Plant Science Letters, 7 (1976) 381--390 381 © Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam -- Printed in The Netherlands

INTERACTION DES IONS ARGENT AVEC L'ADN NUCLEAIRE DE C H L O R E L L A P Y R E N O I D O S A

JACQUES DALMON et MARCEL BAYEN* Laboratoire de Biologic V~g~tale, D~partement de Recherche Fondamentale, Centre d'Etudes Nucl~aires 85X, 38041 Grenoble-C~dex, et *Laboratoire de Biologie Mol~culaire V~g~tale, Universitd de ParisoSud (Centre d'Orsay), Bt. 430, 91405 Orsay (France) (France)

(Requ le 30 avril 1976) (Accept~ le 25 mai 1976)

SUMMARY

In teract ion o f A g ÷ ions wi th Ch, orella pyrenoidosa nuclear D N A When centrifuged in Ag+-Cs:SO4 gradients, Chlorella pyrenoidosa (strain

211/8b and strain Emerson) nuclear DNA exhibits a satellite, the density of which is heavier than that of the main band.

The presence and the buoyant density of this satellite strongly depend on pH and molar ratio : Ag÷/DNA-P (rf) of the DNA solution. The binding of Ag ÷ ions on the heavy satellite occurs from the lower rf. It is quite unaffected by previous chelating agent treatment of the DNA solutions or by purification on hydroxyapatite columns. After removing of bound Ag+ ions, the densities of the heavy satellite DNA and main band DNA return to the native DNA density in CsC1 gradient.

INTRODUCTION

Certains ions m~tailiques poss~dent la propri~t~ de se fixer sur les chaines de rADN. Parmi ces ions, les ions Ag ÷ [1] et Hg ~÷ [2] forment avec I'ADN natif des complexes dont la densit~ en gradient Cs2SO4 est beaucoup plus ~lev~e que celle de rADN natif. G~n~raiement les propri~t~s de fixation de ces ions sont diff~rentes le long de la molecule d'ADN. La centrifugation en gradient de densit~ de Cs2SO4 des complexes form& entrahe la s~pamtion de bandes satellites dont la densit~ est plus ~lev~e (satellite lourd) ou plus faible (satellite l~ger) que celle de la bande principale, selon que les sites de fixation ont capt~ plus ou moins d'ions.

De tels satellites ont ~t~ mis en ~vidence ~ partir des ADN nucl~aires d'animaux [3--19], de v~g~taux sup~rieurs [20--23], de levure [24] et de dinoflagell~ [25].

382

L'analyse de ces sites est int6ressante dans la mesure o/1 elle apporte des renseignements suppl6mentaires sur la structure d 'un ADN comme I'ADN nucl6aire de Chlorella pyrenoidosa (souche 211/8b et souche Emerson), dont l'h6t6rog6n6it6 a d6j~ 6t6 6tudi6e par d'autres m6thodes [ 26,27]. Dans ce rapport nous exposons et comparons les caract6ristiques de la fixation des ions Ag ÷ sur I 'ADN nucl6aire de ces deux souches d'algue.

MATERIEL ET METHODES

Le mat6riel utilis6 est l'algue unicellulaire Chlorella pyrenoidosa (souche Emerson fournie par le laboratoire de Photosynth6se, Gif sur Yvette, France, et souche 211/8b fournie par l 'algoth6que de l'Universit6 de GSttingen, Allemagne). Les techniques de culture des algues [28--29] et d 'extract ion et de purification de I 'ADN [26,30--31] ont 6t6 d6crites pr6c6demment. L'ab- sence de contaminat ion bact6rienne a 6t6 syst6matiquement v6rifi6e par obser- vation microscopique et par ensemencement sur milieu de culture bact6rien.

Centrifugation analytique en gradient de Cs2S04 Avant la fixation des ions Ag ÷, les solutions d 'ADN sont dialys~es contre

plusieurs bains de solution de Na2SO4 0.1 M. Chaque ~chantillon ~ analyser cont ient environ 20 ~ 25/~g d 'ADN en solu-

tion dans 0.5 ml de Na2SO4 0.1 M puis AgNO3, 10 -3 M e n quantitd suffisante pour obtenir le rf d~sir~ (rf: rapport molaire Ag÷/DNA-phosphore) et enfin du tampon borate pour ajuster le pH ~ la valeur d~sir~e. Du Cs2SO4 (Merck, Suprapur) est ensuite ajout~ au m~lange afin d 'amener son indice de r~frac- tion ~ des valeurs comprises entre 1.375 et 1.389, selon le rf choisi, ce qui correspond ~ des densit~s de f lot tat ion moyenne de I 'ADN principal comprises entre 1.512 et 1.704 g/ml.

Les ~chantillons sont ensuite centrifuges dans une ultracentrifugeuse Spinco module E, ~ 44000 rpm, ~ 25°C et pendant 20 h. Les densit~s de f lot tat ion des ADN sont calcul~es ~ partir de la densit~ finale du m~lange et de la distance de la bande consid~r~e au milieu du gradient [32]. La precision des mesures est de + 0.008 g/ml, ~tant donn~ la difficult~ avec laquelle le rapport molaire rf est ~tabli et l 'impossibilit6 d 'a jouter un ADN marqueur.

RESULTATS ET DISCUSSION

Comme le montrent les trac~s densitom~triques de la Fig. 1, les ADN nucl~aires extraits des deux souches de Chlorella ne pr~sentent aucune con- tamination par les autres ADN (dans les limites de d~tection de la m~thode). Etant donn~ la precision des mesures de densit6 en gradient de Cs2SO4, les valeurs obtenues pour les deux souches sont identiques, alors qu 'en gradient de CsCI, une difference significative existe entre les deux souches.

383

souche EMERSON

CsC!

1.142 1.7'1e

c== so,

1,418

souche 211-8b

1.742

CsCI

1.709

c,~so,

1,423

4 DENSITE(g/ml )

Fig. 1. Trac~s densitomi~triques (apr~s ultracentrifugation analytique en gradient de CsC1 ou de Cs2SO4) des ADN nuci(mires des souches Emerson et 211/8b de ChloreUa pyrenoidosa Le marqueur est I 'ADN du phage • E (densit~ 1.742 g/ml).

(a) Fixation des ions Ag ÷ La centrifugation en gradient de Cs2SO4 du complexe ADN nucl~aire-ions

Ag ÷ (rf = 0.3 et pH 9.2) met en ~vidence une bande principale (densit~s de 1.502 et 1.482 g/ml pour les souches Emerson et 211/8b respectivement) et une bande satellite de densit~ plus ~lev~e (densit~s de 1.561 et 1.510 g/ml pour les souches Emerson et 211/8b respectivement) (Fig. 2). En outre il appara~t aussi quelquefois sur les trac~s densitom~triques une bande satellite de densit~ plus faible que celle de la bande principale (visible dans le cas de la souche Emerson, sur la Fig. 2).

En presence d'ions Ag ÷, les densit~s de flottation des ADN des deux souches, en gradient de Cs2SO4, montrent une difference semblable ~ celle obtenue pour les densit~s de flottation en gradient de CsCI: les densit~s sont plus ~lev~es pour la souche Emerson que pour la souche 211/8b. La m~me difference est observ~e pour la bande principale et pour le satellite lourd. C'est I'ADN le plus riche en paires dG:dC (souche Emerson) qui a la densit~ la plus ~lev~e et qui a donc fix~ une plus grande quantit~ d'ions Ag÷: ce r~sultat est en accord avec le principe propos~ par Jensen et Davidson [1] selon lesquels la fixation des ions Ag ÷ augmenterait avec la teneur en dG:dC des ADN.

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souche IFMI:RSON souche 211 8b

C~ C~

1;561 1.502 1.5~10 1482

I t DENSITE ( g / m l )

Fig. 2. Trac6s densitom6triques (apr~s ultracentrifugation analytique en gradient de Cs~SO, et en pr6sence des ions Ag +, rf = 0.3, ~ pH 9.2) des ADN nucl6aires des souches Emerson et 211/8b de Chlorella pyrenoidosa.

De tels satellites ont aussi 6t6 obtenus par fixation des ions Ag ÷ sur des ADN nucl6aires de v6g6taux sup6rieurs [20--24] et d 'animaux [3,4,6,7,9,14, 16,19 ], sur des ADN mitochondriaux [ 33--35 ] et sur des ADN chloroplastiques [33,36] . Les proport ions d 'ADN isol6 sous forme de satellite lourd varient 6norm6ment selon l'origine de I 'ADN nucl6aire, ce qui pourrait indiquer une certaine h6t6rog6n6it6 de la partie du genome ainsi raise en 6vidence.

(b) Influence du pH Les profils densitom6triques repr6sent~s sur la Fig. 3 montrent que le pH

de la solution agit sur la densit6 des bandes principales et satellites, ainsi que sur l 'apparition et la r6solution des ADN satellites.

La bande satellite lourde n 'apparait qu'~ des pH alcalins (~ partir de 8.3 dans l 'exp6rience pr6sent6e), ce qui confirme les donn6es publi6es par Jensen et Davidson [ 1 ] selon lesquelles la r6action coop6rative entre les ions m6tal- liques et I 'ADN est plus importante ~ pH alcalin qu'~ pH neutre ou acide. La densit6 de la bande satellite et celle de la bande principale varient dans le m~me sens que le pH.

(c) Influence durf Quelque soit la souche de Chlorella, la densit6 de f lot tat ion de la bande

principale en gradient de Cs2SO4-Ag ÷ varie proport ionnel lement au rf, dans l'intervalle des valeurs 0--0.5 (Fig. 4). La pente de la droite correspond ~ une variation de densit6 de 0.150 g/ml pour 0.5 ion Ag ÷ par nucl6otide, dans le cas de la souche Emerson, et de 0.152 g/ml pour 0.5 ion Ag ÷ par nucl6otide, dans le cas de la souche 211/8b. Ces valeurs sont tr6s voisines de celles ob-

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souche EMERSON souche 211-8b

.• . . . . . . ~ pH 7.5

I-

1.550 I

pH I0.0

1.5oo ,~so 1.550 1.500 1.450 I I t

DE NSITE ( g/ml b

Fig. 3. Trac6s densitom6triques (apr~s centrifugation analytique en gradient de Cs,SO4 et en pr6sence des ions Ag ÷, rf ffi 0.3) des ADN nucl6aires des souches Emerson et 211/8b de Chlorella pyrenoidosa. Centrifugations r6alis}es ~ des pH compris entre 7.5 et 10.

tenues avec les ADN de bact~ries et de phages [1], ainsi qu'avec I'ADN nucl6aire principal du thymus de veau [10] et de la souris [12]. Pour des valeurs de rf sup6rieures ~ 0.5, la pente de la courbe diminue progressivement et les valeurs mesur~es montrent une grande dispersion; ce ph6nom~ne a aussi ~t~ observ~ pour les ADN bact~riens [1] et les ADN nucl6aires d 'animaux [121.

L'6tude des variations de densit~ de la bande satellite lourde en fonction du tf n'a pu ~tre faite que pour des rf inf~rieurs ou 6gaux ~ 0.4; au-del~ de cette valeut, la bande satellite s'6tale consid6rablement et se trouve partiellement masqu~e par ]a bande principale. N~anmoins, compte-tenu des r6sultats obtenus pour les faibles rf, il semble que la densit~ du satellite lourd varie de la m~me fa~on que celle de la bande principale.

(d) Traitement par I 'EDTA Afin d'61iminer les ions qui auraient pu interf6rer avec l 'argent lots de la

formation des complexes ADN-Ag ÷, et en particulier entrer en competit ion avec les ions Ag ÷, pour les sites de fixation sur I'ADN, nous avons dialys~, de faqon r~p6t6e, la solution d'ADN nucl6aire contre une solution: EDTA 0,01

386

souche EMERSON souche 211-8b

1,750

1.700

1.650

1+600

1.550

1.500

1.450

1,410

1.750

1.700

1,650+

~ 1.600

Q

1 5 5 0

1,500-

1.450-

1.410 0.5 1 2Rf 3 4

Rf

Fig. 4. In f luence du rf sur la densit~ de f l o t t a t i o n en gradient de Cs2SO4 des A D N nucl~aires des souch es Emerson et 2 1 1 / 8 b de Chlorella pyrenoidosa. • • : A D N de la bande principale; o o : A D N du sate l l i te lourd. Centr i fugat ions r~alis~es ~ pH 9 .2

M + NaC1 0.18 M, pH 8, avant le traitement par les ions Ag +. La Fig. 5B montre le r~sultat obtenu pour I'ADN nucl~aire de la souche 211/8b: le profil densitom~trique ne diff~re pratiquement pas de celui obtenu avec I'ADN nucl~aire non trait~ (Fig. 5A).

L'utilisation d'un agent ch~latant tel que I'EDTA montre que des ions autres que l'argent et presents dans les solutions d'ADN ne semblent pas interfdrer avec le m~canisme de formation des complexes ADN-ions Ag +.

( e ) Traitement par l'h ydroxyapat i te Etant donn6 que les ADN en simple chaine fixent beaucoup plus d'ions

m~talliques que les ADN en double cha~nes [1] , il est apparu ndcessaire de v~rifier si la bande satellite lourde ne r~sulterait pas de la presence de frag- ments en simple charne. Pour cela une solution d'ADN nucldaire de la souche 211 /8b a ~t~ fix~e sur une colonne d'hydroxyapatite, puis 41ude par un tam- pon phosphate 0,15 M, puis 0,5 M, selon la technique pr~c~demment d~crite [27] . L'ADN en double cha~ne, ~lu~ par le tampon phosphate 0.5 M, donne, apr~s fixation des ions Ag + (rf = 0.2) et centrifugation en gradient de Cs2804 un profil densitom$trique (Fig. 5C) sensiblement identique A celui de I'ADN non trait~ (Fig. 5A).

387

o

I

®

®

©

1.s!so ~.5'oo ~.4'so DENSITE(g//ml)

Fig. 5. Trac~s densitom~triques (apr~s ultracentrifugation analytique en gradient de Cs~SO4 et en presence des ions Ag +, rf ffi 0.2, ~ pH 9.2) de I'ADN nucl~aire de la souche 211/8b de Chlorella pyrenoidosa. (A) ADN non traitS; (B) ADN apr~s dialyses contre une solution EDTA 0.01 M + NaCI 0.18 M, pH 8; (C) ADN ~lu~ par le tampon phosphate 0.5 M apr~s fixation sur colonne d~ydroxyapati te et une premiere ~lution par le tampon phosphate 0.15 M.

La bande satellite lourde de I'ADN nucl~aire de Chlorella ne provient donc pas de la prdsence d'ADN en simple cha~ne. N~anmoins il n'est pas exclu que de petits segments en simple cha~ne, intercal~s entre de longs segments en double chatne et dont la petite taille emp~cherait leur dlution des colonnes d'hydroxyapatite avec le tampon phosphate 0.15 M, soient responsables de la formation des satellites lourds. La fixation des ions Ag ÷ sur ces sdquences

0

en simple cha~ne entra£nerait des cassures, lib~rant sous forme d 'une bande satellite de densitd ~lev~e, les r~gions de l 'ADN contenant ces petites zones en simple cha[ne ayant fix~ les ions Ag ÷.

(f) E l iminat ion des ions A g ÷ et eentr i fugat ion en gradient neutre de CsCl Apr~s centrifugation en gradient de Cs2SO4 et en prdsence d'ions Ag + (rf

0.3 et pH 9.2), t ous l e s ADN r~unis sont dialysds de faqon r~p~t~e contre une solution: NaCI, 5 M + Tris HC1, 0.01 M, pH 7, afin d'~liminer les ions Ag +. Apr~s centrifugation en gradient neutre de CsC1, les ADN ne forment plus qu 'une seule bande dont la densit~ est identique ~ celle de I 'ADN nucldaire natif (Fig. 6). Ce r~sultat est ~ rapprocher de ceus obtenus chez d'autres organismes [7,21]. Toutefois les propri~t~s que poss~de I 'ADN satellite lourd de revenir ~ une densit~ identique ~ celle de la bande principale en gradient neutre de CsC1 n'est pas g~n~rale: la densit~ peut ~tre soit plus faible [4,20], soit plus ~lev6e [3,6,23].

i - -

J I

1.742

388

1.710

Densit~ (g/ml)

Fig. 6. Trac~ densitom6trique (apr~s ultracentrifugation analytique en gradient de CsCI) de I'ADN nucl6aire de la souche 211/8b de ChloreUa pyrenoidosa. L'ADN a 6t~ pr~alable- rnent centrifug6 en gradient de Cs2SO4 et en presence des ions Ag +, rf = 0.3, ~ pH 9.2. Les ions Ag + ont 6t6 ensuite 61imin6s par plusieurs dialyses contre une solution NaCI 5 M + Tris--HCl 0.01 M pH 7. Le marqueur est I'ADN du phage • E (densit~ 1.742 g/ml).

L'origine des ADN satellites lourds n'est pas encore connue. Selon Lieber- man [12] , ces satellites pourraient provenir soit de la presence d 'un nombre de sites de fixation des ions Ag ÷ plus ~lev~ que celui de la bande principale, soit d 'une conformat ion particuli~re favorisant la fixation de ces ions. Les sites de fixation des ions Ag ÷ pourraient ainsi ~tre des dim~res ou des trim~res dG:dC [12]. Une autre hypoth~se est que les sites de fixation pourraient ~tre

389

~ga lement des segmen t s en s imple c h a ~ e , ceux-ci f i xan t b e a u c o u p plus d ' i ons que les A D N en d o u b l e cha ine [1 ] . De n o m b r e u s e s obse rva t ions i nd iquen t la p r & e n c e de segmen t s en s imple cha ine dans des molecu le s d ' A D N d 'or ig ines diverses [ 3 7 - - 4 3 ] ; ces segmen t s sera ient s u r t o u t localis~s dans les rdgions r iches en d G : d C [43] .

Le rSle de I ' A D N f o r m a n t la bande satel l i te lou rde avec des ions Ag + en g rad ien t de Cs2SO4 n ' e s t pas connu . N o t o n s c e p e n d a n t que cer ta ins d ' e n t r e eux p r~sen ten t un degr~ de r~p~t i t ion ~levd [4 , 9 , 20 , 21 , 44 ] , mais que cela n ' e s t pas g~n~ral [3 ,19 ] . Une au t r e propr i~ td de tels satel l i tes lourds est leur local isa t ion pr~f~rent ie l le dans l ' h ~ t d r o c h r o m a t i n e cons t i tu t ive [8] . Des exper i ences son t en cours af in de pr~ciser la na tu re e t le rSle possible des f rac t ions du g d n o m e nucl~aire isol~es c o m m e satel l i te lourd chez Chlorella.

RESUME

La centrifugation, en gradient de Cs2SO4 et en pr&ence d'ions Ag ÷ de I'ADN nucl~aire de Chlorella pyrenoidosa (souche 211/8b et souche Emerson) permet la raise en ~vidence d'une bande satellite dont la densit~ de flottation est plus dlevde que celle de la bande principale.

L'apparition de ce satellite, ainsi que sa densit~ de flottation, d~pendent dtroitement du pH des solutions et du rapport molaire Ag÷/DNA-P (rf). La fixation des ions Ag + sur le satellite lourd s'effectue d~s les faibles rf et n'est que tr~s peu modifi~e par le traitement pr~alable des solutions d'ADN avec un agent ch~latant ou par purification de ces solutions sur colonne d'hydroxy- apatite. Enfin, apr~s dlimination des ions Ag ÷ fixds, la densit~ de flottation en gradient de CsCl du satellite lourd et celle de la bande principale sont iden- tiques ~ la densit~ de I'ADN natif.

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