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Thérapies issues de la connaissance des gènes : essor d’une discipline nouvelle aux
facettes multiples Serge Braun, PharmD, PhD
Directeur scientifique
1866
Lois de l’hérédité (G. Mendel)
1906 1909 1911
« Génétique » (W. Bateson) « Gènes » (W. Johannsen) Gènes portés par les chromosomes (T. Morgan)
1944 1947
« Thérapie génique » (C.E. Keeler; J Hered.)
1932
Gènes transférés par l’acide nucléique: « correction génétique » (O. Avery)
« Ingénierie génétique » (6th International Congress of Genetics)
1866
Lois de l’hérédité (G. Mendel)
1953
Années 60-70
Etablissement des bases de génétique moléculaire: - code génétique - isolement, conception, synthèse et transfert de gènes dans les bactéries, puis les cellules animales et humaines - technologie de l’ADN recombinant avec systèmes de sélection
Joshua Lederberg (Biological future of man . In: Wolstenholme G , ed. Man and his future. London: J & A Churchill. 1963; p263-273)
Double hélice (Watson et Crick)
1932
« Ingénierie génétique » (6th International Congress of Genetics)
Gènes transférés par l’acide nucléique: « correction génétique » (O. Avery)
« Thérapie génique » (K.E. Keeler)
Rétrovirus / Lentivirus AAV, Adénovirus Non-viral
- S’intègre
- Efficace
- Risque de rejet anti-vecteur
(et anti-transgène ?)
- Taille des séquences
- Production à grande échelle
- Peut persister
- Ne s’intègre pas (?)
- Efficace
- Risque de rejet
- Taille des séquences
- Production
à grande échelle
- Peut persister
- Ne s’intègre pas (?)
- Larges séquences
- Pas de réponse
anti-ADN
- Peu efficace
Exemples de Vecteurs
RaboralTM
Glycoprotéine rabique
Virus de la vaccine modifié
transgene Une thérapie génique à grande échelle: Vaccination orale antirabique de la faune sauvage
1970: Stanfield Rogers (Univ Tennessee) - Deux soeurs avec déficit en arginase - Virus du papillome de Shope
1980: Martin Cline (UCLA), β-thalassémie - 2 patientes - Plasmide-β-globin-HSVtk
Transfert du gène sain
Cellules souchesde la moelle osseuse
Rétrovirus
Réinjection
des cellules
corrigées
Transfert du gène sain
Cellules souchesde la moelle osseuse
Rétrovirus
Réinjection
des cellules
corrigées
Controverses scientifiques, de procédures et éthiques recommandations et règlementations
spécifiques
Plasmide
Premières tentatives de thérapie génique chez l’Homme
1990: William French Anderson (NIH) - 1 patiente ADA-SCID - Rétrovirus-ADA
Aleyna,
ADA-SCID
Guérie par
thérapie
génique
Transfert du gène sain
Cellules souchesde la moelle osseuse
Rétrovirus
Réinjection
des cellules
corrigées
Transfert du gène sain
Cellules souchesde la moelle osseuse
Rétrovirus
Réinjection
des cellules
corrigées
(Thérapie génique ex vivo)
Premières preuves de principe
Les premières AMM
• Administration locale, ex-vivo, systémique • Expression court/long terme
AAV-LPL (1M$)
Gendicine®, Oncorine® Ad5-p53 (360$)
2000 essais / 4500 patients
33 10 12
39
11 7 5 9
Ginn et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 – an Update J Gene Med 2013; 15: 65–77
Indications
Forme précoce de rétinite pigmentaire
Vision réduite, notamment en lumière faible
RPE65 identifié en 1997
Sain
RPE-/-
Amaurose Congénitale de Leber
hRPE65 huRpe65 Poly A ITR ITR
OS
IS
ONL
RPE c b a
Chien non traité Chien traité Chien sain
rAAV-2/5
rAAV-2/4
Thérapie génique AAV4-RPE65
(administration locale)
hRPE65 human rpe65 Poly AITR ITR
Fabienne ROLLING,
CHU de Nantes,
Laboratoire de
thérapie génique,
Inserm U649
Expression de dopamine, potentialisant la thérapie par la L-DOPA
IRES SIN LTR
TH CH1 AADC CMVp
IRES
Tyrosine
Hydroxylase(TH)
L-DOPA
Dopamine
L-Tyrosine
GTP-
Cyclohydrolase 1(CH1)
BH4
L-aminoacide
aromatique
décarboxylase
(AADC)
Lésion 6-OHDA
Contrôle
Lentivirus équin EIAV pour le traitement de la maladie de Parkinson
Chirurgie de l’ADN: forme ultime de thérapie génique
Nucléase
Coupure double-brin
Réparation de l’ADN
Applications : Activation / inactivation
de gènes
Recombinaison homologue
• Invalidation • Insertion ou remplacement • Correction
Nucléases à doigts de zinc
Nat Meth 9 (1) 2012 - Urnov et al., Nat. Rev. Genet 2010
• Domaines de liaison à l’ADN trouvés dans facteurs de transcription des eukaryotes
• 1 codon / 1 Zinc finger
• Séquences cibles riches en G = 18-36 nt
• Fusion avec domaine nuclease de FokI
• Optimisation :
de l’interface de dimérisation
de l’interface entre Zn finger
des espaceurs
• Sigma, Sangamo, plateformes OPEN ou CoDA
Nucléases à doigts de Zinc - Clinique
• Glioblastome
- Inactivation du récepteur aux glucocorticoïdes dans LT CD8+
- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; déc. 2012
• (Neuropathie diabétique)
• SIDA
- Mutation CCR5D32 chez les patients résistants aux HIV
- Efficacité des ZFNs: >50 % dans LT CD4+
- Spécificité des ZFNs: pas d’activité sur CCR2 - off-target = 1/20000
- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; jan. 2013
Avantages
• Tout type de correction
• Correction non aléatoire
• Conservation du promoteur natif du gène d’intérêt
• Plusieurs plateformes disponibles
Inconvénients
• Faible fréquence de recombinaison homologue
• Exclue pour les cellules quiescentes
• Vectorisation nécessaire
• Spécificité - génotoxicité
Chirurgie des génomes basée sur les nucléases
Méganucléases, ZFP, TALEN, CRISPR
Régulation de gènes et
de l’ARN: un rôle clé
de « l’ADN poubelle »
Exons
ADN non codant unique
Types de séquences d’ADN dans le génome humain
ADN répétitif
Introns et séquences régulatrices
ADN répétitif non apparenté aux éléments transposables
L’interférence à ARN
ADN
ARNm
Oligonucléotides antisens
Ribozyme
miARN / siARN
Blocage de la transcription
Protéine
Interférence par ARN
(C. Mello et A.Z. Fire, Nobel 2006)
ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante
siARN: une nouvelle classe de nutriments !
Blocage de la traduction
+ Chalcone synthase (R. Jorgensen, 1990)
siARN: small interfering RNA ou petit ARN interférent miARNm: micro ARN (qui comprennent les ARNst pour petits ARN temporaires) snoARN: small nucleolar RNA ou petit ARN nucléolaire snARN: small nuclear RNA ou petit ARN nucléaire circARN: ARN circulaire piARN: PIWI-RNA rasiARN: repeat-associated small interfering stARN: small temporal RNA snmARN: small non-mRNA 21-U ARN Mirtrons: pré-miARNs localisés dans les introns de différents gènes
ARN codants ARN non codants
ARNm
ARN transcriptionnels
ARNr ARNt
petits ARN
siARN, miARN, snoARN, snARN, circARN, piARN, rasiARN, stARN, snmARN,…
Le monde des petits ARN
L’interférence à ARN
ADN
ARNm
Oligonucléotides antisens
Ribozyme
siARN (db) / miARN (sb)
Blocage de la traduction
Protéine
ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante
Blocage de la traduction
Thérapies par modulation de l’ARN
Pathologie Gène cible Agent thérapeutiqueStade de
développement
b-thalassémie HBB molécule trans-épissage clones minigènes Alzheimer/Taupathies MAPT molécule trans-épissagelignées cellulaires
Cancer BRCA1, PTCH1oligos antisens clones minigènes oligos antisens, molécule
Mucoviscidose CFTR U1snARN clones minigènes Cancer BCL2L1, FGFR1, oligos antisens souris
Duchenne dystrophine oligos antisens chien GRMD MDM2, MCL1 lignées cellulaires
Hémophilie Fact IX, VII U1snARN clones minigènes multiple molécules lignées cellulaires
Fanconi FANCC U1snARN cellules de patients Amyotrophie spinale infant.SMN2 oligos antisens, molécule Phase I-IIIRétinites pigmentaires Rho, RPGR U1snARN cellules de patients
Alzheimer BACE1, muAPP oligos antisens lignées cellulaires, souris
b-thalassémie HBB oligos antisens souris SOD1 oligos antisens Phase I
Cancer BRCA2 oligos antisens clones minigènes Cancer CDKNA, MYC molécules Phase I
Insuf. congénitale surrén.CYP11A oligos antisens clones minigènes BCL2, TGF b ,custérine oligos antisens Phase III
Mucoviscidose CFTR oligos antisens, molécule cellules de patients
eIF-4E, RNR, Akt-1,
survivine oligos antisens Phase I, Phase IIDuchenne dystrophine oligos antisens cellules de patients ERBB2, SRA1,TERT, oligos antisens lignées cellulairesDystrophie de Fukuyama FKTN oligos antisens souris STAT3 oligos antisens sourisInsuffisance en GH GHR oligos antisens clones minigènes VEGF+kinésine, dsARN Phase II
Progeria (HGPS) LMNA oligos antisens souris DMLA IRS-1, kinase C-Raf oligos antisens Phase III, Phase IDystrophie myotonique DMPK oligos antisens souris REDD-1, RTP801 dsARN Phase IINeurofibromatose NF1 oligos antisens cellules de patients Hyperlipidémie familia. APOB oligos antisens Mipomersen/KinamroNiemann-Pick C NPC1 oligos antisens cellules de patients Asthme, colite IL4/5RA,+CCR3, ICAM-1 oligos antisens Phase I, Phase IIUsher USH1C oligos antisens souris Rétinite à CMV IE2 oligos antisens Fomiversen/Vitravene
Chorée de Huntington HTT oligos antisens sourisCancer BRCA1 oligos antisens cellules de patients Sclérose en plaques CD49D oligos antisens Phase II
Neurofibromatose NF1 molécule cellules de patients Diabète de type II PTP1B, GLP-1R, SGLT1 oligos antisens Phase II, Phase I
Albinisme oculaire de type1GRP143 oligos antisens cellules de patients Myasthénie AChE oligos antisens Phase II
Albinisme oculaire I GRP143 oligos antisens cellules de patients
Myopathie de Duchenne dystrophine oligos antisens 2'OM Phase III HCV miRNA122 oligos antisens Phase I
oligos antisens Morpholino Phase II Œdème maculaire diabét. VEGF siARN Phase II
Epidermolyse bulleuse COL7A1 oligos antisens cellules de patients
Myopathie de Myoshi DYSF oligos antisens cellules de patients Myopathie de Duchenne dystrophine Molécule Ataluren
TRANSLECTURE DE CODONS STOP
CORRECTION D'EPISSAGES ABERRANTS
Dérégulation de l'épissage alternatif
Saut d'exon
Mutations d'épissage
Sites cryptiques d'épissage
Séquences régulatrices
INVALIDATION DE L'EXPRESSION DE GENES (+/- RNase H)
Duchenne : • Degénérescence musculaire progressive • Atteinte centrale (30%) • Atteintes des muscles lisses, cardiomyopathie • Diagnostic: 16 mois- 8 ans Dystrophie musculaire de Becker: plus tardive, moins marquée
J Neuropathol Exp Neurol. 2009;68:762-73
Dystrophin
Sain DMD
Domaine de liaison à l’actine Hinge C-terminale
Domaine riche en Cystéine Motifs répétés Spectrine-like
Dystrophine
51 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52
50 51, 51-53, 51-55
45 12-44, 18-44, 44, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, 46-55
53 10-52, 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 52
44 10-43, 19-43, 30-43, 35-43, 36-43, 40-43, 42-43, 45, 45-54
8 4-7, 5-7, 6-7, 3-7,
55 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 52-54, 54, 56, 56-62
7 2-6,8-11, 8-17, 8-43, 8-45
52 53, 53-55, 53-57, 53-59, 53-60
17 12-16, 18, 18-20, 18-22, 18-25, 18-27, 18-29, 18-33, 18-36,
Exon sauté Délétions ou exons réparés
18-38, 18-41, 18-44
Drisapersen: FDA « breakthrough therapy » 27/06/13)
Implications dans : - Cancer - Maladies autoimmunes - Maladies mentales - Maladies cardiovasculaires - Diabète
Structure de la chromatine
Méthylation De l’ADN
Mécanismes épigénétiques; rôle dans: le développement, l’évolution effets de facteurs environnementaux vieillissement
Modifications des histones
ZolinzaTM
• Thérapie génique • « Chirurgie » de l’ADN • Modulation de la transcription, saut d’exon • Régulation des ARNm • Modulation de la traduction • Epigénétique • Pharmacogénomique
Supposent une connaissance précise des caractères génétiques des individus Génotypage, séquençage à très haut-débit Médecine personnalisée
Thérapies issues de la connaissance des gènes : essor d’une discipline nouvelle aux facettes multiples
Marché ARNi: 2010: 7 Mds $ 2015: >24 Mds $
Comprendre la structure des génomes
Comprendre la biologie des génomes
Comprendre la biologie de la maladie
Innovations thérapeutiques
Améliorer l’efficacité de la prise en charge
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