La Mort Cellulaire

en Radiothérapie

C. HENNEQUIN,Hôpital Saint-Louis, Paris

S. RIVERAGustave Roussy, Villejuif

Mort cellulaire:Définition

Mort cellulaire ou mort clonogénique:

perte de la capacité proliférative

Effet recherché en radiothérapie

Tests clonogéniques

Mort cellulaire

1/ Cellules proliférantes perte de la capacité de prolifération

Intérêt dans le traitement du cancer

Disparition des cellules clonogéniques

2/ Cellules différenciéesCellules nerveuses, musculaires, secrétoires, … Perte de la fonction

Tissus sains +++ Toxicité

Cell response to ionizing radiation

IR

DNA double strandbreak induction

DNA double strandbreak repair

Tolerance ofresidual damage

• Hypoxia• Free radical scavengers• Chromatin structure

• Cell cycle arrestto allow repair

• Repair enzymes- production in response to damage- rate and accuracy of repair

Cell lives

Cell dies

Cell death

Effets cellulaires des radiations ionisantes

-Formation de lésions sur l’ADN

- Activation de voies de signalisation

=> Expression génique modifiée

=> Synthèse/dégradation protéique

- Mutations/ aberrations chromosomiques

- Altération de la progression du cycle cellulaire

- Modifications du phénotype

- Mort cellulaire

Types de lésions crées

Lésions létales:Ne peuvent pas être réparéesEntraînent la mort cellulaire rapide

Lésions potentiellement létales (PLD)> Peuvent être réparées si les caractéristiques

Du milieu s’y prêtent

Lésions sublétales (SLD):> Peuvent être réparées si on leur laisse le temps

Concept de SLDLésion sub létale

Lésion potentiellement réparables si on laisse le temps aux réparations d’avoir lieu

1 2 3 4 5

FractionSurvivante

Heures

Délai entre deux fractions

Temps de réparationVariable d’un tissu à l’autre

RI

Réparation ad integrum

Défauts de réparation

Réparation

TempsPhasecycle

Chromosomes

Apoptose

Oncose (nécrose)

Mort différéeInstabilité génomique

TranslocationsInversions

Capture télomèresDélétions

AcentriquesDicentriques

Cassures

p53P

Sénescencep21Waf1

Evènements conduisant à la Mort cellulaire radio-induite

Autres???

Les différents types de mort cellulaire

Mort immédiate

Senescence Mort mitotiqueOncose (nécrose)

Mort différée

Apoptose

Non programmée

Programmée Non programmée Programmée

Cellules épithéliales

Fibroblastes Cell. ÉpithélialesMutations/délétions

pT53

LymphocytesThymocytes

ProstateAcini salivaires

Cryptes intestinalesCell. endothéliales

Mort immédiate

Survient quelques minutes/heures après l’irradiation

Forte dose de rayonnement

Hyperactivation de la PARP

Perte de l’intégrité membranaire, activation des lysosomes,Dégradation rapide des organites intra-cellulaires

Sénescence/ Quiescence ou arrêt en G1

Arrêt en G1 irréversible : fibroblastes

Disparition complète des cyclineset perte irréversible du pouvoir de prolifération

« Dose unique de 40 à 60 Gy »Fibroblastes métaboliquement actifs pdt de longues durées,(utilisés en cocultures comme supports)

Fibroblastes en cultureLes cell. Jeunes sont petites et fixent peu la b-Galactosidase.Les cell. agées sont grandes,Multinucléeset positives pour la b-galactosidase

Sénescence

Perte définitive de la capacité de prolifération tumorale

Mise en évidence par:

secrétion accrue de b-galactosidase

foci d’hétéro-chromatine spécifique

Impliquée dans les effets de la RT sur les cellules prostatiques

Voie métabolique:

DNA damage ----> p53 ----> p21 ----> Arrêt du cycle cellulaire

Pas de sénescence chez les P53 mutées!

Autophagie

Processus de digestion cellulaire

Dégradation lysosomale des protéines et organites

Création d’un autophagosome au sein de la cellule

contenant protéines/organites

puis fusionnant avec les lysosomes

Régulé génétiquement

autophagy-related genes

Mécanismes de mort des cellules cancéreuses

Mort cellulaire autophagiqueMort cellulaire de type 2

La mort cellulaire par autophagie

Mort cellulaire

Mécanismes principaux: Mort mitotique et Nécrose (Oncose) Apoptose

Necrose et mort mitotique Survienent quand des lésions non réparées débouchent sur des aberrations chromosomiques

(dicentriques, acentriques, …)Aux mitoses suivantes, ces aberrations conduisentÀ des « catastrophes mitotiques »

Mécanismes de mort des cellules cancéreuses

Mort cellulaire autophagiqueMort cellulaire de type 2

NécroseMort cellulaire de type 3

La mort cellulaire par catastrophe mitotique

Divisions cellulaires asymétriques

Mort mitotique

• Aberrations chromosomiques graves:- Non transmises à la descendance- Conduisent à la mort cellulaire rapide

• Aberrations « bénignes »(translocations, inversions, courtes délétions)

• Compatibles avec une survie clonogénique• Mais instabilité génomique/chromosomique• Responsables d’une mort cellulaire future• Faible potentiel clonogénique => microcolonies

Mort mitotique différée

Après irradiation,Les cellules finissent par mourirmais après un nombre variable de divisions (jusqu’à 20)(Thompson, IJRB, 1969)

Mort mitotique différée

• Secondaire à des aberrations chromosomiques transmisesRéarrangements complexes/dicentriques: Diminution de 30% et 50% à chaque mitose

• Ou acquises après quelques divisions (Instabilité génomique)Augmentation de la fréquence des mutations de novo,des aberrations chromosomiques, et de la létalité

Þ Diminution de la capacité proliférative (Plating efficiency)des cellules irradiées

De 15 à 20% par passage

(Little, IJRB, 1990; Motherhill, IJRB, 1997; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)

Mort mitotique

• Incapacité à accomplir avec succés une mitose,

• Conséquence de l’accumulationde lésions chromosomiques non réparées

• Apparition de cellules binuclées et géantes,et de micronoyaux

• Mort cellulaire prépondérante ds les cell. Épithéliales

• Peut déboucher sur nécrose (oncose) ou apoptose

Nécrose (Oncose)Reproductive cell death-Caractérisée par sa spécificité pour les cell. proliférantes

- Augmentation de la perméabilité membranaire- Diminution rapide des synthèses protéiques- gonflement des mitochondries, puis de la cellule

-Corrélation entre oncose et:

- quantité de lésions crées sur l’ADN- aberrations chromosomiques (Ward, IJRB, 1990)

-Se traduit par un épaulement de la courbe de survie(lésions toxiques potentiellement réparables)

Incapacité pour la cell. à réparer complétement et correctement les lésions de l’ADNAnomalies biochimiques/métaboliques

NECROSE

Kerr, 1965: Observations morphologiques

• Gonflement du cytoplasme et des organites

• Accroissement de la perméabilité membranaire(entrée des colorants: éosinophilie)

• Condensation puis lyse chromatiniennesans oligomères de nucléosomes

• Perte des organites cellulaires et vacuolisation

• Infiltration par des cell. inflammatoires

La mort cellulaire par nécrose

Nécrose cellulaire

V79 irradiés à la dose de 5 Gy après 7 joursA: colonie normaleB,C: colonies irradiées

Apoptose

Décrit initialement comme une mort en Interphase(ne nécessitant pas de mitoses)

Décrite chez les lymphocytes, les cell. Seminomateuseset les ovocytes

Processus actif, necessitant la synthèse de nbres protéines

Mort programmée

Evenements déclenchantl'apoptose

- selon les types cellulaires

• Différenciation cellulaire lors du dévellopement

• Suppression hormonale ou de facteurs de croissance

• Signal de mort (récepteur FasAPO-1/CD95 des lymphocytes)

• TGF-ß, TNF, corticoïdes, …

• Perte d’adhésion (anoikis)

• DNA-damaging agents: Drogues, toxines, Rayons X, …

Apoptosis

Apoptotic signals

Initiator caspases

Effector caspases

Coactivators Inhibitors

Biochimie de l'apoptose:Activation des Endonucléases

• Endonucléases: coupent l'ADN entre les nucléosomes

=> fragments mutiples de 185 bp

=> "Apoptotic ladder" sur gel d'agarose

• Reconnaissance topologique et non d'une séquence d'ADN

• Activation: - endonucléases DNAse I et II - NUC-18 (Thymocytes)

Apoptose: vue généraleVoie extrinséque Voie intrinséque

Signals TNF-related proteins - GF withdrawal- X-rays, Chemo

Caspase activators Death effectors:FADD, TRADD

Cytochrome CRelease

Initiator caspases Caspases 8, (10) Apaf-1Caspase 9

Effector caspasesCaspases 3, (6-7)

APOPTOSE

Voie intrinséque

CytochromeC

Bcl2 Bax

Cytotoxic signals

Apaf-1

Caspase 9

Caspase 3

Apo

ptos

ome

IAPs Diablo

IAPs: Inhibiteurs de l’apoptose

La mort cellulaire par apoptose

Apoptose radio-induite

Survient classiquement dans les 48 hr suivant RT avant la mitose mort en interphase (Stephens, Rad Res, 1991)

déclenchée par les DSB (Story, IJRB, 1994)

DNA damage

Radiation sensors

P53 activationSignal transduction

P21; RbMdm2Gadd45

Growth arrest

CaspasesBaxFas

Apoptosis

Apoptose Radio-Induite

- Requiert la p53 (+++)(Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992)

- L’irradiation accroît l’activité p53 cellulaire( Zhan, Mol Cell Biol, 1993)

- Les cellules p53 mutées seraient donc plus radio-résistantes (Lowe, Science, 1994)

Thymocytes des souris p53 -/-: pas d’apoptose radio-induite(Clarke, Nature, 1993; Lowen, Blood, 1993; Lowe, Nature, 1993)

Cell. Cryptiques intestinales: souris Nles: apoptose souris p53 -/-: pas d’apoptose

(Clarke, Oncogene, 1994)

p53 status and the Efficacyof Cancer Therapy In Vivo

Lowe, Science, 1994

Fibrosarcoma cell lines p53 +/+ or p53 -/-

Injected in nude mices

Irradiation (7Gy oy 14 Gy) or Adriamycin treatment

Death by apoptosis after irradiation or chemotherapy

7 Gy

14 Gy

Adria

Lowe, Science, 1994

p53 +/+

p53 -/-

Radiation-induced apoptosis

p53

Bax (Noxa)

Relarguage du cytochrome Cdes mitochondries

Apaf-1/casp-9

Bcl2

DNA damage outcomes

DNA-DSBATM DNA-PK

(p450, Ku 70/86)

p53

Bax Bcl2

Apoptosis

p21

G2/S/G1 delay

Repair Reproductive integrity

P53 au centre de la réponse aux dommages radio-induits

P53: gardien du génome

P53:Acteur direct de la réponse aux lésions de l’ADN

Liaison aux protéinesXPD, XPB et CSB (Hélicases)

Du Nucléotide-excision repair (NER)(Wang, Nature Genet, 1995;Leveillard, EMBO J, 1996)

Liaison aux Hélicases:WRN: Sdr de WernerBLM: Sdr de BloomRECQ4: Sdr deRothmund-Thomson

Facilite la « base excision repair »(Offer, FEBS Lett., 1999)

Action directe de la P53sur la réparation des DSBs

Réparation des DSBsSelon le statut p53

(Test de la comète en hautEt Foci H2AX en bas)

Lignée HCT116 wP53carrés noirs

Ou déficiente en p53carrés blancs

Mirzayans, IJROBP, 2006

Role de Baxdans l’apoptose radio-induite

-Augmentation p53 dépendante de Bax après RT Démontrée dans plusieurs lignées cellulaires

-Mais:- Induction d’Apoptose par p53

observée sans augmentation de Bax

- Les souris Bax -/- ont une apoptose p53 dépendante post-RT nle

Quatre voies apoptotiques

P53 --> BAX ---> Voie intrinsèque DNA damage ---> Ceramide synthase ---> Voie

intrinséque Atteinte membranaire

> ---> activation de la sphingomyélinase> ---> transformation de la sphingomyéline en céramide> ---> activation de la voie intrinséque

Activation de la voie extrinséque

Target for Radiation-induced Apoptosis:The plasma membrane ?

RT

Activation directe

de la sphingomyelinase membranaire

Ceramide Sphingomyelin

Apoptose

Voie métaboliqueDu stress

(Santana, Cell, 1996Chumura, Cancer Res, 1997)

Quatre voies apoptotiques

DNA damage

Ceramidesynthase

Ceramide

Sphingomyelinase

p53 Bax

Fas

DeathReceptor

Caspase 8Apoptose

Apoptose et Réponse à l’irradiation

Importance du phénoméne apoptotique après irradiation ?• Dépend des tissus étudiés• Très variable d’une tumeur à l’autre• par ex., les fibroblastes ne meurent pas d’apoptose

(Yanagihara, IJRB, 1995)• alors que c’est le principal mode de mort

des cell hématopoïétiques

L’induction d’apoptose semble corrélée au contrôle tumoral

Dans certaines lignées, pas de corrélationentre apoptose radio-induite et survie cellulaire(Alridge, Br J Cancer, 1995)

Comparisonof apoptotic responsein 15 different tumours

Apoptose et irradiation fractionnée

Chen, Rad Res, 1994 -

Rat embryo cells

- Survie avec apoptose: 0.53- Survie sans apoptose: 0.67

A 2 Gy:

Apres32 fractions

- Survie avec apoptose: 1.5.10-9

- Survie sans apoptose: 2.7.10-6

=> Prob. de contrôle local diminuée de 30%

Apoptose spontanéedans les tumeurs

- Rare- Dans le cancer du col utérin:

Entre 0 et 4% des cellules(Levine, Lancet, 1994, 344: 472)

-Facteur pronostique avant radiothérapie ?=> Données contradictoires

Nouvelles hypothéses

La cible: l ’ADN

La cible: membrane/cytoplasme

Bystander effect

Entose ou cannibalisme cellulairePost-Doc2

Mort cellulaire non apoptotique

Internalisation d’une cellule vivante dans une cellule vivante

Elimination de la cellule internalisée par les lysosomes de la cellule hôte

Overholtzer et al. Cell. 2007.

Pleural effusion

MUC-1b-cat

Breast tumor

b-cat

Cano et al, EMBO Molecular Medicine

(2012)

Florey et al, Nature Cell Biology (2011)

Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011)

Guadamillas, Journal of Cell Science (2011)

Yuan, et al, Genes and Development (2010)

Wang et al, Cell Research (2009)

Overholtzer et al, Cell (2007)

White et al, Cell (2007)

Cannibalisme cellulaire dans les tumeursPost-Doc2

Cytokeratin 5b-cat

Melanoma

Conclusion: mort cellulaire en radiobiologie

= Perte de la capacité de division et non disparition physique de la cellule!!!

Une cellule morte peut métaboliser La létalité avec la dose mais la cinétique de ↗

réparation est constante