HYPERCOAGULABILITE DANS LA DREPANOCYTOSE: UN NOUVEL

OUTIL DIAGNOSTIQUE?

Denis NOUBOUOSSIE, Anne DEMULDER

CHU Brugmann, Bruxelles

Journée de la drépanocytose, Hôpital Erasme, Février 2009

PLAN

• Hypercoagulabilité dans les syndromes drépanocytaires (SD)– Définition et arguments– Mécanismes pathogéniques– Faiblesse des méthodes diagnostiques actuelles

• Test de Génération de Thrombine in vitro (TGT)– Principe et technique (CAT)– Avantages et limites

• Etude préliminaire de la GT chez les enfants SD

Etat d’hypercoagulabilité

• DéfinitionSituation clinique associée à une tendance anormale à développer une thrombose (caillot de fibrine) dans la circulation veineuse et/ou artérielle.

• Causes constitutionnelles ou acquisesTriade de Virchow: la thrombose résulte d’une anomalie du vaisseau, du flux ou d’un constituant du sang

• NB– Possible thrombose sans facteur de risque identifié– Possible facteur de risque identifié sans thrombose

Hypercoagulabilité dans les SDArguments cliniques et radiologiques

• Etude CSSCD USA 1978-1988 (n=4082, durée moyenne de suivi: 5,2 ± 2 ans) (Semin Cerebrovasc Dis Stroke 2002;2:143-50)

– Incidence AVC: 0,46% patients/an– Anomalies cérébrales IRM: 22% (patients >6 ans)– Infarcissements cérébraux infracliniques: 13%

• Registre national Belgique (Le et al, présentation orale, Oct 2009)

– AVC/AIT: 3%– Anomalies cérébrales à l’IRM: 18%– STA: 19%

• Etude Turkie: IRM chez 50 patients avec symptomes du SNC (Alkan et al. 2009; Eur J Radiol: in press)– Infarcissements cérébraux: 32%– Thrombose sinus veineux: 2%

Hypercoagulabilité dans les SDArguments anatomopathologiques

• Thrombi in situ retrouvés à l’autopsie:

– Dans les artères cérébrales des patients décédés d’AVC (Rothman et al, Ann neurol 1986)

– Dans les artères pulmonaires des patients décédés de STA (Adedeji et al, Arch Pathol Lab Med 2001)

Hypercoagulabilité dans les SDArguments biologiques

(Ataga and Key, Hematology 2007)

• Hyperactivation des plaquettes– Agrégométrie, cytométrie en flux

• ↑ des paramètres d’activation de thrombine in vivo– Fragments de thrombine, complexes T-AT

• ↑ des paramètres de fibrinolyse in vivo– D-dimers, complexes P-AP

• ↓ des anticogulants physiologiques– Système protéine C/protéine S

• Présence des anticorps anti-phospholipides

• Pas de facteur de risque thrombotique constitutionnel associé aux SD

Hypercoagulabilité dans les SDPathogénèse

From Ataga. Haematologica 2009;14(11):1481-4

Phosphatidylserine exposition

From Piccin et al. Blood Rev 2007;21: 157-171

Microparticules

Microparticules et hémostase

• Certaines MP sont dites procoagulantes car véhiculent le FT et les PPL (PS)

• MP procoagulantes en nombre augmenté chez les patients à risque de thrombose:– Dans les maladies cardiovasculaires– Dans les cancers

• Dans les SD– MP FT+ dérivant des monocytes et des cellules endothéliales

(Shet et al, Blood 2003)

– MP PS+ dérivant des GR et des plaquettes (Westermann et al, Br J Haematol 2008)

Points faibles de l’étude de l’hémostase dans les SD

• Etude segmentaire et non intégrée de l’hémostase

• Paramètres étudiés:– Ne miment pas la physiologie de l’hémostase– Peuvent être influencés par leur élimination– Bonne VPN mais mauvaise VPP

• Participations non prises en compte– Cellules du sang – Vaisseau sanguin– Flux sanguin

Test de génération de trombine in vitro (TGT)

• Connu depuis les années 1950, mais difficile à réaliser

• Abandonné au profit des tests en un seul temps (aPTT, PTT, dosage des facteurs)

• Travaux de Hemker et al,– Améliorations techniques– Mise au point d’un software– Interprétation par des paramètres précis– Calibrated Automated Thrombinography (CAT)

Calibrated Automated Thrombinography (CAT)

• Principe

– Activation par un mélange de facteur tissulaire (FT) + phospholipides (PL)

– Cascade de réactions aboutissant à la génération de thrombine

– Activité de la thrombine générée sur un substrat fluorescent

– Mesure continue de la fluorescence

– Conversion automatique de la fluorescence en concentration de thrombine active grâce à un calibrant analysé en parallèle

Courbe de génération de thrombine

D’après Josso, Hemker et Mann, modifié par F. Debaugnies

• Avantages

– Il mesure directement l’activité de l’enzyme clé de la coagulation– Intègre l’activité des facteurs procoagulants et anticoagulants

– Mime mieux la physiologie de la génération de thrombine in vivo

– Technique automatisée avec une bonne reproductibilité

• Limites

– Défaut de standardisation

– Importante variabilité inter-individus

– Pas de participation des cellules sanguines, du vaisseau et du flux sanguin

Calibrated Automated Thrombinography (CAT)

CAT et hypercoagulabilité chez les enfants drépanocytaires: étude préliminaire

But: caractériser les différentes phases de la génération de thrombine chez les enfants drépanocytaires cliniquement stables

Méthodologie (1)

• Patients – n = 19 HbSS stables suivis à l’HUDERF– Age: 4 – 20 ans, médiane = 8– Sexe: M = 10; F = 9

• Groupe témoins– n = 8 pré-op petite chirurgie– Age: 4 – 20 ans, médiane = 8,5– Sexe: M = 4; F = 4

Méthodologie (2)

• Prélèvement: Sang veineux,tube citraté à 0,109M

• Double centrifugation: Obtention d’un PPP

• Conservation à -80°C

• TGT par technique CAT– Activation par 1pM FT + 4µM PL ± Thrombomoduline (TM)

• Six paramètres analysés: Lagtime(min), Peak(nM), Ttpeak(min), Vel ind(nM/min), ETP(nM), Starttail(min)

• Comparaison des 2 groupes: test de Mann Withney; p<0,05 = significatif

Influence de la TM sur la GT chez un adulte normal

-50

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60 70

Temps (mn)

Thro

mbi

ne (U

/ml)

Résultats

Without thrombomodulinWith addition of

thrombomodulin

% of reduction after addition of

thrombomodulin

Controls(n=8)

SCD(n=19)

Controls(n=8)

SCD(n=19)

Controls(n=8)

SCD(n=19)

Lagtime(min)

5,1(3,9-8,3) 5(2,5-8,8)5,2(4,07-

8,3)5,1(2,5-

10,1)NE NE

Peak(nM)

96,7(48,8-199,8)

141,1(57,1-230,6)

88,6(49,2-177)

145,2*(56,0-225,8)

NE NE

TtPeak(min)

10,1(8,4-14)

8,7*(5,2-13,9)

10,8(9,2-14,9)

9,3(4,8-16,4)

NE NE

Velocity Index

(nM/min)

22,5(8,1-46,1)

36,3*(10,7-99,9)

26,1(11,4-52,2)

40,8(14,9-117,5)

NE NE

ETP(nM)

855,5(604,5-

1584)

861(564-1485)

562(422-1164)

706(381-1184)

36,5(22-44)

14*(-4-50)

Startail(min)

30,7(23,9-44,4)

24,9(15,7-38,0)

24,5(19,3-28,5)

21,0(15,4-28,5)

20(14-36)

12*(1-31)

p

Sans TM Avec TM

Lag time 1,000 0,936

TtPeak 0,027 0,056

Velocity Index 0,027 0,059

Peak 0,098 0,046

ETP 0,978 0,253

Start tail 0,075 0,094

-50

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50 60 70

-50

0

50

100

150

200

250

0 20 40 60 80

Sans TM Avec TM

Augmentation des vélocités chez les SDDiscussion

• Chaari et al, abstract ASH 2009– ↑ vitesse GT liée à la

présence des MP de GR

• Shah et al, abstract ASH 2009– Pas de différence entre

plasma riche et dépourvu de MP

• Rôle de ↑ FVIII!!

Reduction du strattail Nx vs SD

Nx SD

-10

0

10

20

30

40

Reduction ETP Nx vs SD

Nx SD-10

0

10

20

30

40

50

60

CAT CHEZ UN ENFANT NORMAL

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70

Temps (min)

Th

rom

bin

(n

M)

CAT CHEZ UN PATIENT ATTEINT D'UN SD

-50

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50 60 70

Temps (min)

Th

rom

bin

e (n

M)

Anomalie de la régulation de la génération de thrombine par le système TM/PC/PS!

p = 0,038 p = 0,024

Normaux PC >50 PC <50-10

0

10

20

30

40

50

60

%

Réduction ETP et activité PC: Nx vs PC>50 vs PC<50

n = 8n = 5

n = 8

p = 0,040

Conclusion

• Le TGT permet une meilleure évaluation du phénotype hémostatique des patients SD

• Il montre– Une accélération de la phase de propagation– Une augmentation des concentrations de thrombine générée– Un défaut de neutralisation par le système TM/PC/PS

probablement compensé par les autres anticoagulants physiologiques

• Cependant, nécessité: – Études à plus grande échelle – Standardisation de la méthode

Remerciements

• HUDERF– Médecins du service d’hémato-oncologie– Personnel de S60– Personnel service du prélèvement– Personnel des S66

• CHU Brugmann– Personnel du tri– Personnel du laboratoire d’hématologie et de

coagulation

Merci pour votre attention!