordon ombilical sans

dommages �evidents. L’extravasation �etait d�etectable

apres 4 hr de perfusion et d�ependait fortement de la

pr�ecession du traitement par VEGF, mais elle n’�etait

pas induite par la machine de perfusion. Ainsi, il

devient de plus en plus �evident qu’un oedeme

g�en�eral peut etre provoqu�e par VEGF seul chez les

patients pr�esentant un taux s�erique �elev�e de VEGF

du a une l�esion importante mais localis�ee.

Effets de VEGF sur les kinases du

r�ecepteur de la tyrosine

Nous avons �egalement d�emontr�e que le milieu de

perfusion contenant du VEGF d�eclenche l’expres-

sion de la prot�eine VEGF par les cellules

endoth�eliales de l’intima de l’artere ombilicale.

L’observation s’accorde avec un premier r�esultat

obtenu a partir de l’incubation des cellules en-

doth�eliales en pr�esence de VEGF externe sous mi-

crogravit�e.24 VEGF se lie aux kinases du r�ecepteur

de surface des cellules pour la tyrosine principale-

ment exprim�ees sur les cellules endoth�eliales, dont

les plus importantes sont VEGFR-1 (Flt-1) et

VEGFR-2 (Flk-1). La coloration immunohisto-

chimique de Flk-1 et de Flt-1 a clairement montr�e


VEH 90 min VEGF 5.5 h VEGF0

10

20

30

40

50

60 **

CEVOHVEH39%

CEVOH90 min VEGF

45%

CEVOH5,5 h VEGF

44%

0

5

10

15

20

25

Lam

in

in

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

Laminine

VEH 90 min VEGF 5.5 h VEGF

**

*

Lam

in

in

e

(%

d

e cellu

les p

ositives)

A

B

veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h

C

Num

ber

Num

ber

R1 R2 R1 R2 R1 R2

Fig. 7. Recherche en cytom�etrie de flux de la laminine

dans les CEVOH (A, B). VEGF augmentait pr�ecocement

la quantit�e de laminine. Cette observation �etait

confirm�ee par l’analyse Western blot (C). VEH, v�ehicule.

*p< 0,05.

VEGF 165 sur les cellules endoth�eliales de l’intima

des arteres ombilicales. En outre, l’application de

VEGF a augment�e l’expression de ses r�ecepteurs.

Flk-1 �etait d�etectable dans les arteres ombilicales

dans une certaine mesure au d�ebut de l’exp�erience,

alors que Flt-1 n’�etait pas trouv�e a ce moment.

Apres 4 hr de perfusion, Flk-1 �etait clairement

stimul�e dans l’intima et Flt-1 �etait devenu

d�etectable.

Pendant longtemps, on a largement suppos�e que

VEGF agit en tant que facteur de croissance sp�eci-

fique des cellules endoth�eliales et att�enue la mala-

die vasculaire en induisant la prolif�eration

endoth�eliale principalement par Flk-1. Des preuves

r�ecentes suggerent que Flt-1 et Flk-1 fonctionnels

sont aussi exprim�es sur les cellules musculaires

lisses de la m�edia apres que les vaisseaux sanguins

aient �et�e l�es�es. Dans ce travail, l’application endolu-

minale de VEGF augmente les deux kinases du

r�ecepteur de la tyrosine au niveau de l’en-

doth�elium de l’artere ombilicale, indiquant que

notre appareil de perfusion fonctionne sans cr�eer

de l�esions de perfusion. VEGF et Flt-1 jouent un

role essentiel dans la formation de nouvelles

intimas apres des l�esions.27

VEGF, Flk-1, et Flt-1 peuvent stimuler la pro-

lif�eration, la migration, et l’activit�e prot�eolytique

des cellules endoth�eliales. VEGF induit �egalement

la perm�eabilit�e, la vasodilatation, et l’angiog�enese

vasculaires.28 Par ailleurs, la quantit�e de VEGF

exprim�e est control�ee par la diff�erentiation, la

transformation, et la fourniture d’oxygene. Flt-1

et Flk-1 sont presque exclusivement situ�es sur les

cellules endoth�eliales.26,29,30 La densit�e des deux

kinases du r�ecepteur de la tyrosine est basse dans le

tissu normal mais augment�ee dans les tissus tumo-

raux ou a proximit�e en cas de n�eoangiog�enese et/ou

de perm�eabilit�e vasculaire augment�ee comme

observ�e dans l’angiog�enese tumorale.31 Comme

d’autres32 nous avons d�emontr�e que VEGF lui-

vmeme est un facteur important menant a l’ac-

croissement des r�ecepteurs de VEGF.

Effets de VEGF sur la MEC

Dans une �etude r�ecente,13 nous avons montr�e que

VEGF appliqu�e par voie endoluminale acc�el�erait la

r�eendoth�elialisation et am�eliorait la cicatrisation

vasculaire apres traumatisme. Plusieurs prot�eines de

la MEC, telles que la fibronectine et le collagene de


0

5

10

15

20

25

*

Co

lla

gè

ne

T

yp

e IV

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)



Collagène Type IV

GAPDH

*A B

0

5

10

15

20

25 *

Flk-1

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

Flk-1

*


E

0

5

10

15

20

25

30

35 *

Flt-1

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

Flt-1

*

*

VEH 90 minVEGF 5.5 h VEGF

F

0

5

10

15

20

25

ß1

-In

tè

grin

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

ß1-Intègrine

**

0

10

20

30

40

VE

GF

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

VEGF

C

*

**

veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h

D

0

5

10

15

20

25

30

Os

tè

op

on

tin

e

(u

nités d

en

sito

métriq

ues)

Ostéopontine

VEH 90 minVEGF 5.5 h VEGF VEH 90 minVEGF 5.5 h VEGF

* **

veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h

veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h veh veh 90 min 90 min 5.5h 5.5h

Fig. 8. Analyses Western blot du collagene de type IV et

de la prot�eine GAPDH dans les CEVOH (A). Le charge-

ment �egal des prot�eines dans chaque ligne est indiqu�e par

GAPDH. VEGF augmentait le collagene de type IV dans

un d�elai de 90 min. Par ailleurs, VEGF augmentait vite

l’ost�eopontine (B), la ß1-int�egrine (C), VEGF (D), Flk-1

(E), et Flt-1 (F). VEH, v�ehicule. *p< 0,05.

types I, III, et IV, �etaient significativement aug-

ment�ees dans la paroi vasculaire. Nous avons

assum�e que l’application locale de VEGF apres les

l�esions vasculaires favorise le processus de remo-

delage vasculaire, en d�epit de l’induction de l’oe-

deme. Jusqu’a maintenant, nous ne disposions

pas de donn�ees au sujet de l’impact de VEGF sur

l’expression des prot�eines de la MEC dans les

arteres ombilicales. La MEC est n�ecessaire pour

constituer et la paroi vasculaire, et elle repr�esente

jusqu’a 80% du poids sec des vaisseaux sanguins.13

Les vaisseaux contenaient principalement du colla-

gene de types I et III,13,33 tandis que le collagene de

type IV et la laminine pouvaient etre d�etect�es dans la

membrane basale entour�ee de cellules musculaires

lisses vasculaires.16 D’ailleurs, le collagene de type

IV est d�etectable en gel�ee de Wharton en plus du

collagene de types I et III, comme le montre la

Figure 2.

Les arteres ombilicales trait�ees au VEGF produi-

sent des quantit�es clairement augment�ees de colla-

gene de types III et IV et de laminine. Cette

production int�eresse toute l’artere ombilicale, alors

que le collagene de type I s’accumule principale-

ment dans le secteur p�erivasculaire. Ainsi, nous

d�emontrons pour la premiere fois que VEGF

d�eclenche la production de laminine et de plusieurs

types de collagene dans les cellules endoth�eliales de

l’intima. Nous d�emontrons �egalement que les CE-

VOH trait�ees par VEGF produisent plus de laminine,

comme le montrent la cytom�etrie de flux et l’ana-

lyse Western blot.

En outre, nous avons observ�e que les arteres om-

bilicales trait�ees par VEGF produisent tres vite plus

d’ost�eopontine. L’ost�eopontine semble jouer un

role principal dans le remodelage vasculaire in

vivo car c’est un m�ediateur de croissance et un im-

portant composant de l’immunit�e et de l’inflamma-

tion cellulaires. Elle agit �egalement en tant que

facteur de survie, d’adh�esion cellulaire, et facteur

chimiotactique pour les cellules endoth�eliales;34 en

outre, elle induit un �epaississement de la m�edia sans

l�esions et la formation d’une n�eointima apres des

l�esions lorsqu’elle est surexprim�ee chez une souris

transg�enique.35

Par ailleurs, la production de ß1-int�egrine �etait

stimul�ee par VEGF. Elle forme un r�ecepteur

d’adh�erence permettant l’attache des cellules en-

doth�eliales a la MEC, facilitant leur croissance, leur

migration, et leur capacit�e de d�eposer des prot�eines

de matrice. Les int�egrines sont des facteurs impor-

tants de la rest�enose et de l’ath�eroscl�erose


art�erielles17 et peuvent etre important dans le re-

modelage vasculaire.

CONCLUSIONS

En r�esum�e, le modele automatis�e de perfusion

utilis�e offre des possibilit�es tres int�eressantes pour

la recherche sur les interactions complexes entre

VEGF et la paroi de l’artere ombilicale. Ainsi, nous

avons montr�e pour la premiere fois que VEGF sti-

mule les cellules endoth�eliales de l’intima de l’artere

ombilicale pour produire des concentrations aug-

ment�ees des prot�eines de la MEC. VEGF influence�egalement la m�edia et l’adventice adjacents et en-

traıne un oedeme vasculaire pr�ecoce. VEGF stimule

la production de la prot�eine ost�eopontine, ainsi que

celle du VEGF intracellulaire et ses kinases du

r�ecepteur de la tyrosine en 90 min ex vivo et in vi-

tro. Toutes les mol�ecules mentionn�ees ci-dessus

sont connues pour etre impliqu�ees dans le processus

de remodelage vasculaire. Le remodelage vasculaire

commence des la formation d’un oedeme d’ac-

compagnement. Cependant, ce sera un futur travail

que d’�etudier comment il est possible d’empecher

l’oedeme induit par VEGF dans des vaisseaux sains a

distance des l�esions. Un traitement par des inhibi-

teurs de VEGF commencant imm�ediatement apres

une brulure ou des l�esions traumatiques peut

r�eduire l’oedeme tissulaire �etendu. La cons�equence

peut etre une am�elioration des r�esultats apres des

l�esions graves.

Nous remercions Jessie Webb pour la pr�eparation du manuscrit

et Mme Ursula Schwikowski pour son aide avec les figures.

REFERENCES

1. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, et coll. Tumor cells secrete

a vascular permeability factor that promotes accumulation

of ascites fluid. Science 1983;219:983-985.

2. Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a

novel heparin binding growth factor specific for vascular

endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1989;161:

851-858.

3. Plouet J, Schilling J, Gospodarowicz D. Isolation and cha-

racterization of a newly identified endothelial cell mitogen

produced by At T20 cells. EMBO J 1989;8:3801-3808.

4. Vincenti V, Cassano C, Rocchi M, et coll. Assignement of the

vascular endothelial growth factor gene to human chro-

mosome 6p21.3. Circulation 1996;93:1493-1495.

5. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, et coll. Vascular en-

dothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen.

Science 1989;246:1306-1309.

6. Keck PJ, Hauser SD, Krivi G, et coll. Vascular permeability

factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science

1989;246:1309-1312.

7. Aird WC. Spatial and temporal dynamics of the endo-

thelium. J Thromb Haemost 2005;3:1392-1406.

8. Houck KA, Ferrara N, Winer J, et coll. The vascular endo-

thelial growth factor family: identification of a fourth mo-

lecular species and characterization of alternative splicing of

RNA. Mol Endocrinol 1991;5:1806-1814.

9. Devries C, Escobedo JA, Ueno H, et coll. The fms-like

tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth

factor. Science 1992;255:989-991.

10. Schiffrin EL. The endothelium and control of blood-vessel

function in health and disease. Clin Invest Med 1994;17:

602-620.

11. Harrigan MR, Ennis SR, Masada T, et coll. Intraventricular

infusion of vascular endothelial growth factor promotes

cerebral angiogenesis with minimal brain edema. Neuro-

surgery 2002;50:589-598.

12. Infanger M, Schmidt O, Kossmehl P, et coll. Vascular en-

dothelial growth factor serum level is strongly enhanced

after burn injury and correlated with local and general tissue

edema. Burns 2004;30:305-311.

13. Infanger M, Shakibaei M, Kossmehl P, et coll. Intraluminal

application of vascular endothelial growth factor enhances

healing of microvascular anastomosis in a rat model. J Vasc

Res 2005;42:202-213.

14. Sixma JJ, van Zanten GH, Saelman EU, et coll. Platelet ad-

hesion to collagen. Thromb Haemost 1995;74:454-459.

15. Polanowska-Grabowska R, Simon CG, Jr, Gear AR. Platelet

adhesion to collagen type I, collagen type IV, von Wille-

brand factor, fibronectin, laminin and fibrinogen: rapid ki-

netics under shear. Thromb Haemost 1999;81:118-123.

16. Hallmann R, Horn N, Selg M, et coll. Expression and func-

tion of laminins in the embryonic and mature vasculature.

Physiol Rev 2005;85:979-1000.

17. Xu H, Zeng L, Peng H, et coll. HMG-CoA reductase inhibitor

simvastatin mitigates VEGF-induced ‘‘inside-out’’ signaling

to extracellular matrix by preventing RhoA activation. Am J

Physiol Renal Physiol 2006;291:F995-F1004.

18. Kossmehl P, Schonberger J, Shakibaei M, et coll. Increase of

fibronectin and osteopontin in porcine hearts following

ischemia and reperfusion. J Mol Med 2005;83:626-637.

19. Kossmehl P, Kurth E, Faramarzi S, et coll. Mechanisms of

apoptosis after ischemia and reperfusion: role of the renin-

angiotensin system. Apoptosis 2006;11:347-358.

20. Junqueira LCU, Cossermelli W, Brentani R. Differential

staining of collagens type I, II and III by sirius red and po-

larization microscopy. Arch Histol Jpn 1978;41:267-274.

21. Grimm D, Cameron D, Griese DP, et coll. Differential effects

of growth hormone on cardiomyocyte and extracellular

matrix protein remodeling following experimental myo-

cardial infarction. Cardiovasc Res 1998;40:297-306.

22. Grimm D, Huber M, Jabusch HC, et coll. Extracellular ma-

trix proteins in cardiac fibroblasts derived from rat hearts

with chromic pressure-overload: effects of beta-receptor

blockade. J Mol Cell Cardiol 2001;33:487-501.

23. Infanger M, Ulbrich C, Baatout S, et coll. Modeled gravita-

tional unloading induced downregulation of endothelin-1

in human endothelial cells. J Cell Biochem 2007;101:

1439-1455.

24. Infanger M, Kossmehl P, Shakibaei M, et coll. Induction of

three- dimensional assembly and increase in apoptosis of

human endothelial cells by simulated microgravity: impact

of vascular endothelial growth factor. Apoptosis 2006;11:

749-764.

25. Gan L, Sjogren LS, Doroudi R, et coll. A new computerized

biomechanical perfusion model for ex vivo study of fluid


mechanical forces in intact conduit vessels. J Vasc Res

1999;36:68-78.

26. Jakeman LB, Winer J, Bennett GL, et coll. Binding sites for

vascular endothelial growth factor are localized on endo-

thelial cells in adult rat tissues. J Clin Invest 1992;89:244-253.

27. Zhao Q, Egashira K, Hiasa K, et coll. Essential role of vas-

cular endothelial growth factor and Flt-1 signals in neoin-

timal formation after periadventitial injury. Arterioscler

Thromb Vasc Biol 2004;24:2284-2289.

28. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endo-

thelial growth factor. Endocr Rev 1997;18:4-25.

29. Shibuya M, Yamguchi S, Yamane A, et coll. Nucleotide

sequence and expression of a novel human receptor-type

tyrosine kinase gene (FLT) closely related to the fms family.

Oncogene 1990;5:519-524.

30. Terman BI, Dougher VM, Carrion ME, et coll. Identification

of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular en-

dothelial growth factor. Biochem Biophys Res Commun

1992;187:1579-1586.

31. Barleon B, Siemeister G, Martiny-Baron G, et coll. Vascular

endothelial growth factor up-regulates its receptor fms-like

tyrosine kinase 1 (FLT-1) and a soluble variant of FLT-1 in

human vascular endothelial cells. Cancer Res 1997;57:

5421-5425.

32. Plate KH, Breier G, Millauer B, et coll. Up-regulation of

vascular endothelial growth factor and its cognate receptors

in a rat glioma model of tumor angiogenesis. Cancer Res

1993;53:5822-5827.

33. Farquharson C, Robins SP. Immunolocalization of collagens

type I and III in the arterial wall of the rat. Histochem J

1989;21:172-178.

34. Leali D, Dell’Era P, Stabile H, et coll. Osteopontin (Eta-1)

and fibroblast growth factor-2 cross-talk in angiogenesis.

J Immunol 2003;171:1085-1093.

35. Isoda K, Nishikawa K, Kamezawa Y, et coll. Osteopontin

plays an important role in the development of medial

thickening and neointimal formation. Circ Res 2002;91:

77-82.

le facteur de croissance vasculaire endothéliale induit les protéines de la matrice...

Documents