LA RPLICATION DE LADN

LA RPLICATION DE LADNI. GNRALITES.

Lors de la division cellulaire, quand une cellule-mre donne deux cellules-filles, il est essentiel que lADN prsent dans les cellules-filles soit la copie identique de lADN prsent dans la cellule-mre. Cette copie de lADN est indispensable raliser avant la mitose (ou division cellulaire) on parle de rplication de lADN. Pralablement toute division cellulaire, la quantit dADN est multiplie par deux. Les mcanismes de rplication conditionnent donc le droulement de la division cellulaire.

II. LA RPLICATION DE LADN CHEZ LES PROCARYOTES.

II.1. Les caractristiques gnrales.La rplication est tout dabord dite semi-conservatrice (Meselson et Stahl, 1958). Ceci signifie que sur les deux brins dADN, on a toujours un brin dADN qui provient dun des deux brins de lADN parental et un brin nouvellement form. A chaque rplication, les deux brins dADN parental se sparent, chacun de ces deux brins sert de matrice pour la synthse dun brin complmentaire.

II.2. Les lments ncessaires la rplication de lADN.La rplication de lADN ncessite:- Tout dabord, une matrice dADN constitue par un brin parental.- La prsence de nuclotides propres lADN, cest--dire contenant du 2-dsoxyribose, des bases A, T, G et C et sous forme de nuclosides triphosphates: dATP, dTTP, dCTP et dGTP (on crit souvent pour les dnommer dNTP).- La prsence de nombreux enzymes que nous verrons plus loin.- La prsence de certains ions (cations bivalents: Mg2+, ce cation est indispensable pour la rplication de lADN).

II.3. Les mcanismes de linitiation de la rplication.II.3.1. Notion de rplicon.Lunit dADN o se produit la rplication est appele le rplicon. Ce rplicon a une origine o est initie la rplication et une terminaison o est arrte la rplication. LADN bactrien constitue lui seul un rplicon. A partir dun point dinitiation, la rplication peut progresser soit de manire unidirectionnelle, soit de manire bidirectionnelle. Chez les procaryotes, partir dune origine de la rplication (ou oeil de rplication), la rplication progresse dans les deux sens. On compare souvent cette progression de la rplication dans le sens bidirectionnel un oeil qui sagrandit jusqu que la rplication sachve.

II.3.2. Initiation de la rplication.Chez E. coli, il existe au niveau de lADN bicatnaire une origine unique de la rplication appele OriC. Le locus OriC est constitu dune squence de 245 paires de bases. Cette squence contient en tandem - trois squences nuclotidiques presque identiques constitues de 13 nuclotides chacunes (squences de type GATCTNTTNTTTT). - quatre sites de liaison comportant un motif de 9 paires de bases pour une protine appele dnaA ou protine dinitiation de la rplication, code par le gne dnaA. Des copies multiples de la protine dnaA vont sassocier avec lADN lorigine de la rplication. Ces liaisons ncessitent de lATP.Cette tape est indispensable la transformation localise de lADN double brin en ADN simple brin.Ces complexes vont ensuite fixer lADN hlicase (ou protine dnaB), code par le gne dnaB. LADN hlicase va catalyser le droulement de la double hlice dADN en prsence dATP, ce qui dfinira la future fourche de rplication. Une protine appele dnaC est indispensable cette tape. Elle sera ensuite relche aprs fixation de la protine dnaB la fourche de rplication. Deux hlicases se lient la rgion OriC, une hlicase pour chacun des brins dADN.Les brins spars de lADN sont stabiliss sous forme simple brin grce la fixation de protines appeles SSB (pour single strand binding). Ces protines SSB empchent les deux brins dADN de se rapparier.Puis, il se formera rapidement un complexe appel primosome entre lhlicase et une enzyme appele primase (ou protine dnaG) qui synthtise une amorce dARN. Aprs synthse de lamorce dARN (9-12 nuclotides), lADN polymrase III sinsre au niveau de la fourche de rplication, elle utilise lamorce dARN pour commencer la synthse de lADN. LADN polymrase III possde deux sites actifs qui seront capables de synthtiser les nouveaux brins dADN au niveau de la fourche de rplication. Le complexe de protines qui se dplace le long de l'ADN pour catalyser la rplication est appell rplisome.

II.4. La discontinuit de la rplication entre les deux brins dADN.La rplication nest pas identique entre les deux brins dADN. En effet, sur lun des brins la rplication seffectue de manire continue, on parle de brin avanc, alors que sur lautre brin elle seffectue de manire discontinue, on parle de brin retard.Sur le brin avanc, la progression de la rplication se fait dans le sens 5(3 en utilisant comme modle le brin dADN orient dans le sens 5(3. Sur le brin retard, des petits fragments dADN sont synthtiss, encore appels fragments dOKAZAKI. Chaque fragment est synthtis dans le sens 5(3, le brin modle correspondant de lADN est orient de manire anti-parallle 3(5. On voit donc que lallongement discontinu de ce brin retard se fait dans le sens de la propagation de la rplication.Il est important de comprendre que le brin qui sert de matrice de lecture pour la constitution du brin retard doit former une boucle autour dun des deux sites actifs de lADN polymrase III. Dans ces conditions, lintervention de la primase et de lADN polymrase III permet la synthse dun brin nouveau dADN dans le sens 5(3 par copie au niveau de cette boucle. Aprs la synthse dADN sur le brin retard, la boucle est dfaite et une nouvelle est reforme au niveau de louverture de la fourche de rplication. Finalement, des fragments dADN sont ainsi synthtiss sur le brin retard; de manire discontinue.Pour donner une ide plus concrte sur la rplication, les fragments d'Okazaki ont chez E. coli une longueur moyenne de une deux kb. La fourche de rplication se dplace une vitesse estime environ 1000 nuclotides par seconde 37 degrs.

II.5. Lintervention de lADN-polymrase III.LADN polymrase III synthtise un brin complmentaire partir de lextrmit 3-OH libre de lamorce dARN en utilisant lADN comme matrice (sens 5(3). L'holoenzyme d'ADN polymrase III comporte 10 polypeptides (2X5 sous units protiques). La mme enzyme synthtise le brin avanc et les fragments discontinus sur le brin retard.

II.6. Ncessit damorces dARN.La copie du brin dADN parental ncessite lintervention dune amorce dARN synthtise grce une ARN polymrase ou primase. Cette enzyme synthtise une amorce de 9 12 nuclotides. Puis, lADN polymrase III allonge cette amorce dARN mais pour synthtiser le brin complmentaire dADN. Cette complication apparente est lie au fait que les ADN polymrases sont incapables de commencer la synthse dune chane dADN sans amorce par contre, elles sont tout fait capables allonger une chane de nuclotides.

II.7. Hydrolyse et remplacement des amorces dARN, intervention de lADN polymrase I.Les amorces dARN seront ensuite dtruites et hydrolyses par lintervention dune enzyme, la RNAse H. Elles seront remplaces par des fragments dADN. Les lacunes engendres par lenzyme RNAse H sont combles par une ADN polymrase I. Finalement, les fragments dADN deviennent contigus et sont souds les uns aux autres par lintervention dune enzyme qui est une DNA-ligase.Il faut remarquer que lADN polymrase I peut hydrolyser les amorces dARN la place de lenzyme RNAse H.

II.8. Remarques gnrales sur les fonctions des ADN polymrases I et III.Les ADN polymrases I et III impliques dans la rplication de lADN prsentent plusieurs fonctions enzymatiques:

- Tout dabord une fonction polymrasique qui permet la constitution de la chane polynuclotidique, lenzyme ajoute un nuclotide lextrmit 3 OH dun acide nuclique.

- Une fonction exonuclasique 5(3 (activit de rparation de lADN).

- Une fonction exonuclasique 3(5. Cette dernire fonction est trs intressante. En effet, lenzyme est capable de vrifier le dernier nuclotide mis en place. En prsence dun dfaut dappariement, elle enlve ce dernier nuclotide (proprit exonuclasique 3(5) et insre le nuclotide correct (proprits polymrasiques). Ce mcanisme capital est appel fonction ddition des ADN polymrases et permet donc la correction derreurs au cours de la rplication.

II.9. Terminaison de la rplication.Il existe plusieurs sites de terminaison dans le gnome bactrien (au moins 6 sites de terminaison ou sites ter). Une protine spcifique appele Tus peut se lier aux sites de terminaison. Cette liaison arrte la protine dnaB (hlicase). Les sites de terminaison ne travaillent que dans une seule direction, un seul site de terminaison est utilis au cours dun tour de rplication.

III. LA RPLICATION DE LADN CHEZ LES EUCARYOTES.

III.1. Les caractristiques gnrales.La rplication de lADN chez les eucaryotes est tout fait comparable la rplication de lADN chez les procaryotes. Elle est gnralement bidirectionnelle, elle est discontinue entre les deux brins dADN. Des amorces dARN sont ncessaires. Cette rplication est galement complmentaire, antiparallle et dans le sens 5(3.

III.2. Caractristiques particulires.La replication se fait en de nombreux points dinitiation. Elle fait intervenir un nombre dADN polymrases plus important que chez les procaryotes. De nombreuses protines interviennent comme facteurs de rplication. On connait mal les changements subis par les nuclosomes au cours de la rplication de lADN eucaryote. Enfin, la rplication de lADN des extrmits chromosomiques (ou tlomres) commence tre connue de manire plus approfondie.

III.3. Quelques caractristiques des ADN polymrases des eucaryotes.On connait au moins 5 ADN polymrases chez les eucaryotes.- La polymrase alpha/primase. Cette polymrase est impliqu dans l'initiation de la rplication ("priming").- La polymrase bta. - La polymrase gamma. Cette polymrase est localisation mitochondriale, bien que code par un gne du noyau cellulaire.- La polymrase delta.- La polymrase epsilon.La polymrase alpha/primase synthtise les amorces d'ARN. Une protine appele PCNA ("proliferating cell nuclear antigen") intervient.L'ADN simple brin au cours de la rplication est stabilis par des protines correspondant aux protines SSB du colibacille.Les amorces d'ARN sont dtruites par la RNase H. Les lacunes formes sont combles par les polymrases bta ou alpha.

IV. LES TLOMRES.IV.1. Dfinition.Les tlomres constituent les extrmits des chromosomes eucaryotes. Ils sont forms par des squences rptitives dADN. A lextrmit 3 des chromosomes, on retrouve des copies rptes de squences de type TTGGGG (retrouves chez un protozoaire cili: Ttrahymena) ou TTAGGG (retrouves chez lHomme). A lextrmit 5, on a les squences complmentaires riches en cytosine.Le problme majeur lors de la rplication de lADN est llimination potentielle de lamorce dARN la plus externe ce qui pourrait entraner un raccourcissement de lADN chaque cycle de rplication. La protection des extrmits des chromosomes des eucaryotes est assure par une enzyme spcifique: la tlomrase.IV.2. Lintervention dune enzyme spcifique: la tlomrase.La rplication de lADN lextrmit des chromosomes eucaryotes fait donc intervenir une enzyme particulire appele tlomrase. Cette enzyme ajoute des squences spcifiques en 3 dun brin dADN.La tlomrase va se positionner lextrmit 3 du brin dADN selon le schma suivant:5

3 (brin parental 5(3)

AACCC3

5

brin tardif incomplet (nouvellement synthtis 3(5)La tlomrase possde une matrice qui lui est propre et qui est une matrice dARN, elle va se fixer lextrmit 3:

3 brin parental + tlomrase

AACCCCAAC (5)

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG (3)

AACCC

5

brin tardif incomplet (nouvellement synthtis)Il y a synthse dADN face la matrice dARN:

3 brin parental + tlomrase

AACCCCAAC (5)

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG (3)

AACCC

5

brin tardif incomplet (nouvellement synthtis)Puis, une translocation conduit un mouvement de la tlomrase:

3 brin parental + tlomrase

AACCCCAAC (5)

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG (3)

AACCC

5

brin tardif incomplet (nouvellement synthtis)La tlomrase peut poursuivre ce mouvement de translocation:

3 brin parental + tlomrase

AACCCCAAC (5)

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG (3)

AACCC

5

brin tardif incomplet (nouvellement synthtis)Une rptition de motifs: TTGGGG est synthtise. Elle constitue le tlomre. Pour synthtiser le brin tlomre complmentaire riche en C, une primase interviendrait avec synthse dune amorce dARN par copie de lextrmit 3. Puis lADN polymrase allongerait la chane partir de lamorce dARN. Finalement, une ligase assurerait la soudure finale.5

3

squences tlomres riches en G

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squences tlomres riches

en C + amorce dARN3

5Aprs hydrolyse de lamorce dARN ( ), les tlomres riches en C sont lgrement plus courts que les tlomres riches en G:5

3

squences tlomres riches en G

INCLUDEPICTURE "D:\\BIOLOGIE MOLECULAIRE U.LYON\\cri-cirs-wnts.univ-lyon1.fr\\Polycopies\\BiologieMoleculaire\\IV_fichiers\\image019.gif" \* MERGEFORMATINET

squences tlomres riches

en C aprs hydrolyse de

lamorce dARN3

5Lactivit des tlomrases est trs rduite ou nulle dans les cellules normales en culture. Aprs plusieurs rplications, les chromosomes perdent leurs tlomres et deviennent instables. Par contre dans les cellules cancreuses, lactivit est augmente.