La protéomique : principales techniques et outils informatiques dédiés à l'étude des protéines

Cédric PIONNEAUpionneau@chups.jussieu.fr

Plate-forme Post-génomique de la Pitié-Salpétrière (P3S)http://www.p3s.chups.jussieu.fr

Terme définit par Wilkins et al., Biotechnol. Gene.Eng.Rev. (1995),13, 19-50

Concept désignant l’ensemble des produits fonctionnels des gènes d’un organisme vivant = ensemble des protéines à un temps t d’un organisme vivant dans un environnement donné.

Protéome :

Etude du protéome, c’est-à-dire l’étude à grande échelle des protéines, et plus particulièrement l’étude de leurs :

- niveaux d’expression

- modifications

- interactions

Protéomique :

Génome et transcriptome : supports de l’information

génétique

Protéines : éléments

fonctionnels

Pourquoi l’étude du protéome ?

Chaque protéine a une structure et une fonction qui lui est propre.

- hemoglobine : forme globulaire. Fixation de l’oxygène et du CO2

- actine : filament. Permet la contraction des muscles

Pourquoi l’étude du protéome ?

Le séquençage du génome humain a révélé l’existence de 30 000 gènes. On peut déterminer la séquence des protéines à partir de la séquence des gènes.

Mais connaître la séquence théorique des protéines ne suffit pas…

la séquence ne permet pas toujours de prédire la fonction de la protéine : celle-ci est souvent reliée à sa structure dans l’espace

la protéine est très souvent modifiée après sa fabrication (coupure, ajout d’autres composés,…)

1 gène peut donner plusieurs formes d’une même protéine. Chez l’homme : 30 000 gènes mais 100 000 protéines supposées

Après l’étude du génome, l’étude du protéome est donc indispensable et constitue une nouvelle étape.

Comprendre les processus cellulaires normaux ou responsables de maladies (cancers, maladie neurodégénératives, etc...)

Identifier de nouvelles protéines

Identifier des protéines indicatrices de maladies (bio-marqueurs)

Applications de la protéomique

La structure des protéines

Chaque protéine est élaborée à partir de 20 “briques élémentaires” : les acides aminés.

Une protéine est une combinaison, sous la forme d’une chaîne plus au moins longue et orientée, de ces 20 acides aminés (100 à 200 acides aminés).On représente chacun des acides aminés par une lettre.

La séquence des acides aminés d’une protéine constitue la structure primaire de la protéine.

M

N

R

C

A

I

L

La structure des protéines

Des régions de la protéines peuvent adopter 2 formes particulières : hélices ou feuillets. On parle de structure secondaire. La structure tridimensionnelle finale qu'adopte la chaîne d'acides aminés, constitue la structure tertiaire de la protéine.

Structure tertiaire d’une protéine

Structures secondaires

La structure des protéines

Plusieurs protéines peuvent s’associer pour former des ensembles complexes. On parle de structure quaternaire.

Techniques d’études des protéines

Les protéines sont extraites à partir :- de tissus- de cellules en culture- de liquides biologiques (sang, liquide céphalo-rachidien, etc..)

On utilise des solutions à la composition bien définie pour solubiliser les protéines et les séparer des autres constituants.On obtient ainsi un extrait protéique = matériel de base pour l’étude des protéines.

Extrait : mélange d’un grand nombre de protéines (plusieurs milliers). Il faut individualiser les protéines pour mieux les étudier.

Technique développée par O'Farrell en 1975 (30 ans !).Combine 2 séparations séquentielles des protéines en gel de polyacrylamide (20 X 20 X 0,1 cm).

Electrophorèse bidimensionnelle

+

+

-

Extrait

1ere séparation (charge) 2eme séparation (masse)

-

Le gel de polyacrylamide est incubé dans une solution qui colore les protéines.

Electrophorèse bidimensionnelle

Chaque « tache » sur le gel représente une protéine.

Plus la « tache » est grosse et foncée, plus la protéine est abondante.

Electrophorèse bidimensionnelle

Application : comparer les gels dans différentes conditions (cellules normales vs cellules cancéreuses par exemple) pour trouver des différences de quantité de protéine et/ou des absences de protéines.

cellules normales cellules cancéreuses

Logiciel d’analyse d’images

Après numérisation, détection automatique des protéines dans l’image du gel

Quantification : mesure de l’intensité en niveaux de gris des protéines

Matching : un algorithme d’appariement compare les gels 2 à 2 pour trouver les taches qui représentent la même protéine dans les 2 gels

Logiciel d’analyse d’images

Outils de visualisation 3D pour mieux voir les « taches »Aide pour vérifier la détection faite par le logiciel

Logiciel d’analyse d’images

But : repérer les variations d’expression des protéines et les valider par des tests statistiques.

Spectrométrie de masse

Technique permettant d’identifier les protéines séparées par électrophorèse bidimensionnelle ou les protéines en solution (mais en nombre limité).

Il faut casser au préalable les protéines : on utilise un enzyme qui fragmente les protéines toujours après 2 acides aminés bien précis.

Les fragments produits sont caractéristiques de la protéine : « empreinte digitale »

Principe : propulser les fragments de protéines dans un tube sous vide. Pendant leur vol, les fragments se séparent selon leur masse, les plus légers arrivent les premiers sur le détecteur en bout de tube.

Spectrométrie de masse

Mesure du temps de parcours = mesure de la masse

Résultat : spectre de masse des fragments de la protéine

Spectrométrie de masse

Liste de masses- 2716.23- 2284.16- 2212.10- 1882.97- …

Analyse des données : la liste de masses de la protéine est comparée aux listes de masses théoriques obtenues à partir des séquences protéiques dérivées du génome.

Spectrométrie de masse

Protéine X- 2716.23- 2284.16- 2212.10- 1882.97

Actine- 2716.23- 2284.16- 2212.10- 1882.97- 1312.25

Cytochrome C- 3002.28- 1684.53- 1124.53- 969.12

Cytokeratine- 2621.23- 1985.36- 1524.59- 1212.36

Génomeconnu

Protéome

Bases de donnéesComme pour le gènes, les séquences de toutes les protéines sont stockées dans des bases de données accessibles par Internet.

SwissProt : base contenant les séquences de protéines connues. En plus de la séquence, sont stockées des informations sur la protéine (structure, fonction, etc…)

Logiciels de recherche dans les bases de donnéesPour les données de spectrométrie de masse par exemple. Différent algorithmes :

SEQUEST : calcul d’un score basé sur la corrélation entre la liste de masses et les listes de masses théoriques

MASCOT : calcul d’un score basé sur la probabilité de trouver une correspondance entre la liste de masse et les listes théoriques qui n’est pas due au pur hasard

Outils informatiques pour l’étude des protéines

Outils informatiques pour l’étude des protéines

Prédiction de structure

A partir de la séquence, des programmes tentent de déterminer la structure tridimensionnelle de la protéine.

Nécessite beaucoup de calculs (très grand nombre de combinaisons possibles) : réalisés sur des supercalculateurs.

Souvent les programmes se basent sur des modèles de structures de protéines connues (détermination de la structure par homologie).

Le calcul partagé (grid computing)

Programme Décrypthon :Mieux comprendre le fonctionnement et le rôle des protéines, prédire leur fonction si elle est inconnue, progresser dans la connaissance de leur structure en 3 dimensions, croiser les données du protéome et celles du

génome

- 3 supercalculateurs (Bordeaux, Lille et Paris 6) connecté par le réseau à haut débit RENATER. Puissance de calcul initiale de de 298 Gflops

- grille d’internautes : 75 000 volontaires qui ont permis la comparaison de 559275 séquences protéiques en moins de deux mois

Berkeley Open Infrastructure for Network Computing (BOINC)

- projet Predictor@home et Rosetta@home : pour la prédiction de structure de protéines impliquées dans les maladies telle que le SIDA, les cancers, etc…

Outils informatiques pour l’étude des protéines

Conclusions

Après l’étude génome (toujours en cours), l’étude du protéome est actuellement le nouveau défi des chercheurs.

Le nombre de données biologiques sur les protéines ne cesse d’augmenter et on aura encore plus besoin de l’informatique pour gérer et analyser toutes ces données.