ISABELLE WEPPE

ÉVALUATION DE LA STRATÉGIE ANTISENS POUR L'ÉTUDE DU RÉCEPTEUR 13, DE LA DOPAMINE CHEZ LE PRIMATE.

Mémoire presenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M-Sc.)

Neurobiologie FACULTÉ DE MÉDECINE

Université Laval

O Isabelle Weppe, 2000

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La stratégie antisens devient un outil d'investigation de plus en plus utilisé en

Neurosciences, Elle a permis la caractérisation des propriétés pharmacologiques et des

fonctions biologiques de certains récepteurs. Ceci est dû à la découverte rapide de la

structure moléculaire de nouveaux sous-types de récepteurs dont les fonctions sont mal

connues. Les ODNs antisens permettent de réduire I'expression, et ce, de façon sélective

d'un sous-type particulier de récepteur, alors qu'encore beaucoup d'agents

pharmacologiques traditionnels ne permettent pas d'obtenir un tel résultat,

Dans un premier temps, et pour me familiariser avec la technique antisens,.nous

avons tenté de bloquer, via des ODNs antisens, la synthèse des récepteurs 5HT-, chez

le rat 11 m'a paru néanmoins important de présenter ici les résultats de cette étude. Nous

avons donc bloqué la synthèse des récepteurs 5HT-, et d'observer ses effets sur

l'expression de différents facteurs de transcriptions et neuropeptides. Cependant, notre

ODN antisens reste sans effet observable sur les sites de liaison SKI'-,. En revanche,

I'ODN mismatch semble avoir des effets non-spécifiques alors que théoriquement il ne

devrait pas s'hybrider avec I'ARNrn du récepteur 5HT-,.

Dans un deuxième temps, nous nous sommes attachés à bloquer la synthèse du

récepteur Dopaminergique D2 chez un singe normal, et ce, unilatéralement au niveau

des noyaux gris centraux dans le but créer une asymétrie du système dopaminergique et

de mieux comprendre le rôle de ce récepteur dans l'activité motrice. Ces résultats nous

permettrons de mieux appréhender, à plus long terme, le rôle des RD, dans la maladie

de parkinson et dans les troubles moteurs liés à cette maiadie. Les résultats suggèrent

que le blocage des RD2, au niveau du putamen et du noyau caudé par des ODNs

antisens, entraîne une diminution de l'utilisation de la main contralatérale alors que les

résultats suite à I'injection d'ODN antisens dans le putamen et le noyau accumbens

montrent une augmentation de l'utilisation de la main.

Ces résultats sont préliminaires certes, cependant ils permettront d'affiner la

mise au point de la stratégie antisens chez le primate.

Danid L~%ESOUE lsabelIe WEPPE

AVANT-PROPOS

Je voudrais tout d'abord remercier mon directeur de maîtrise le Dr. Daniel Lévesque et

mon codirecteur le Dr. Paul J. Bédard pour m'avoir accueilli dans leurs laboratoires. Leurs

valeurs scientifiques, leur patience, leur confiance ainsi que leurs encouragements m'ont été

d'une aide précieuse. Je remercie également le Dr. Paul J. Bédard pour son soutien financier

au cours de ma maîtrise.

Je remercie le Dr. Claude Rouillard pour ses conseils précieux et le Dr Guy Drolet pour

m'avoir fait 1 'honneur d'évaluer mon mémoire.

Je tiens aussi à remercier toute l'équipe du laboratoire de Daniel Lévesque pour

I'ambiance de travail et de sympathie dans le labo tout au long de ma maîtrise. Et tout

particulièrement Geneviève Beaudry et Laurent Grégoire pour leur patience sans limites, leur

aide de tous les instants.

Je voudrais aussi remercier tous les étudiants, assistants de recherche, secrétaires et

chercheurs de l'unité de Neurosciences qui, par leur chaleur et leur disponibilité, ont crée une

grande famille autour de moi.

Enfin, je tiens à remercier très particulièrement mes parents pour leurs soutiens, leur

confiance et leurs encouragements dont ils ont toujours fait preuve au cours de mes études.

AC

AMR + AMPc - ADN

ARNrn

Cx Cing

Cx PréF

DA

EPS

i.c.

i c v .

EG

IP + L-DOPA

LCA

N. Acc.

ODN(s)

PS-O

m l 7 29 3 9 Ji 5

RD2

mm-, SN

SNC

SNc

SNr

StDL

StVL

Tub. O.

Sm

Adenylyi cyclase

Stimule l'adénosine mono phosphate cyclique

inhibe l'adénosine mono phosphate cyclique

Acide désoxyn'bonucléique

Acide ribonucléique messager

Cortex cingulaire

Cortex préfrontal

Dopamine

Symptômes extrapyramidaux

Intra-cérébrale

Intra-cérébro-ventriculaire

Gène à réponse précoce

Stimule phosphatidyl inositoI

L-3,4dihydroxyphenylalanine

Liquide céphalorachidien artificiel

Noyau accumbens

OligodéoxynucIéotide(s)

Oligonucléotide phosphorothioate

récepteur D,, Da, D3, D4, D5 de la dopamine

Récepteur doparninergique D,

Récepteur sérotoninergique 5HT-,

Substance noire

Système nerveux centrai

Substance noire pars compacta

Substance noire pars reticulata

Striatum dorsolatéral

Striatum ventrolatéral

Tubercule olfactif

Sérotonine

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX :

FIGURE 1 :

FIGURE 2 :

TABLEAU 1 :

FIGURE 3 :

FIGURE 4 :

CHAPITRE PREMIER : INTRODUCTION

Les différents mécanismes d'actions de I'ODN antisens avec I'ARNm.

Ossature d'un PS-O, changement d'un Oxygène par un Soufre,

Synopsis de la classification des récepteurs dopaminergiques.

Coupe transversale, d'un cerveau de primate, au niveau des ganglions

de la base,

Physiopathologie de la maladie de Parkinson,

CHAPITRE TROISIÈME : MATÉRIELS ET MÉTHODES

FIGURE 5 :

TABLEAU 2 :

FIGURE 6 :

FIGURE 7 :

FIGURE 8 :

FIGURE 9 :

Représentation schématique des régions échantiIlonnées pour

l'analyse des niveaux d'ARNm des facteurs de transcriptions et des

neuropeptides.

Séquences des différentes amorces utilisées pour obtenir une partie de

la séquence du gène R D2 de macaca fmcicularis.

Position des amorces sur l'ADN du récepteur dopaminergique D1.

Schéma de la transcription inverse.

Effets de I'ODN antisens 5HT-, et de I'ODN misrnatch sur les niveaux des

sites de liaison des récepteurs 5HT-, au niveau du Cortex préfrontal

(Cx PréF).

Effets de 1'ODN antisens SHT-, et de L'ODN mismatch sur Ies niveaux des

sites de liaison des récepteurs 5HT-,. A :du corps du noyau accumbens

(NAC), B : de la coquille du noyau accumbens (NAS).

FIGURE 10 :

FIGURE 11 :

FIGURE 12 :

FIGURE 13 :

FIGURE 14 :

GEL 1 :

FIGURE 15:

FIGURE 16 :

FIGURE 17 :

FIGURE 18 :

Effets de I'ODN antisens et de i'ODN mismatch Sm-, sur les niveaux des

sites de liaison des récepteurs 5HT-,, A : du striatum dorsoiatéral (St DL),

B :du striatum ventrolatérai (St VL).

Effets de I'ODN antisens et de I'ODN rnismatch 5HT-, sur Ies niveaux des

ARNm de c-fox

Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des

ARNm de NGFI-B.

Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des

ARNm de Neurotensine.

Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des

ARNm de Dynorphine.

Résultats des PCR sur gels d'agarose L %-

Séquence obtenue du gène RD, de macaca fascicularis.

Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd, Put,) d'ODN

antisens Dz sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

(SOpg/site/injection).

Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd, Put.) d'ODN

antisens D-, sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

( LOOpb/site/injection).

Effet d'une double infusion intracérébrale continue (Put., Acc) d'ODN

antisens D-, sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

( LOpgIpl- L pl/h),

TABLEAU 3 : Effet des injections sous cutanées de quinpirole sur Le comportement moteur

du singe traité par des ODNs antisens RD,.

TABLEAU 4 : Effet d'injections i.c. sur le comportement moteur du singe sans traitement

ODN antisens RD,.

Résumé ............................................................................................... i . . Avant.propos ........................................................................................ II . . . * . * Abreviations ........................................................................................ 111

Liste des figures et tableaux. ..................................................................... iv .. Table des rnatieres .................................................................................. vi

CHAPITRE PREMIER INTRODUCTION ..................................................... 1

1-Introduction à la technique antisens ................ .. ............................................... 2

1 -Mode d'action .............................................................................. 2

2-Applications aux Neurosciences ........................................................ -5 II-Introduction aux récepteurs de la sérotonine ................................................... -7

.............................. 1-Le récepteur de la sérotonine Sm, et la schizophrénie 8

UT-Introduction aux récepteurs de la dopamine ................................................... 10

L-Le récepteur dopaminergique D2 ....... .... ..... ......................................... 11

2-Anatomie et physiopathologie des noyaux gris centraux .......................... -12

3-La maladie de Parkinson ................................................................. 15

CHAPITRE DEUXIÈME PROBLÉMATIQUE .............................................. 18

1-Application de ta stratégie antisens au récepteur de la sérotonine SHT., chez le rat ...... 19

1-Pertinence de la recherche.. ............................................................. 19

2-Hypothèses et objectifs ................................................................... 20

II-Application de la stratégie antisens au récepteur de la dopamine D2 chez le macaque .. -22

I -Pertinence de la recherche .......... .,. ... ,.., ........................................ 22

2-Hypothèses et objectifs ............................................... ,. ................ -24

....... CHAPITRE TROISDÈME MATÉRIELS ET MÉTHODES ................. .. -27

[-Animaux et administration des ODNs SHT., .................................................. -28

II-Test de liaisons (binding) des récepteurs 5HT-, m3] Kétansérine ........................... 29

III-Hybridation in situ sur les coupes du protocole antisens Sm, ............................ 31

1-Synthèse des ri bosondes ................................................................. 31

2-Réactions d'hybridations in situ ........................................................ 32

N-Clonage du récepteur dopaminergique D2 de macaca fascicularis .......................... 34

1-Transcription inverse ..................................................................... 36

V-Les ODNs RD2. ..................................................................................... -38

VI-Les administrations des ODNs au singe macaca fascicularis. .............................. -39

1-L'anesthésie du singe ..................................................................... 39

2-Expériences de micro-injections d'ODN antisens.. ................................. -39

3-Expérience d'infusion continue d'ODN antisens .................................... -40

4Les tests d'utilisation de la main.. ..................................................... -41

5-Les injections de quinpirole... .......................................................... -41

CHAPITRE QUATRIÈME RÉSULTATS ..................................................... 42

1-Résuitats de la stratégie antisens appIiquée au RSHT- ,.. ...................................... 43

............. 1-Effet de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch sur les EHT- , ..... 43

2-Effet de I'ODN antisens et de 1'ODN mismatch sur les niveaux d'ARNm des

facteurs de transcription et des neuropeptides ......................................... -47

II-Résultats de la stratégie antisens appliquée au RD, de rnacaca fascicularis ............. - 3 2

1-Résultats du clonage du gène RD, de macaca fmcicularis ......................... 52 a- Résultats des PCR .................................................................... 3 2

b- Résultats du séquençage du gène RD , ............................................. 53

2-Résultats des micro-injections ponctuelles ....... ... .. ...................... .. ....... .54 a- 5 pgipl. ............................................................................... -54

b- 10 &pl ................................................................................ 55

3-Résultats de l'infusion continue ...................................................... - 3 3

4Résultats des injections de quinpirole .................................................. 60

CHAPITRE CINQUJÈME DISCUSSION .................................................. -63

1-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au récepteur 5HT, chez le rat ............... 64

II-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au récepteur D, chez le singe macaca

fascicularis ............................................................................................ -66

1-Le séquençage du gène RD, de macaca fascicularis ................................ 66 2-La stratégie antisens appliquée au RD2 de primate et la préférence d'utilisation

de la main ..................................................................................... 67

CONCLUS ION ........................................................................................ -72

B IBLIOGRAPHIE ..................................................................................... 73

CHAPITRE PREMIER

Introduction

1-in traduction à la tee hniaue an tisens.

1- Mode d'action.

Les Oligodéoxynucléotides (ODNs) antisens sont de petits fragments synthétiques

d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN), habituellement appelés

ODNs antisens et ayant une action au niveau génique. Ils sont généralement désignés pour

être complémentaire d'une petite séquence d'un ARNm cible. Les ODNs antisens inhibent

ainsi la traduction de l'acide ribonucléique messager (ARNm) cible en se liant à une séquence

unique et ce, de façon, séquence spécifique. Cette liaison, par hybridation spécifique de

ltODN avec I'ARNm de la protéine ciblée, permet d'inhiber spécifiquement la synthèse de la

protéine codée.

Les ODNs sont concus pour réguler l'information qui est transférée du gène à la

protéine. La meilleure cible gour les ODNs est donc I'ARNm. Les ODNs vont agir à

différents stades du métabolisme intermédiaire de I'ARNm et ainsi altérer la synthèse

protéique (figure 1) (Croo ke, 2000).

Tanscription - Transcriptional Arrest

Effects on OegfadaUon

m e 1 : Les différents mécanismes d'actions de I'ODN antisens avec 1'ARNm

(Croo ke, 2000).

Cette liaison peut inhiber la transcription. C'est le cas lorsque llODN se fixe sur la

double hélice d'ADN formant ainsi un triplex. Dans le cas de la liaison de lfODN avec

lfARNm, cela entraîne une inhibition de l'interaction de I'ARNm avec les protéines, d'autres

acides nucléiques et les facteurs essentiels aux étapes du mécanisme intermédiaire de

1' ARNrn.

Ces mécanismes dépendent de la chimie de I'ODN et de son site de liaison avec

1'ARNrn. Au court de cette recherche nous avons utilisé des ODNs antisens désignés pour

inhiber la traduction. Parmi les mécanismes d'actions visés par la stratégie antisens, l'arrêt de

la traduction représente le plus couramment ciblé, La plupart des ODNs qui ont été

synthétisés pour arrêter la traduction de la protéine cible, reconnaissaient spécifiquement la

séquence contenant le codon d'initiation (Crooke, 1999; Crooke, 2000). Cette hybridation va

donc empêcher la fixation des ribosomes au site d'initiation, inhiber le phénomène

d'élongation et ainsi empêcher la traduction de 1'ARNm (Baker et Monia, 1999; Cooper et

coll., 1999).

Avant d'émettre une conclusion à partir d'observations expérimentales, l'utilisation des

ODNs antisens nécessite la prise en compte de différents paramètres essentiels. Ces

paramètres sont : la stabilité, la pénétration cellulaire, la sélectivité et l'affinité, l'activité et le

mécanisme d'action, la tolérance, la bio disponibilité et la fabrication (Phillips et Zhang,

2000). Pour induire son effet biologique, un ODN antisens doit se lier spécifiquement et avec

un degré d'affinité élevé à sa cible ARNm. La dégradation des antisens représentait une autre

difficulté à surmonter lorsque ces derniers commencèrent à être utilisés comme agents

thérapeutiques (Agrawal, 1999).

Les ODNs composés de liens phosphodiesters ne sont pas de bons candidats pour la

stratégie antisens. En effet, ils sont très rapidement dégradés par les nucléases avant même

d'avoir atteint leur cible (Agrawal, 1999). Plusieurs structures modifiées des ODNs

phosphodiesters ont donc été synthétisées et testées. L'objectif de ces travaux est d'augmenter

la demi-vie des ODNs tout en conservant leur capacité à traverser la membrane cellulaire et à

se lier avec un degré d'affinité et de sélectivité élevée à leur cible ARN (De Mesmaeker et

coli., 1995; Zhou et Agrawai, 1998; Cooper et coII., 1999; Giles et coll., 2000; Nielsen, 2000).

Même si chacun des trois composants dVODN (base, sucre et liaison phosphodiester) peut être

modifié, les changements les plus importants ont été apportés à la liaison.

Les oligodéoxynucléotides phosphorothioates (PS-O) sont les plus utilisés de la première

génération d'ODNs modifiés. Un des atomes d'oxygène de la liaison phosphodiester est

remplacé par un atome de soufre (figure 2).

PO Iinkage

Figure 2 :Ossature d'un PS-O, changement d'un Oxygène par un Soufre

(Agrawal et Iyer, 1997).

Cette modification, au niveau de la liaison de PS-O, a permis de considérablement

augmenter la résistance de cet ODN antisens aux nucléases. Les PS-O sont devenus les

"antisens standard" étant donné leur facilité de synthèse et leur bonne résistance aux

nucléases. Ils sont également de bons substrats pour l'activation de la endoribonucléase H

(RNAse H) (Agrawal, 1999; Monteith et Levin, 1999). La RNAse H est une enzyme

omniprésente chez les procaryotes comme chez les eucaryotes. La RNAse H est présente dans

le noyau mais aussi dans le cytoplasme et son activité est variable suivant le type cellulaire.

Elle dégrade spécifiquement le brin d'ARN du duplex Am-ADN. L'hybridation de lYODN

antiwns avec I'ARNm va donc eniraîner une déagadation de ITARNm cible et empêcher son

utilisation pas la cellule (Crooke, 1998; Baker et Monia, 1999).

La taille de I'ODN antisens est essentielIe e t a fait l'objet de nombreuses études.

Actuellement, il est bien démontré que la taille de I'ODN doit se situer entre 15-20 bases pour

être spécifique de la séquence pour laquelle il est désignd et s'hybrider avec sa cible ARNm

avec un bon degré d'affinité (Stein, 1998; Agrawal, 1999). Si ltODN possède moins de 15

bases le risque d'être non-spécifique augmente et s'il est plus long que 25 bases un autre

problème se pose ; celui de la pénétration cellulaire. Ainsi avant de choisir la séquence de

I'ODN antisens il est important de connaître les structures secondaires de I'ARNm car

l'hybridation à ces endroits aura alors peu de chance de survenir (Gewirtz et coll., 1998;

Phillips et Zhang, 2000).

Pour choisir la séquence d'un ODN antisens, il est donc important de faire dans un

premier temps une recherche dans GenBank pour obtenir la séquence ARNm de la protéine

que I'on veut cibler. Ensuite de bien choisir la séquence que I'on veut cibler ; les trois régions

Ies plus utilisées sont : la région 5'-cap, le codon d'initiation et la région 3'non traduite de

I'ARNm. 11 est impératif d'éviter les séquences palindromiques. Enfin il convient de choisir

une séquence avec un bon ratio ATKG et d'éviter le quartet G ainsi que les séquences CpG

(Gewirtz et coll., 1998; Steiii, 1998; Stein, 1999; Myers et Dean, 2000).

2- A ~ ~ l i c a ü o n s Dour les Neurosciences.

La technique antisens se développe de plus en plus dans le domaine des

Neurosciences- Spécialement dans les études sur les récepteurs métabotropiques- La stratégie

antisens a été très performante dans Ia caractérisation des propriétés pharmacologiques et des

fonctions biologiques de certains récepteurs (Weiss et coll., 1997a; Davidkova et Weiss,

1998). Ceci est dû à la découverte rapide des structures moléculaires de nouveaux sous-types

de récepteurs métabotropiques dont les fonctions sont encore mal définies (pharmacologiques,

biologiques et comportementaIes). Les ODNs antisens permettent de réduire l'expression d'un

sous-type particulier de récepteur, et ce de façon spécifique, alors qu'encore beaucoup

d'antagonistes traditionnels ne permettent pas d'obtenir un tel résultat.

Le tissu nerveux est un milieu propice à I1utiIisation de la stratégie antisens. En effet,

l'entrée des ODNs antisens dans les cellules nerveuses et gliales se fait facilement et ne

nécessite pas l'ajout de molécules "porteuses" comme, par exemple des lipides cationiques

nécessaire dans d'autres systèmes (Whitesell et coll,, 1993; Sommer et coll., 2000).

L'administration des ODNs antisens doit se faire soit directement dans le site ou dans le(s)

ventricule(s). Cette administration intra-cérébrale (i-c.) ou intra-cérébro-ventriculaire (i.c.v.)

peut se faire de façon ponctuelle ou par infusion continue (pompe) (Whitesell et coll., 1993;

Ogawa et coll., 1995). La diffusion de I'ODN dans le tissu est dépendante de différents

facteurs à savoir: le type d'injection, du volume injecté, de la concentration de la solution

injectée, de la durée de l'injection et enfin du site de l'injection (Whitesell et coll., 1993;

Rajakumar et coll., 1997; Crooke, 2000). Malheureusement, les administrations d7ODN en

intra-veineuse ou intra-péritonéale n'ont pas montré la présence dlODN dans le cerveau. Cela

pose donc un important problème quant à Ifutilisation des ODNs antisens comme agents

thérapeutiques (Broaddus et coll-, 1998; Sommer et coll., 2000).

Un autre point important est la faible dégradation et la relative stabilité des ODNs dans le

système nerveux comparativement au niveau périphérique. En effet, deux facteurs contribuent

à la stabilité des ODNs antisens dans le système nerveux : le liquide céphalorachidien possède

peu d'exo-et endonucléases et le tissu nerveux est non-prolifératif (Peng Ho et coll., 1998;

Phillips et Zhang, 2000).

Notons également deux avantages qui ont participé au développement de la technique antisens

en Neurosciences. D'abord, la forte augmentation de l'effet physiologique comparé à la faible

magnitude des changements observés de la protéine ciblée notamment dans les études des

récepteurs D, (RD& des récepteurs de l'ocytocine ou encore de la progestérone (Weiss et

coll., 1993; Zhang et Creese, 1993; Ogawa et PfafT, 1996; Zhang et coll., 1996a; Weiss et

coll., 1997a). Cependant, il est important de mentionner ici que cette observation ne peut pas

servir de règle absolue et être généralisée. Enfin, le fait que l'expression génique soit très

régionalisée, il est possible de cibler spécifiquement un récepteur dans une région très définie

du cerveau alors qu'il est plus délicat de bloquer, par exemple, des gènes viraux dans la

circulation sanguine (Weiss et coll., 1997a).

La stimulation des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) peut avoir des

effets permanents ou semi-permanents sur Ie fonctionnement du cerveau. Dans de nombreux

cas, ces changements sont le résultat de l'activation de facteurs de transcriptions dont certains

font partie des gènes à réponse précoce (IEG) (comme c-fos, jun-B, erg-1 ...). Le rôle des IEG

a donc aussi été étudié, dans différentes parties du cerveau, grâce à la technique antisens

(Chiasson et coll., 1997; Chiasson et coll., 1998).

Les cas de récepteurs ayant fait l'objet d'étude sont nombreux. Les récepteurs de la

dopamine (DA) ont été très étudiés. En effet, l'implication de la DA dans de nombreuses

maladies telles que ; la maladie de Parkinson ou la schizophrénie a suscité l'intérêt des

chercheurs et il est devenu essentiel de comprend Ie rôle précis de chacun des récepteurs

dopaminergiques pour mieux soigner ces maladies (Weiss et coll., 1993; Zhang et Creese,

1993 ; Weiss et coll., 1997c; Tremblay et coll., 1998).

Les récepteurs sérotoninergiques, Muscariniques, opioides, NMDA-.. ont également fait

l'objet d'études (Weiss et coll-, 1997c; Scalzitti et Hensler, 2000).

II- Introduction aux récepteurs de la sérotonine.

La sérotonine (5HT) est un neurotransmetteur présent dans le SNC, le tractus gastro-

intestinal et le sang. Au niveau cérébral, la 5HT est impliquée dans te contrôle de différentes

fonctions telles que : le cycle veille/sommeil, la nociception, la thermorégulation, les

comportements sexuels, etc ... (Hamon et Gozlan, 1993 ; Peroutka, 1995). Actuellement, il

existe de plus en plus d'évidences visant à démontrer l'implication de la 5HT dans des

affections neuropsychiques comme la dépression, I'anxiété ou la schizophrénie (Byne et coll.,

1999; Krystal et coll., 1999 ).

L'action de la 5HT au niveau du SNC se fait via plusieurs sous-types de récepteurs

sérotoninergiques. L'essor de la biologie moléculaire a permis d'isoler 15 sous-types de

récepteurs de la 5HT (Peroutka, 1995). La nouvelle classification, proposée par Humphrey et

collaborateurs en 1993, est fondée sur les caractéristiques moléculaires des sous-types ainsi

que sur les systèmes de transduction de ces derniers. Il existe donc 7 classes de récepteurs

sérotoninergiques, d'où dérivent les 15 sous-types : 5HT-,, Sm-,, 5HT-,, 5HT-,, Sm-,, 5HT-

,, 5HT-, (Humphrey et coll., 1993).

1- Le récepteur de la sérotonine 5Hï-, et la schizophrénie.

La schizophrénie est une psychose touchant 1 95 de la population mondiale (Breier,

1999 ; Dalery et D'Amato, 1999). Jusqu'à récemment, les neuroleptiques étaient

principalement des antagonistes des récepteurs doparninergiques (D, essentiellement) (Byne et

coll., 1999). Cependant, ces antipsychotiques dits typiqcres comme I'halopéridol (Haldol)

diminuent les symptômes positifs de la maladie (hallucinations, idées délirantes, excitation,

suspicion, hostilité) mais entraînent beaucoup d'effets secondaires (Crow, 1985; De Clercq et

Peuskens, 2000). En effet, une exposition chronique aux neuroleptiques entraîne des troubles

neuroendocriniens comme l'hyperprolactérnie et des symptômes extrapyramidaux (EPS)

(Barnes et Edwards, 1993). Les nouveaux neuroleptiques dits astpiques, comme la clozapine,

traitent les symptômes positifs mais également les symptômes négatifs de la maladie

(diminution ou disparition d'une fonction psychique normale comme un affect émoussé, retrait

émotionnel, pauvreté des contacts sociaux, manque de spontanéité du discours, pensée

stéréotypée) (Crow, 1985; De Clercq et Peuskens, 2000). De plus, les neuroleptiques atypiques

entraînent moins d'effets secondaires (EPS) et sont efficaces dans le traitement des symptômes

positifs et négatifs de la maladie mais aussi pour le traitement des patients résistants aux

neuroleptiques typiques (Crow, 1985; De Clercq et Peuskens, 2000). Ces agents

pharmacologiques ont une caractéristique essentielle ; à savoir qu'ils possèdent une

composante doparninergique et sérotoninergique.

Il est donc devenu crucial de distinguer précisément les effets biochimiques et

pharmacologiques des deux types de neuroleptiques. Actuellement, il existe de plus en plus

d'évidences visant à montrer que la 5HT et ses récepteurs sont impliqués dans la

paîhophysiologie et la phamacothérapie de la schizophrénie (Roth et al, 1998; Byne et coll.,

1999 ). L'intérêt des chercheurs s'est porté, plus précisément, sur les récepteurs 5HT-=

(FSHT-& (Bumet et coll., 1996a; Seeman et coll., 1996). En effet, les nouveaux

neuroleptiques atypiques, comme la clozapine, rispéridone ou olanzapine sont d'importants

antagonistes 5HT-,, Ces observations suggèrent fortement que les RSHT-, jouent un rôle

prédominant dans la pathophysiologie de la schizophrénie (Burnet et coll., 1996a; Roth et al,

1998 ; Byne et coll., 1999 ).

Des résultats d'études de liaison ont permis de localiser les MHT, au niveau

cérébral. Il semblerait que les plus hauts niveaux de R5HT-, se trouvent dans le cortex

frontal, et dans d'autres aires du néocortex, comme le cortex cingulaire (Pams et COU., 1984).

iis sont égaiement présents dans le noyau accumbens (N. Acc.) et le striatum (Pompeiano et

coli., 1994). Ces régions cérébrales (le cortex cérébral et le N. Acc.) sont reconnues pour être

associées à l'activité antipsychotique des neuroleptiques atypiques (Lucas et Hen, 1995). Dans

la mesure où des traitements chroniques de rats à la clozapine montraient une diminution de

l'expression dYARNm et des sites de liaisons des RSHT-, dans les cortex cingulaires et

frontaux, Burnet et collaborateurs en 1996, ont suggéré que l'action de la clozapine sur le

système sérotoninergique et plus spécifiquement sur les RSHT-, pourrait contribuer à son

profil atypique (Burnet et coll., 1996a).

Les facteurs de an script ions sont des protéines qui se lient à des séquences ADN

spécifiques, présentes dans les promoteurs des gènes. Cette iiaison va influencer ainsi le taux

de transcription de ces gènes. L'expression de ces facteurs de transcriptions permet

d'examiner, au niveau cellulaire, les réponses du cerveau suite à différents stimuli. Étant

donné, qu'ils sont exprimés de façon transitoire dans des populations neuronales spécifiques, il

devient ainsi possible de cartographier les « réponses » du cerveau in vivo. Dans de nombreux

cas, ces changements sont le résultat de l'activation de facteurs de transcriptions. Certains de

ces facteurs de transcriptions font partie des gènes à réponse précoce (IEG), exprimés de façon

transitoire (Robertson, 1992 ; Morgan et Curran, 1995). Des données expérimentales ont

montré que l'expression de ces marqueurs biochimiques était liée à l'administration de

neuroleptiques. De plus, leur expression dans différentes régions cérébrales a été associée au

profil clinique des neuroleptiques (typique et atypique) (Merchant et coll., 1992; Merchant et

Dorsa, 1993)

L'administration de neuroleptiques induit différents effets dans le cerveau notamment,

des effets sur I'expression des iEG et des neuropeptides (c-fos et Neurotensine) (Robertson et

Fibiger, 1992; Robertson et coII., 1995). C-fos est devenu un marqueur d'activité neuronale

très utilisé. Le un récepteur nucléaire orphelin nerve growth factor-inducible B (NGFI-B), est

également un marqueur biochimique intéressant étant donné qu'il possède un niveau

d'expression basal au niveau du striatum. De plus, il a aussi été montré que des agonistes

doparninergiques et sérotoninergiques avaient un effet sur I'expression basde de 171EG NGR-

B au niveau du striatum (Gervais et coll., 1999). Dernièrement il a été montré que

l'administration aiguë et chronique de neuroleptiques modifie l'expression de NGF'I-B chez le

rat (Eleaudry et coll., 2000).

III- Introduction aux réce~teurs de la do~amine.

La DA est un neurotransmetteur qui fait partie de la famille des catécholamines. La DA

se retrouve au niveau cérébral et au niveau pét-iphérique- Elle contrôle un grand nombre de

fonctions cérébrales comme : l'activité motrice, la cognition, l'émotion.. .

Le système dopaminergique a été intensément étudié depuis une trentaine d'annees en raison

de son impiication dans des maladies comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie, le

syndrome de Tourette. .. (Missale et coll., 1998).

La classification des récepteurs de la DA repose sur trois paramètres : la

pharmacologie, Ia structure génétique et la signalisation cellulaire. Avant les années 90, on ne

connaissait que deux sous-types de récepteurs dopaminergiques : les récepteurs D, et les

récepteurs DZ7 car certains agonistes DA stimulaient I'adenylyl cyclase (AC) alors que d'autres

l'inhibaient ou étaient sans effet. L'essor de la biologie moléculaire a permis d'identifier

d'autres sous-types de récepteurs dopaminergiques, qui ont été dénommés chronologiquement

à leurs découvertes. Us ont été ensuite divisés selon l'ancienne classification comprenant

seulement les deux sous-types, D, et D,. IL existe donc actuellement cinq sous-types de

récepteurs dopaminergiques qui sont présentés dans Ie tableau 1 (Jackson et Westlind-

Danielsson, 1994 ; Jaber et coll., 1996)

Récenteurs tp- D,

Dl D5

Intron

Séquence codante

Chromosome

Localisation cérébrale

Tableau 1 : Synopsis de la classification des récepteurs dopaminergiques

(Inspiré de Schwartz, 1993).

Second Messager

1 - Le réce~teur dopaminer

Non Non

Waa 477aa

5q3 1 -q34 4q 16.3

Striaturn Hypothaianus

Le récepteur dopaminergique D, fut le premier à être cloné en 1988 (Bunzow et coll.,

1988). Le clonage du récepteur D2 a révélé la présence de isoformes. Les deux isoformes, la

forme D, court (D,S) et la forme D, long (D,L), different seulement de 29 acides aminés, au

niveau de la troisième boucle intra-cytoplasmique. (Da1 Toso et coll., 1989; Giros et coll.,

1989; Monsma et coll., 1989). Malgré le fait que cette dissemblance se situe dans la troisième

boucle intra-cytoplasmique, site de couplage du récepteur avec la protéine G, il ne semble pas

avoir de différence fonctionnelle entre les deux isoformes. La seule différence qu'il semble

exister se situerait au niveau de leur mode de régulation (Missale et coll., 1998).

Le RD, semble couplé négativement à I'AC, dans la majorité des lignées cellulaires

(Onali et coll., 1985; Neve et coll., 1991). Ce récepteur possède également la capacité

d'augmenter les niveaux de calcium intracellulaire via ta stimulation de l'hydrolyse du

phosphatidyl inositol (XP). D'autre part, le RD, peut réduire les concentrations intracellulaires

Oui (6) Oui (5) Oui (3)

DZL 443aa W a a 387à515aa

D, 414aa

llq22-q23 3q13.3 1 Le Striamm Tub. O. Cx PréF

H i ~ ~ o c a ~ e

APMc + APMc + N Acc, N Acc.

APMc- APMc-? APMc -

IP + K+, Ca2+ -

de calcium via l'inhibition des canaux calciques. Cette inactivation des canaux calciques

pourrait être directement liée à l'activation d'une protéine G- Enfin, le RD, est également

capable de moduler l'ouverture des canaux potassiques, la libération de l'acide arachidonique

et l'activité des pompes Na= (Jaber et coll., 1996; Missale et coll., 1998).

La localisation cérébrale du RD, chez le primate est assez bien documentée (HuntIey et

coll., 1992). Les RD, sont exprimés dans le cortex moteur comme, les récepteurs

dopaminergiques DL et D, (RD, et RD,). II existe une prédominance des RD, et RD, dans le

striatum (putamen et noyau caudé). Des expériences d'hybridation in situ ont permis de mettre

en évidence, au niveau du striatum, une ségrégation des RD, et les RD2 (Hundey et coll.,

1992). En effet, les RD, sont exprimés dans la voie striatonigrale/Substance P, alors que les

RD, sont exprimés dans la voie striatopallidale/Enképhaline (Cambier et coll., 2000). Le RD,

est le seul sous-type de récepteur dopaminergique retrouvé au niveau pré et post-synaptique.

Les RD2 se retrouvent principalement dans le striatum, le tubercule olfactif (Tub. O.) et

le N. Acc. Dans l e corps du N. Acc,, ils sont exprimés par les neurones acide y-

aminobutyrique (GABA) coexprimant l'enképhaline. Alors que dans le pôle septal de la

coquille du N. Acc., ils sont exprimés par des neurones coexprimant la neurotensine. On les

retrouve également dans la substance noire pars compacta (SNc), l'aire tegmentale ventrale et

l'hypothalamus, ils sont exprimés par des neurones dopaminergiques- Les RD, sont également

présents dans la glande pituitaire où ils régulent la production et la sécrétion de la prolactine

(Jaber et coll,, 1996; Missale et coll., 1998).

2- Anatomie et ~h~s iopa tho lo~ ie des noyaux -gis centraux.

Les noyaux gris centraux (NGC), ou ganglions de la base, forment un ensemble de cinq

structures sous corticales faisant partie du système moteur extrapyramidal. Les composantes

de cet ensemble sont le noyau caudé, le putamen, le globus pallidus qui se divise en segment

interne et externe, le noyau sous thalamique et enfin la substance noire pars reticulata et pars

compacra (SNr et SNc). Le noyau caudé e t le putarnen proviennent de la même structure

télencéphalique et l'ensemble de ces noyaux forme le striatum (figure 1) (Kandel et coll.,

1991).

Le striatum est le principal composant des ganglions de la base et semble

principalement impliqué dans le contrôle des fonctions motrices. Le striatum du primate

(noyau caudé-putamen) peut être divisé en trois composantes majeures en fonction de Leurs

afférences corticales (Parent et coll,, L995):

- La région striatale sensorimotrice regoit des afférences du cortex sensorirnoteur. Elle

comprend la partie dorsolatéraIe du putamen et le bord dorsolatéral du noyau caudé.

- La région siriatale associarive regoit des projections du cortex préfrontal, temporal, pariétal

et cingulaire. Elle correspond à la majeure partie du noyau caudé et au pôle rostral du

putamen.

- La région srriatale limbique reçoit des afférences des cortex limbiques et paralimbiques

(gyrus hippocampique, gyrus parahippocampique et cortex cingdaire). Etle correspond au N-

Acc- et au Tub- O. (Parent et coll-, 1995; Morissette et colI., 1998).

GPe

STh

Fimre 3 : Coupe transversale d'un cerveau de primate, au niveau des

ganglions de la base (Kandel et coll., 1991).

Les noyaux gris centraux sont donc des structures complexes recevant des informations

en provenance du cortex et du système limbique. L'intégration de ces fonctions, laisse

supposer qu'ils possèdent un rôle fonct io~el au niveau des fonctions cognitives. Cependant,

ils ont d'abord un rôle bien connu dans le contrôle des fonctions motrices, en raison de leur

implication directe observée dans certaines pathologies, comme la maladie de Parkinson

(Graybiel et coll-, 1994; Parent et coll., 1995). Les ganglions de la base interviennent dans les

processus de proboramniation et d'exécution des mouvements par le traitement et le filtrage de

diverses informations sensorielles-

Comme nous L'avons vu précédemment lors du paragraphe sur la localisation des

récepteurs RD2, les connections, reliant les W C , sont formées de plusieurs types de neurones

synthétisant une variété de neurotransmetteur. Le mode de transmission qui est utilisé repose

sur le principe inhibitioddésinhibition des efférences du striatum. L'information reçue par le

cortex puis envoyée au striatum donne lieu à deux voies distinctes de sorties (Kandel et coll-,

1991; Parent et coll., 1995; Cambier et coll., 2000)-

La voie striatonigrale également appelée la « voie directe » exprime les RD,, alors que la voie

striatopallidale ou « voie indirecte », exprime les RD2. La stimulation de la voie striatonigrale

mène à I'inhibition des neurones projetant vers le globus pallidus interne et la substance noire.

À l'inverse, la stimulation de la voie indirecte provoque une inhibition des neurones du

thaIarnus.

3- La maladie de Parkinson.

Les symptômes de la maladie de Parkinson ont été décrits pour la première fois en

1817 par James Parkinson dans son rapport intitulé « Essai sur la paralysie agitante ». La

prévalence de la maladie de Parkinson est évaluée à 150 sur 100 000 et augmente avec l'âge.

Après 65 ans, la maladie touche 3 9% de la population, 5 à 10 % des cas débutent avant 40 ans

et aucune prévalence connue reliée au sexe ou à la race n'a été observée (Cambier et coll.,

2000). Les débuts sont généralement insidieux. Des douleurs mal systématisées, une fatigue

générale, une réduction de l'activité peuvent orienter, à tort, vers une affection rhumatismale

ou un état dépressif- Néanmoins dans 80 % des cas, le tremblement a retenu l'attention du

malade- Signalons que l'unilatéralité ou la prédominance unilatérale est habituelle au stade

précoce de la maladie. Les symptômes de la maladie sont : le tremblement de repos, l'akinésie,

la rigidité musculaire, les troubles de posture e t la bradykinésie (ralentissement des

mouvements). À ces symptômes moteurs, viennent s'ajouter après quelques années des

troubles psychiatriques tels que : la confusion mentale, des troubles copitifs et une tendance

dépressive (Cambier et coll,, 2000).

Du point de vue physiologique, la maladie de Parkinson est caractérisée par une

dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la partie pars compacta de Ia

substance noire (figure 4).

_ _ - - Tronc cérébral M o e l l e épiniëre

Fimire 4 : Physiopathologie de la maladie de Parkinson (Carnbier et coll., 2000)-

Vlo : noyau thalamique veniro-latéral-oraI, VA : noyau thalamique ventral antérieur,

CM : cortex frontal moteur, PM : cortex prémoteur, AMS : aire motrice supplémentaire.

Au cours de la maladie de Parkinson, la défaillance des neurones dopaminergiques de la

SNc a une double conséquence sur les neurones effecteurs du putarnen (Zigmond et coll-,

1989; Zigrnond et Stricker, 1989 ; Cambier et coll., 2000).

1- Les RD2 ne sont plus régulés négativement par la SNc. L'inhibition GABA qu'ils

exercent sur les neurones du Globus pallidus externe est auamentée. De ce fait, l'inhibition

GABA du noyau sous-thalamique (NST) par les neurones du Globus pallidus externe est

diminuée. L'excitation glutarnatergique exercée, par le noyau sous-thalamique sur le Globus

pallidus interne et sur la SNr, est augmentée. Les neurones du Globus pallidus interne et de la

SNr exercent une puissante inhibition GABA sur les noyaux thalamiques qui adressent

normalement une excitation tonique au cortex frontal moteur, pré-moteur et à l'aire motrice

supplémentaire.

2- Les RD1 ne sont plus régulés positivement par la SNc. L'inhibition GABA qu'ils

exercent, sur le Globus pallidus interne et sur la SNr, est réduite. Ceci contribue à renforcer

l'action inhibitrice de ces dernières structures sur les noyaux thalamiques.

Bien qu'il existe aussi d'autres types de traitements antiparkinsoniens, l'administration

du précurseur de la dopamine, la L-3,4dihydroxyphenyIalanine (L-DOPA), reste cependant le

médicament de référence. Le traitement par la L-DOPA a pour but de compr le déficit en DA

constaté au niveau de la SN et du striatum. La plupart des patients parkinsoniens répondent

bien à la L-DOPA. Elle améliore à peu près tous les symptômes moteurs observés surtout

l'akinésie et la rigidité. 11 n'en demeure pas moins qu'après quelques années de traitement, des

effets secondaires sont observés. Un de ces effets est la diminution de l'efficacité des

médicaments (effet de tolérance) caractérisé par une baisse de L'efficacité de la réponse et par

une augmentation de la dose pour obtenir un effet maximal (Cambier et coll., 2000). Notons

également qu'après quatre ou cinq ans de traitement, on observe souvent l'apparition de

mouvements violents et saccadés, que l'on nomme dyskinésies. La survenue des dyskinésies

est plus précoce lorsque la maladie a débuté chez un sujet jeune. Les dyskinésies revêtent

souvent l'aspect de mouvements choréoathétosiques, d'intensité très variable. La plupart des

agonistes de la DA testés jusqu'à maintenant et qui démontrent un bon effet antiparkinsonien

induisent eux aussi des dyskinésies, exceptée la bromocriptine qui est un agoniste sélectif D2

présentant également des propriétés antagonistes D 1 (Nutt, 1990; Carnbier et coll., 2000).

CHAPIWRE SECOND

Problématique

1- Application de la stratéeie antisens au réce~teur de la sérotonine 5WT-,, chez le rat.

1-Pertinence de la recherche,

Les récepteurs dopaminergiques de type D, sont des cibles pharmacologiques pour les

antipsychotiques. Pendant longtemps, les effets cliniques des neuroleptiques utilisés dans le

traitement des symptômes de la schizophrénie furent associés presque exclusivement aux RD,

(Byne et coll,, 1999). En effet, l'utilisation d'antagonistes aux RD2, comme I'halopéridol

(antipsychotique typique), permet de traiter les symptômes positifs de la schizophrénie, mais

entraîne de nombreux effets secondaires d'ordre extrapyramidaux comme les dyskinésies ou

d'ordre endocriniens comme la galactorrhée, la gynécomastie ou l'aménorrhée (Barnes et

Edwards, 1993). L'apparition sur le marché de nouveaux antipsychotiques (atypiques), comme

la clozapine, traitant les symptômes positifs et négatifs de la maladie et entraînant moins

d'effets secondaires surtout ceux d'ordre extrapyramidaux, a poussé les chercheurs à essayer

de mieux comprendre les différences biochimiques et pharmacoIogiques qu'il existe entre les

deux types de neuroleptiques (typiques versus atypiques).

Les récepteurs sérotoninergiques, essentiellement tes sous-types SHT-,,, ,,, , et ,,

sont apparus comme étant de nouvelles cibles potentielles pour l'action des agents

antipsychotiques atypiques (Burnet et coll,, 1996a; Bumet et COLI-, 1996b; Seeman et coll.,

1996: Kapur et coll., 1999). En effet, certains neuroleptiques, comme la clozapine ou la

rispéridone, montrent une plus grande affinité pour les récepteurs SHT, que pour les

récepteurs de la famille 4 (Leysen et coll., 1993; Seeman et Van Tol, 1994). De plus, les

RSHT-, sont exprimés dans des aires cérébrales, comme le cortex cérébral et Ie N. Acc,

connues pour être associées avec des symptômes psychotiques ou avec une activité

antipsychotique.(Lucas et Hen, 1995). Ainsi, il a été suggéré que le blocage des R5HT-,

pourrait participer au profil atypique démontré par des neuroleptiques comme la clozapine

(Leysen et coll., 1993; Meltzer, 1995). IL a été démontré que la schizophrénie est associée avec

une altération de l'expression des R5J3T-lA (baisse) et des RSHT-, (augmentation) (Burnet et

coll.. 1996b). Également, un traitement chronique avec de la clozapine entraîne une

diminution de l'expression de I'ARNm des WHT-, ainsi qu'une diminution du nombre des

sites de liaison au niveau des cortex cingulaires et frontaux (Burnet et coll., 1996a).

L'étude des récepteurs de la 5HT dans le SNC est devenue très ardue. L'essor de la

biologie molécutaire a permis d'isoler 15 sous-types de récepteurs de la 5HT. Les outils

pharmacotogiques actuels ne permettent pas d'envisager l'étude de ces sous-types de façon

isolée, puisque aucun agent pharmacologique actuellement disponible n'est spécifique d'un

seul sous-type de récepteur de la SHT. La stratégie antisens permet d'étudier spécifiquement

un sous-type de récepteur couplé aux protéines G dans le SNC.

2-Hv~othèses et objectifs,

Les récepteurs sérotoninergiques sont impliqués dans la schizophrénie et sont devenus

des cibles potentielles pour l'action des neuroleptiques atypiques (Burnet et coll., 1996a; Roth

et al, 1998 ; Byne et coll., 1999 ). Plus particulièrement le récepteur 5HT-, fait t'objet,

actuellement, de nombreuses recherches (Seeman et coll., 1996)-

Le rôle des EHT-,, au niveau du système nerveux centrai, n'est pas encore très bien

connu. Chez le rat, on retrouve de fortes concentrations de récepteurs Sm-, dans le Cx PréF

et dans d'autres aires du néocortex, comme le cortex cingdaire (Pazos et coll., 1984). Ils sont

également présents dans le N. Acc. et dans le striatum (Pompeiano et coll., 1994). Les

récepteurs Sm-, sont exprimés dans des régions cérébrales reconnues pour être associées à

l'activité antipsychotique des neuroleptiques (Lucas et Hen, 1995). La plupart des

neuroleptiques atypiques comme la clozapine possèdent une forte affinité pour ce sous-type de

récepteurs. Ces caractéristiques suggèrent que le récepteur 5HT-, pourrait participer à

l'activité antipsychotique des neuroleptiques, II pourrait également jouer un rôle clé dans la

diminution des effets secondaires extrapyramidaux des neuroleptiques atypiques.

L'administration des neuroleptiques entraîne différents effets au niveau cérébral, un

des plus important est la modification de l'expression de certains gènes (Robertson, 1992).

En effet, deux familles de gènes sont bien documentées, les gènes à réponse précoce

(IEG) et les neuropeptides (c-fos et neurotensine .spectivement).

L'expression transitoire de c-fos peut être considérée comme un marqueur d'activité

neuronale. Un rôle pour la neurotensine dans la schizophrénie a été proposé (Merchant et

Dorsa. 1993). De façon intéressante, des schémas cérébraux d'expression de ces marqueurs

biochimiques ont été associés aux profils atypiques et typiques des antipsychotiques.

L'administration de neuroleptiques typiques, comme halopéridol, entraîne une augmentation

de l'expression de c-fos au niveau du striatum dorsolatéral (StDL) (structure motrice) et

également au niveau de la coquille du N. Acc. (structure Iimbique). Cependant,

l'administration de neuroleptiques atypiques, comme la clozapine, entraîne une au,gmentation

de l'expression de c-fos dans la coquille du N. Acc. mais pas dans le StDL. Cela montre que le

la coquille du N. Acc. est une cible commune aux deux classes de neuroleptiques et il pourrait

être un site de l'activité antipsychotique des neuroleptiques. Le Cx PréF quant à lui pourrait

être un site par lequel les neuroleptiques atypiques induiraient leur action sur les symptômes

négatifs de la maladie et aussi leur action sur les patients non répondant aux neuroleptiques

typiques. En ce qui concerne le StDL, les résultats semblent converger vers un rôle dans les

EPS des neuroleptiques typiques. Il a d'ailleurs été proposé que la différence d'expression de

c-fos entre le N. Acc. et le StDL serve d'index pour les neuroleptiques atypiques (Merchant et

Dorsa, 1993; Robertson et coll., 1994; Robertson et coll., 1995; Deutch et Duman, 1996).

Les résultats obtenus avec la neurotensine sont moins nombreux, cependant, ils

indiquent que la neurotensine pourrait servir également de marqueur pour distinguer les

antipsychotiques typiques des atypiques et les schémas d'expressions sont identiques à ceux

de c-fos (Merchant et coll,, 1992; Merchant et Dorsa, 1993).

Les effets des ODNs antisens sur la synthèse du récepteur 5HT-, et sur l'expression

des différents marqueurs biochimiques, comme c-fos et neurotensine, sont difficilement

prévisibles. Cependant, on peut s'attendre à observer des effets localisés au niveau des aires

cérébrales reliées aux actions antipsychotiques comme le N. Acc. et le Cx PréF. Il est possible

que l'expression de c-fos soit bloquée dans ces structures comme d'ailleurs celle de la

Neurotensine. Il nous est apparu important de connaître également les effets de l'antisens

5HT-= sur l'expression du facteur de transcription NGIFI-B et le neuropeptide Dynorphine. En

effet, N F I - B possède un niveau basai d'expression dans ie striatum et son expression est

influena% par les antagonistes doparninergiques et sérotoninergiques (Gervais et coll., 1999).

La dynorphine, CO-exprimée avec les RD1 dans la voie s t r ia t~ni~pde , pourrait également nous

donner des informations quant à la moddation des récepteurs Sm-,, sur la transmission

dopaminergique.

Ce travail me permettra de me familiariser avec la technique antisens pour après

l'appliquer au récepteur D2 chez Le singe. Ce travail de recherche constituera donc à

développer cette stratégie pour l'étude du récepteur SHT-,- Pour cela, des ODNs antisens

seront fabriqués et administrés de façon intra-ventriculaire chez des rats normaux. Cette

technique a déjà été utilisée avec succès pour différents récepteurs comme le récepteur D3,

D2- -. (Weiss et coll., 1997a; TrembIay et coll., 1998). Dans le but de vérifier l'efficacité de

notre antisens, nous administrerons un contrôle ODN mismatch à d'autres rat et enfin un

dernier groupe de rat recevra Iui une injection intra-ventriculaire de salin (contrôle VEH).

Cette étude nous permettra de mettre au point la stratégie antisens appliquée au RSHT-, et

d'observer les effets de 1'ODN antisens Sm-, sur les Mm-,, sur l'expression des facteurs

de transcription c-fos et NGFI-B ainsi que sur les neuropetides, Neurotensine et Dynorphine.

Et à plus long terme de mieux comprendre Ie rôle du récepteur SHT-, dans la schizophrénie.

II- A~plication de la straté e antisens au réce~teur de la do amine D2 chez le macaque.

La dopamine est un neurotransmetteur du SNC, impliqué dans la régulation de

nombreuses fonctions cérébrales (activité motrice, cognition émotion prise alimentaire...).

L'étude du système dopaminergique est au cœur de nombreuses recherches étant donnée que

son altération est impliquée dans de nombreuses dysfonctions cérébrales. La dégénérescence

progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire entraîne Ia maladie de

Parkinson. Les principaux traitements de cette maladie sont l'administration d'agonistes

dopaminergiques ou du précurseur de la DA, la L-DOPA. Ces traitements ont pour but de

contrebalancer le déficit en DA au niveau des ganglions de la base. Cependant ces traitements

ne sont pas sans effets secondaires, essentiellement liés à leur action sur le système

dopaminergique. En effet, I'administration chronique de L-DOPA entraîne souvent

l'apparition de mouvements involontaires et de réactions psychotiques (Kandel et coll., 1991;

Cambier et coll., 2000).

La DA exerce son action via piusieurs récepteurs, classés suivant leur action sur l'AC.

Ii semblerait que le RD, joue un rôle essentiel dans l'activité rnotrke, cependant son rôle exact

dans l'activité motrice en général et dans la maladie de Parkinson en particulier est encore mal

connu. La localisation cérébraIe du RD, chez le primate est assez bien documentée (Huntley et

coll., 1992). Les RD, sont exprimés largement exprimés dans le striatum, le Tub. O. et le N.

Acc. Ils sont également présents dans la SNc, dans l'aire tegrnentaie ventrale et dans les cortex

préfrontaux, cingulaires, temporaux et entorhinaux (Jaber et coll., 1996; Missale et coll.,

1998).

Pour mieux traiter les patients atteints de troubles moteurs, il devient donc impératif de

bien distinguer le rôle de chaque sous-type de récepteur. Cependant, les outils

pharmacologiques actuels ne nous permettent pas d'étudier un sous-type de récepteur de façon

isolée. En effet, les antagonistes actuellement disponibles ne sont pas assez spécifiques. La

stratégie antisens a été intensivement appliquée au récepteur D, chez les rongeurs. Elle a

permis de mieux comprendre les fonctions motrices véhiculées par le RD, (Zhang et Creese,

1993 ; Wahlestedt, 1994; Weiss et coll., 1997a).

En 1993, Zhang et Creese ont infusé, en i.c.v. pendant 2-3 jours, des ODNs antisens

RD2 chez des rats. Après traitement, le nombre de sites de liaisons D, étaient diminués de 50

% dans le striatum et de 70 % dans le noyau accumbens. Les effets, de ces diminutions des

RDz sur le comportement des rats étaient des catalepsies, une baisse de l'activité motrice

spontanée ainsi qu'une diminution de la locomotion stimulée par I'agoniste, sélectif D2,

quinpirole (Zhang et Creese, 1993).

En 1993, Weiss et collaborateurs rapportaient les résultats de I'administration i . c x

disconhnue, d'ODN antisens RD, chez des souris 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lésées

unilatéralement. Après 6 jours de traitement, le nombre de sites de liaisons 4 était diminué

seulement de 15 %. Malgré cette faible diminution, les auteurs observaient une inhibition

complète de la réponse motrice sous agoniste, sélectif D,, quinpirole. Alors qu'aucun

changement moteur n'était observé sous agoniste sélectif D,. Pour expliquer l'importance de

la réponse comportementale comparativement à la faible baisse du nombre de RD,, les auteurs

ont émis l'hypothèse suivante : les réponses motrices véhiculées par les RDz passeraient via un

petit groupe fonctionnel de RD, nouvellement synthétisé et que les ODNs antisens réduiraient

préférentiellement ce groupe de RD2 (Weiss et coll., 1993; Zhang et coll., 1996b).

Zhang en 1996, Weiss en 1997 e t Davidkova 1998 ont rapporté des injections,

continues ou discontinues, intra-striades et unilatérales chez le rat, dYODN antisens RD,

incorporé dans un vecteur. Ces traitements entrainaient une diminution locale des RDZ. De

plus, l'injection d'agonistes D2 après Ie traitement entraînait une rotation de l'animal du côté

contraiatérai à t'injection (Zhang et coIl., 1996b ; Weiss et coll., 1997b; Davidkova et coll.,

1998).

Toutes ces expériences nous montrent que la stratégie antisens est concluante chez les

rongeurs et a permis d'établir plus précisément le rôle des RD, dans l'activité motrice.

L'asymétrie striatale en RD, entraîne une rotation de l'animal, sous agoniste D2, du côté

contralatéral à L'injection d'ODN antisens. Le RI& est effectivement impliqué dans l'activité

motrice et son inhibition entraîne une diminution de cette dernière.

2-Hvpothèses et obiectifs.

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénération de la vo

doparninergique nigrostriée et se traduit au niveau moteur par un tremblement de repos, une

akinésie, une rigidité musculaire, des troubles de la posture et une bradykinésie

(ralentissement des mouvements). Le rôle exact de chaque récepteur dopaminergique, dans les

différents effets de la maladie, reste encore méconnu. La littérature fait état de plusieurs études

semblant confirmer l'implication du RD, dans l'activité motrice (Weiss et COIL, 1993; Zhang

et Creese, 1993; Kelly et coll., 1998; Morissette et coll., 1998). II est donc important, de

distinguer le rôle exact de ce récepteur dopaminergique, au niveau moteur, dans la maladie de

Parkinson.

Le rôle de la DA, dans les fonctions motrices, est traditionnellement associé au

système moteur extrapyramidal, dont le striatum est le principal composant (putamen et noyau

caudé). Cette association est basée sur le nombre important de fibres dopaminergique qui

innervent le striatum. Le striatum de primate (putamenhoyau caudé) exprime de fortes

concentrations de RD, et RD, comparativement aux récepteurs dopaminergiques D, (RD,)

beaucoup moins nombreux et aux récepteurs dopaminergiques D, et D, (RD, et RD3 quasiment inexistants. Fonctionnellement, la prédominance des RD, et RD, dans le striamm

suggère que ces récepteurs doivent avoir ; des rôles plus sélectifs dans la modulation

dopaminergique impliquée dans le fonctionnement du striatum en général et dans le contrôle

extrapyramidal en particulier (Huntley et coll., 1992). Comme déjà mentionné dans le chapitre

premier, le striaturn peut être divisé en trois composants majeurs en fonction de l'origine de

leurs inputs corticaux (Parent et coll., 1995).

-Le putamen est associé à la région striatale sensorirnotrice et associative et il semble qu'il so i t

impliqué dans l'exécution du mouvement, de I'activité motrice en général (Flaherty et

Graybiel, 1993; De la Fuente-fernandez et coil., 2000).

-Le noyau caudé quant à lui a une composante plus associative que sensorirnotrice et semble

plus impliqué dans l'initiation du mouvement, la programmation du mouvement (Graybie 1 et

coll., 1994; Menon et coll., 1998; De la Fuente-fernandez et coll., 2000).

-Le N-Acc- est une structure limbique, mais qui semble impliquée également d a n s la

locomotion du moins chez les rongeurs (Deutch et Cameron, 1992; Canales et Iversen, 2000).

Chez les primates, il semble plus impliqué dans l'apprentissage moteur (Stem et Passingham,

1994; Stern et Passingham, 1995).

Ainsi au vue des observations exposées dans le pa rqpphe précédent, si nous inhibons,

via des ODNs antisens, les RD, du putamen et du noyau caudé, nous pensons pouvoir inhi ber

l'activité motrice contralatérale. En effet, le singe que nous utiliserons au cours de ce travaL1, à

une très forte préférence, dans tous ses gestes quotidiens, pour l'utilisation de sa main gauche.

En inhibant les RD2 dans le putarnen et le noyau caudé de l'hémisphère droit, nous espérans

contrebalancer cette dominance gauchère et observer une augmentation de l'utilisation d e la

main droite.

Si nous inhibons en plus du putamen, le noyau accumbens (composante

d'apprentissage moteur), nous espérons observer une diminution de l'utilisation de la main

contralatérale.

Le travail de recherche consistera, donc en premier lieu, à cloner le gène du récepteur

dopaminergique D,du macaque macaca fascicularis et à développer la stratégie antisens pour

l'étude de ce récepteur 4. Une fois les ODNs antisens synthétisés, nous les injecterons à

différents endroits des noyaux gris centraux d'un singe normal, cela, dans le but, de créer une

asymétrie du système doparninergique et d'en observer les effets. Dans un premier temps,

nous effectuerons des injections, i.c discontinues, à la fois dans le putamen et le noyau caudé

ensuite nous effectuerons des infusions i.c, simultanément dans le putamen et le N-Acc.

Dans cette étude pionnière, nous tenterons de mettre au point la stratégie antisens chez

Ie primate. En effet, il n'existe actuellement aucune donnée dans la littérature sur l'utilisation

des ODNs dans le SNC des primates. Ce travail nous aidera donc à mieux connaître les modes

d'administrations, les concentrations à injecter et les tests comportementaux à effectuer.

Les études, via des ODNs antisens, du rôle du RD, chez les rongeurs, mentionnent

souvent l'utilisation de l'agoniste sélectif D2, quinpirole (Weiss et coll., 1993; Zhang et

Creese, 1993; Weiss et coll., 1997b). Puisque, les RD, semblent impliqués dans l'activité

motrice, les injections de quinpirole, dans ces études, ont pour but d'induire un mouvement

rotatoire de l'animal. En effet, si on diminue le nombre de RD,, via des ODNs antisens RD,,

dans un hémisphère donné, l'injection d'agoniste D,, quinpirole, induira un mouvement

rotatoire, de l'animal, contralatéra1 à l'hémisphère traité par les ODNs antisens.

Lors des différentes expériences dYODNs antisens RD, que nous allons effectuer sur le

primate, nous effectuerons régulièrement des injections de quinpirole en sous-cutanée. Ainsi,

nous pourrons observer les réactions motrices de l'animal, sous agoniste D,, et essayer

d'évaluer l'efficacité de notre ODN antisens ainsi que le rôle des RD, dans les différentes

structures étudiées.

Cette étude nous permettra ainsi de mieux comprendre la physiologie des ganglions de

la base chez le macaque et plus particulièrenient Ie rôle du RD, dans l'activité motrice chez le

primate non humain. Et à plus long terme de mieux comprendre le rôle du récepteur D, dans la

maladie de Parkinson et l'apparition des mouvements anormaux comme la dyskinésie.

Matériels et Méthodes

&Animaux et administration des ODNs 5HT-,

Pour cette expérience, treize rats mâles Sprague-Dawley de 200 à 250g (Charles River,

Canada) ont été utilisés, La veille de l'expérimentation et dans le but de prévenir toute

infection, du Kétoprofen 50 mg, un analgésique, a été ajouté à l'eau des abreuvoirs, et ce,

jusqu'au sacrifice des animaux. Les ODNs ont été administrés via des canules implantées dans

le ventricule latéral gauche des rats. Avant l'implantation des canules en forme de « L » aux

coordonnés stéréotaxiques suivantes : Antéro-postérieur (AP) : 0.8mm postérieur au Brepa,

Latéral (L) : 1,4mm, Vertical (V) : 4.0mm, les rats ont été anesthésiés avec de la

kétarnine:xylarnine (200:3 mg/rnl) et placés dans les appareils stéréotaxiques afin de procéder

à la chirurgie.

Les ODNs ont été synthétisés par le service « analyse d'image et synthèse d'ADN du

Centre Hospitalier de l'université Laval » et n'ont pas été purifiés. Afin d'obtenir la

concentration souhaitée pour les infusions, 10 pg/pl, les ODNs ont été dissous dans une

solution stérile de Ringer. Le mélange Ringer-ODNs a été administré dans le ventricule latéral

gauche des animaux à l'aide de mini-pompes osmotiques ALZET Mode1 2001

commercialisées par la compagnie ALZA Corp. (Pa10 Alto, CA). Ces mini-pompes

osmotiques, placées sous la peau du coup et attachées au kit Brain lnfusion (ALZA Corp), ont

permis d'infuser les ODNs à raison d' lplheure pendant 6 jours.

L'ODN antisens dirigé contre 1'ARNm du RSHT, était composé de 18-mers

modifiées en phosphorothioates à toutes les positions (S-CAT-TAT-GGT-AGA-GCC-TCG-

3'). L'ODN antisens 5HT, que nous avons choisi, correspondait à la région codante de +7 à

+24 de l'ADN complémentaire du récepteur SHT, de rat (Accession no XI3971 R-norvegicus

mRNA for serotonin receptor SHT-2.-GenBank) (Pritchett et coll., 1988)- Cinq des treize rats

ont reçu des ODNs antisens Sm,.

Les huit rats restant ont été séparés en deux groupes contrôles. Quatre d'entre eux ont

reçu un ODN 5HT, << mismatch » de même séquence que I'ODN antisens SHT, mais avec 4

changements de bases (5'-CAT-MT-CGT-ACA-GCWG-3 '). Ces ODNs SHT,

<< mismatch » ont également été modifiés en phosphorothioates à toutes les positions. Les

quatre rats restant ont composé le groupe contrôle véhicule (groupe VEH) et ont reçu des

infusions de solution saline.

Nous avions bien vérifié au préalable, connues selon les bases de données de GenBank, que

les séquences ODNs utilisées n'avaient pas d'homologies significatives avec d'autres

séquences,

Une fois les traitements terminés, les rats ont été sacrifiés par décapitation sous anesthésie au

CO,. Leurs cerveaux ont été retirés de la boîte crânienne et immédiatement congelés quelques

secondes dans de I'isopentane à -40°C, puis conservés à -80°C jusqu'à analyse ultérieure,

II- Test de liaison lu bindiag 4 des réceateurs 5FIT-, avec la Kétansérine lH31 .

Dans ce cas précis, les études de liaisons ont consisté à utiliser des ligands 5HT-,

radioactifs pour détecter la présence des RSHT-,, et, par la suite, de caractériser les sites

récepteurs présents sur les coupes de cerveaux,

Pour mesurer l'impact de L'administration des ODNs, nous avons utilisé le ligand

radioactif w3] Kétansérine 2nM (activité spécifique :73 Cilrnmol) comme ligand spécifique

aux R 5 K ï , et le Méthysergide lyM comme ligand non-spécifique. Nous savions que la

Kétansérine lie, de façon non spécifique, les récepteurs aiphal-adrénergiques c'est pourquoi

nous avons rajouté aux solutions de liaisons, du Prazosin à 50pM. En effet, le Prazosin est un

ligand spécifique des récepteurs alpha,-adrenergiques (Leysen et coll., 1982).

Les cerveaux des treize rats ont été préalablement découpés sur cryostat. Et des coupes

de 12pm ont été montées sur lames SuperfrostTM (Fisher Scientific, Totronto, Canada). Avant

de procéder à l'expérience de liaison, les coupes de cerveaux ont été pré-incubées pendant 1

heure avec du tampon d'incubation (50 nM Hépes /10 nM éthylène diamine tétracétate

(EDTA) I 0.1 % sérum-albumine bovine (MA), pH 7.4). Ensuite, les différentes solutions de

liaisons (spécifique et non-spécifique) ont été déposées sur les lames correspondantes.

La solution spécifique était composée de 50 p M de Prazosin et de 2 nM de

[II3] Kétansérine dans du tampon d'incubation. La solution non-spécifique quant à elle était

composée de 50pM de Prazosin de 2nM de CH3] Kétansérine et de 1 y M de Méthysergide dans

du tampon d'incubation. Après 2 heures d'incubation et une fois lavées avec du tampon de

lavage composé de 50 nM d'H6pps et de 100 nM de NaCI, le tout à pH 7.4 et à +OC, puis avec

de l'eau distillée à 4°C' les coupes été déposées à sécher, toute la nuit, sous la hôte. Le

lendemain, les lames ont été exposées sur un film ~ ~ p e r f i l r n ~ ~ (Amersham) pendant 5

semaines. Le développement des films s'est fait en les immergeant 5 minutes dans le

développeur de la compagnie Kodak, le D-19 et en les rinçant 30 secondes dans l'eau. Les

films ont ensuite été fixés 10 minutes avec du Rapid Fix de Kodak.

La révélation s'est donc faite par autoradiographie sur film, cette technique présente

l'avantage de localiser anatomiquement la densité des sites étudiés. Le comptage des films a

été effectué grâce au logiciei NIH image (Wayne Rashanb, NIMH). Pour cela, après

soustraction du bruit de fond, les densités optiques de ont été transformées en nCi/mg de

tissu à I'aide des courbes standards générées par les micros échelles CH3] (Amersham).

La figure 5 présente la localisation schématique des différentes régions analysées dans cette

étude : le cortex préfrontai, le sûiatum dorsolatérai, le seiaturn ventrolatéral, la coquille du

noyau accumbens. e t le corps du noyau accumbens.

Fisyre 5 : Représentations schématiques des régions échantillonnées pour l'analyse des

niveaux d'ARNm, des facteurs de transcriptions et des neuropeptides.

III- Hvbridation in sihr sur les coupes du ~rotocole antisens 5HT-,

L'Hybridation in situ est une technique de biologie moléculaire basée sur la

complémentarité des bases des acides nucléiques. Cette technique, utilisant une partie de la

séquence en acides nucléiques du brin complémentaire radioactif, permet de localiser par

appariement des bases, la présence d'ARNm endogènes sur des coupes de cerveaux.

Nous avons utilisé cette technique pour évaluer les effets des infusions des ODNs et de

salin sur l'expression des ARNm des facteurs de transcriptions, NGFI-B et c-fos. et sur

l'expression des neuropeptides, Neurotensine et Dynorphine.

1- La synthèse des ribosondes :

Pour chaque ARNrn, une sonde ARN spécifique e t complémentaire, radiomarquée à

I7UTP [s3'] a été utilisée. Les sondes ARN ont été synthétisées et radiomarquées avec de

I'UTP[S~~] (Dupont NENTM, Boston, MA) à l'aide du Kit Riboprobe systemTM commercialisé

par la compagnie Promega.

Pour la synthèse des différentes sondes, les plasmides linéarisés correspondants ont été

utilisés : - La sonde c-fus a été obtenue à partir d'un fragment EcoRI 1.8 Kb d'ADNc de c-fus de rat

sous-cloné dans pBlueScript, linéarisé avec SmaI et synthétisé avec la T7 RNA polymérase. - La sonde NGFI-B a été obtenue à partir d'un fragment EcoRI 2.4 Kb d'ADNc de NGFI-E3

de rat sous-cloné dans pBluescript, linéarisé avec BamHI e t synthétisé avec la T3 RNA

pol ymérase.

+Pour la Neurotensine, un fragment correspondant aux nucléotides 424 à 760 a été introduit

dans le plasmide pGEM4Z, linéarisé avec BamHI et synthétisé avec la T7 RNA polymérase.

-+Pour la Dynorphine, un fragment correspondant aux nucléotides à 770 à 1430 a été introduit

dans le plasmide pGEM-42, linéarisé avec EcoM et synthétisé avec l a T"7 RNA polymérase.

Avant de procéder à la synthèse des ribosondes, il est important de laisser incuber 25 pl de

mélange de synthèse, 1-2 heures à 37'C. Le mélange de synthèse est composé de tampon de

transcription SX, de lOOrnM de dithiothréitol (DTT), de lOmLM de rATP, rCTP et rGTP, de

0.2-lpg de plasmide linéarisé, de 39 unitédpl de ribonucléase (RNAse) inhibiteur et enfin de

15-20 unités de I'ARN Polymérase (T7 ou T3) correspondant à Ia ribosonde que l'on souhaite

synthétiser.

Une fois I'incubation terminée rajouter lpl de désoxyribonucléase @Nase) (10 unités)

et laisser incuber le mélange 10 minutes à 37°C. Arrêter La réaction avec 5 pl d'EDTA 0.5M,

pH 8 et rajouter ensuite 19 pl de tampon de ribosonde composé de Tris pH 7.4 0. lM, de NaCl

O. 15M, de EDTA 12-5 mM et de dodécylsulfate de sodium (SDS) 0.2%. 11 est important de

purifier la sonde sur colonne MiniQuick spin RNA Column (Roche) et de la conserver à

-80°C jusqu'à son utilisation.

2-Réactions d'hybridations in sitzi :

L'expérience d'hybridation in situ sur coupes de cerveaux se fait en trois étapes :

Le pré-traitement, l'hybridation et le post-traitement.

Le pré-traitement consiste à fixer les coupes de cerveaux dans du paraformaldéhyde

4 %/solution tampon phosphate (PBS) lx, pendant 20 minutes à 4°C.

Une fois les coupes fixées, les lames doivent être incubée, pendant 10 minutes à 37"C,

dans un tampon Protéinase K 1X composé d e l 0 mM de Tris pH 8,SOrnM EDTA et I pglrnl

de Protéinase K puis rincées brièvement avec de l'eau traitée au diéthyl pyrocarbonate

(DEPC). Cette étape va permettre de perméabiliser la membre et ainsi permettre aux sondes de

pénétrer. Les lames doivent ensuite être placées, 10 minutes avec agitations, dans une réaction

d'acéthylation composée de O. LM triéthanolamine pH 81 anhydre acétique, cela va permettre

de bloquer les charges positives et négatives des ARNm. Une fois cette étape terminer, les

lames doivent être rincées deux fois avec une solution de sodium citrate standard (SSC) 2X

pendant 5 minutes. Enfin les coupes de cerveaux sont déshydratées avec&fférents gradients

d'alcool éthylique (EtOH) : EtOH 30 %, 15 secondes ; EtOH 60 95, 15 secondes ; EtOH 95 %,

15 secondes ; EtOH 100 %, 1 minute et laissées à sécher à L'air libre-

La réaction d'hybridation, consiste à déposer 50 pl de solution d'hybridation sur les

lames. La solution d'hybridation est constituée de 2*106 CPM de sonde/lame, de lOOmM de

DTT et enfiln du mélange d'hybridation 50% formamide. La sonde doit être préchauffée à

65°C pendant 5 minutes avant d'être ajoutée à la solution d'hybridation, cela va permettre de

briser les structures secondaires.

Le mélange d'hybridation se compose ainsi pour 50 ml de solution :

25 ml de formamide ultra pure désionisée

10 ml de SSC 20 X

1,250 ml de Tris pH8 2M

1,100 ml NaPPi 4'5%

100 PI EDTA 0,5M pH8

1 ml dextran Sulfate 50X

2'5 g de dextran sulfate R-,

Une fois la solution d'hybridation déposée sur chaque lame et afin d'éviter le

dessèchement des coupes de cerveaux, il faut déposer délicatement une lamelle sur chaque

lame. L'hybridation peut commencer, il faut alors placer les lames, toute la nuit, dans une

chambre humide saturée à 50 % formamidef4X SSC et dans un four à hybridation réglé à 55°C

pour c-fos, neurotensine et dynorphine cependant, pour NGFI-B, il est préférable d'utiliser un

four à 58°C.

Le lendemain, une fois la réaction d'hybridation terminée, il faut procéder au post-

iraitement. En premier lieu, il faut décoller les lamelles en plaçant les lames dans une solution

de 2X SSC avec agitations. Une fois les IamelIes enlevées, les lames doivent alors être traitées

avec de la RNase A (20 mg/ml RNase A dans le tampon de RNase A) pendant 1 heure à 37°C'

la RNAse A digère les ARN simple brin (les ribosondes non hybridées). Une fois le traitement

terminé, il faut rincer brièvement les lames avec de l'eau distillée et procéder aux différents

lavages suivant : 15 minutes avec du 2X SSC ;30 minutes avec du 0.5X SSC à 55°C ;30

minutes avec du 0.1X SSC à 55°C ; 5 minutes avec du 0-IX SSC. Les lavages à 55°C

s'effectuent, pour NBGI-B, à 58°C.

Avant de placer les lames sur film, il convient de les déshydrater avec différents

gradients d'alcool acéthylique contenant de 17ammonium d'acétate qui permet de garder les

hybrides ARN/ARN stables : EtOH 30 %/ 300m.M ammonium acétate 15 secondes, EtOH 60

%/ 300mM ammonium acétate 15 secondes, EtOH 90 %/ 300mM ammonium acétate 15

secondes, EtOH 100 % 1 minute- Les lames sèchent à l'air libre et sont ensuite exposées sur

des films radio-sensibles B iomaxMR (Kodak, New Haven, CT).

Selon les ribosondes utilisées, les temps d'expositions different. Ainsi pour NGFI-B,

les lames sont exposées 4 jours, 20 jours c-fos, 6 jours pour la Neurotensine et 4 jours pour la

Dynorphine-

La quantification des films s'est effectuée par analyse d'image via ordinateur avec le

Iogiciel NM image (Wayne Rasbanh, NIMH). Pour ceIa, après soustraction du bruit de fond,

les densités optiques de gris ont été transformées en nCi/mg de tissu à l'aide des courbes

standards générées par les micros échelles @13] (Amersham). Les mesures ont été effectuées

sur des coupes présentant les régions suivantes : le cortex cingulaire (Cx Cing), le cortex

préfrontal (Cx PréF), le striatum dorsolatérd (StDL), le striatum ventrolatéral (StVL) ainsi que

la coquille (« shell ») du N- Acc. (NAS) et te corps (« core ») du N. Acc, (NAC), La

localisation exacte de ces différents territoires est représentée sur la figure 5.

IV- Clona~e du réce~teur do~aminereiaue D, de macaca fascicularis :

Nous avions besoin d'au moins une partie de la séquence du gène RD2 pour pouvoir

concevoir notre ODN antisens RD,. Pour obtenir la séquence codante, allant du codon de

départ jusqu'à la troisième boucle intra-cytoplasmique, nous avons choisi un oligo dégénéré

(amorce N095) en amont de 1'ATG de départ et dont la séquence était commune aux gènes

RD, de rat et de souris. Nous avons également conçu deux autres amorces (NO36 et 37) situées

dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Le tableau 2 présente les différentes séquences

des amorces utilisées lors de cette expérience.

Pour obtenir la séquence de l'amorce N095, nous avons effectué un alignement avec le

logiciel GeneWorks de différentes séquences connues de GenBank, de RD, d'humain, de rat et

de souris (Accession nOC : Uû43301 rat Sprague-D D, prom ; Xl7458.l r rattus 4 ; XS3278.1 R norvegicus 4 ; X55674.1 M musculus 4 ; MM3683 1.1 Rat D, compl cDNA ; h D2

M29066 compl cDNA). Nous avons ensuite choisi une séquence, de 18-mers, identiques à

toutes les séquences alignées, en amont de L'ATG de départ et ayant un nombre important de

CG. Les amorces 36 et 37, quant à elles, ont pu être désignées grâce à une partie de séquence

du gène RD2 de macaca fascicularis de la troisième boucle intra-cytoplasmique qui avait été

obtenu par un autre groupe de recherche. Pour chacune des amorces, une séquence de 18-mers

avec un nombre important de CG a été choisie. Les positions des différentes amorces sur le

gène RD, sont représentées sur la figure 6

Diff6rent.s oligos utilisés pour obtenir la séquence ADN du récepteur D,

L

NO36 : Amorce située dans la troisième boucle intra-cytoplasmique.

NO37 : Amorce située dans la troisième boucle intra-cytoplasmique.

NO95 : Amorce située en amont de I'ATG de départ et dont la séquence est commune au

Tableau 2 : wuence des différentes amorces utilisées pour obtenir une partie de la séquence

du gène du RD, de macaca fascicularis.

ATG

3i'mC boucle intra-cytoplasmique

Fimire 6 : Position des amorces sur l'ADN du récepteur dopaminergique Dz

de mucaca fasciczrlaris.

1 -Transcription inverse:

Pour obtenir un premier brin d'ADN complémentaire (ADNc) du RD, de mucaca

fascicularis, une préparation d'ARN totaux d'un kagrnent de putamen de singe macuca

fascicularis a été inverse transcrit.

Pour cela, une solution contenant : 1 pg/ul d'ARN totaux de singe macaca

fascicularis, 20 unités d'AMV reverse transcriptase (RT) (Roche), tampon 5X d'ADNc de

synthèse, 12.5 mM de déoxynucléotide triphosphate (dNTP), 39 unités de RNase Inhibiteur

(Roche) 20 m g h l BSA et 12.5 p M d'amorce NO36 a été incubée à 55°C pendant 1 heure. Le

mécanisme de la transcription inverse est explicité dans la figure 7.

Transcription

PREMER BRIN D'ADNc

Fimre 7 : Schéma de la transcription inverse.

Nous avons effectué deux amplifications de 1'ADNc par PCR. Une première PCR avec

les amorces 95/36 et une deuxième avec Ies amorces 95/37. Pour 50 pl de réaction 2 pl

d9ADNc (inverse transcrit) a été amplifié avec 1.25 unités d9AmpliTaq Gold (Perkin Elmer),

5pl de tampon PCR AmpliTaq Gold, 10 rnM dNTP, et 12.5 y M de chaque amorce (95136 ou

95/37).

Les amplifications ont été effectuées avec le programme suivant :

Dénaturation à 94°C pendant 9 minutes

12 cycles : 94OC, 1 minute

60°C, 1 minute 30 secondes

72"C, I minute 30 secondes

12 cycles : 94T, 1 minute

55"C, 1 minute 30 secondes

72"C, 1 minute 30 secondes

12 cycles : 94T, 1 minute 30 secondes

50°C, 1 minute 30 secondes

72°C 15 minutes

La ligation des fragments PCR a été effectuée avec le i< TA Cloning Kit (pCR 2.1) »

commercialisé par Invitroben,

Les plasmides pCR 2.1 résistant à I'ampicilline et contenant l'ADN double brin de notre

séquence RD, ont été transférés dans des bactéries compétentes JM-109. La sélection de

bactéries JM- 109 ainsi transfectées s'est effectuée sur gélose LB contenant O. 1 mglm1

d'ampicilline.

Les clones positifs, obtenus après les cultures bactériennes, ont été mis en culture

liquide dans 2.5 ml de LB contenant 70 ml11 Final d'ampicilline.

L'ADN du RD, doit être extrait du plasmide pour le séquençage. Pour cela 1,s ml de

culture liquide va en premier lieu être centrifugé et le culot resuspendu dans 200 pl de tampon

de lyse composé de Glucose 50 rnM, de Tris-HCl pH-8 25 mM, de EDTA 10 mM et 4 m g h l

de lysozyme. Après 5 minutes à température pièce, Ia réaction de lyse est stoppée en ajoutant

400 pl de solution 0.2 M NaOH, SDS 1 % et en laissant le méIange, 5 minutes sur glace. Après

l'arrêt de la réaction de lyse, 300 p1 d'acétate ammonium 7.5 M, pH 7.8 doivent être ajouté et

I'eppendorf doit être rapidement vortexé puis centrifugé 10 minutes. Avant de laisser le

mélange incuber 30 minutes à -20°C, il faut rajouter au surnageant, préalablement prélevé,

0.6 volume d'isopropanol. Après avoir centrifuger 20 minutes I'eppendorf et éliminé le

surnageant, le culot doit être lavé à I'éùianol 70 % puis lyophilisé 1 minute. Une fois sec, le

culot doit être resuspendu dans 50-100 pl de TE, RNase 0.2 % et conservé à 4OC.

Pour le séquençage, nous avons utilisé le service de séquençage de l'université Laval.

Le séquençage s'est fait avec le séquenceur d'ADN AB1 373 Strech avec option XL. L'ADN

était en solution dans de I'eau ou dans du Tris-HC1 pH 8'0 10 mM (0.5 yg par

réaction;100ng/pl). Les amorces Reverse et T7 (1 -5 FM) ont été utilisées pour le séquençage.

V- Les ODNs RD,

Grâce à la séquence clonée, nous avons pu identifier une région spécifique au récepteur

D, de cette espèce et développer notre ODN antisens RD2. Les ODNs ont été synthétisés par le

service K analyse d'image et synthèse d'ADN du Centre Hospitaiier de l'Université Laval »

puis purifiés sur cartouches OPC (Perkin Elmer (AB[), Foster city, CA, USA). 11s ont été

ensuite dissous dans une solution stérile de Liquide céphalorachidien artificiel ( K A ) pour

obtenir une concentration de 5-6 y&d. La composition du LCA utilisé lors de cette

expérience est la suivante (Theo, 1994):

8.7 1 g/I de NaCl

0.2 g/l CaCI,

0.296 g/1 MgS04.7H20

1.8 g/1 Glucose

0.068pll KH2P0,

0.342gI K,HP0,.3H20

0.1 mgml gentamicine.

L'ODN antisens RD, choisi était un 18-mers modifiés en phosphorothioates aux

positions 1 et 17 dirigé contre I'ARNrn du récepteur D2. L'ODN antisens RD, correspondait à

la région codante de +1 à +18 de la séquence du gène RD, obtenue et contenant I'ATG de

départ (5'-ATG-GAT-CCA-CïG-AAT-CïG-3 ' ).

Un ODN contrôle « Missense » de 18-mers modifiés en phosphorothioates aux positions 1 et

17 a été synthétisé (5 ' -TAT-ACFAGC-GTC-TAC-GAG-3 ' ).

Les séquences utiIisées n'avaient pas d'homologies significatives avec d'autres séquences

connues selon les bases de données de GenBank.

VI-Les administrations des ODNs au siwe macaca farcicularis :

Toutes les expériences ont été effectuées sur le même singe, une femelle Macaca

fascicularis, non-ovariectomisée de 2.46 Kg. Pour chaque injection, le singe était placé dans

une chaise spécial. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées, lors de ces expériences, ont été

déterminées ,@ce à l'atlas de Szabo (Szabo et Cowan, 1984).

1-L'anesthésie du sinee :

Lors des chirurgies intracérébrales, l'induction de l'anesthésie s'effectue par injection

intramusculaire d'un mélange de kétaminelatropine (10 mg/kg, ; 0.05 mglkg). Par la suite,

l'anesthésie est maintenue par infusion continue (10 ml/kg/heure) dans la veine saphène d'un

mélange de kétamine/propofol/fentanyl(1 mglmi ; 0.8 mgld ; 0- 1 pghl).

Après les chirurgies, le singe reçoit un analgésique (kétoprofen) à raison de 2.0 mg/kg

le jour de l'intervention puis 1.0 mgkg les deux jours suivants.

2-Ex~ériences de micro-iniections d70DN antisens :

Pour les deux expériences d'injections ponctuelles, des canules guides, 23G(David

Kopft Instruments), ont été placées de façon stéréotaxique dans le Noyau Caudé et dans le

putamen de l'hémisphère droit aux coordonnées suivantes :

Noyau Caudé : Antéro-postérieur : + 22.0, Latéral : +4.0, Vertical : +7.0

Putamen : Antéro-postérieur : t16.0, Latéral : + 11.0, Vertical : +5.0

Première expérience :

Les injections ont eu lieu à l'aide d'une pompe pour micro-injections (CMA/100, BAS) deux

fois par jour pendant 4 jours (matinée et après-midi). Dans chaque site, 10 pl ODN antisens

(50 pb/site/injection) été injectés, à raison de 0 .5~1 par minute.

Lors des injections seul Ie coordonné verticai été modifié :

Noyau Caudé : Verticale: +6S.

Putamen : Verticale: + 4.5

Deuxième expérience : '

Les injections ont eu lieu à l'aide d'une pompe pour micro-injections (CMA/100, BAS) deux

fois par jour pendant 3 jours (matinée et après-midi). Dans chaque site, 10 y1 ODN antisens

(100 pg/site/injection) été injectés, à raison de OS@ par minute.

Lors des injections seul le coordonné vertical été modifié :

Noyau Caudé : Verticale: 4-0.

Putamen : Verticale: + 4-0.

3-Ex~érience d'infusion continue d'ODN antisens :

Pour l'expérience d'infusion intracérébrale continue d'ODN antisens, 2 canules en

<< L D, 23G(David Kopft Instnirnents), ont été placées de façon stéréotaxique dans le noyau

accumbens et dans le putamen de l'hémisphère droit Ces 2 canuIes en L D ont été rattachées

à des mini-pompes osmotiques ALZET Mode1 2001 (ALZA Corp., Pa10 Alto, CA) permettant

d'infuser notre ODN antisens RD2 (10 pgfpl) à raison de lpllheure pendant 7 jours.

Les canules ont été placées aux coordonnées suivantes :

Noyau accumbens : Antéro-postérieur : + 20.5, Latéral : 2.2, Vertical : +3.0.

Putamen : Antéro-postérieur : +18.0, Latéral : 10.0, Vertical : 4.0.

4-Les tests d'utilisation de la main :

Chaque test comportait dix essais. Chaque essai consistait à présenter, au singe, une

barre métallique avec cinq morceaux de fruit. Chaque essai était effectué à des endroits

différents à l'intérieur de la cage, mais le même schéma était suivi pour chaque test. Le singe

prenait alors les morceaux de fruit avec ses mains. Lors de chaque test, le nombre de fruit pris

avec la main droite et le nombre de fruit pris avec la main gauche été comptabilisé et nous

permettait d'obtenir une moyenne sur 10 essais soit 50 morceaux de fruit et une préférence

d'utilisation de chaque main.

5-Les injections de quinpirole.

Nous avons également effectué des injections sous-cutanées (s.c.) d'agoniste D,

quinpirole,

Tout au long des différentes expériences i< antisens >> effectuées sur le singe, différents

dosages de quinpirole ont été testés en sous-cutanée : 0.05 rng/kg 0.1 mgkg et 0.2 mgkg. Les

injections avaient toujours lieu vers 14 heures et la durée d'observation de l'animal était

d'environ 1 heure et demie. Pendant cette heure et demie, nous observions les réactions

motrices de l'animal et comptabiiisions le nombre de tour complet sur lui-même, effectués par

le singe,

Nous avons égaiement effectué une injection de quinpirole (25 pg/Spl LCA) en i-c.

dans le putamen et observé les effets d'une telle injection.

Enfin nous avons voulu tenter de combiner les effets d'un antagoniste D2 en i-c. et

ceux d'un agoniste D2 en sous-cutanée. Ainsi nous avons injecté du radopride (25pg/15pl

LCA) en i-c. dans le putarnen et le noyau caudé combiné à une injection de quinpirole 0.2

mgkg en s-c.

CHAPITRE QUATRIÈME

Résultats

1-Résuitats de la stratépie antisens apaliauée au RSHT-,

1-Effet de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch sur les R5HT-,

Les ODNs antisens Sm-,, ont été administrés en i.c.v. via des mini-pompes

osmotiques à raison d' 1 pl/heure pendant 6 jours (10çcg/pl). Les groupes contrôles ont reçu

soit des ODNs mismatch Sm-,, (10pD/yl) soit des infusions de sohtion saline (groupe VEH).

Des tests de radioliaison ont été réalisés, avec la Kétansérine tritiée, sur les coupes de

cerveaux présentant les différentes régions à analyser à savoir : le cortex préfrontal (Cx PréF),

la coquille et le corps du noyau accumbens (NAS et NAC) ainsi que le striatum dorsolatéral et

ventrolatéral (StDL et StVL).

Au niveau du Cx PréF, on n'observe pas d'effet I'ODN antisens Sm-,, ni de I'ODN

mismatch SHI'-,, sur les sites de liaison des récepteurs 5HT-,, comparativement au groupe

contrôle VEH (figure 8)-

Au niveau du NAC, nous n'observons pas d'effet de I'ODN antisens 5HT-, sur les

RSHT-,, en revanche I'ODN mismatch 5HT-, entraîne une augmentation significative du

nombre de R5HTW comparativement au groupe contrôle VEH (figure 9A).

Et au niveau du NAS, nous n'observons aucun n'effet significatif de l'antisens ni du

mismatch (figure 9B).

Au niveau du StDL comme du StVL, I'ODN antisens 5HT-, reste sans effet sur

l'expression du R5HT-,- En revanche, I'ODN contrôle mismatch 5HT-, entraîne une

augmentation significative de l'expression de ce récepteur comparativement au groupe VEH

(figure 10 A et B).

Cela sembIe suggérer que I'ODN antisens Sm-=, utilisé dans cette expérience, n'a pas

d'effet observable sur le site de liaison du RSHT-, tel que mesuré avec la kétansérine tritiée.

En revanche, les effets significatifs de I'ODN mismatch 5W-, laissent supposer que celui-ci

a des effets non-séquence spécifique, puisque théoriquement, il ne devrait pas s'hybrider au

récepteur Sm-,.

Figure 8 : Effets de 1'ODN antisens 5HT-, et de 1'ODN mismatch sur les niveaux des sites de

liaison des récepteurs 5HT-, au niveau du Cx PréF.

Binding SET-2A NAC

Binding 5HT-2A NAS

Fiare 9 : Effets de 1'ODN antisens 5HT-, et de 1'ODN mismatch sur les niveaux des sites de

Liaison des récepteurs 5J3T.-,,

A :du corps du noyau accumbens (NAC), B : de Ia coquille du noyau accumbens (NAS).

* : t-test si,&~catif P< 0.0 1,

Buiding 3m-ZA StDL

Fimire 10 : Effets de L'ODN antisens 5HT-, et de I'ODN cc mismatch fi sur les niveaux des

sites de liaison des récepteurs 5HT-,.

A :au niveau du Striaturn dorsolatéral (StDL), B : au niveau du Striatum ventrolatéral

(StVL).* : t-test sibdcatif P< 0-0 1.

2-Effet de I'ODN antisens et d e I'ODN mismatch sur les niveaux d'ARNm des

facteurs de transcri~tion et des neurooeptides

Aux vues des résultats des tests de radioliaison, I'ODN antisens 5HT-, est sans effet

observable dans toutes les structures analysées (Cx PréF, NAC, NAS, StDL et StVL). En

revanche I'ODN misrnatch a des effets significatifs dans le NAC, StDL et StVL. Cela, semble

dû à des effets non-séquence spécifiques de I'ODN mismatch 5HT-,.

Ainsi même si nous observons des résultats significatifs, suite au traitement antisens au

niveau de l'expression de I'ARNrn de c-fos et de NGFI-B (figure 11 et 12), ils ne peuvent en

aucun cas être attribués à des effets antisens.

Les traitements ODNs antisens et misrnatch restent sans effet significatif sur

l'expression de I'ARNrn des neuropeptides Neurotensine et Dynorphine (figure 13 et 14).

VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS ;

C x Cine - NAC NAS StDL m%

Fieure 11 : Effets de W D N antisens et de L'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des

ARNm de c-fos.

* : t-test significatif PC 0.0 1.

VEH MM AS

Cx Cing

VEH MM

NAC -

_Ba_ VEH MM

NAS - VEH

Fimire 12 : Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des

d' ARNm de NGFI-B.

* : t-test significatif Px 0.0 1 ; ** : t-test significatif P< 0.05.

Neurotensine / 5HT-2A

. -- .... ---A- A---

VEEf MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM -4s

Cs Cing &+!= - NAS sl!x a

Figure 13 : Effets de 170DN antisens et de I'ODN mismatch 5m-, sur les niveaux des

d7ARNm de Neurotensine.

VEH MM

NAC - MM

NAS

VEH MM

s t n -

F i m w 14 : Effets de L'ODN antisens et de L'ODN mismatch SH'ï, sur les niveaux des

d' ARNm de Dy norp hine.

II-Résultats de la stratégie antisens a~pIiauée au RD de macaca -fasciculmr's.

l -Résultats du clonage du gène RD2 de macaca -fascicularis

a- Résultats des PCR.

Les taiUes attendues des deux fragments sont respectivement de 1013 pb avec les amorces 95-

36 et de 989 pb avec les amorces 95-37.

Les résultats des deux PCR sont présentés sur le gel 1. Les tailles correspondent aux attentes et

il est important de souligner que chaque fixament est dédoublé, cela pourrait laisser supposer

la présence d'isoformes du RD, chez le singe macaca fascicularis comme c'est le cas chez le

rat et l 'home-

a b c

GEL 1 :Résultats des PCR sur gels d'agarose 1%.

fragment du gène RD2 obtenu avec les amorces NO95 et 36

fragment du gène RD2 obtenu avec les amorces No 95 et 37

contrôle PCR

b- Résultats du s é ~ u e n ç a ~ e du cène RD2.

La séquence obtenue est présentée dans la figure 15. Elle présente une partie de

séquence non codante, de 1 à 100 pb, et une partie codante qui débute à I'ATG de départ et se

termine dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Dans la séquence obtenue, on retrouve

1'ODN antisens RD, que nous avons choisi et qui comprend I'ATG de départ

situé dans la 3"me boucle hm-cytoplasmique.

Nous avons obtenu 931 pb de la séquence du gène RDI de singe macaca fascicularis, les 100

premières bases, de la séquence obtenue, sont non codante.

GC-CTCGAGCAGC

GGCGCCCTAT-GGCTTGAAGA-GCCTGGCCAC-CCAGTGGCTC-CGCCGCCCCG-IOO

ATGGATCCAC-TGAATCTGTC-CTGGTACGAT-GATGGTCTGG-AGAGGCAGAA-150

CTGGAGCCGG-CCCTTCAATG-GGTCGGACGG-GAAGGCGGAC-AGACCCCACT-OO

ACAACTACTA-TGCCACGCTG-CTCACCCTGC-TCATCGCGGT-CATCGTCTTC-50

GGCAACGTGC-TGGTGTGCAT-GGCCGTGTCC-CGCGAGGG-CGCTGCGAC-300

CACCACCAAC-TACCTGATCG-TCAGCCTCGC-GGTGGCCGAC-CTCCTCGTGG-50

CCACACTGGT-CATGCCCTGG-GTTGTCTACC-TGGAGGTGGT-AGGTGAGTGG-OO

AAATTCAGCA-GGATTCACTG-TGACATCTTC-GTCACTCTGG-ACGTCATGAT-50

GTGCACGGCA-AGCATTCTGA-ACTTGTGTGC-CATCAGCATC-GACAGGTACA-SOO

CAGCTGTGGC-CATGCCCATG-CTGTACAATA-CGCGCTACAG-CTCCAAGCGC-550

CGGGTCACCG-TCATGATCGC-CATCGTCTGG-GTCCTGTCCT-TCACCATCTC-6OO

CTGTCCACTC-CTCTTCGGAC-TCAACAACGC-AGACCAGCGAGTGCATCA-650

TTGCCAACCC-GGCCTTCGTG-GTCTACTCCT-CCATCGTCTC-CTTCTACGTG-7OO

CCCTTCATCG-TCACCCTGCT-GGTCTACATC-AAGATCTACA-TTGTCCTCCG-75O

CAGACGCCGC-AAGCGAGTCA-ACACGAAGCG-CAGCAGCCGA-GCCTTCAGGT-800

CCCACCTGAG-GGCTCCACTA-AAGGAGGCTG-CCCGGCGAGC-CCAGGAGCTG-85O

GAGATGGAGA-TGCTCTCTAG-CACCAGCCCA-CCCGAGAGGA-CCCGGTACAG-900

CCCCATCCCG-CCCAGC ____----------------- 931

Figure 15: La séquence obtenue du gène RD, de macaca farcicularis où sont représentés,

, I'ODN antisens RD, qui comprend I'ATG de départ, et

2-Résultats des micro-in iections uonctuel Ies

Toutes les expériences ont été effectuées sur le même singe, une femelle macaca

fascicularis, non-ovarectornisée de 2.46 Kg. Ce singe démontrait une nette préférence pour

l'utilisation de sa main gauche.

Les ODNs antisens RD2 (SOpg/site/injection) ont été injectés unilatéralement en ix., de façon

ponctuelle, à l'aide d'une pompe pour micro-injections. Les injections avaient lieu deux fois

par jour (10 @/injection à une vitesse de O.Spl/rninute) pendant 4 jours. Ces injections ont eu

lieu dans le putamen et dans le noyau caudé de l'hémisphère droit. Les résultats de ces

injections sont présentés dans la figure 16.

Les résultats contrôies. effectués avant toute manipulation chirurgicale de l'animal,

montrant que le singe a une nette préférence pour l'utilisation de sa main gauche. En effet, il

utilise à 80 % sa main gauche et à 20 % sa main droite.

Tout au long des injections d'ODN antisens RD, (a, b, c, d), nous observons une

augmentation de l'utilisation de la main droite pour finalement atteindre 54 % d'utilisation de

la main droite pour 46 % d'utilisation de la main gauche le jour suivant l'arrêt des injections

(19 février). Après le 19 février, nous observons un retour progressif (en 4 jours) aux résultats

contrôles.

Les ODNs antisens RD,, injectés au niveau du putamen et du noyau caudé, semblent

donc agir sur la préférence d'utilisation de la main et le singe utilise de plus en plus sa main

droite. Les effets sont particulièrement important le 5''" jour après le début du traitement

Les ODNs antisens RD, (lûOpgfsite/injection) ont été injectés unilatéralement en i.c., de façon

ponctuelle, à l'aide d'une pompe pour micro-injections- Les injections avaient Lieu deux fois

par jour (10 plfinjection à une vitesse de O.Spl/minute) pendant 3 jours. Ces injections ont eu

lieu dans le putamen et dans le noyau caudé de l'hémisphère droit. Les résultats de ces

injections sont présentés sur la figure 17.

Les résultats contrôles ont été vérifiés avant la deuxième expérience d'injection, Le

singe utilise toujours préférentiellement sa main gauche pour attraper les objets et les

morceaux de nourriture (84 % de main gauche et 16 % de main droite).

Nous observons une au-mentation de l'utilisation de la main droite tout au long des

injections d'ODN antisens RD, (a, b, c) pour finalement atteindre un plateau les deux jours

suivant la fin des injections (4'*= et le Sième jour) avec 34 % d'utilisation de la main droite pour

66 % d'utilisation de la main gauche Nous observons, ensuite, un retour progressif aux

résultats contrôles.

Les ODNs antisens RD,, injectés au niveau du putamen et du noyau caudé, semblent donc agir

sur la préférence d'utilisation de la main et le singe utilise de plus en plus sa main droite-

Cependant les effets sont moins importants que lors du premier traitement. En effet, nous

n'observons pas de tendance au renversement de la préférence d'utilisation de main comme

lors de la première expérience et ce, malgré, L'augmentation de la concentration d'ODN

antisens RD, injecté quotidiennement. Notons enfin, que la durée d'injection était de trois

jours pour cette expérience alors que pour la picmière expérience, les ODNs antisens étaient

injectés pendant quatre jours.

Effet d'une double injection intracérébrale pontuelle (Cd,Put.) d'ODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

(50 pg/site/injection)

1 main droite

4% -- main gauche

a : Injections 1,2 d'antisens (AM,PM)

b : Injections 3,4 d'antisens (AM,PM)

c : Injections 5,6 d'antisens (AM,PM)

d : Injections 7,8 d'antisens (AM,PM)

Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd,Put.) d'ODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

I main droite

1 :3 main gauche

a : Injections 1,2 d'antisens (AM,PM)

b : Injections 3,4 d'antisens (AM,PM)

c : lnjections 5,6 d'antisens (AM,PM)

3-Résultats de l'infusion continue

Le même singe a été utilisé pour cette expérience d'infusion d'ODN antisens RD, qui

fait suite aux deux premières d'injections ponctuelles CODN antisens RD,-

Les ODNs antisens RD, ont été infusés, pendant 7 jours, unilatéralement en ix, à l'aide

de mini-pompes osmotiques (10 pg/pI ;lyllheure). Ces infusions ont eu lieu dans le putamen

et dans le noyau accumbens de l'hémisphère droit et non plus dans le putarnen et le noyau

caudé comme précédemment Les résultats de ces injections sont présentés dans la figure 18.

Les résultats contrôles ont été vérifiés avant la troisième expérience d'injection d'ODN

antisens RD,. Le singe utilise toujours préférentiellement sa main gauche pour attraper les

objets et les morceaux de nourriture (80 % sa main gauche et à 20 % sa main droite).

Contrairement aux deux premières expériences, nous observons une diminution de

l'utilisation de la main droite tout au long des 7 jours d'infusion des ODNs antisens RD, (du 5

mai au 12 mai), pour atteindre le Brne jour d'infusion quasiment 100 % d'utilisation de la main

gauche. Nous observons un retour progressif aux résultats contrôles après la fin du traitement.

Les ODNs antisens infusés au niveau du putamen et du N. Acc. semblent donc agir sur

la préférence d'utilisation de la main. Cependant les effets ne correspondent pas aux

hypothèses de dépah En effet, les infusions CODN antisens R D , dans le putamen et dans le

N-Acc, du singe devaient entrainer une diminution de l'utilisation de la main gauche au profit

de la main droite. Notons néanmoins que les effets observés sont maximums le 6i'me jour après

le début du traitement et qu'ils sont opposés à ceux observés après injections ponctuelles

d'ODN antisens RD,au niveau du putamen et noyau caudé.

Effet d'une double infusion intracérébrale continue (Put, Acc) dfODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque

(1 O pg/ pl- 1 pVhr)

100

90 = 80 ig-S

70 C

g 60 a V) .-

'L main droite - .- 50 c. 3

40 main gauche s

10

O

Implantation et début infusion 5 mai (10pg/pl- 1 pl/hr)

4-Résultats des iniections de auinpirole :

Différents dosages de quinpirole ont été injectés en sous-cutanées au singe aux cours

des trois expériences d'injections d90DN antisens RD,. Les résultats obtenus sont présentés

dans le tableau 3.

Ne tourne pas

~Mvts rap. en avant main droite

Regarde sous jambe gauche

Boit beaucoup

Active

Injections (m@g)

Expérience

11 16- 17 18 19 27 fév fév fév fév fév fév

0.05 0.05 0.1 0.1 0.1 0.1

Contrôle 1 1 1 1 2

29 8 10 12. 16 fév mai mai mai mai

Tableau 3 : Effet des injections sous cutanées de quinpirole sur le comportement moteur du

singe traité par des ODNs antisens RD2.

Exp. 1 : Injection ponctuelle ODN antisens SOpg/site/injection (4 jours) (putamen, N. caudé)

Exp. 2 : Injection ponctuette ODN antisens lOOpg/site/injection (3 jours) (putamen, N. caudé)

Exp. 3: Infusion ODN antisens (10yg/pI, lm) pendant 7 jours.

Mvts rap. : Mouvements rapides

Nous avons voulu tester différentes doses de quinpirole en sous-cutanée pour mieux

connaître leurs effets sur le comportement du singe. Une dose comprise entre 0.1 et 0-2 m d k g

entraîne une phase d'éveil assez importante chez le singe. Cette activité se maintient durant à

peu près 1 heure à 1 heure e t demie. II est important de souligner ici, que l'injection de

quinpirole entraîne une phase de somnolence, post-injection, d'environ 10 minutes puis

l'animal devient très actif. Les comportements moteurs rapportés dans le tableau 3 sont le fruit

d'observations du singe sous quinpirole. Étant donné le caractère pionnier de ces expériences,

nous ne savions pas quels comportements nous allions observer, ainsi nous avons rapporté ici

ceux qui nous semblaient différer de la << normale ».

L'injection contrôle de quinpirole (0.05 mg/kg) nous montre que le singe utilisé ne

tourne pas, spontanément, sur lui-même.

Lors de la première expérience d'injections ponctuelles dYODN antisens RD, les

injections de quinpirole (0-05 e t 0.1 mg/kg) ont eu lieu le 16, 17 et 18 février, jours

d'injections d'ODN antisens RD,.,, ainsi que le 19 février, jour où nous avons observé te

renversement de préférence d'utilisation de la main.

Le premier constat, aux vues des résultats du tableau 3, est que le singe ne tourne pas sur lui-

même. En revanche, un comportement singulier du singe a attiré notre attention. En effet, les

16 et 17 février, il a commencé à regarder régulièrement sous sa jambe gauche. Puis ces

mouvements se sont transformés en une pirouette complexe qui consistait à regarder sous sa

jambe gauche puis à effectuer une rotation complète autour de l'axe formé par sa jambe

gauche. Un autre point important ici, mis à part le fait que l'animal s'abreuve souvent au cours

de l'expérience, est le fait que l'animal fait souvent des mouvements rapides vers l'avant avec

sa main droite.

Les injections des 27 et 29 février (0.1 rngfkg) ont eu lieu lors de la deuxième

expérience mais après la fin des injections d'ODN antisens RD,. Le 27 février correspond au

plateau post-injection durant lequel l'utilisation de la main droite a été la plus importante

(34%). Le 29 février correspond au palier de retour à la normale.

Le singe ne tourne toujours pas sur lui-même mais effectue toujours sa pirouette et boit

beaucoup.

Les injections de quinpirole effectuées pendant l'expérience d'infusion d'ODN

antisens RD, different des injections précédentes par leur concentration : 0.2 m g k g au lieu de

0.1 m g k g

Les injections des 8, 10 et 12 mai ont été faites pendant l'infusion d'ODN antisens RDZ et

celle du 16 mai a été faite le dernier jour de l'expérience correspondant au jour du retour à la

« normale ».

Le singe ne tourne pas sur lui-même, mais effectue toujours régulièrement sa pirouette. Le

singe n'a plus tendance à boire beaucoup ni a avoir des mouvements rapides des mains.

Nous avons égaiement d'injecté en i.c. du quinpirole (25 pg/5pl) dans le putamen le 22

mars, date ne correspondant à aucun traitement antisens. Le singe montre effectivement une

phase de somnolence mais aucune phase d'excitation réelle et surtout il ne tourne pas sur lui-

même,

Le 24 mars nous avons voulu connaître les effets d'une injection en i.c. d'antagoniste

D,, raciopride (25 pg/15yl), dans le putarnen et le noyau caudé, combinée à une injection

sous-cutanée d'agoniste D, quinpirole (0.2 mglkg). Les résultats sont présentés dans le

tableau 4 et montrent que le singe ne toume pas sur lui-même mais effectue beaucoup de

pirouettes.

Type d'injection

In-iection i.c. putamen

25pg / 51.11 LCA

Injection i.c putamen et N Caudé

25pg raclopride / 15p.l LCA

In-iection S.C.

quinpirole 0.2 mgfkg

Date

22 mars

24 mars

Durée d'observation

1 heure post-injection

1 heure post-injection

OBSERVATIONS 1 -Somnolence -Aucune phase d'excitation -Ne toume pas

-Phase de somnolence de 10 minutes -Phase d'excitation -Fait beaucoup de pirouettes -Ne toume pas

Tableau 4 : Effet d'injections i-c. sur le comportement moteur du singe sans traitement ODN

antisens RD2.

Discussion

1-Évaluation de la straté-e antisens à l'étude du réce~teur 5HT-, dans le cerveau de

rat. -

La stratégie antisens à été appliquée, avec succès, à l'étude de différents récepteurs

métabotropiques chez le rat (RD,, RD,...). Les résultats montraient un effet significatif de

I'antisens sur le récepteur pour lequel il était désigné, alors que les ODNs contrôles (missens

ou mismatch) n'entraînaient pas d'effet significatif.

Nous sommes confrontés ici à plusieurs problèmes. L'ODN antisens 5HT-, reste sans

effet observable sur les récepteurs, tels que mesurés avec la kétansérine tritiée. Et cela même

si I'infusion des ODNs à durée 5 jours et que le turn-over du récepteur Sm-, est de 2.5 à 3

jours (Gozfan et coll., 1994, Pinto et Battaglia, 1994). En revanche, I'ODN contrôle mismatch

5HT-, entraîne une augmentation significative de l'expression des RSHT-, au niveau d u

NAC, StDL et StVL. Théoriquement, I'ODN contrôle misrnatch 5HT-, ne devrait pas

s'hybrider avec I'ARNm du récepteur 5HT-,. Ces effets pourraient donc être associés a des

effets non-séquence spécifiques.

Scalzitti et collaborateurs ont observé une augmentation des R5HT-, dans le cortex et le

striatum de rat suite à l'infusion i.c.v. d'ODNs antisens 5HT-, pendant 8 jours. Cependant ils

soulignent également le fait que des structures secondaires de I'ARNm ont été trouvées dans la

séquence pour laquelle leur antisens était désigné (Scalzitti et coll., 1998; Scalzitti et Hensler,

2000). L'ODN antisens Sm-,, que nous avons utilisé pourrait donc être complémentaire

d'une séquence comportant également une structure secondaire. Une structure secondaire a pu

gêner l'hybridation de I'ODN antisens avec I'ARNm et ainsi empêcher la liaison. Cela

expliquerait donc le manque de résultats significatifs observés avec notre antisens. Il est

important de souligner ici que les niveaux de MHT-, sont faibles dans Ies structures

analysées de plus nos groupes ne comporte pas beaucoup de sujets (n faible) et les erreurs

calculées sont grandes.

Nous observons une augmentation significative des WHT-, dans le NAC, StDL et

StVL après le traitement par I'ODN contrôle mismatch. Ceci est sûrement le fruit d'une

liaison non-séquence spécifique de L'ODN avec l7ARNm. Il aurait peut-être été judicieux de

choisir un mismatch avec 5 ou 6 bases différentes de I'antisens, cela aurait sûrement

diminuerait les chances de liaisons non-spécifiques de ce dernier. Peut-être même aurait-il

fallu choisir un missens plutôt qu'un mismatch comme l'a suggéré Chiasson en 1994

(Chiasson et coll,, 1994).

Ainsi même si nous observons des résultats significatifs, suite au traitement antisens,

sur les niveau d'expression des ARNm de c-fos et de NGFI-B (figure 11 et 12)' ils ne peuvent

en aucun cas être attribués à des effets antisens. Il est probable que le stress, les différences de

la manipulation ou encore la chirurgie aient pu avoir des effets sur les niveaux d'expression de

I'ARNm de ces facteurs de transcription.

En revanche, les traitements ODNs restent sans effets sur l'expression des ARNm des

neuropeptides, Neurotensine et Dynorphine.

Il serait intéressant de refaire cette expérience pour vérifier l'augmentation des

récepteurs SW-, dans le cortex et le striatum observée par Scaizitti et coll. en 2000 (Scalzitti

et Hensler, 2000). En effet, 17aumgnentation de l'expression des récepteurs 5HT-,, observés

par les auteurs, est en contradiction avec Les effets attendus de la technique antisens.

L'hybridation de I'ODN antisens avec sa séquence complémentaire de I'ARNm, du récepteur

cible, entraîne théoriquement une diminution de l'expression des récepteurs étudiés. Les

auteurs expliquent ces augmentations par la perturbation du mécanisme visant à stabiliser les

structures secondaires de 1'ARN. Ils supposent que la perturbation de ce mécanisme, par la

Liaison des ODNs antisens avec 17ARNm, pourrait inhiber la répression de la traduction et

ainsi augmenter l'expression des récepteurs 5HT-,.

Pour refaire l'expérience, il faudrait donc choisir un autre ODN antisens 5HT-,, s'assurer

qu'il n'est pas complémentaire d'une structure secondaire, et désigner correctement un ODN

mismatch ou missens. Les ODNs devront être infuser en i.c.v. pendant 8 jours, puisque c'est

au bout de 8 jours seulement que Ies auteurs ont observé cette augmentation.

Seulement après avoir pris ces précautions, il sera alors peut être possible de connaître

les effets des RSHT-, sur les niveaux d'ARNm des facteurs de transcription comme c-fos ou

NGFI-B et sur les neuropeptides comme Neurotensine ou Dynorphine.

II-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au RD, chez le singe macaca fascicularis.

1- Le séauencaoe du gène RD2 de mucaca füscicularis

Le résultat de la PCR, effectuée avec les amorces 95 et 37, montre deux fragments (gel

1)- L'amorce 37 se trouve dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Les différences

existantes entre les deux isoformes connus des RD, humain et rat (D,L et D,S) se situent dans

la troisième boucle intra-cytoplasmique (Giros et coll., 1989; Monsma et coll., 1989)- Ces

observations suggèrent fortement la présence de deux isofomes du RD, chez le singe macaca

facicularis, De plus, nous avons également obtenu deux fragments avec la PCR, effectuée

avec les amorces 95 et 36. Cela soutien donc l'hypothèse de la présence de deux isoformes

chez le RD, du singe macaca fascicularis.

Nous nous attendions à obtenir 989 paires de bases (pb) du gène RD, de macaca

fascicularis. Nous avons obtenu une séquence de 93 1 pb. II est possible que nous ayons cloné

l'isoforme court du RD2 de rnacaca fascicularis. Il est donc essentiel de continuer le

séquençage du RD, du singe macaca fu.scicularis pour tout d'abord obtenir la séquence

complète du RD2 de rnacaca fascicwiwis et ensuite tenter de vérifier l'hypothèse selon laquelle

il existe deux isoformes de a chez macaca fascicrrlaris. Si on se réfêre aux tailles des

séquences connues de RD, humain (no accession M29066) et RD, rat (noaccession X56065),

la séquence codante du RD, du singe macaca facieularis devrait avoir une séquence codante

d'environ 1330 pb.

Pour obtenir la séquence complète du RD, de macaca fascicularis, il faudrait concevoir un

oIigo dégénéré (comme nous l'avons fait avec l'amorce N095) c'est-à-dire effectuer un

alignement avec le logiciel GeneWorks des différentes séquences connues de GenBank, de

RD, d'humain, de rat et de souris. Une fois l'alignement effectué, choisir une séquence se

situant à la f in des séquences alignées. Cette séquence del8-mers devra être la plus identique

possible à toutes les séquences alignées, avoir une bon ration ATKG et ne pas présenter

d'homologies significatives avec d'autres séquences connues selon les bases de données de

GenBank.

2- La straté-ie antisens appliquée au RD de primate et la préférence d'utilisation de la main

Comme il a été mentionné dans le chapitre second, la stratégie antisens pour le RD, a

été largement appliquée aux rongeurs. Ces études semblent soutenir l'hypothèse selon

laquelle, les RD,, situés dans te striatum, seraient impliqués dans la locomotion. En effet, la

diminution de l'expression des RD, dans le striatum entraîne une diminution de la Iocornotion.

Ainsi, les RD, aurait un rôle excitateur sur l'activité motrice (Weiss et coll., 1993; Zhang et

Creese, 1993; Weiss e t coll., 1997b)-

Nous avons tenté d'appliquer cette stratégie au primate pour tenter d e mieux

comprendre le rôle du RD, dans le striatum de primate (putamen, noyau caudé, N. Acc.). Les

rôles exacts de chaque noyau gris centraux sont encore mal connus. Cependant, leur déplétion

en dopamine, lors de la maladie de Parkinson, entraîne des troubles moteurs importants. Nous

avons donc essayé d'évaluer, grâce à Ia technique antisens, le rôle des RD, dans l'activité

motrice du striatum de primate.

Nous savons que le putamen semble plus impliqué dans l'exécution du mouvement et

que Ie noyau caudé serait lui plutôt impliqué dans l'initiation du mouvement (De la Fuente-

fernandez et coll., 2000). Nous avons donc tenté de bloquer la synthèse des Q dans ces deux

structures en y injectant directement les ODNs antisens RD, de mieux comprendre le rôle

du RD, dans ces deux structures motrices. Nous avions pris soin d'implanter les canules

d'injection dans la partie, du putamen et du caudé, allouée aux membres supirieurs. En effet il

semblerait qu'il existe une topographie corporelle au sein de ces structures (Flaherty et

Graybiel, 1993; Graybiel et coll., 1994; Parent et coll., 1995).

Le singe que nous avons utilisé, tout au long des expériences antisens, avait une très

forte préférence pour l'utilisation de sa main gauche dans tous ses gestes quotidiens. En

inhibant les RD,, dans le putamen et le noyau caudé de l'hémisphère droit, nous espérions

contrebalancer cette dominance gauchère e t observer une augmentation de l'utilisation de la

main droite.

Lors d e la première expérience d'injection ponctuelle d'ODN antisens RD,

(SOpg/site/injection, 2 injections/jour pendant 4 jours), nous avons effectivement observé,

chez notre singe, un changement dans Ia préférence d'utilisation de la main. Comparativement

aux contrôles (80% d'utilisation de la main gauche), les effets étaient spectaculaires le 5ième

jour après le début du traitement, En effet, le singe est devenu à 54 % droitier,

Lors de la deuxième expérience d'injection ponctuelle d'ODN antisens RD,

(~ûOpglsite/injection, 2 injections/jour pendant 3 jours), nous avons essayé d'augmenter la

concentration de notre antisens- Ainsi au Iieu d'injecter 50yg/site/injection nous avons injecté

100yg/site/injection en prenant soin de descendre un peu nos canules d'injection pour éviter

d'injecter dans un site peut être nécrosé, tout en restant dans la zone supposée allouée aux

membres supérieurs. Les résultats obtenus après trois jours de ce traitement ne sont pas aussi

concluants que ceux de la première expérience. En effet, le renversement de préférence

d'utilisation de la main n'a pas Iieu même au 5ièmc jours après le début du traitement comme

pour la première expérience. Nous n'observons qu'un plateau les deux jours suivants la fin des

injections (4ième et 5ième jours) avec 34% d'utilisation de la main droite.

Plusieurs paramètres sont à mettre en exergue ici :

-Visiblement la concentration de I'antisens injecté est essentielle puisque nous

observons le renversement de la préférence de Ia main lorsque la concentration injectée

ponctuellement est de 50yglsitelinjection. Alors qu'avec une concentration de

iOOpg/sitelinjection, on n'observe pas ce renversement

-La durée du traitement est également primordiale. Effectivement, les effets sont plus

probants lorsque le traitement dure 4 jours au lieu de 3 jours. 11 serait intéressant d'injecter de

façon ponctuelle des ODNs antisens RD, à une concentration de 50yg/site/injection pendant 7

jours dans le putamen et le noyau caudé. afin d'observer les effets sur la préférence

d'utilisation de la main. En effet, c'est le s " ~ ~ jours après le début des traitements que les

effets sont les plus importants et les infusions d'ODN antisens ont eu lieu pendant 7 jours.

Ainsi en injectant ponctuellement des ODNs antisens dans les putamen et le caudé pendant 7

jours, nous aurons un << contrôle temps » sur les deux types d'expériences d'administrations

d'ODN antisens.

-Un autre point important ici, est la notion de l'apprentissage par l'animal. Bien que les

fi-uits étaient disposés dans des endroits différents de la cap , il est indéniable que le singe ait

pu apprendre les schémas de présentations des fruits au fil des jours. Ainsi si les résultats de la

deuxième expérience sont moins importants dans quelle mesure ne sont-ils pas influencés par

cet apprentissage ?

Cependant nous avons observé un contre-balancement de la préférence de 1'utiIisation de la

main chez notre singe gaucher. Ainsi les RD, localisés dans le putarnen et le noyau caudé,

semblent jouer un rôle important dans l'activité motrice.

Les résultats obtenus avec I'expérience d'infusion dans le putamen et le N-Acc. ne sont

pas en accord avec notre hypothèse de départ. En effet, si le putamen est impliqué dans

l'exécution du mouvement, le N-Acc., structure limbique, est égaiement impliquée dans la

locomotion du moins chez les rongeurs (Deutch et Carneron, 1992; Canales et Iversen, 2000)-

Chez les primates, le N.Acc. semble plus impliqué dans l'apprentissage moteur (Stern et

Passingharn, 1994; Stern e t Passingharn, 1995)- Le blocage de l'expression des RD, par

I'ODN antisens devrait diminuer ['activité motrice et par le fait même contrebalancer la

préférence d'utilisation de la main. Cependant les effets observés sont opposés à ceux attendus

et le singe devient pratiquement à 100% gaucher le 6i'me jour d'infusion.

Si l'expression des RD, est inhibée dans le N.Acc. et le putamen, cela suggère que

t'apprentissage moteur et l'exécution du mouvement soient inhibés, du moins pendant le

traitement. Ainsi l'inhibition de l'expression des RD, dans ces structures devrait avoir Ies

mêmes effets sur la préférence d'utilisation de la main que ceux observés lors des deux

premières expériences. Cependant ce n'est pas le cas, le singe devient de plus en plus gaucher.

L'inhibition de l'expression des RD,, au niveau du putamen et du N.Acc. avec ces

concentrations, n'est pas suffisante pour obtenir un effet sur la préférence de l'utilisation de la

main. Faut-il une inhibition des RD, à la fois au niveau du putamen et du noyau caudé pour

observer un effet moteur ?

Il est intéressant de mentionner ici, que les effets maximums observés lors des expériences

d'injections ponctuelles d'ODN antisens ont eu lieu le jour alors que les effets maximums

lors de l'infusion d'ODN antisens ont eu lieu le @"'jour. De plus, ces effets sont opposés. Les

deux combinaisons, putamenhoyau caudé versus putamen/N.Acc., ne sont pas équivalentes et

semblent même avoir des effets moteurs opposés sur l'utilisation de la main droite

Enfin le dernier point important de cette étude, a été les injections d'agoniste D, chez

le singe sous traitement antisens. Nous nous attendions à ce que notre singe tourne sur lui-

même sous quinpirole. Cependant, quelles que soient les concentrations, le type et la durée des

administrations ainsi que les structures ciblées, le singe ne tourne pas, pourtant il est

indéniablement actif sous quinpirole. Néanmoins, deux modifications du comportement

moteur ont attiré notre attention.

La première modification du comportement moteur a été des mouvements rapides en

avant de la main droite lors de la premiére expérience. Comme il a été précisé plus haut, il

semble exister une topographie corporelle au sein de ces structures et nous avions pris soin

d'implanter les canules d'injection dans la partie, du putamen et du caudé, allouée aux

membres supérieurs. 11 est possible que le quinpirole ait accentué, dans ces régions,

l'asymétrie due au traitement antisens dans l'hémisphère droit. Cependant nous n'observons

pas ces mouvements de la main droite lors des expériences suivantes.

Enfin, il est intéressant de souligner l'apparition de pirouettes » plutôt atypiques.

Cette <i pirouette N complexe consistait à se pencher en avant pour regarder sous sa jambe

gauche puis à effectuer une rotation complète autour de l'axe forme par sa jambe gauche. Lors

de la première expérience d'injection ponctuelle, le singe a d'abord commencé à regarder

régulièrement sous sa jambe gauche (16 et 17 février) et ce mouvement s'est transformé en

« pirouette » le 18 f6vrier. Et à partir de cette date, ce mouvement singulier a persiste à chaque

injection de quinpirole. Ce mouvement est difficilement interprétable. Est-ce le reflet de

l'action de ODNs antisens dans les régions étudiées ou celui de lésions dues aux injections

successives ?

Ndanmoins le quinpirole reste sans effet sur le comportement rotatoire du singe. Cette

absence de rotation de l'animal pourrait être dû à une trop faible diffusion des ODNs antisens

dans les structures. En effet, nous n'avons aucune donnée sur la diffusion du liquide

(LCAIODN antisens) dans le tissus.

L'inhibition de la synthèse des RD, n'est peut-être pas assez importante pour entraîner une

asymétrie du système dopaminergique suffisante et nécessaire à un mouvement de rotation

sous quinpirole.

Enfin, les canules ont été implantées dans les regions douées aux membres supérieurs, peut-

être aurait4 mieux fallu injecter les ODNs antisens dans la région des membres inférieurs

pour observer un mouvement rotatoire sous quinpirole-

11 est important de mentionner ici que nous ne savons pas si les effets observés sont dus

à des effets de I'ODN antisens ou aux lésions entraînées par les injections de liquide

directement dans les structures.

II serait donc très utile pour la poursuite de cette étude d'élucider plusieurs points essentiels à

l'application de la technique antisens.

-II faudrait connaître la diffusion, dans les tissus, de notre liquide (LCA/ ODN

antisens) ainsi que la pénétration cellulaire de notre ODN antisens. Pour cela il faudrait

marquer les ODNs antisens avec de la biotine et ensuite une fois le cerveau prélever suivre le

trajet de notre liquide (Yee et coll., 1994). Ainsi nous pourrons cornaître la diffusion tissulaire

du liquide, la pénétration cellulaire et peut-être avoir une idée de la concentration de I'ODN à

utiliser ou de la vitesse à laquelle t'administrer.

-Une fois ces données recueillies, il serait sans doute intéressant d'administrer les

ODNs antisens à un singe Iésé unilatéralement avec de la 6-hydroxydopamine. En effet, le

singe 16sé devrait tourner spontanément sous quinpirole. Dans ce cas de figure, peut-être qu'il

serait possible d'observer des effets plus important en contrebalançant le déficit moteur,

comme cela a été fait lors des études du RD, chez le rat avec la technique antisens.

-Enfin, il est essentiel de mettre au point un test d'utilisation de la main dans lequel, le

facteur apprentissage est réduit au maximum. Peut-être faudrait-il tester la vitesse d'exécution

du geste plutôt que la main choisi pour effectuer le geste.. .

CONCLUSION :

Il est, à l'heure actuelle, bien établi que la stratégie antisens est un outil d'investigation

efficace et permettant d'étudier un sous-type particulier de récepteur au niveau cérébral. Cette

technique n'entraîne pas d'up régulation des récepteurs cibles, ainsi, contrairement aux

traitements courants (antagonistes et agonistes) les récepteurs ne sont pas super sensibles après

l'arrêt du traitement, Cette technique est b i e n au point chez les rongeurs, néanmoins, cette

stratégie n'avait pas encore été appliquée aux primates non-humains au niveau cérébral Les

résultats présentés ici, sont préliminaires et done à considérer avec précaution.

D'autant qu'aucune donnée n'est encoFe disponible sur le turn-over-du RD2 au niveau

cérébral chez le primate. Mais ces résultats nous permettrons à l'avenir de perfectionner les

différents points essentiels au bon fonctionnement de la technique antisens. En effet, cela nous

permettra d'affiner : les concentrations d'ODN antisens à injecter, la diffusion du liquide dans

les tissus, la position exacte des injections a u sein des structures, la pén6tration cellulaire de

notre ODN antisens, te mode d'administration Ci.c. ou i.c.v,) .

Néanmoins ces résultat montrent u n certain effets au niveau de la préférence

d'utiIisation de la main. En effet, 11 semble indéniable que le RD, joue un rôle prédominant

dans l'activité motrice. Néanmoins, le rôle jouer par les différentes structures étudiées ici

(putamen, noyau caudé et N.Acc.) semble p lus complexe que prévu. Ainsi une fois que les

effets observés pourront être attribués avec certitude aux effets de l'antisens et les mises au

point effectuées, nous pourrons tenter de mieux comprendre le rôle du RD, dans l'activité

motrice du primate et également d'affiner nos connaissances sur le rôle des différentes

structures motrices étudiées.

Non seulement les ODNs antisens son* de bons outils expérimentaux, mais ils

possèdent également un important potentiel en tant qu'agents thérapeutiques pour des

maladies neurodégénératives ou neuropsychiques-

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