Intéractions Moléculaires Puces ACTivités

Jeudi 29 mars 2012 à Lorient

Pierre Weigel & Cathy Charlier

http://www.impact-plateforme.com

5 axes technologiques, 20 plates-formes technologiques

Mer

Agro

Santé

Bio-informatique

Le réseau Biogenouest

4 domaines d'activité : plus de 50 unités de recherche

• Réseau de 20 plates-formes en sciences du vivant du Grand Ouest Régions Bretagne et Pays de la Loire - regroupées en 5 axes :

Génomique (Séquençage/Génotypage, Transcriptome)

Protéome Exploration fonctionnelle

Bio-informatique Analyse structurale et métabolome • Soutiens Régions Bretagne et Pays de la Loire, du Ministère de la Recherche et de l'Union Européenne

• Partenariats

Grands organismes de recherche : Afssa, CNRS, Ifremer, Inra, Inria, Inserm 5 universités de l’Ouest Pôles de compétitivité bretons et ligériens : Atlantic Biotherapies, Pôle Mer Bretagne, Valorial et

Végépolys Organismes associés (CHU, grandes écoles...)

50 unités de recherche (2000 personnes) 800 chercheurs et enseignants-chercheurs

Biogenouest (anciennement OUEST-genopole/OGP)

Nantes

Angers

Rennes

Axe Protéomique

Animateur : Charles Pineau

Identification–Caractérisation à haut débit Charles Pineau

Développement d’anticorps monoclonaux (PADAM)

Hugues Gascan

Interactions moléculaires puces activités (IMPACT)

Yannick Jacques et Pierre Weigel

Intéractions Moléculaires Puces ACTivités

Etude de la fonctionnalité des protéines dans la cellule Modulation/régulation des réseaux d'interactions protéiques Technologies de pointe complémentaires

Etude globale des interactions moléculaires Du criblage à haut débit jusqu'à leur caractérisation Analyse structure-fonction des interactions Par un ensemble d'approches biophysiques

Interactomique

Recherche de profils d’interaction, de motifs de signalisation, d’activité fonctionnelle.

Recherche de cibles

Recherche de modulateurs

Interactomique

Positionnement / expertise de la plateforme

Caractérisation des interactions moléculaires/mécanismes

Analyse des réseaux d'interactions

Protéom

ique

Valider Moduler

Positionnement / expertise de la plateforme

Découvrir

Interactions moléculaires

Découvrir

de nouvelles interactions protéiques

Profiling et screening haut débit: In vitro, extraits cellulaires procaryote/eucaryote,

tissus animaux et végétaux.

Puces à protéines et à petites molécules HTRF-BRET, SPR-i

Valider Moduler

Positionnement / expertise de la plateforme

Découvrir

Valider

de nouvelles interactions protéiques

Caractérisation des paramètres thermodynamiques, stoëchiométriques, conformationnels, fonctionnels.

SPR, microcalorimétrie, dichroïsme circulaire,

fluorescence et anisotropie de fluorescence

Moduler

Positionnement / expertise de la plateforme

Valider

Moduler des interactions protéiques et leur fonctionnalité

Identification de nouveaux outils de recherche,

pharmacologiques et thérapeutiques.

Screening à haut débit : puces à petites molécules chimiques antagonistes, SPR-i, HTRF-BRET

Découvrir

Positionnement / expertise de la plateforme

1.L’étude des interactions protéine-protéine, antigène-anticorps, protéine-acide nucléique, protéine-glycosides, protéine-ligand chimique…

2.L’étude des modifications post traductionnelles (phosphorylation, acétylation…).

3.La dérégulation des voies de signalisation.

4.L’étude du profil d’expression de protéines, de leurs activités.

5.La recherche de biomarqueurs et de cibles d’intérêt.

6.Le développement de tests de spécificité et d’outils diagnostiques.

7.Le criblage de biomolécules d’intérêt pharmacologique, thérapeutique, agroalimentaire, etc.

Champs d’application de la plateforme

38 projets en cours 50% dédiés à des programmes de

recherche sur le cancer . - 20% projets internes - 60% collaborations - 20 % R&D 14 publications, 6 brevets (4

européens, 1 USA ,1 France).

Positionnement et projets en cours

Projets européens, nationaux et régionaux: Labex IRON et Labex IGO, INCA, ARC, 4 ANR, CIMATH2 “Ciblage moléculaire

et applications thérapeutiques”, AFM, TARCC project, SIRIC project (Integrated Cancer Research Center)

Partenaires industriels: Jasco, Polyintell, TLC Pharma, Cytune Pharma, Atlantic bone Screen Etroite collaboration avec Protneteomix et Affilogic, Financement de 2 programmes majeurs par Servier et Chemveda Life Sciences :

criblage d’agents thérapeutiques potentiels pour le traitement du cancer. Membre du “VWR national tour” en 2011 et 2012 Membre de réseaux : GDR CNRS 3260 ACCITH “Anticorps et Ciblage thérapeutique”, GDR CNRS 3056 “Criblage de petites molécules” Sharebiotech En voie d’intégrer le réseau national « chemical biology » et le réseau européen

ESFRI EU-OPENSCREEN.

Positionnement et projets en cours

Équipements de la PF

Puces à Protéines et technologie de criblage

Équipements d'analyses biophysiques

Spotteurs Scanners

BioRobot (Qiagen) Station Agilent

(Electrophorèse Microcapillaires)

Microcalorimètre Dichroisme circulaire

Fluorescence, spectroscopie UV-Vis Anisotropie de Fluorescence

Plateau HTRF, BRET, FRET

BIACORE (2000, 3000, SPR-i)

Synthétiseur de peptides

Répartitions des équipements - 1,5 M€ - sur les deux sites….

Technologie des puces à protéines

Détection :

Fluorescence (visible ou proche

infrarouge)

Sondes marquées Protéine, ADN, Anticorps…

Interaction

Protéines

• Systèmes de dépôt manuels ou automatiques des échantillons (Spotteurs)

MicroCaster Microarrayer

System (WHATMAN)

GMS 417 Arrayer

(Aviso) sciFLEXARRAYER S3

(Scienion)

• Détection des interactions par fluorescence, deux types de scanners

ScanArray GX

(Perkinelmer) LI-COR d’Odyssey

(Infrared Imaging System)

• 2 types d’expérimentations

– Conception & Fabrication de puces à façon de puces à protéines, à anticorps,

à antigènes, à peptides, en phase directe ou reverse – Utilisation de puces commerciales (Invitrogen, Sigma, R&D, Protneteomix…)

Approches biophysiques pour l’étude

des interactions biomoléculaires

• Détermination structurale de macromolécules: protéines,

peptides, ADN

• Stabilité et Analyses de la dénaturation Thermique et

chimique

• Evaluation de la pureté de substances optiquement active

• Détermination de l’affinité ligand/protéin peptide/protéine,

ADN/Protéine

• Données thermodynamiques (Kd, enthalpie, entropie)

• Criblage haut débit

Spectropolarimètre J-810 Dichroïsme Circulaire et linéaire

Spectrofluorimètre FP-6500 Fluorescence

Spectromètre UV-530 Absorbance UV-Vis

Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715

Microcalorimètre ITC

Mithras LB940 HTRF / BRET / FRET / AF Biacore 3000 & 2000

Résonance plasmmonique de surface (SPR) et SPRI

La PF dispose également d’un synthétiseur de peptides (INTAVIS)

1. Rendez-vous de faisabilité • Définition avec l’équipe demandeuse de la stratégie et des objectifs du projet

Initiation d’une prestation collaborative

2. Partie expérimentale • Disponibilité des biomolécules cibles ou des extraits

• Définition des tampons d’interactions et de lavages

• Disponibilité des sondes marquées pour la détection (AC, protéines, ligands…)

• Critères de détection

• Analyse résultats

• Système d’exploitation des résultats

3. Définition de la prestation

Approche à haut débit par la technologie des puces à protéines et plateau MITHRAS

Approches biophysiques pour l’étude des interactions biomoléculaires

1. Prestation R&D – projet collaboratif

2. Activité d’expertise

3. Prestation « libre service »

Protocole d’accès

Fiche projet

Protocoles

Réservation

Tarification

18

Approches biophysiques pour l’étude des interactions moléculaires Site UFR ST

Fluorescence

Anisotropie de fluorescence

Dichroïsme Linéaire et Circulaire

Microcalorimètrie

Etude des différentes étapes de la recombinaison homologue Régulation transcriptionnelle/Promoteur fort

Inhibition d’une activité enzymatique

1. Dénaturation d’une protéine 2. Détermination des sites d’interaction monomère-monomère dans le filament Rad51 3. Sondes des surfaces des protéines 4. Etude de l’inhibition de rad 51 5. Transfert d’énergie de fluorescence (FRET)

Approches biophysiques pour l’étude des interactions moléculaires Application de la fluorescence

Marqueurs fluorescents intrinsèques des protéines

CH2

CHH2N COOH

Phenylalanine

Tryptophane

Tyrosine

CH2

CHH2N COOH

OH

N

COOHH2N CH

CH2

H

280 295

Fluorescence de trp = 90% fluorescence des protéines

Réparation des CDBs de l’ADN par Recombinaison Homologue

apparition CBD

digestion nucléolytique

Formation du nucléofilament = autoassociation de Rad51 sur ADNsb

échange de brin

réparation fidèle de l’ADN

Rad51 Co-facteurs (BRCA2)

Localisation des sites d’interaction

Monomère - monomère

HsRad 51

M A M Q M Q L E A N A D T S V E E E S F G P Q P I S R L E Q C G I N A N

D V K K L E E A G F H T V E A V A Y A P K K E L I N I K G I S E A K A D

K I L A E A A K L V P M G F T T A T E F H Q R R S E I I Q I T T G S K E

L D K L L Q G G I E T G S I T E M F G E F R T G K T Q I C H T L A V T C

Q L P I D R G G G E G K A M Y I D T E G T F R P E R L L A V A E R Y G L

S G S D V L D N V A Y A R A F N T D H Q T Q L L Y Q A S A M M V E S R Y

A L L I V D S A T A L Y R T D Y S G R G E L S A R Q M H L A R F L R M L

L R L A D E F G V A V V I T N Q V V A Q V D G A A M F A A D P K K P I G

G N I I A H A S T T R L Y L R K G R G E T R I C Q I Y D S P C L P E A E

A M F A I N A D G V G D A K D

Séquence primaire de Rad51 humaine (Hs Rad51)

Longueur d’onde (nm)

IF

1.0 -

0.5 -

0 - 350 400 300

Trp enfoui Trp exposé

Dissociation

Polymérisation

Analyses de Mutants

Rad51 ne contient pas de tryptophane

Identification des interfaces impliqués

dans l’auto-association de Rad51

Insertion Trp = sonde fluorescente

Conilleau S., et al, J. Mol. Biol., 2004, 339, 797-804.

Selmane T. et al. J. Mol. Biol., 2004, 335, 895-904.

Etude de la dissociation du filament Rad51- ADN par des inhibiteurs

(Ex. 320nm – Emission 400nm)

PolydεA + Rad51 [ polydεA- Rad51] Fluorescence

PolydεA + Rad51 + inhibiteur

[inhibiteur- Rad51] + polydεA Fluorescence

Un inhibiteur nucléique : aptamères « ADNsb »

Un inhibiteur peptidique : peptide BRC4 Etude de 2 inhibiteurs

Spectre d’émission

[polydεA- Rad51]

+ aptamère

24

Dissociation du filament Rad51-ADN en présence d’aptamères

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Co

mp

lexe H

sR

ad

51/A

DN

(%

)

BRC4-28 (µM)

Mesure de la fluorescence du poly(deA) Dissociation du filament Rad51-ADN en présence du peptide BRC4

Nomme et al. Genes to Cells (2008) 13, 471-481

IC50 = 2,2 µM

HsRad51: 1,5 µM / poly(deA) : 3,0 µM / 1 mM ATP

Co

mp

lexe

Ra

d5

1-A

DN

(%

)

1. Suivi de cinétique de l’hélicase

2. Interaction Rad51/peptide BRC4 3. De la fonctionnalité sous unité alpha de l’ARN Polymérase 4. De l’effet d’inhibiteurs potentiels 5. Transfert d’énergie de fluorescence (FRET)

Anisotropie de fluorescence

C-ter

N-ter

Interaction Rad51-peptide

Peptide 28aa

Peptide 13aa

Peptide 15aa

Conservation de la structure tenaille du peptide 28aa

Peptides marqués par FITC

BRC4-FITC : 0,2 µM / ATP : 1 mM

Anisotropie de fluorescence

Etude de la liaison spécifique du peptide BRC4-FITC à HsRad51 A

nis

otr

op

ie (

UI)

Concentration en protéine (µM)

Nomme et al. Genes to Cells (2008) 13, 471-481

(Kd : 100 nM)

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

HsRad51

RecA

DMC1

Dichroisme circulaire

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

200 210 220 230 240 250 260

Rad51

Rad51 + aptamère T 15min

Rad51 + aptamère T 30min

Longueur d’onde (nm)

CD

(m

de

g)

Dichroïsme circulaire

Etude de la structure de Rad51 libre ou liée à l’ADNsb

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

220 240 260 280 300 320 340

CD

[m

deg

]

A79

Longueur d’onde (nm) -20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

220 240 260 280 300 320 340

CD

[m

deg

]

A30

Longueur d’onde (nm)

Structure des aptamères

20°C

80°C

Présence de structure dans les aptamères étudiés

Dichroïsme circulaire (CD)

Bande + à 275 nm et bande – à 240 nm

Présence de G-quartet?

Forte ressemblance avec des spectres CD de G-quartet

32

-10

0

10

20

CD

(m

deg

)

200 220 240 260 280

Wavelength (nm)

(a)

60

70

80

90

100

Tm

(

°C)

0 2 4 6 8 10

[Urea] (M)

(b)

Analyse du répresseur ArgR de T. neapolitana par dichroïsme circulaire

33

Microcalorimètre à Titration Isotherme - Auto ITC200

Etude des interactions entre biomolécules en solution

Protéine / Protéine

Protéine / ADN

Protéine / petites molécules

Anticorps / Antigène

Drogue / cible

Enzyme / inhibiteur

Mesure la quantité de chaleur qui est générée ou absorbée

lors de l’interaction entre 2 biomolécules

Paramètres thermodynamiques ( G, H, et S) et affinité de la réaction (Kd)

Pas d’étape de marquage

La calorimétrie pour caractériser les interactions entre 2 biomolécules

Microcalorimètre à Titration Isotherme Auto ITC200

ΔG = −RT lnKa 34

Thermogramme

= données brutes

Courbe de titration du ligand

= données intégrées

µcal/s µcal/mol ligand injecté

[Ligand]/[Biomol]

Constante d’affinité

Stoechiométrie (n) = nb site de fixation

Enthalpie H

ΔG = ΔH − TΔS

Auto ITC200 : exemple d’application

35

interaction enzyme BCA (bovine carbonic anhydrase II) + 2 types d’inhibiteurs

détermination des paramètres thermodynamiques

H1 H2

affinité

similaire

Affinité similaire pour les 2 inhibiteurs mais mécanisme d’interaction différent

E + I EI

ΔG = −RT lnKa

ΔG = ΔH − TΔS

Microcal Life Sciences, 2011

ITC : interactions entre 2 molécules en solution

Affinité et stœchiométrie de l’interaction

mécanisme de l’interaction: enthalpie et entropie de la réaction

Applications:

Protéine / Protéine

Protéine / ADN

Protéine / petites molécules

Anticorps / Antigène

Drogue / cible

Enzyme / inhibiteur

36

Microcalorimètre à Titration Isotherme Auto ITC200

Accès à la plateforme IMPACT

Contacts - Responsables techniques

Site de l’UFR Sciences et techniques

Cathy CHARLIER, IE

cathy.charlier@univ-nantes.fr UMR CNRS 6204

Faculté des Sciences et des Techniques

2, rue de la Houssinière BP 92208 - 44322 NANTES Cedex 3 FRANCE

Tél : +33 (0)2 51 12 56 21

Site du Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA)

Mike MAILLASSON, IE

Mike.Maillasson@univ-nantes.fr Institut de Recherche Thérapeutique 1

8, quai Moncousu BP 70721 - 44007 NANTES Cedex 1

Tel: (33) (0)2.28.08.03.79

(33) (0)2.28.08.03.78 (lab) http://www.impact-plateforme.com

FIN