genèse des cibles des auto- anticorps anti-protéines...

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UNIVERSITÉ PAUL SABATIER-TOULOUSE III U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre (SVT) École Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies T T H HÈ È S S E E Pour l’obtention du grade de D DO OC CT TE EU UR R D DE E L L U UN NI I V VE ER RS S I I T TÉ É T TO OU UL L O OU US S E E I I I I I I Spécialité : IMMUNOPATHOLOGIE Présentée et soutenue par C Cé é l l i i n n e e F F O OU UL L Q QU UI I E E R R Le 2 octobre 2007 Jury F. APPARAILLY Rapporteur A.-S. KORGANOW Rapporteur S. VALITUTTI Examinateur J. ROUDIER Examinateur M. SEBBAG Examinateur G. SERRE Directeur de thèse Unité « Différenciation Épidermique et Auto-immunité Rhumatoïde » UMR 5165 CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse III Gen Gen è è se des cibles des auto se des cibles des auto - - anticorps anti anticorps anti - - prot prot é é ines ines citrullin citrullin é é es es dans le tissu dans le tissu synovial rhumato synovial rhumato ï ï de : de : peptidyl peptidyl - - arginine arginine d d é é siminases siminases et fibrine et fibrine citrullin citrullin é é e e Gen Gen è è se des cibles des auto se des cibles des auto - - anticorps anti anticorps anti - - prot prot é é ines ines citrullin citrullin é é es es dans le tissu dans le tissu synovial rhumato synovial rhumato ï ï de : de : peptidyl peptidyl - - arginine arginine d d é é siminases siminases et fibrine et fibrine citrullin citrullin é é e e

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UNIVERSITÉ PAUL SABATIER-TOULOUSE III U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre (SVT)

École Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies

TTHHÈÈSSEE

Pour l’obtention du grade de

DDOOCCTTEEUURR DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ TTOOUULLOOUUSSEE IIIIII

Spécialité : IMMUNOPATHOLOGIE

Présentée et soutenue par

CCéélliinnee FFOOUULLQQUUIIEERR

Le 2 octobre 2007

Jury

F. APPARAILLY Rapporteur A.-S. KORGANOW Rapporteur

S. VALITUTTI Examinateur J. ROUDIER Examinateur M. SEBBAG Examinateur G. SERRE Directeur de thèse

Unité « Différenciation Épidermique et Auto-immunité Rhumatoïde » UMR 5165 CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse III

GenGenèèse des cibles des autose des cibles des auto--anticorps antianticorps anti--protprotééines ines citrullincitrullinééeses dans le tissu dans le tissu synovial rhumatosynovial rhumatoïïde : de :

peptidylpeptidyl--arginine arginine ddéésiminasessiminaseset fibrine et fibrine citrullincitrullinééee

GenGenèèse des cibles des autose des cibles des auto--anticorps antianticorps anti--protprotééines ines citrullincitrullinééeses dans le tissu dans le tissu synovial rhumatosynovial rhumatoïïde : de :

peptidylpeptidyl--arginine arginine ddéésiminasessiminaseset fibrine et fibrine citrullincitrullinééee

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Remerciements

Mes remerciements s'adressent en premier lieu au Professeur Guy SERRE pour m'avoir

accueillie dans son équipe de recherche et pour m'avoir permis de réaliser ce travail.

Je remercie très sincèrement Florence APPARAILLY, chargée de recherche INSERM

(Montpellier, INSERM U 844) et Anne-Sophie Korganow, maitre de conférence de

l'université Strasbourg I, de m'avoir fait l'honneur d'être les rapportrices de ce travail et

d'avoir accepté avec enthousiasme la lourde tâche d'évaluer ce manuscrit.

Je tiens également à remercier Jean Roudier, Professeur de l'Université Aix Marseille II, et

Salvatore VALITUTTI, professeur de l'université Paul Sabatier (Toulouse III), pour m'avoir

fait l'honneur de juger cette thèse.

Mireille, je pense que tu le sais, mais merci encore pour TOUT ce que tu as fait pour

moi !!! Merci pour ton investissement, ton soutien et tes encouragements. Sans toi, je n'en

serai pas arrivée là ! Merci aussi de m'avoir supportée (patiemment) durant ces 5

années…

Un grand merci à toi Roula pour ton aide précieuse au microscope et pour l'investissement

et l''intérêt que tu as porté à ce travail.

Un grand merci à Régine et Mitou, qui on partagé avec moi les "joies" du western blot et

du clonage … Finalement les " plus que 2 ans !!! " vont me manquer…☺

Un très grand merci "aux deux Marie" : merci pour votre aide et votre bonne humeur qui

m'ont permis de mieux supporter ces longues heures passées au cryo-microtome…

Merci à tous les membres de l'équipe (passés et présents) qui ont partagé avec moi ce

travail et qui m'ont soutenue toutes ces années : Sabine, Valérie, Cyril, Léonor, Christina et

Keyvan.

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Remerciements

Un grand Merci à l'équipe du " 3ième "… Marina, merci pour ton "coaching" et ton aide en

biologie moléculaire et surtout durant ces longs mois passés sur le clonage de la PAD6 !

Eve et Nico, mille fois merci pour votre aide très précieuse et pour toutes les fois où je

vous ai dérangés avec mes petits soucis techniques ou autres…

Je remercie également toutes les personnes du laboratoire et plus particulièrement celles

qui sont intervenues de près ou de loin dans ce travail… Marie-Claire, merci pour l'intérêt

que tu as porté à ce travail durant ces années.

"Laetiti" : notre cohabitation fût courte mais j'espère qu'elle n'aura pas été trop difficile…

En tout cas, fini les petits dessins ! J'espère que tu prendras le relai Fanny… ☺

Véro, je sais que ça te fera plaisir : je te passe (avec joie) le briquet !!!! ☺

Un grand merci à toute la "bande de naze" : Choupinet et Choupinette, Guigui, CriCri et

Bernardin, Jé, sophie… Merci pour votre bonne humeur et votre présence.

Un merci tout particulier à ma Vivi… je suis heureuse que tu sois toujours là (même à

distance) depuis toutes ces années !!!

Un merci tout spécial à mon chouchou… Merci d'avoir été présent et de m'avoir soutenue

et supportée surtout ces loooooooooongs derniers mois !

Et enfin un grand merci à ma famille et surtout à toi Maman… Merci pour tes

encouragements et ton soutien tout au long de cette thèse et même avant !

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Liste des Abréviations

ACPA auto-anticorps anti-protéines citrullinées ACR American College of Rheumatology ADN Acide Désoxyribo-Nucléique ADNc ADN Complémentaire AFA auto-anticorps anti-Filaggrine AhFibA auto-anticorps anti-Fibrinogène humain citrulliné AKA auto-anticorps anti-kératine APF Facteur anti-périnucléaire ARA American Rheumatism Association ARNm Acide Ribo-Nucléique messager Ca Calcium CCP Cyclic Citrullinated Peptide CI Complexe immun CIA Collagen-Induced Arthritis CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité CPA Cellule Présentatrice d'Antigène Da/kDa Dalton / kilodalton EBV Epstein-Barr Virus ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EST Expressed Sequence Tag FcR Récepteur au fragment cristallisable des immunoglobulines FNH Facteur Naturel d'Hydratation FR Facteur Rhumatoïde GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein GPAO Glaucome Primaire à Angle Ouvert HLA Human Leukocyte Antigen Ig Immunoglobuline IL Interleukine LPS Lipopolysaccharide MBP Myelin Basic Protein M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Mφ Macrophage MMP Matrix Metallo-Protease NLS Nuclear Localisation Sequence NO monoxyde d'azote PAD Peptidyl-Arginine Désiminase PADI gène codant pour une PAD pb paire(s) de bases PCR Polymerase Chain Reaction pI point isoélectrique PR Polyarthrite Rhumatoïde

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Liste des Abréviations

RANK Receptor Activator of Nuclear factor (NF)-ΚB RANKL RANK ligand RT Reverse Transcription SEP Sclérose En Plaque TCR T Cell Receptor TGF Transforming Growth Factor THH Trichohyaline TNF Tumor Necrosis Factor t-PA tissue-Plasminogen Activator u-PA urokinase-Plasminogen Activator

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Résumé

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est la maladie auto-immune la plus fréquente. Elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales pouvant conduire à leur destruction. Chez les patients, de nombreux auto-anticorps ont été décrits parmi lesquels les auto-anticorps anti-protéines citrullinées (ACPA) qui, sur leurs antigènes-cibles, reconnaissent des épitopes porteurs de résidus citrullyl. Ces derniers sont générés par la désimination (citrullination) de résidus arginyl catalysée par une peptidyl-arginine désiminase (PAD). De nombreux arguments suggèrent un rôle important des ACPA dans la physiopathologie de la PR. En effet, ils sont très spécifiques de cette maladie et sont détectés dans le sérum des patients très précocement, parfois même avant l'apparition des signes cliniques. Ils sont de plus synthétisés et concentrés au sein du tissu synovial rhumatoïde où leur cible antigénique, la fibrine citrullinée, est présente.

Nous avons cherché à préciser l'origine et le rôle du conflit immunologique entre fibrine citrullinée et ACPA dans la physiopathologie de la PR, à travers 3 questions : i/ quelles sont les PAD impliquées dans la désimination de la fibrine ? ii/ cette désimination est-elle spécifique de la PR ? et iii/ la fibrine citrullinée est-elle immunogène et arthritogène ?

Nous avons établi que, parmi les cinq isotypes de PAD existantes, seules les PAD2 et 4 sont présentes au sein du tissu synovial rhumatoïde. En outre, nous avons montré que l'expression synoviale des PAD2 et 4 n'est pas exclusivement associée à la PR, puisqu'elle est observable au cours d'autres rhumatismes inflammatoires et corrélée à l'inflammation tissulaire. Cependant alors que la PAD2 est également présente dans le tissu synovial de patients atteints d'arthrose, l'expression de la PAD4 est associée aux seuls rhumatismes inflammatoires. Des analyses immunohistologiques ont révélé que ces 2 PAD sont exprimées par des cellules mononucléées infiltrant le tissu mais également, en ce qui concerne la PAD4, par les synoviocytes hyperplasiques. L'expression de CD68 par les cellules PAD-positives indique leur origine myélo-monocytaire. De plus, la localisation des PAD2 et 4 au voisinage proche ou au sein des dépôts de fibrine citrullinée suggère fortement que ces 2 isotypes sont tous deux impliqués dans la citrullination de la fibrine.

En cohérence avec ces résultats, nous avons également montré que la fibrine citrullinée n'est pas spécifique du tissu synovial rhumatoïde. En effet, sa présence dans le tissu synovial enflammé de patients atteints d'autres rhumatismes, inflammatoires ou non, indique que la citrullination de la fibrine est une caractéristique générale des synovites qui n'induit donc pas nécessairement la production d'ACPA.

Enfin, nous avons étudié l'immunogénicité et l'arthritogénicité de la fibrine citrullinée autologue chez le rat. Seuls les animaux ayant reçu des inoculations de fibrinogène sous forme citrullinée, et non ceux ayant reçu la forme native, ont développé une " réponse anticorps ". Cependant, cette réponse auto-immune n'a pas induit d’arthrite, ni permis d’aggraver une arthrite aigüe transitoire. Des dépôts de fibrine citrullinée ne s'étant pas formés au sein des articulations, le défaut d'arthritogénicité pourrait être dû à l'absence de conflit immunologique local.

Ces résultats conduisent à s'interroger sur les mécanismes d'induction chez les seuls patients atteints de PR, d'une réponse auto-immune spécifique vis-à-vis d'un auto-antigène présent dans toutes les arthrites. Restent également à identifier les facteurs qui induisent l’expression des PAD2 et 4, à expliquer comment et/ou pourquoi ces enzymes sont relarguées et activées pour désiminer des protéines extracellulaires telles que la fibrine. L'inhibition de l'activité ou de l'expression des PAD2 et/ou 4 pourrait en effet constituer une stratégie thérapeutique nouvelle de la PR.

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Abstract

Rheumatoid arthritis (RA), essentially characterized by chronic inflammation of synovial joints with frequent extra-articular manifestations, is the most common human autoimmune disease. In the serum of patients with RA, presence of autoantibodies to citrullinated proteins (ACPA) also constitutes a major disease feature. Citrullyl residues are essential components of the ACPA-targeted epitopes. They result from the posttranslational conversion of arginyl residues by a peptidylarginine deiminase (citrullination). ACPA are very probably involved in the pathophysiology of RA. Indeed, they are highly specific for the disease and appear early in the disease course. In addition, they are produced and concentrated into the rheumatoid synovial tissue (ST) where their major antigenic target, citrullinated fibrin, is present.

In this work, we tried to clarify the origin and role of the immunological conflict between ACPA and citrullinated fibrin in RA pathophysiology by asking 3 questions: i/ What PAD isotypes are involved in the citrullination of fibrin ? ii/ Is fibrin citrullination specific for RA ? and iii/ Is citrullinated fibrin immunogenic and arthritogenic ?

We established that, among the five PAD isotypes, only PAD2 and PAD4 were present in the rheumatoid ST. In addition, we showed that synovial expression of PAD2 and PAD4 was not exclusively associated to RA but observed in other arthritides and correlated with the intensity of tissue inflammation. While PAD2 was also present in the ST of patients with osteoarthritis, PAD4 expression was restricted to arthritides. Immunohistological analyses revealed that mononuclear cells infiltrating the ST were a major source of both PAD2 and PAD4, and that hyperplastic cells of the synovial lining constituted another important source of PAD4. Finally, localization of PAD2 and PAD4 within or at the close vicinity of citrullinated fibrin deposits strongly suggested that these two isotypes were involved in fibrin citrullination.

In accordance with these results, we also showed that the presence of citrullinated fibrin in the ST was not specific for RA. Indeed, it was also observed in the inflamed ST of patients suffering from other, inflammatory or non inflammatory, rheumatisms. This indicates that fibrin citrullination is a general feature of synovitides that does not necessarily induce ACPA production.

Finally, we assessed the immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen in the rat. Only inoculation of citrullinated fibrinogen, and not that of native fibrinogen, induced an autoimmune response. However, this response was neither spontaneously arthritogenic nor able to aggravate acute ankle arthritis. This lack of arthritogenicity was probably due to the absence of a local immunological conflict, citrullinated fibrin deposits being absent from the ankle joints.

The mechanisms governing induction of an RA-specific autoimmune response to a non-disease type specific antigen still remain to be established. Moreover, factors inducing PAD2 and PAD4 expression in the ST are still unknown. Finally, the way these enzymes are secreted and activated to citrullinate extracellular proteins like fibrin remains to be determined. Inhibition of PAD2 and/or PAD4 expression or activity could represent a new valuable therapeutic approach for RA.

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TABLE DES TABLE DES MATIMATIÈÈRESRES

DISCUSSION GÉNÉRALE

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

DISCUSSION GÉNÉRALE

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

INTRODUCTION

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Table des matières

INTRODUCTION ....................................................................................................1

1. LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE ....................................................................1

1.1. Généralités ............................................................................................................................1 1.1.1. Historique ........................................................................................................................ 1 1.1.2. Définition nosologique ...................................................................................................... 1 1.1.3. Epidémiologie .................................................................................................................. 1

1.1.3.1. Prévalence ................................................................................................................... 1 1.1.3.2. Age, sexe, incidence ..................................................................................................... 3 1.1.3.3. Evolution et pronostic .................................................................................................... 3

1.1.4. Caractéristiques anatomo-pathologiques............................................................................ 4 1.1.4.1. Sur un plan articulaire ................................................................................................... 4 1.1.4.2. Sur un plan extra-articulaire........................................................................................... 6 1.1.4.3. Signes biologiques ........................................................................................................ 7

1.1.5. Etiologie de la maladie ..................................................................................................... 7 1.1.5.1. Facteurs génétiques ...................................................................................................... 8

1.1.5.1.1. Gènes HLA............................................................................................................. 8 1.1.5.1.2. Gènes non-HLA ...................................................................................................... 9

1.1.5.2. Facteurs hormonaux et environnementaux..................................................................... 11

2. ASPECTS PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE .......14

2.1. Rôle des lymphocytes T .........................................................................................................15 2.1.1. Généralités .................................................................................................................... 15 2.1.2. Les cellules TH17............................................................................................................ 18 2.1.3. Les cellules T régulatrices dans la PR ................................................................................ 21

2.2. Rôle des macrophages..........................................................................................................22 2.2.1. Activation des macrophages dans la PR............................................................................ 24 2.2.2. Stimulation/ régulation de l'activation des macrophages dans la PR .................................... 25

2.2.2.1. Interactions cellulaires ................................................................................................. 26 2.2.2.2. Facteurs solubles ........................................................................................................ 27 2.2.2.2.1. Cytokines pro-inflammatoires................................................................................... 27 2.2.2.2.2. Cytokines régulatrices.............................................................................................. 28

2.2.3. Molécules effectrices des macrophages dans la PR ............................................................ 29 2.2.3.1. Cytokines pro-inflammatoires....................................................................................... 29 2.2.3.2. Cytokines anti-inflammatoires/régulatrices .................................................................... 30 2.2.3.3. Cytokines avec un double rôle dans l'arthrite................................................................. 30 2.2.3.4. NO et espèces réactives oxygénées (ROS)..................................................................... 31

2.3. Autres cellules ......................................................................................................................32 2.3.1. Les neutrophiles.............................................................................................................. 32 2.3.2. Les mastocytes................................................................................................................ 32 2.3.3. Autres cellules ................................................................................................................ 33

2.4. Rôle des lymphocytes B .........................................................................................................33 2.4.1. Accumulation de cellules B dans le synovium rhumatoïde................................................... 34 2.4.2. Cellules B en tant que cellules présentatrices d'antigène..................................................... 36 2.4.3. Rôle des cellules B dans des modèles murins d'arthrite ....................................................... 37

2.4.3.1. Modèle d'arthrite induite au collagène (CIA, "Collagen-induced arthritis") ........................ 37 2.4.3.2. Modèle K/BxN............................................................................................................ 38

2.4.4. Complexes immuns dans la polyarthrite rhumatoïde .......................................................... 39 2.4.4.1. Complexes immuns circulant dans la polyarthrite rhumatoïde ......................................... 40 2.4.4.2. Complexes immuns dans l'articulation rhumatoïde......................................................... 40

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Table des matières

2.4.5. Activation du complément ............................................................................................... 41 2.4.5.1. Généralités ................................................................................................................ 41 2.4.5.2. Activation du complément dans la PR ........................................................................... 42

2.4.6. FcγR et PR ...................................................................................................................... 43 2.4.6.1. Caractéristiques des FcγR ............................................................................................ 43 2.4.6.2. FcγR dans la PR .......................................................................................................... 44

2.4.7. Auto-anticorps et polyarthrite rhumatoïde ......................................................................... 45 2.4.7.1. Facteurs rhumatoïdes .................................................................................................. 45 2.4.7.2. Anticorps anti-A2/ RA33.............................................................................................. 46 2.4.7.3. Anticorps anti-BiP........................................................................................................ 46 2.4.7.4. Autres auto-anticorps .................................................................................................. 47

3. AUTO-IMMUNITE ANTI-PROTEINES CITRULLINEES .........................................48

3.1. Étapes de la découverte des auto-anticorps anti-protéines citrullinées.........................................48 3.1.1. Anticorps anti-kératine (AKA, "anti-keratin antibodies") ....................................................... 48 3.1.2. Facteur anti-périnucléaire (APF, "anti-perinuclear factor") ................................................... 49 3.1.3. Caractérisation de la cible articulaire des AFA................................................................... 50

3.1.3.1. Caractérisation des épitopes des AFA ........................................................................... 50 3.1.3.2. Synthèse des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde ....................................................... 51 3.1.3.3. Identification de la cible des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde ................................. 51 3.1.3.4. La Fibrine................................................................................................................... 52

3.2. Intérêt clinique des auto-anticorps anti-protéines citrullinées ......................................................55 3.2.1. Valeur diagnostique ........................................................................................................ 55 3.2.2. Valeur pronostique ......................................................................................................... 58

4. LES PEPTIDYL-ARGININE DESIMINASES ..........................................................60

4.1. Introduction .........................................................................................................................60 4.1.1. La désimination ou citrullination....................................................................................... 61 4.1.2. Caractéristiques générales des peptidyl-arginine désiminases ............................................. 62

4.2. Caractéristiques des PAD : clonage, profil d'expression, conservation, activité. ............................64 4.2.1. Clonage et profil d'expression des Pad murines ................................................................. 64

4.2.1.1. Pad1 ......................................................................................................................... 64 4.2.1.2. Pad2 ......................................................................................................................... 65 4.2.1.3. Pad3 ......................................................................................................................... 66 4.2.1.4. Pad4 ......................................................................................................................... 67 4.2.1.5. Pad6 ......................................................................................................................... 67

4.2.2. Clonage des PAD humaines ............................................................................................ 68 4.2.2.1. PAD1......................................................................................................................... 68 4.2.2.2. PAD2......................................................................................................................... 68 4.2.2.3. PAD3......................................................................................................................... 69 4.2.2.4. PAD4......................................................................................................................... 69 4.2.2.5. PAD6......................................................................................................................... 69

4.2.3. Profil d'expression des différentes PAD humaines ............................................................... 70 4.2.3.1. Expression des gènes PADI au niveau ARNm................................................................. 70 4.2.3.2. Expression des PAD au niveau protéique....................................................................... 72

4.2.4. Conservation des différentes PAD..................................................................................... 73 4.2.4.1. Organisation génomique et conservation des gènes PADI/Padi....................................... 73 4.2.4.2. Conservation des séquences des PAD........................................................................... 75

4.2.5. Substrats et spécificités des PAD....................................................................................... 77

4.3. Relations structure / fonction : structure cristallographique de la PAD4 .......................................80 4.3.1. Structure générale........................................................................................................... 80

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Table des matières

4.3.2. Sites de fixation au calcium ............................................................................................. 81 4.3.3. Implications fonctionnelles dans le domaine N-terminal ..................................................... 83 4.3.4. Implications fonctionnelles dans le domaine C-terminal ..................................................... 83 4.3.5. Site actif en forme de sillon.............................................................................................. 84 4.3.6. Dimérisation de la PAD4 ................................................................................................. 85 4.3.7. Reconnaissance de substrats naturels : les histones ............................................................ 86

4.4. PAD, désimination et processus physiologiques ........................................................................88 4.4.1. Désimination et différenciation épidermique...................................................................... 88

4.4.1.1. Désimination et Facteur naturel d'hydratation ................................................................ 89 4.4.1.1.1. Désimination de la filaggrine et FNH ...................................................................... 90 4.4.1.1.2. PAD impliquées dans la désimination de la filaggrine............................................... 92

4.4.1.2. Désimination des filaments intermédiaires de kératines................................................... 93 4.4.2. Désimination et différenciation du follicule pileux............................................................... 94 4.4.3. Désimination et apoptose................................................................................................ 99 4.4.4. Désimination et régulation génique ................................................................................ 100

4.4.4.1. Généralités .............................................................................................................. 100 4.4.4.2. Rôle de la PAD4 dans la régulation transcriptionnelle .................................................. 102 4.4.4.3. La PAD4 catalyse-t-elle la déméthylimination?............................................................. 104

4.5. PAD, désimination et pathologies autres que la PR .................................................................107 4.5.1. Maladies neurodégénératives ........................................................................................ 107

4.5.1.1. La Sclérose en plaque ............................................................................................... 108 4.5.1.2. Maladie d'Alzheimer.................................................................................................. 113

4.5.2. Glaucome primaire à angle ouvert................................................................................. 115 4.5.3. Cancer ........................................................................................................................ 116 4.5.4. Psoriasis et érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse ........................................... 117 4.5.5. Néphropathie obstructive .............................................................................................. 119

5. OBJECTIFS ................................................................................................121

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ...............................................................................123

Publication N°1 : ...........................................................................................................................123 Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but commonly occurs during synovitides. The Journal of Immunology, 174:5057-5064, 2005. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Baeten D, Clavel C, Foulquier C, De Keyser F, Serre G.

Publication N°2 : ...........................................................................................................................133 In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune response is not arthritogenic. Clinical and Experimental Immunology, 145:502-512, 2006. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Al Badine R, Serre G, Saoudi A, Sebbag M.

Publication N°3 : ...........................................................................................................................147 Peptidylarginine deiminase 2 and 4 but not 1, 3 and 6 are expressed in the rheumatoid arthritis synovium in close relation with tissue inflammation. Arthritis and Rheumatism (Sous presse). Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Al Badine R, Méchin M-C, Vincent C, Nachat R, Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G.

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Table des matières

DISCUSSION GÉNÉRALE ....................................................................................189

1. INTRODUCTION .......................................................................................189

2. CITRULLINATION ET POLYARTHRITE RHUMATOÏDE......................................190

2.1. Mécanismes impliqués dans la citrullination au sein du tissu synovial........................................190

2.2. La citrullination : phénomène lié à l'inflammation...................................................................193

2.3. Conséquence de la citrullination ..........................................................................................194

3. ORIGINE ET ROLE DE L'AUTO-IMMUNITE ANTI-PROTEINES CITRULLINEES ....195

3.1. Origine de la réponse ACPA................................................................................................195

3.2. Arthritogénicité ...................................................................................................................197 3.2.1. Modèles animaux ......................................................................................................... 197 3.2.2. Potentiel inflammatoire chez l'homme............................................................................. 198

4. PAD ET POLYARTHRITE RHUMATOÏDE.........................................................199

4.1. Association génétique PADI / PR...........................................................................................199

4.2. Sources de PAD dans l'articulation rhumatoïde.......................................................................200

4.3. Modulation de l'activité des PAD ..........................................................................................201

ANNEXES ...........................................................................................................203

Annexe 1 : Revue générale sur les peptidyl-arginine désiminase ..........................................................203 Annexe 2 : Communications à Congrès ……………………………………………………………………..227

BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................229

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INTRODUCTIONINTRODUCTIONDISCUSSION GÉNÉRALE

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

DISCUSSION GÉNÉRALE

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

DISCUSSION GÉNÉRALE

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Introduction

- 1 -

1. La polyarthrite rhumatoïde

1.1. Généralités

1.1.1. Historique

Les rhumatismes sont aussi vieux que le monde. Aux XVIème et XVIIème siècles, la

goutte était tenue pour responsable de nombreuses maladies, et en particulier, de tout ce

qui touchait aux articulations. La première description de la polyarthrite rhumatoïde (PR),

en tant que maladie individualisée, remonterait à la thèse "sur la goutte asthénique

primitive", soutenue par Auguste Landré-Bauvois, le 3 août 1800.

1.1.2. Définition nosologique

La PR est une maladie auto-immune dont l'étiologie reste encore inconnue de nos

jours. Elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales

pouvant conduire à terme à leur déformation et à leur destruction irréversibles. L'évolution

de la maladie se fait par poussées, souvent entrecoupées de phases de rémission,

conduisant le patient vers un stade d'invalidité fonctionnelle. Par définition, la

dénomination de "PR" n'est utilisée que pour des sujets de plus de 15 ans (Ryckewaert

1987).

1.1.3. Epidémiologie

1.1.3.1. Prévalence

La PR présente une distribution mondiale et affecte tous les groupes ethniques.

C'est la plus fréquente des maladies auto-immune et le plus fréquent des rhumatismes

inflammatoires chroniques. Les études épidémiologiques de la PR sont difficiles et donnent

des résultats souvent divergents à cause de l'hétérogénéité de la maladie et en fonction

des critères de diagnostics utilisés. La plupart de études utilisent les critères de l'American

Rheumatism Association (ARA) (Ropes et al. 1958), révisés en 1988 par l'American

College of Rheumatolgy (ACR) (Arnett et al. 1988). Ces critères de classification de la

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Introduction

- 2 -

maladie ont été établis en prenant en compte des données cliniques, radiologiques et

biologiques (cf Tableau 1).

1. Raideur matinale : raideur articulaire matinale durant au moins une heure. 2. Arthrite simultanée d'au moins 3 articulations : gonflement des parties molles, touchant au moins 3 articulations simultanément, observé par un médecin. 14 articulations ou groupes d'articulations sont à prendre en compte : IPP, MCP, poignets, coudes, genoux, chevilles et MTP. 3. Arthrite touchant la main : gonflement d'au moins une articulation des mains (IPP ou MCP), observé par un médecin 4. Arthrite symétrique : atteinte articulaire simultanée symétrique (une atteinte bilatérale sans symétrie absolue des MCP, IPP ou MTP est acceptée) 5. Présence de nodules rhumatoïdes : nodules sous-cutanés, au niveau des proéminences osseuses, des surfaces d'extensions, ou dans les régions péri-articulaires, observés par un médecin. 6. Facteur rhumatoïde : sérologie rhumatoïde positive (taux anormal par toute méthode où les résultats sont positifs chez moins de 5 % de sujets témoins normaux). 7. Signes radiologiques : changements radiologiques typiques de polyarthrite rhumatoïde sur les radiographies des mains (IPP, MCP) et des poignets, avec présence nécessaire d'érosions ou de déminéralisation. IPP : articulations inter-phalangiennes proximales ; MCP : articulations métacarpo-phalangiennes proximales ; MTP : articulations métatarso-phalangiennes Au moins 4 des 7 critères doivent être présents. Les critères 1 à 4 doivent être présents depuis au moins 6 semaines. Tableau 1 : Critères de classification de la polyarthrite rhumatoïde proposés par l'American College of Rheumatology (ACR) en 1988.

En utilisant ces critères, la prévalence de la PR est estimée entre 0.5 et 1% de la

population adulte (Spector 1990). Il existe néanmoins des variations de prévalence selon

les populations étudiées. En France, la prévalence serait de l'ordre de 0.25 à 0.5 %. La PR

serait plus répandue en Europe du nord et en Amérique du nord, notamment dans

certaines populations consanguines comme les indiens Pima et Chippewa, avec des

prévalences particulièrement élevées (5.3 et 6.8 % respectivement). Au contraire la

maladie semble plus rare au japon et en chine ou même absente dans certaines

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Introduction

- 3 -

populations rurales africaines. Ces résultats soulignent l'influence du terrain génétique et

des facteurs environnementaux sur le développement de la maladie (Silman and Pearson

2002).

1.1.3.2. Age, sexe, incidence

La polyarthrite peut apparaître à tout âge mais l'âge moyen de début de la maladie

est voisin de 45 ans avec une incidence maximale entre 40 et 60 ans. La PR touche plus

les femmes que les hommes avec un sex-ratio variant de 2:1 à 3:1 (Alamanos and Drosos

2005).

L'incidence (nombre de nouveaux cas observés par an) est variable. Aux états unis,

les chiffrent varient de 20 à 40 pour 100 000 personnes. En France, l'incidence semble

plus faible ; dans une étude sur la période de 1986-1989, l'incidence a été estimée à

environ 8.8 pour 100 000 (12,7/100 000 femmes et 4.7/100 000 hommes) (Guillemin

et al. 1994).

1.1.3.3. Evolution et pronostic

L'évolution de la PR peut être très variable d'un patient à un autre : 35 % des

malades ont un seul épisode qui dure 2 à 3 ans, 50 % ont une évolution cyclique avec

des poussées suivies de rémissions, et une détérioration fonctionnelle qui progresse lors de

chaque poussée, et enfin 15 % ont une evolution progressive sans rémission. Chez la

plupart des patients, la maladie évolue encore au-delà de 10 ou même 20 ans. La PR est

une maladie potentiellement grave en raison de son incidence fonctionnelle (l'impotence

articulaire des patients augmente avec le temps) et de son incidence sur l'espérance de vie

(en moyenne, celle des hommes est écourtée de 7 ans et celle des femmes de 3 ans).

Généralement, la mortalité est associée aux complications viscérales et/ou générales de la

maladie combinées aux effets secondaires toxiques des traitements anti-inflammatoires ou

immunosuppresseurs.

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Introduction

- 4 -

1.1.4. Caractéristiques anatomo-pathologiques

1.1.4.1. Sur un plan articulaire

L'inflammation articulaire concerne les articulations diarthrodiales (également

appelées articulations synoviales) des membres, où les extrémités osseuses, revêtues de

cartilage, se rejoignent latéralement par une membrane capsulo-synoviale. Cette dernière

est un tissu conjonctif formé d'une part, de la capsule articulaire, manchon périphérique

externe qui s'insère sur les os au voisinage de l'articulation, et d'autre part, de la

membrane synoviale qui tapisse la face interne de la cavité articulaire et qui, à la hauteur

de l'insertion de la capsule, se réfléchit sur l'os pour s'insérer autour des cartilages

articulaires (cf ).

La membrane synoviale se compose de 2 couches :

- la couche bordante (intima) au contact de la cavité articulaire. Elle est formée de une à

quatre assise(s) de synoviocytes de 2 types : les synoviocytes de type A ou synoviocytes de

type macrophagique, dérivés de cellules souches sanguines mononucléées, et les

Figure 1 : Représentation schématique d'une articulation synoviale saine (image obtenue sur http://www.med.howard.edu; copyright © 2004 Pearson Education Inc., éditeur : Benjamin Cummings).

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Introduction

- 5 -

synoviocytes de type B ou synoviocytes de type fibroblastique. Ces deux types cellulaires

ont respectivement des propriétés de phagocytose et de biosynthèse du liquide synovial.

- la couche sous-intimale (subintima) au contact de la capsule articulaire. Elle est formée

de fibroblastes, histiocytes, mastocytes et de fibres de collagène. Elle présente également

un réseau microvasculaire important.

L'inflammation rhumatoïde, appelée synovite rhumatoïde, se caractérise, comme

toutes les inflammations, par une vasodilation, un œdème et une infiltration cellulaire. Sur

un plan histhopathologique, de nombreux changements vont s'opérer en fonction de la

progression de la maladie. Les capillaires et veinules post-capillaires ainsi que des

synoviocytes de bordure deviennent hyperplasiques. Une infiltration massive par des

monocytes / macrophages, des cellules dendritiques, des lymphocytes T et B ainsi que des

plasmocytes a également lieu au sein de la couche sous-intimale. Finalement, par

différents mécanismes, l'inflammation aboutit à la formation d'un tissu bourgeonnant, le

pannus synovial qui va éroder le cartilage et l'os sous-jacent (cf Figure 2).

Figure 2 : Représentation schématique d'une articulation normale (a) ou rhumatoïde (b). D'après (Strand et al. 2007).

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Introduction

- 6 -

Chez 80% des patients, on observe une atteinte multicompartimentale des

articulations généralement de façon symétrique. Les articulations des doigts et des

poignets sont les plus fréquemment impliquées et généralement elles sont touchées en

premier. D'autres articulations vont progressivement être également atteintes comme celles

des pieds, des coudes, des chevilles, des genoux ou encore du rachis cervical.

L'inflammation concerne beaucoup plus rarement les articulations des épaules, des

hanches, les tempo-maxillaires, les sterno-claviculaires ou les sacro-iliaques et très

exceptionnellement les segments dorsaux et lombaires du rachis (cf Figure 3).

1.1.4.2. Sur un plan extra-articulaire

Même si la PR est une maladie essentiellement articulaire, elle peut également

s'accompagner de manifestations extra-articulaires diverses, souvent liées à la gravité de la

maladie. Une de ces manifestations est la présence de nodosités sous-cutanées également

appelées nodules rhumatoïdes. Ces nodules apparaissent dans des zones typiques sur la

face postérieure des avant bras, au niveau des doigts, des coudes et aussi du pied et du

Figure 3 : Représentation schématique du profil des articulations généralement impliquées au cours de la polyarthrite rhumatoïde. La fréquence relative d'atteinte de chaque articulation est indiquée par les différents ronds. D'après (Zvaifler 2006).

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Introduction

- 7 -

tendon d'Achille. Ces nodules sont détectés chez 20 à 25% des patients, et sont

généralement associés à la présence de facteur rhumatoïde sérique, d'un haplotype de

susceptibilité à la PR ainsi qu'aux PR les plus agressives (Zvaifler 2006). D'autres

manifestations extra-articulaires peuvent se développer, les principales étant des

manifestations pleuro-pulmonaires, cardiaques ou rénales. Par contre, aucune atteinte

épidermique n'a été associée à la PR.

1.1.4.3. Signes biologiques

Au niveau articulaire, le liquide synovial des patients est de type inflammatoire,

pauvre en acide hyaluronique, et riche en cellules, essentiellement des polynucléaires

neutrophiles (cf Figure 2). Le liquide contient aussi des facteurs rhumatoïdes et d'autres

auto-anticorps, qui participent à la formation de complexes immuns (CI) et ainsi

contribuent à diminuer le taux des fractions du complément en activant ces dernières. Des

enzymes protéolytiques y sont également présentes.

Plus généralement au niveau sanguin, les patients présentent les signes biologiques

classiques de l'inflammation comme une anémie, une hyperleucocytose, une

thrombocytose, une augmentation de la vitesse de sédimentation (VS) érythrocytaire, ou de

la concentration de protéines comme la protéine C réactive (CRP) ou encore une

augmentation du taux de fibrinogène. De nombreux auto-anticorps sont également

détectés dans le sérum des patients atteints de PR et seront détaillés plus loin.

1.1.5. Etiologie de la maladie

Il existe un consensus général selon lequel la PR est une maladie multifactorielle

complexe qui résulte de l'association de plusieurs facteurs à la fois génétiques et

environnementaux qui contribuent à l'apparition et au développement de la maladie. Les

facteurs génétiques ont été suspectés de jouer un rôle depuis quelques décennies sur la

base d'un regroupement ("clustering") de la maladie au sein de familles. En effet, la

prévalence de la PR est de 2 à 12% chez les parents au 1er degré de patients tandis

qu'elle est de 0.5 à 1% dans le reste de la population. Egalement, les degrés de

concordance pour la maladie de 15 à 30 % chez les jumeaux monozygotes et de 5 à 10

% chez les jumeaux dizygotes de même sexe, confirment un rôle de facteurs génétiques

dans la susceptibilité à la maladie (Silman et al. 1993; MacGregor et al. 2000).

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Introduction

- 8 -

Cependant, le risque familial pour la PR ne semble pas très important et les études sur la

concordance entre jumeaux ont permis d’estimer que les facteurs génétiques pourraient

représenter 50 à 60 % du risque de développer la maladie (MacGregor et al. 2000).

1.1.5.1. Facteurs génétiques

1.1.5.1.1. Gènes HLA

Le gène le plus incontestablement impliqué dans le déterminisme génétique de la

PR est le gène HLA-DRβ1, codant pour la chaîne β de la molécule HLA-DR (molécule du

CMH de classe II) et situé sur le chromosome 6 en 6p21. L'association à la PR d’allèles de

gènes localisés dans la région HLA a été proposée pour la 1ère fois en 1976 par Stastny

(Stastny 1976). Quelques années plus tard, les gènes codant pour les molécules DR4 et

DR1 ont été identifiés comme étant associés à la PR (Stastny 1978; Woodrow et al. 1981).

A la fin des années 1990, grâce au développement d'outils moléculaires permettant le

séquençage du locus HLA-DRβ1, Gregersen et ses collaborateurs ont proposé l'hypothèse

de l'épitope partagé pour expliquer l'association de la région codant pour les molécules

de classe II du CMH avec la PR. Selon l'hypothèse formulée, les molécules HLA-DR

seraient directement impliquées dans la physiopathologie de la PR et l'association entre

HLA-DR et PR serait attribuable à des allèles de susceptibilité codant pour une séquence en

acides aminés conservée, située dans la 3ème région hypervariable de la chaîne β des

molécules HLA-DR (Gregersen et al. 1987). Ce serait la présence de cette séquence

(QKRAA, QRRAA ou RRRAA) en position 70-74, codée par les allèles DR4 (DRβ1*0401,

*0404 et *0405), DR1 (DRβ1*0101 et *0102) et DR10 (DRβ1*1010), qui serait associée

à une plus grande susceptibilité à développer une PR. Le risque relatif de développer la

maladie varie selon les allèles à l'intérieur d'une population donnée. Par exemple,

l'hétérozygotie HLA-DRβ1*0401/0404 confère un risque relatif voisin de 30 (cf Tableau 2).

De la même façon, la susceptibilité conférée par les allèles codant pour l'épitope partagé

varie à travers les populations; ces allèles ne sont en effet pas associés à la PR dans

certaines populations américaines (africaines et hispaniques) (McDaniel et al. 1995; Teller

et al. 1996).

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Introduction

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génotype DRβ1 risque relatif p

0101/DRX 2,3 10-3

0401/DRX 4,7 10-12

0404/DRX 5,0 10-9

0101/0401 6,4 10-4

0401/0404 31,3 10-33

Tableau 2 : Risques relatifs des génotypes DRβ1 pour la PR. D'après (Gregersen et al. 2006).

Bien que HLA-DRβ1semble être le facteur génétique majeur dans la PR, le locus

HLA ne contribue qu'à hauteur de 30 % dans le risque familial global. De plus, la

présence d’un des allèles HLA-DR conférant la susceptibilité à la PR est décrite dans 40 %

des individus dans la population générale et dans 70 % des patients atteints de la

maladie. Ceci indique que ces allèles ne sont ni suffisants, ni nécessaires pour provoquer

le développement de la maladie chez un individu donné. Ces données suggèrent donc

que d'autres gènes non-HLA puissent également jouer un rôle dans la susceptibilité à la

PR.

1.1.5.1.2. Gènes non-HLA

D'autres locus et gènes, outre les gènes HLA, ont été étudiés et se sont avérés être

associés à la PR. Par exemple, des gènes candidats ont été identifiés, non seulement au

niveau de la région CMH de classe II mais aussi de la région CMH de classe III où le

gène TNFα a été impliqué comme facteur de susceptibilité à la maladie (Singal et al.

2000) (pour revue (Dieude and Cornelis 2005)).

Plusieurs criblages génomiques ont identifié la région 1p36 en tant que locus

d'intérêt pour la PR. Ce locus contient en particulier le gène TNFR2 qui code pour le

récepteur 2 au TNFα. Le rôle crucial de cette cytokine dans la physiopathologie de la PR

et le fait que le gène TNFR2 soit présent dans un locus d'intérêt font de ce gène un

candidat majeur pour le développement de la PR. Un polymorphisme (SNP) a été localisé

dans l'exon 6 et se caractérise par la substitution en position 196 d'un résidu méthionyl en

résidu arginyl. Cette substitution accentue la transmission intracellulaire des signaux

générés par la fixation de TNFα sur TNFR2 (Morita et al. 2001). Plusieurs études familiales

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Introduction

- 10 -

réalisées dans des populations caucasiennes et japonaises ont montré une association

significative de l'allèle TNFR2 196R et du génotype TNFR2 196R/R. Cependant, même si

des preuves d'une telle implication ont été obtenues, le rôle du gène TNFR2 reste modeste,

puisqu'il semble plutôt restreint aux formes familiales de PR.

Au sein de la même région d'intérêt que le gène TNFR2, en 1p36, est localisé le

locus PADI, qui correspond au groupe de gènes codant pour les 5 isotypes de

peptidylarginine désiminases (PAD, cf chapitre 4). L'association de ces gènes avec la PR

sera évoquée dans le chapitre discussion.

Une association entre la PR et un SNP fonctionnel du gène PTPN22 a récemment

été mise en évidence dans une étude cas-contrôle aux Etats-Unis (Begovich et al. 2004).

Ce gène, localisé sur le chromosome 1 en p13, code pour une protéine tyrosine

phosphatase LYP (Lymphoid phosphatase) impliquée dans la régulation négative de

l'activation des cellules T transitant par le TCR. L'allèle 1858T du SNP PTPN22-C1858T

provoque la substitution R620W au niveau de la tyrosine phosphatase et affecte un motif

riche en proline impliqué dans les interactions protéine-protéine. L'association à la PR de

cet allèle T a été démontrée dans plusieurs populations, toutes caucasiennes. Une

association à d'autres maladies auto-immunes incluant le diabète de type I ou encore le

lupus a également été rapportée (pour revue cf (Gregersen et al. 2006)). Bien que

plusieurs mécanismes de gain ou de perte de fonction aient été suggérés, le mécanisme

moléculaire de susceptibilité à la maladie reste à établir. Très récemment, des preuves de

l'association de l'allèle T avec la PR ont été apportées dans une population caucasienne

française, et plus précisément entre l'allèle T et les patients PR séropositifs pour le facteur

rhumatoïde. PTPN22 serait ainsi, plus généralement, "un gène de l'auto-immunité"

(Michou et al. 2007). Enfin, dans une population suédoise, l'allèle T a également été

associé avec la présence d'anti-CCP chez les patients atteints de PR, la combinaison des

deux donnant une spécificité de diagnostic très élevée de la PR (Johansson et al. 2006;

Kokkonen et al. 2007).

La protéine CTLA-4, tout comme LYP, joue un rôle important dans la régulation

négative de l'activation des cellules T, en se fixant, avec une forte affinité, aux molécules

de costimulation CD80/86 et en entrant en compétition avec CD28. Des polymorphismes

du gène CTLA-4 ont été associés avec plusieurs maladies auto-immunes, particulièrement

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Introduction

- 11 -

la thyroïdite auto-immune et le diabète de type I. Ce gène semble donc être un locus

général de susceptibilité aux maladies auto-immunes. L'association entre le SNP A49G du

gène CTLA-4 et la PR a été recherchée mais les résultats apparaissent contradictoires.

Cependant, très récemment, il a été montré une association de l'allèle CT60 du gène

CTLA-4 avec le développement de la PR dans une cohorte caucasienne nord-américaine.

Dans cette cohorte, ainsi que dans une cohorte suédoise, l'association de CTLA-4 s'est de

plus révélée plus forte avec les patients PR séropositifs pour les auto-anticorps anti-

protéines citrullinées (ACPA). Ce gène serait donc un gène de susceptibilité pour

seulement un sous-ensemble de patients PR (Plenge et al. 2005).

Enfin, le groupe ayant identifié l'haplotype de susceptibilité à la PR de PADI4 a

démontré l'association entre le gène SLC22A4 et la PR (Tokuhiro et al. 2003). SLC22A4

est localisé en 5q31 et code pour une protéine transporteur de cations organiques. Bien

que ce gène ne soit pas à l'intérieur d'un locus d'intérêt, il est localisé dans une région qui

contient d'autres gènes impliqués dans des mécanismes d'inflammation, et associé avec la

maladie de Crohn (Plenge et al. 2005). Une étude au sein d'une population japonaise a

révélé une association entre la PR et un SNP intronique localisé dans une séquence

contenant un site de fixation pour un facteur de transcription, RUNX1. La présence de

l'allèle de susceptibilité aurait pour conséquence une plus grande affinité du facteur de

transciption RUNX1 vis-à-vis de son site de fixation ce qui abaisserait la transcription du

gène SLC22A4. Le même groupe japonais a également testé un SNP intronique dans le

gène RUNX1, présent tout comme SLC22A4 à l'extérieur des régions d'intérêt identifiées

par criblage génomique, et montré son association avec la PR (Tokuhiro et al. 2003).

L'ensemble de ces données illustre la complexité de la susceptibilité génétique à la

PR, qui implique probablement la combinaison de variants de nombreux gènes.

1.1.5.2. Facteurs hormonaux et environnementaux

Le fait que les femmes soient 3 fois plus touchées par la PR que les hommes a

suggéré le rôle de facteurs hormonaux dans l'apparition de la maladie. Les hormones

exogènes ont également une influence sur le risque à développer la maladie. Par exemple,

la prise d’une pilule contraceptive oestro-progestative reduirait le risque de développer

une PR. De la même façon, comme dans d'autres maladies auto-immunes, la survenue

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Introduction

- 12 -

d'une grossesse aurait une influence négative sur le développement de la maladie. Même

si la protection n'est pas totale, on observe une amélioration des symptômes durant la

grossesse, qui pourrait s'expliquer par l'induction de cellules T régulatrices (Ostensen and

Villiger 2002) avec toutefois un retour de la maladie durant la période post-partum (pour

revue cf (Silman and Pearson 2002; Calvo-Alen and Alarcon 2006)).

De nombreux pathogènes, virus ou bactéries, ont également été impliqués dans

l'étiologie et la pathogenèse de la PR. C'est le cas par exemple de Borrelia burgdorferi

(agent de la maladie de Lyme), du parvovirus B-19 (vecteur de la cinquième maladie), du

virus de la rougeole ou encore du virus d'Epstein-Barr (EBV) (pour revue cf (Calvo-Alen

and Alarcon 2006)). Etant donnée la distribution mondiale de la PR, plus d'un agent

infectieux doit être impliqué dans sa causalité. Les plus vieux ossements sur lesquels ont

été observés des lésions caractéristiques de polyarthrite ont été découverts en Amérique et

dataient de 3000 à 5000 ans (Rothschild et al. 1988). Il a ainsi été suggéré que l'agent

infectieux impliqué dans la maladie soit originaire d'Amérique et ait été distribué à travers

le monde après que les Européens aient été au contact des populations natives

américaines. Cependant, la preuve directe de l'intervention d'un ou plusieurs agents

pathogènes n'a jamais été apportée. Une hypothèse serait que, chez les individus

prédiposés génétiquement, probablement plus d'un facteur environnemental, infectieux ou

non, pourrait conduire au développement de la PR en initiant une réaction

immunopathologique. Cette dernière activerait une cascade d'événements caractérisés

initialement par une inflammation (au niveau articulaire) puis par une destruction

articulaire. L'implication d'un agent infectieux ou d'un produit microbien pourrait

s'expliquer par un mimétisme moléculaire d'un peptide microbien spécifique vis-à-vis de

molécules autologues.

Un autre facteur qui semble influencer non seulement l'évolution de la PR mais aussi qui

augmente le risque de développer la maladie est le tabagisme. La cigarette est un

mélange complexe de composants parmi lesquels des adjuvants et de la nicotine. Des

adjuvants non-spécifiques sont connus pour favoriser la réaction immunitaire et même,

chez certaines souches de rongeurs, provoquer une arthrite. Au contraire, la nicotine peut

avoir des propriétés anti-inflammatoires du fait de son action sur le système nerveux

parasympathique (Czura and Tracey 2005). Ainsi, différents composants de la cigarette

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Introduction

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peuvent avoir différentes actions, qui dans certains contextes peuvent également avoir des

effets contraires sur la maladie. Le tabagisme a été décrit en tant que facteur de risque

environnemental pour la PR à la fin des années 1980 et depuis confirmé par de

nombreuses études. Cependant, pendant plusieurs années, ces études sur l'association de

la cigarette avec la PR n'avaient pas pour objectif de mieux comprendre les effets du

tabagisme dans différentes sous-classes de la maladie, ni de caractériser une association

avec des gènes particuliers. Ce n'est que très récemment que le tabagisme a été étudié

dans un contexte plus mécanistique. Il a été démontré que le tabagisme était un facteur de

risque principalement chez les patients PR séropositifs pour le facteur rhumatoïde,

marqueur sérologique de la PR, et que d'autre part, le risque conféré par le tabagisme

était supérieur chez les individus portant des allèles des molécules du CMH (HLA-DRβ1)

codant pour l'épitope partagé (Padyukov et al. 2004). Ces données montrent une

interaction gène-environnement entre le tabagisme et les gènes HLA-DRβ1 codant pour

l'épitope partagé et indique que le tabagisme pourrait favoriser des réactions immunes

spécifiques chez certains patients PR en présence de certains gènes. De plus une étude

publiée par le groupe Klareskog a montré que le tabagisme et les gènes HLA-DRβ1

codant pour l'épitope partagé étaient tous deux des facteurs de risques exclusivement pour

les PR positives pour les ACPA (Klareskog et al. 2006). Ces résultats confirmés dans deux

autres études, respectivement aux Pays–Bas (Linn-Rasker et al. 2006) et au Danemark

(Pedersen et al. 2006), n'ont cependant pas été retrouvés dans une étude très récente

réalisée sur 3 cohortes Nord-Américaines (Lee et al. 2007). Une association significative

entre tabagisme et la présence d'ACPA ou entre les allèles codant pour l'épitope partagé

et les ACPA a été retrouvée dans respectivement 2 et 3 des populations Nord-

Américaines. Cependant, aucune interaction gène-environnement (entre tabagisme et

allèle codant pour l'épitope partagé) pour la formation d'ACPA n'a pu être mise en

évidence dans aucune des 3 populations Nord-Américaines (Lee et al. 2007). D'autres

études sont nécessaires pour confirmer cette interaction gène/environnement avec les PR

positives pour les ACPA, et éventuellement mettre en évidence, outre le tabagisme, de

nouveaux facteurs de risque environnementaux.

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2. Aspects physiopathologiques de la polyarthrite rhumatoïde

Parce que la PR est le plus commun des rhumatismes inflammatoires et une source

majeure de handicap pour les malades sa physiopathologie a été et demeure très étudiée.

Depuis le milieu du 20ième siècle, les notions qui prévalaient sur cette physiopathologie ont

beaucoup évolué. La première idée sur le rôle d'une auto-réactivité immune dans la PR est

venue avec la découverte du facteur rhumatoïde (FR) dans le sérum des patients affectés.

Waaler en 1939, puis Rose en 1948, ont décrit un facteur sérique capable d’agglutiner

des globules rouges de mouton pré-revêtus de sérum de lapin. Le facteur, jusque là

inconnu, a finalement été caractérisé par l'équipe de Kunkel comme étant un anticorps se

fixant à la partie Fc des immunoglobulines G (Franklin et al. 1957). Cette observation a

ainsi amené à considérer la PR comme une maladie auto-immune impliquant des

anticorps auto-réactifs.

Le potentiel pathogénique du FR dans la PR en tant qu'initiateur d’une

maladie causée par un complexe immun a été formulé dans les années 1960, et décrit

dans un modèle proposé en 1973 par Zvaifler (Zvaifler 1973). Dans ce modèle, les

complexes immuns formés par le FR et probablement d'autres auto-anticorps, fixent le

complément et relarguent des facteurs chimiotactiques tels que le C5a. Les cellules

inflammatoires sont par la suite recrutées au sein de l'articulation rhumatoïde où elles sont

activées et participent à la destruction locale. En particulier, l’accent est mis sur un rôle

des neutrophiles qui s'accumulent dans le liquide synovial où ils vont capter les complexes

immuns et sécréter des enzymes protéolytiques.

De nombreuses données se sont accumulées pour renforcer cette hypothèse.

Des études ultra-structurales de cartilage ont révélé la présence de complexes immuns

adsorbés sur les couches superficielles, apportant ainsi une surface solide pour faciliter

l'adhésion et l'activation des neutrophiles. Le synovium lui-même est une source importante

pour la production des protéines du complément et de facteur rhumatoïde. En dépit d'une

production abondante de complément dans la PR, ses concentrations dans le liquide

synovial sont faibles comparé à d'autres arthropathies inflammatoires en raison d'une forte

consommation intra-articulaire (Neumann et al. 2002).

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Introduction

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Bien que la « théorie » des complexe-immuns puisse expliquer de

nombreuses caractéristiques de la synovite rhumatoïde, dans les années 1980, un intérêt

majeur s'est porté sur les lymphocytes T. L'infiltration massive de ces cellules dans le tissu

synovial rhumatoïde ainsi que la découverte de l'association génétique entre PR et

molécules HLA codant pour l'épitope partagé, ont suggéré que les lymphocytes T jouaient

un rôle clé dans la physiopathologie rhumatoïde. A la fin des années 1980, de nouvelles

techniques permettant de mettre en évidence la présence de cytokines dans synovium et le

liquide synovial ont souligné le rôle important de cytokines telles que l'IL-1β et le TNF-α,

ainsi que des cellules les produisant, les macrophages, dans l'inflammation synoviale.

Enfin, très récemment, la découverte de nouveaux modèles murins

spontanés d'arthrite (souris K/BxN), l'efficacité des traitement anti-CD20 ciblant les

lymphocyte B, ainsi que la découverte d'auto-anticorps anti-protéines citrullinées chez les

patients malades, ont contribué à redonner un intérêt aux lymphocytes B, et aux rôles des

auto-anticorps et des complexes immuns dans la PR.

Dans ce chapitre, j’évoquerai plus en détail le rôle des lymphocytes T, des

macrophages et des lymphocytes B dans la physiopathologie de la PR.

2.1. Rôle des lymphocytes T

2.1.1. Généralités

C'est en 1976 que Stastny a suggéré un rôle important des lymphocytes T dans la

physiopathologie de la PR, à la suite d’expérience mettant en jeu des réactions

allogéniques lymphocytaires mixtes. Il a montré que des lymphocytes provenant de patients

atteints de PR prolifèrent normalement lorsqu'ils sont stimulés par des lymphocytes

d'individus sains, mais présentent des défauts de réponse après stimulation par des cellules

provenant d'autres patients atteints de PR (Stastny 1976). Ces expériences démontraient

des similarités génétiques entre les patients atteints de PR et ont par la suite conduit à la

découverte que certains allèles du gène HLA-DR codant pour les molécules de CMH de

classe II, étaient plus fréquemment présents chez les patients atteints de PR. Comme je l'ai

mentioné auparavant, les allèles HLA-DR de susceptibilité à la PR codent pour une

séquence en acide aminé homologue (QK/RRAA), dit épitope partagé ou épitope de

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Introduction

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susceptibilité, dans la 3ème région hypervariable de la chaîne β des molécules HLA-DR

(Gregersen et al. 1987). La position de cet épitope partagé au sein des molécules de

CMH II suggère que les molécules HLA-DR portant cet épitope pourraient être capables

de fixer et présenter aux lymphocytes T CD4+ des peptides arthritogéniques spécifiques,

responsables du développement de la PR. Cependant le rôle précis des molécules HLA-DR

dans la PR semble beaucoup plus complexe, et des peptides spécifiques capables de se

lier aux protéines HLA-DR chez les patients atteints de PR n'ont jamais pu être clairement

identifiés. D'autres hypothèses pour expliquer le rôle de l'épitope partagé dans la PR ont

été proposées. Elles sont résumées dans le (Tableau 3).

Présentation de peptides arthritogéniques aux lymphocytes T CD4+ par des molécules de CMH classe

II associées à la PR Surexpression spécifique des allèles codant pour l'épitope partagé favorisant la présentation de

peptides arthritogéniques

Liaison avec d'autres gènes présents dans ou à proximité du locus des molécules de CMH classe II

Modification dans la sélection thymique des lymphocytes T conduisant à l'expansion de populations de cellules T potentiellement arthritogéniques

Réactivité croisée entre un antigène exogène et l'épitope partagé

Différences dans l'expression de surface et dans le trafic intracellulaire d'allèles spécifiques du CMH

Signalisation anormale à travers les allèles CMH

Absence d'allèles CMH protecteurs

Modification de l'affinité de peptides (épitope partagé) pour des protéines chaperonnes, altérant le chargement de peptides antigéniques sur les molécules CMH

Stimulation directe de lymphocytes T par l'épitope partagé présent sur les cellules présentatrices d'antigène Tableau 3 : Mécanismes possibles pour expliquer l'association entre des polymorphismes des molécules de CMH classe II et la PR. D'après (Fox 2006).

Outre l'association génétique de la PR avec certains allèles codant pour les

molécules de CMH classe II, mais également un allèle PTPN22 (gène codant pour une

tyrosine phosphatase impliquée dans la régulation de l'activation des cellules T via le

TCR), de nombreux éléments ont impliqué les lymphocytes T dans la pathogenèse de la

PR. Les lymphocytes T sont par exemple détectés en très grand nombre dans le synovium

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rhumatoïde enflammé, bien que ce ne soit pas spécifique à la PR mais plutôt

caractéristique de lésions synoviale observées dans des arthrites inflammatoires. Les

arguments évoqués pour expliquer un rôle central des lymphocytes T dans la PR ont été

résumés dans le Tableau 4.

Un nombre important de lymphocytes T et de cellules présentatrices d'antigène sont présents dans le

tissu et le liquide synovial Expression de marqueurs d'activation et de marqueurs de cellules mémoires par les cellules T

synoviales Accumulation dans l'articulation rhumatoïde, de manière non-aléatoire, de sous-populations de

lymphocytes T, probablement de populations de lymphocytes T clonales

Association de la PR avec certains allèles codant pour des molécules de CMH classe II (HLA-DR)

Rôle central de cellules T et de populations clonales de cellules T spécifiques, dans l'induction et la régulation de l'arthrite dans des modèles animaux expérimentaux

Présence dans l'articulation rhumatoïde de cytokines produites par les lymphocytes T, telles que l'IFN-γ et l'IL-17, qui peuvent jouer un rôle important dans l'inflammation et la destruction articulaire

Présence dans le synovium rhumatoïde (à des concentrations fonctionnellement significatives) de cytokines telles que l'IL-15 et l'IL-12, qui favorisent l'activation des cellules T et leur différenciation en cellules TH1 Tableau 4 : Arguments en faveur d'un rôle central des lymphocytes T dans la PR. D'après (Fox 2006).

L'importance de cellules T a surtout été soulignée dans des modèles expérimentaux

murins d'arthrite induits (arthrite induite au collagène et arthrite induite à l'adjuvant). Des

données associées aux cellules T ont également été décrites dans des modèles d'arthrites

spontanés, provoqués par des perturbations dans le TCR ou des modifications dans la

régulation des cytokines. Par exemple, dans le modèle de souris transgéniques K/BxN (voir

détail dans chapitre concernant le rôle des lymphocytes B), l'administration d'anticorps

anti-CD4 avant l'apparition des signes cliniques d'arthrite bloque le développement de la

maladie (Korganow et al. 1999). De plus, chez ces souris K/BxN, le développement de

l'arthrite suite à une stimulation initiale de cellules T, nécessite une interaction entre

cellules T et B, restreinte par une molécule de CMH (Ag7) et dépendante de CD40.

Récemment, Sakaguchi et ses collaborateurs, ont isolé une souche de souris qui

développe une arthrite spontanée suite à l’introduction d’une mutation dans ZAP-70 ("zeta

chain-associated protein" de 70 kDa), une protéine de signalisation associée au complexe

du TCR. Cette mutation altère la fonction de ZAP-70 qui provoque une sélection

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inappropriée et la survie de cellules T autoréactives dans le thymus. Bien qu'il n'existe pas

de preuve de mutations similaires dans la PR, ce modèle est important car il démontre

qu'une modification génétique ayant des effets sur la maturation et la fonction des

lymphocytes T peut conduire au développement d'une maladie semblable à la PR

(Sakaguchi et al. 2003).

Cependant, des approches thérapeutiques basées sur la modulation des cellules T,

comme par exemple l'utilisation de cyclosporine (inhibiteur de l'activation des cellules T) ou

d'anticorps anti-CD4, ont été décevantes (pour revue cf (Keystone 2003)). Par contre, les

effets bénéfiques observés chez des patients traités par Abatacept, une protéine de fusion

recombinante CTLA4-Ig Fc, comprenant le domaine extracellulaire de CTLA4 et un

fragment du domaine Fc d’une IgG1 humaine, ont renforcé l'idée que la co-stimulation

des cellules T et l'activation des cellules T effectrices puissent jouer un rôle dans la PR

(Genovese et al. 2005). De plus, le rôle des cellules T dans la PR a été remis en valeur

suite à la découverte de l’existence et des propriétés de l'IL-17, cytokine pro-inflammatoire

dérivée des cellules T, impliquée dans l'inflammation et la destruction articulaire.

2.1.2. Les cellules TH17

Les cytokines régulent le phénotype des cellules T effectrices et régulatrices dans le

synovium. Il y a peu de temps encore, la réponse des cellules T CD4 effectrices était

classée en 2 types : TH1 ou TH2, selon les niveaux d'expression relatifs de certaines

cytokines, particulièrement l'IFN-γ et l'IL-4. Bien que ni les cytokines de type TH1, ni celles

de type TH2, ne soient présentes à de fortes concentrations dans l'articulation rhumatoïde,

l'IFN-γ étant plus abondante que l'IL-4, la PR a ainsi été classée comme étant une maladie

de type TH1 et donc orchestrée par une population de cellules T produisant des cytokines

pro-inflammatoires et des chimiokines, telles que l'IFN-γ, la lymphotoxine-β et le TNF

(Schulze-Koops and Kalden 2001). Récemment, le rôle des cellules T dans la PR a été

remis en question grâce à la découverte d'une nouvelle sous-population de lymphocytes T

helper, les cellules TH17, caractérisées par la production d'une cytokine pro-inflammatoire

l'IL-17.

La première démonstration du rôle pro-inflammatoire de l'IL-17 a été faite il y a

environ 10 ans, lorsque Fossiez et ses collaborateurs ont cloné l'IL-17 humaine à partir de

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Introduction

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cellules T mémoires activées et montré que l'addition d'IL-17 dans des cultures primaires

de synoviocytes fibroblastiques issus de patients atteints de PR, induisait l'expression d'IL-6,

d'IL-8, de prostaglandine E2 et de G-CSF (Fossiez et al. 1996). En outre, l'IL-17 agit en

synergie avec le TNF-α pour induire de fortes concentrations d'IL-6 et de GM-CSF.

Depuis, les effets de l'IL-17 ont été largement étudiés et de nombreux types cellulaires

cibles, ainsi que de nombreux médiateurs inflammatoires en aval ont été caractérisés. Les

activités de ces médiateurs contribuent à la physiopathologie de la PR à travers le

recrutement et l'activation de cellules inflammatoires, un feedback positif sur la réponse IL-

17 et la destruction tissulaire et osseuse (cf Tableau 5).

Tableau 5 : Molécules effectrices induites par l'IL-17. D'après (Lundy et al. 2007).

Bien que le TNF-α et l'IL-1β induits par l'IL-17, participent à la destruction

cartilagineuse et à l'érosion osseuse, l'IL-17 peut avoir de façon indépendante, des effets

Molécules produites Source cellulaire Effets fonctionnels majeurs

IL-1β SF, mono/Mφ, Chond/OC Inflammation/ fièvre, synergie avec IL-17

IL-6 SF, mono/Mφ, Chond/OC stimulation LB, ≠ion TH17

IL-23 SF, mono/Mφ, Chond/OC Inflammation, stimulation TH17

TNF-α mono, Mφ Inflammation, synergie avec IL-17

CXCL1 SF, Chond/OC recrutement de leucocytes

CXCL5 Chond/OC recrutement de leucocytes

CXCL8 SF recrutement de leucocytes

CCL2 SF, Chond/OC recrutement de leucocytes

CCL20 SF recrutement de leucocytes

G-CSF SF régulation hématopoïèse

GM-CSF SF régulation hématopoïèse

VEGF SF, Chond/OC angiogenèse

Cyclooxygénase-2 SF, mono/Mφ, Chond/OC inflammation

Prostaglandine E2 SF, mono/Mφ, Chond/OC inflammation

RANK/RANKL Chond/OC ostéoclastogenèse et résorption osseuse

NO Chond/OC destruction tissulaire

MMP mono/Mφ, Chond/OC destruction cartilagineuse et tissulaire Chond/OC : chondrocytes et ostéoclastes; SF : synoviocytes fibroblastiques; Mono/Mφ : monocytes et macrophages, LB : lymphocytes B, ≠ion : différenciation

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sur le cartilage et l'os. L'IL-17 est notamment capable d'augmenter l'expression de CD265

(RANK ligand) sur les chondrocytes et ostéoclastes et d'agir sur le métabolisme

chondrocytaire en réduisant la synthèse de protéoglycanne, et en augmentant la

dégradation cartilagineuse (pour revue cf (Lubberts et al. 2005)).

Chez les patients atteints de PR, l'IL-17 est retrouvée à la fois dans le liquide

synovial et dans le tissu synovial dans des zones riche en lymphocytes T (Stamp et al.

2004). De plus, l'IL-17 est surexprimée dans le sérum et dans des PBMC activés de

patients atteints de PR comparé à des individus sains (Cho et al. 2004; Kim et al. 2005).

Des expériences dans plusieurs modèles expérimentaux d'arthrite ont démontré

l’importance majeure de l’IL-17 à la fois dans les stades précoces et tardifs du

développement de la maladie. En outre, à la fois l'incidence et la sévérité de la maladie

ont été significativement réduites chez les souris déficientes en IL-17 ou en récepteur à l'IL-

17 durant l'arthrite induite au collagène ou l'arthrite à streptocoque. De plus, chez des

souris déficientes en IL-1Ra, le développement spontané d'une arthrite est bloqué en

absence d'IL-17. Enfin, plusieurs groupes ont montré que l'administration d'anticorps

bloquant ou de récepteur soluble à l'IL-17 durant les phases d'induction ou effectrices

d'arthrite expérimentale, réduisait l'inflammation et la destruction articulaire (pour revue cf

(Lundy et al. 2007)).

De nombreux arguments suggèrent donc que l'IL-17 est un acteur important dans

la pathologie de la PR : sa surexpression dans le synovium rhumatoïde et le sang, ses

effets d'induction sur, et synergiques avec, de nombreux médiateurs de l'inflammation

importants dans la pathologie articulaire ou encore le fait qu'elle soit à la fois nécessaire

et suffisante pour induire une inflammation articulaire dans des modèles expérimentaux.

Concernant la nature des stimuli responsables de la production d'IL-17, outre les

effets du TGF-β, de l'IL-6 et de l'IL-23, l'expression d'IL-17 peut être augmentée par l'IL-1β

et le TNF-α. Le site précis de différenciation des cellules T en cellules T effectrices

pathogènes dans la PR n'est pas connu. L'environnement synovial contient cependant de

nombreuses cytokines capables de favoriser la différenciation et l'expansion des cellules

TH17 dans l'articulation. En outre, l'augmentation d'expression d'IL-17 par l'IL-6, l'IL-1β et

le TNF-α, qui sont tous induits par l'IL-17, laisse supposer qu'il existe une boucle de rétro-

contrôle positive. Ainsi une inflammation, au départ peu importante, pourrait, dans le

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microenvironnement et le milieu cytokinique adapté, favoriser et conduire à une

inflammation chronique qui s'auto-entretiendrait à travers des mécanismes dépendants de

l'IL-17 (pour revue cf (Lundy et al. 2007)).

2.1.3. Les cellules T régulatrices dans la PR

Les cellules T régulatrices (Treg) ont suscité un grand intérêt dans la dernière

décennie en raison de leur participation au contrôle des fonctions effectrices des cellules T

in vitro et de leur potentiel pour réguler des réponses inflammatoires auto-immunes in

vivo. Plusieurs sous-populations distinctes de cellules T CD4+ régulatrices ont été décrites,

mais certains marqueurs comme Foxp3 ("forkhead box p 3") ou l'expression en surface de

CD25 ont été considérés comme étant des marqueurs spécifiques des cellules Treg. Une

autre caractéristique de ces cellules est la sécrétion en quantité élevée de TGF-β et d'IL-10

(pour revue cf (Leipe et al. 2005)). Les mécanismes d'action précis de ces Treg ne sont pas

complètement compris mais ils réguleraient les réponses immunes de plusieurs façons :

par contacts cellulaires (signaux négatifs induits par des molécules de surface inhibitrices),

cytotoxicité, régulation négative de la fonction des CPA, et/ou induction d'autres cellules

régulatrices.

Plusieurs études ont évalué le rôle de ces cellules Treg dans la PR, et des résultats

parfois contradictoires sur le nombre relatif et la fonction des cellules TCD4+CD25+ ont

été décrits. Les Treg ont été identifiés dans le sang périphérique et semblent enrichis dans

le liquide synovial des patients atteints de PR (Mottonen et al. 2005). Ces cellules isolées

de patients avec une PR, présentent un phénotype anergique suite à une stimulation avec

un anticorps anti-CD3 et un anticorps anti-CD28, et sont capables de supprimer la

prolifération des cellules T effectrices in vitro. Cependant, ces cellules Treg semblent

présenter des défauts fonctionnels notamment pour supprimer la sécrétion de cytokines

pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF-α) par les cellules T activées et les monocytes (Ehrenstein

et al. 2004). En outre, les cellules Treg CD4+CD25+ expriment le recepteur 2 au TNF-α,

TNFR2. La signalisation via ce récepteur par le TNF-α inhibe la fonction répressive et

diminue l'expression de Foxp3 par ces cellules (Valencia et al. 2006). Le contexte

cytokinique inflammatoire dans le synovium rhumatoïde, notammant la présence de TNF-

α, pourrait donc empêcher la mise en place d'une réponse auto-immune protective et

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Introduction

- 22 -

participer à la chronicité de la maladie. Le traitement de patients avec des anti-TNFα

s'accompagne d'une augmentation de l'expression de Foxp3 et de la restauration des

fonctions de répression de la synthèse de cytokine par les cellules Treg. Ainsi, l'efficacité

des thérapies anti-TNFα pourrait être dûe à la fois à des effets directs anti-inflammatoires

sur les cellules effectrices pathogéniques, mais aussi indirectement à la restauration de

fonction des cellules Treg (Ehrenstein et al. 2004; Valencia et al. 2006).

Le rôle des Treg a été également largement étudié chez la souris dans des modèles

d'arthrite expérimentale induite au collagène ou avec de la sérum albumine méthylée. Les

cellules CD4+CD25+ se sont révélées importantes pour contrôler l'arthrite, et la

déplétion de cellules CD25+ par un anti-CD25 conduit à l'aggravation de l'inflammation

articulaire. Le transfert des cellules Treg CD4+CD25+ durant la phase d'initiation de

l'arthrite diminue la sévérité de la maladie, mais le développement d'une arthrite établie

reste inchangé (Frey et al. 2005; Morgan et al. 2005). Des études récentes ont démontré

que par exemple les cellules dendritiques immatures pouvaient influencer le

développement d'une nouvelle population de cellules Treg (CD49b+) in vivo, et être

utilisées comme agent thérapeutique potentiel pour soigner la CIA (Charbonnier et al.

2006). L'activation ou la réactivation de cellules Treg chez les patients, pourrait donc

constituer un traitement potentiel de la PR, mais de nombreuses incertitudes persistent

encore concernant l'efficacité et la stabilité de telles stratégies in vivo.

2.2. Rôle des macrophages

Les macrophages sont considérés comme des cellules majeures dans la

physiopathologie de la PR du fait de leur abondance dans la membrane synoviale

enflammée et à la jonction cartilage/pannus, leur état d'activation (cf Tableau 6), et

l'efficacité des traitements dirigés contre leurs produits.

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Introduction

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Classes de molécules surexprimées

Molécules Fonctions (potentielles)

CMH de classe II HLA-DR présentation d'antigènes impliqués dans la phase d'initiation ou la sévérité de la maladie

Cytokines et facteurs de croissance

TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, IL-18, MIF, GM-CSF

régulation de l'inflammation locale et systémique; remodelage tissulaire

Chimiokines et chimioattractants

IL-8, MIP-1, MCP-1, CXCL13 régulation de la migration monocytaire; stimulation de l'angiogenèse

Métalloprotéinases (MMP) MMP9, MMP12 dégradation tissulaire

Molécules de l'inflammation protéine C réactive (CRP) activation d'hépatocytes par macrophages synoviaux et fibroblastes

Tableau 6 : Etat d'activation des macrophages synoviaux et/ou des monocytes circulant dans la PR. D'après (Kinne et al. 2006).

Les macrophages n'occupent probablement pas une place indispensable dans la

phase d'initiation de la maladie, mais possèdent diverses capacités pro-inflammatoires, de

destruction et de remodelage tissulaire, et contribuent ainsi de façon non négligeable à

l'inflammation et à la destruction articulaire dans les PR (cf Tableau 7).

Fonctions Mécanismes Rôles (potentiels) dans la PR

Elimination de complexes immuns

fixation des Ig sur les recepteurs FCγR

élimination de CI, activation des monocytes/macrophages, production d'IL-1, TNF-α

activation du complément liaison des fractions du complément sur CR1 (CD35), CR3 (CD11b) et C5aR (CD88)

opsonisation des CI par le complément --> fixation sur récepteurs au complément des Mφ --> activation cellulaire, production d'IL-1, TNF-α

phagocytose de particules antigéniques

via les FcγR --> dégradation lysosomale et apprêtement antigénique sur CMH I et II

élimination de débris cellulaires et incorporation potentielle de molécules arthritogéniques; présentation Ag et activation de LT CD4+ et CD8+ --> initiation ou entretien de la maladie ?

chimiotactisme et angiogenèse

attraction de cellules inflammatoires; induction de néovascularisation

rétrocontrôle positif entre cytokines et facteurs chimiotactiques dérivés de Mφ (IL-8, MCP-1); stimulation de l'angiogenèse par l'IL-8 et des formes solubles de molécules d'adhésion

cicatrisation remodelage tissulaire via l'interaction avec les fibroblastes

recrutement de monocytes au site inflammatoire via un chimioattractant monocytaire : MIP-1α; phagocytose de débris de la MEC, production d'IL-1, TNF-α...

Tableau 7 : Fonctions des monocytes/macrophages et leur rôle dans la PR. D'après (Kinne et al. 2006).

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Introduction

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Les précurseurs de la lignée myélomonocytaire se différencient en plusieurs types

cellulaires (monocytes / macrophages, ostéoclastes ou cellules dendritiques) impliqués de

façon majeure dans la PR. En raison de la plasticité de ces précurseurs, les différentes

voies de différenciation peuvent être influencées par un déséquilibre dans la concentration

des cytokines ou des facteurs de croissance, et conduire à des modifications dans la

différenciation ou la maturation de ces cellules. Dans la PR, de tels déséquilibres existent

au sein de l'articulation enflammée, le sang périphérique et la moelle osseuse.

Dans la membrane synoviale rhumatoïde, les monocytes infiltrants se différencient

en macrophages matures et colonisent la bordure synoviale et le synovium plus profond

(Kinne et al. 2006). Localement, les macrophages synoviaux se différencient en sous-

populations stimulatrices ou inhibitrices, qui vont influencer de manière différente la

réactivité des cellules T dans l'arthrite. Dans la PR, les sous-populations de macrophages

pourraient être à la fois responsables de la synthèse de cytokines inflammatoires (comme

l'IL-1 ou le TNF-α) ou de la synthèse de cytokines régulatrices (IL-10 ou TGF-β1). Le

déséquilibre entre cytokines pro-inflammatoires et régulatrices est critique pour l'entretien

de la maladie, ainsi que pour l'induction de l'angiogenèse (Kinne et al. 2006).

Dans la moelle osseuse adjacente à l'articulation touchée, les précurseurs

myéloïdes sont plus abondant chez les patients atteints de PR que chez les patients

arthrosiques, et ceci en corrélation avec la quantité d'IL-1β (mais pas de GM-CSF ou d'IL-

6) présente dans le tissu synovial proximal (Kotake et al. 1992).

2.2.1. Activation des macrophages dans la PR

Au niveau de la membrane synoviale, les macrophages apparaissent clairement

activés, comme l'expression de plusieurs marqueurs le démontre (cf Tableau 6). Le degré

d'infiltration et d'activation des macrophages corrèle non seulement avec la douleur

articulaire et les indices d'inflammation, mais aussi avec la progression radiologique des

dommages articulaires (Mulherin et al. 1996). Une corrélation est également observée

entre la densité de macrophages synoviaux dans le sous-intima et l'amélioration clinique

qui fait suite aux traitements ce qui suggère que le nombre de macrophages synoviaux

pourrait être utilisé en tant que "biomarqueur" de l'amélioration clinique (Haringman et al.

2005).

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Les cellules dendritiques d'origine myéloïde sont aussi plus abondantes dans le

compartiment synovial en cas de PR. Leur capacité à présenter les antigènes ainsi que leur

localisation dans les aggrégats lymphoïdes périvasculaires constituent les conditions

préalables optimales pour la présentation d'un antigène arthritogénique potentiel aux

cellules T, et pour la régulation des cellules B (Kinne et al. 2006). D'autre part, les cellules

dendritiques peuvent se trans-différencier en ostéoclastes dans certaines conditions

cytokiniques permissives (présence de M-CSF et RANKL) (Rivollier et al. 2004), et ainsi

contribuer à la destruction osseuse.

Au site de la destruction tissulaire, les macrophages expriment des quantités

significatives de médiateurs inflammatoires comme l'IL-1, le TNF-α et le GM-CSF, et

contribuent à la production de métalloprotéinases de la matrice (MMP). Un rôle particulier

dans les dommages du cartilage semble être joué par MMP-9 (Ahrens et al. 1996) et par

MMP-12 qui est spécifique des macrophages (Wang et al. 2004). La capacité des

macrophages à détruire la matrice cartilagineuse semble toutefois réduite. Ils sont plus

considérés comme des "amplificateurs" (particulièrement via l'activation de fibroblastes)

que comme des effecteurs initiaux de la destruction tissulaire.

La contribution des cellules de type macrophagique semble assez différente à la

jonction os/pannus, où des ostéoclastes dérivés de la lignée myélomonocytaire

contribuent de façon importante à la destruction osseuse. Au niveau de ce site,

l'importance du système ostéoprotégérine/ RANKL/ RANK, est clairement reconnue; ainsi

toute forme d'interférence dans ce système pourrait devenir un traitement efficace de la PR

ou au contraire favoriser la destruction osseuse. D'autre part, l'inhibition de la fonction

ostéoclastique par un amino-biphosphonate a été décrite comme cible efficace pour

empêcher la perte osseuse dans un modèle expérimental d'arthrite et pourrait représenter

un moyen pour préserver l'articulation et la structure osseuse chez l'homme (Goldring and

Gravallese 2004).

2.2.2. Stimulation/ régulation de l'activation des macrophages dans la PR

Plusieurs mécanismes semblent réguler la fonction effectrice des macrophages,

comme la production de cytokines. Ils incluent à la fois des facteurs solubles, mais aussi

les contacts que les macrophages vont établir avec différentes cellules inflammatoires ou

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- 26 -

mésenchymateuses : les lymphocytes T, les fibroblastes, ou encore les cellules

endothéliales.

2.2.2.1. Interactions cellulaires

En réponse à une interaction avec des cellules T, les monocytes vont produire des

MMP, de l'IL-1α ou de l'IL-1β (Brennan and Foey 2002; Burger and Dayer 2002). In vitro,

des cellules T pré-activées via leur complexe TCR/CD3, stimulent la production à la fois

de TNF-α et d'IL-10 par les monocytes. Des cellules T activées en absence de stimulation

de leur TCR (indépendamment d'un antigène), régulent aussi la production de cytokines

des monocytes. L'activation de cellules T par des cytokines, IL-15 ou IL-2 seules ou en

combinaison avec du TNF-α et de l'IL-6, stimulent la sécrétion par les monocytes de TNF-

α seulement, et pas d'IL-10 (Sebbag et al. 1997). Ainsi, ce type d'interaction entre

macrophages et cellules T stimulées par des cytokines abondantes dans le synovium au

cours de l'inflammation chronique, pourrait contribuer à la production excessive de TNF-α

et rendre compte du relatif déficit en IL-10 observé dans l'articulation rhumatoïde.

En raison du nombre important de macrophages et de fibroblastes, ainsi que de

leur niveau d'activation dans le tissu synovial rhumatoïde, l'interaction entre ces cellules est

cruciale pour l'inflammation et les dommages tissulaires qui en résultent, puisqu'elle induit

la production d'IL-6, de GM-CSF et d'IL-8 (Chomarat et al. 1995). En outre, des

fibroblastes synoviaux humains purifiés et cultivés avec des cellules myélomonocytaires,

induisent la dégradation de cartilage in vitro avec la contribution essentielle d'IL-1 et de

TNF-α solubles (Scott et al. 1997).

L'interaction entre monocytes et cellules endothéliales dans la PR est essentielle

pour l'afflux de monocytes activés dans la membrane synoviale et dépend de l'expression

modifiée des intégrines et sélectines à la surface de ces cellules. Puisque l'environnement

cytokinique synovial (particulièrement le TNF-α produit par les macrophages) régule

positivement l'expression de ces molécules, il en résulte un cycle d'auto-entretien dans

lequel les macrophages eux-mêmes favorisent l'afflux et l'activation de monocytes

circulants (Kinne et al. 2006).

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- 27 -

2.2.2.2. Facteurs solubles

Outre les contacts cellulaires, de nombreuses cytokines vont moduler de manière

positive ou négative l'activité des macrophages.

2.2.2.2.1. Cytokines pro-inflammatoires

Le MIF ("macrophage migration inhibitory factor") est une des premières cytokines à

avoir été découverte. Le MIF est sécrété de manière précoce et abondante par les

macrophages, et stimule de manière autocrine de nombreuses fonctions macrophagiques

comme la sécrétion de TNF-α, la phagocytose ou encore la production d'espèces

réactives oxygénées (ROS). De plus, il confère aux macrophages et aux fibroblastes

synoviaux une résistance à l'apoptose, prolongeant ainsi la survie de cellules activées

jouant un rôle important dans la pathologie de la PR. En outre, dans la PR, MIF est

surexprimé dans le sérum et le liquide synovial en corrélation avec l'activité de la maladie

(Morand and Leech 2005).

L'IL-18, membre de la famille de l'IL-1, est exprimée dans la membrane synoviale

rhumatoïde majoritairement par des macrophages CD68+ contenus dans des agrégats

lymphoïdes. Les macrophages CD14+ du liquide synovial expriment également le

récepteur à l'IL-18 (Gracie 2004). L'IL-18, seule ou combinée avec l'IL-12 et l'IL-15,

augmente fortement la production d'IFN-γ, de TNF-α, de GM-CSF et de NO par des

cellules synoviales en culture. Cette cytokine peut également stimuler la formation

d'ostéoclastes à travers la régulation positive de production de RANKL par les cellules T au

cours de la synovite rhumatoïde (Dai et al. 2004). Enfin, l'IL-18 joue également un rôle

dans la stimulation des réponses immunes de type TH1 et TH2 (pour revue cf (Nakanishi et

al. 2001)).

L'IL-15, membre de la famille de l'IL-2, est synthétisée par les cellules de la couche

bordante (incluant les macrophages), et sa concentration est augmentée dans le liquide

synovial des patients atteints de PR (McInnes and Gracie 2004). Les cellules T circulantes

ou de la membrane synoviale, stimulées par de l'IL-15 induisent les macrophages à

produire de l'IL-1β, du TNF-α ou de l'IL-8 (Sebbag et al. 1997; McInnes and Gracie

2004), mais pas de cytokine régulatrice comme l'IL-10. L’IL-15 étant également produite

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- 28 -

par les macrophages eux-mêmes, elle pourrait (re)stimuler les cellules T et auto-entretenir

une boucle pro-inflammatoire (McInnes and Gracie 2004).

L'IL-17, a été évoquée précédemment à propos de l’activation des lymphocytes T

synoviaux. C’est une lymphokine produite dans ~90% des cultures d'explants synoviaux

rhumatoïdes (contre seulement 16% d'explants arthrosiques), qui stimule fortement la

production de TNF-α et d'IL-1 par les macrophages (Jovanovic et al. 1998). En outre, l'IL-

17 induit indirectement la formation d'ostéoclastes à partir de cellules progénitrices

(Kotake et al. 1999) et augmente la production de NO dans les chondrocytes articulaires

(Shalom-Barak et al. 1998), contribuant ainsi à la destruction cartilagineuse et osseuse. En

raison de ses effets pléiotropes sur la production de médiateurs inflammatoires et sur la

dégradation du cartilage et de l'os, l'IL-17 représente donc une autre cible thérapeutique

dans l'arthrite (Lubberts et al. 2004), en combinaison avec des anti-TNF-α ou anti-IL-1.

2.2.2.2.2. Cytokines régulatrices

L'IL-4, cytokine anti-inflammatoire de type TH2, est connue pour avoir un rôle

protecteur dans l'arthrite, bien que sa concentration soit très faible au sein de l'articulation

rhumatoïde. L'IL-4 peut moduler négativement la cytotoxicité des macrophages et la

production de cytokines comme le TNF-α ou de son récepteur (Kinne et al. 2006).

Notamment, l'IL-4 diminue la production d'IL-1β tandis qu'elle augment celle de l'IL-1Ra,

assurant ainsi une fonction anti-inflammatoire "coordonnée" (Allen et al. 1993). Enfin, l'IL-

4 réduit la résorption osseuse et la prolifération de synoviocytes in vitro (Kinne et al.

2006).

L'IL-10, est une cytokine de type TH2, synthétisée par les macrophages, qui présente

des fonctions autocrines. Elle réduit l'expression des molécules HLA-DR et la présentation

antigéniques dans les monocytes, et inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires,

de GM-CSF et des récepteurs Fcγ par les macrophages synoviaux (Isomaki et al. 1996).

En dépit d'une augmentation de l'IL-10 dans le sérum et le compartiment synovial chez les

patients atteints de PR (Isomaki et al. 1996)), plusieurs études ont suggéré qu'il existait un

défaut en IL-10 (Kinne et al. 2006).

L'IL-13, tout comme l'IL-4 et L'IL-10, L'IL-13 a des effets immuno-suppresseurs dans

des modèles expérimentaux d'arthrite, comme dans l'arthrite induite à l'adjuvant chez le rat

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(Woods et al. 2002). En outre, l'incubation d'explants de tissu synovial rhumatoïde ou de

cellules mononucléées du liquide synovial avec de l'IL-13, diminue la production d'IL-1 et

de TNF-α (Woods et al. 2000).

2.2.3. Molécules effectrices des macrophages dans la PR

2.2.3.1. Cytokines pro-inflammatoires

Le TNF-α est une cytokine aux effets pléiotropes, qui augmente l'expression de

cytokines, de molécules d'adhésion, de PGE2, de collagénase et de collagène par les

synoviocytes. Dans la PR, cette cytokine est majoritairement produite par les macrophages

dans la membrane synoviale et à la jonction cartilage-pannus. Le rôle critique du TNF-α -

est supporté par plusieurs observations expérimentales :

- le TNF-α, combiné avec l'IL-1, induit une synovite (van den Berg et al. 1999)

- une expression dérégulée, transgénique de TNF-α provoque le développement

d'une arthrite chronique (Kollias 2004)

- la neutralisation du TNF-α supprime des arthrites expérimentales.

Le TNF-α existe sous 2 formes : soluble et membranaire, toutes deux agissant en

tant que médiateurs pro-inflammatoires. La forme trans-membranaire va agir localement,

par contact cellulaire en stimulant principalement le récepteur p75 (TNF-R2 : récepteur de

faible affinité). Au contraire, la forme soluble, libérée par clivage de la forme trans-

membranaire par des MMP, stimule principalement le récepteur p55 (TNF-R1, récepteur

de haute affinité), et agit à distance de façon plus transitoire (Kinne et al. 2006). En

accord avec le rôle central du TNF-a dans l'arthrite, l'administration d'anticorps

monoclonaux chimériques ou humanisés anti-TNF-a, est d'une efficacité clinique

remarquable (Feldmann and Maini 2001).

L'IL-1, est exprimée majoritairement par les macrophages CD14+ (Wood et al.

1992). Son taux dans le liquide synovial corrèle avec l'inflammation articulaire (Arend et

al. 1998). Cette cytokine est un médiateur majeur de la destruction articulaire du fait de

ses effets sur la synthèse et la dégradation des protéolycannes. L'IL-1 induit la production

des MMP-1 et -3 et favorise la résorption osseuse (Arend et al. 1998). Dans la PR, il y a

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un déséquilibre entre l'IL-1 et son inhibiteur physiologique l’IL1-ra (cf ci-dessous) en faveur

de l'IL-1 (Arend et al. 1998).

Les chimiokines, correspondant à une superfamille subdivisée en quatre sous-

familles (CXC, CC, C et CX3C), sont de petites protéines spécialisées dans le recrutement

de populations leucocytaires à travers un grand nombre de récepteurs trans-

membranaires. Les chimiokines favorisent non seulement l'afflux de monocytes dans le

tissu enflammé, mais jouent aussi un rôle clé dans l'activation et la fonction des

monocytes/macrophages (Mantovani et al. 2004). Dans la PR, les macrophages

synthétisent plusieurs chimiokines, CCL3, CCL5 (RANTES) ou CX3CL1 (fractalkine), et

expriment en même temps les récepteurs à ces chimiokines indiquant l'existence de

boucles autocrines (Haringman et al. 2003). En outre, les chimiokines sont régulées

positivement par le TNF-α et l'IL-1 produites également par les macrophages. Enfin,

certaines chimiokines exprimées par les macrophages (IL-8, fractalkine) sont de puissants

stimulateurs de l'angiogenèse, et constituent donc le lien entre l'activation macrophagique

et la néo-vascularisation importante du synovium rhumatoïde (Koch 2003).

2.2.3.2. Cytokines anti-inflammatoires/régulatrices

Outre des médiateurs inflammatoires, les macrophages produisent des cytokines

anti-inflammatoires et particulièrement l'IL-10 (décrite dans la section précédente) ou l'IL-

1Ra.

L'IL-Ra est un récepteur antagoniste de l'IL-1 constitutivement exprimé par les

macrophages différenciés, qui se fixent sur les récepteurs de l'IL-1 sans provoquer de

réponse. Cette protéine est significativement régulée de manière positive par des

médiateurs pro-inflammatoires, dont l'IL-1 lui-même, ou le GM-CSF, et possède de

puissants effets anti-inflammatoires (Arend et al. 1998).

2.2.3.3. Cytokines avec un double rôle dans l'arthrite

L'IL-6 est la cytokine la plus abondante dans la PR, particulièrement dans le liquide

synovial durant les phases actives de la maladie (Houssiau et al. 1988). Cependant, alors

que la concentration d'IL-6 dans le liquide synovial corrèle avec l’intensité des lésions

articulaires évaluée radiologiquement, et que l'IL-6 et ses récepteurs solubles favorisent la

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génération d'ostéoclastes (Kotake et al. 1996), cette cytokine a des effets différents selon

la phase de la maladie. En effet, elle protège le cartilage en phase aigüe de

l'inflammation, en limitant la perte en protéoglycane, mais favorise la formation osseuse

excessive en phase chronique de la maladie, en augmentant la formation d'ostéophytes

(van de Loo et al. 1997). L'IL-6 est également impliqué dans la prolifération des

fibroblastes synoviaux (Mihara et al. 1995). Enfin, cette cytokine a été décrite comme étant

un facteur de différenciation, de croissance et d'activation des cellules B (Kishimoto 2006).

Le TGF-β, est le principal régulateur du remodelage du tissu conjonctif, en

contrôlant à la fois la production et la dégradation de matrice (Kinne et al. 2006). Il

favorise aussi la surproduction d'acide hyaluronique, caractéristique de la PR. Les effets

pro-inflammatoires du TGF-β s'appuient sur l'induction de l'expression du récepteur

FcγRIIIa par les macrophages (qui permet le relargage de ROS, participant à la

dégradation tissulaire) ou encore sur la promotion de l'adhésion et l'infiltration des

monocytes durant la phase aigüe de l'inflammation. Dautre part, le TGF-β présente des

propriétés anti-inflammatoires. Il contrebalance certains effets de l'IL-1, comme la

production de MMP (Chen and Wahl 2002). Enfin, le TGF-β permet d'induire, seul ou en

synergie avec l'IL-6, la différenciation de cellules T CD4+ naïves respectivement en cellules

T régulatrices ou en cellules TH17 (pour revue cf (Bettelli et al. 2007)).

2.2.3.4. NO et espèces réactives oxygénées (ROS)

Les macrophages de la bordure synoviale sont une source importante de NO

(McInnes et al. 1996). Les niveaux de NO et de NO synthase inductible (iNOS) sont

élevés respectivement, dans le sérum et les macrophages dérivés du sang périphériques

chez les patients avec une PR active. Le NO a pour effet d'induire la production de TNF-a

par les synoviocytes favorisant ainsi la synovite (McInnes et al. 1996). Cependant des

effets protecteurs ont également été décrits dans des modèles d'auto-immunité

expérimentale (Bogdan 1998).

Dans la PR, les macrophages produisent également des ROS, impliqués dans des

processus inflammatoires, incluant la régulation de la production de MMP. Les ROS

entrainent une dégradation des composants de la matrice (Henrotin et al. 2003). Enfin,

l'augmentation de production de ROS dans les monocytes sanguins dans la PR, corrèle

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- 32 -

avec les quantités plasmatiques de TNF-α, confirmant ainsi l'effet stimulateur de cette

cytokine sur la production de ROS (Miesel et al. 1996).

2.3. Autres cellules

2.3.1. Les neutrophiles

Les neutrophiles sont rares au sein d'une cavité articulaire normale et au sein du

tissu synovial, mais ils s'accumulent dans le liquide synovial rhumatoïde où ils représentent

le type cellulaire majoritaire. Ils vont être recrutés dans l'articulation par des mécanismes

similaires à ceux impliqués dans le recrutement de monocytes/ macrophages; cela inclut

une augmentation de l'expression et de l'affinité de molécules d'adhésion sur les cellules

endothéliales et sur les neutrophiles, ainsi que diverses cytokines et chimiokines. Les

raisons pour lesquelles ces cellules s'accumulent dans le liquide plutôt que dans le tissu

synovial ne sont pas complètement élucidées, bien que des facteurs chimiotactiques des

neutrophiles (par exemple IL-8, C5a, leucotriène B4) soient présents à des concentrations

élevées dans le liquide articulaire, tout comme certains médiateurs anti-apoptotiques des

neutrophiles (C5a, GM-CSF) (Nigrovic and Lee 2006).

Les neutrophiles semblent importants dans la physiopathologie de la PR puisque

leur activation via le complément ou les FcγRIIa et FcγRIIIb les pousse à synthétiser une

grande variété de médiateurs avec des effets pro-inflammatoires et de destruction

tissulaire. Ces médiateurs incluent l'IL-1, le TNF-α, l'IL-8, des leucotriènes, des

collagénases ou encore des élastases (Nigrovic and Lee 2006). Leur rôle fonctionnel dans

des modèles expérimentaux d'arthrite a été exploré. Par exemple, dans le modèle K/BxN,

la déplétion en neutrophiles avant l'injection de sérum arthritique modère l’arthrite et limite

le dépôt de CI dans l'articulation (Wipke et al. 2004).

2.3.2. Les mastocytes

Les mastocytes s'accumulent généralement dans des sites d'inflammation chronique

et l'articulation rhumatoïde ne fait pas exception. Bien que la variabilité entre patients soit

importante, les mastocytes représentent 5% ou plus de l'infiltrat cellulaire synovial. Ces

cellules sont localisées dans le sous-intima et proches des zone d'érosions actives du

cartilage ou de l’os (Nigrovic and Lee 2006). Ils sont recrutés à partir du sang circulant et

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synthétisent des médiateurs tels que l'histamine, retrouvée fréquemment en concentration

élevée dans le liquide synovial de patients atteints de PR (Malone et al. 1986). En outre,

elles peuvent synthétiser une grande variété de facteurs pro-inflammatoires comme le

TNF-α, l'IL-1 et l'IL-6, mais aussi des chimioattractants pour les neutrophiles et les

macrophages (leucotriène B4, IL-8, MCP-1).

Des modèles animaux ont permis de mieux comprendre le rôle et l'importance de

ces cellules dans la PR. Dans le modèle K/BxN par exemple, des souris déficientes en

mastocytes sont résistantes à l'arthrite induite par transfert de sérum arthritique (Lee et al.

2002).

2.3.3. Autres cellules

D'autres cellules ont également été décrites dans l'articulation rhumatoïde que je

n'évoquerai pas plus en détail. On peut citer les cellules dendritiques, les cellules NK, NKT

ou encore les lymphocytes Tγδ.

2.4. Rôle des lymphocytes B

Une démonstration directe du rôle de ces lymphocytes B dans la physiopathogénie

de la PR est l'obtention d'une amélioration clinique prolongée chez des patients atteints de

PR suite à un traitement avec un anticorps dirigé contre la molécule CD20 (rituximab), un

antigène membranaire impliqué dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B (De

Vita and Quartuccio 2006). Cet anticorps induit la déplétion des lymphocytes B par

différents mécanismes incluant une apoptose via la coagrégation des molécules CD20 à

la membrane de la cellule, une cytotoxicité dépendante des anticorps impliquant

l’engagement des FcγR à la surface de cellules mononucléées avoisinantes, ou encore une

cytotoxicité résultant de l’action du complément par la formation du complexe d’attaque

membranaire.

En tant que cellules effectrices de la réponse immune humorale, les lymphocytes B

peuvent contribuer à la fois à l'initiation et à l'entretien de cette réponse immune

provoquant ainsi une synovite chronique. S’agissant du rôle pathogène des autoanticorps

associés à la PR en général, il faut mentionner qu’une étude très récente a montré que des

IgG humaines purifiées à partir du sérum de patients atteints de PR sont capables d’induire

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Introduction

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une arthrite après injection intrapéritonéale à des souris déficientes pour la forme

inhibitrice du récepteur de faible affinité aux IgG, le récepteur FcγRIIB (Petkova et al.

2006).

En plus d'être les précurseurs de plasmocytes, les cellules B peuvent agir en tant

que cellules présentatrices d'antigène efficaces, et participer à l'activation de cellules T

auto-réactives. En outre, des cellules B activées peuvent synthétiser et sécréter des

cytokines, et exposer des molécules à leur surface, pouvant favoriser l'activation de cellules

T adjacentes de manière non spécifique. Dans ce chapitre, je décrirai les fonctions des

lymphocytes B à la fois dépendantes et indépendantes des Ig dans la PR.

2.4.1. Accumulation de cellules B dans le synovium rhumatoïde

Des analyses histopathologiques ont montré que plus de 60 % des prélèvements de

tissu synovial de patients atteints de PR contiennent des infiltrats de lymphocytes B et T.

Trois profils différents d'infiltrats lymphocytaires ont été décrits (Takemura et al. 2001;

Weyand and Goronzy 2003):

- des infiltrats lymphocytaires diffus avec des cellules dendritiques interdigitées

- des agrégats peu organisés de cellules T et B infiltrantes, associées avec des

cellules dendritiques interdigitées

- des lymphocytes T et B regroupés en agrégats autour de cellules dendritiques

interdigitées, et associés en réseau avec des cellules dendritiques folliculaires.

Ces agrégats sont retrouvés chez moins d'un tiers des patients, particulièrement

dans des zones adjacentes à la destruction cartilagineuse et osseuse. En général, les

caractéristiques histologiques de ce type d'infiltration, (dite en nodule lymphoïde), sont

similaires à celles des centres germinatifs (CG) au sein des organes lymphoïdes

secondaires qui se forment au cours de réponses antigéniques spécifiques.

Ce type d'organisation ne semble cependant pas entièrement spécifique de la PR.

En effet, chez les patients atteints de spondylarthrite ankylosante, au niveau des

articulations touchées, des agrégats de type CG ont quelquefois été décrits.

L'accumulation de lymphocytes B dans ces tissus lymphoïdes ectopiques semble être

commune aux synovites inflammatoires, mais pas spécifique du synovium rhumatoïde. Par

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contre, l'accumulation de plasmocytes semble plus spécifique de la PR (pour revue cf

(Silverman 2006)).

De nombreuses cellules présentes dans le synovium rhumatoïde, parmi lesquelles

les fibroblastes et les cellules dendritiques, produisent des facteurs capables d'affecter la

survie des cellules B, leur circulation et leur organisation comme par exemple le facteur

d'activation des cellules B de la famille du TNF-α (BAFF "B cell-activating factor of the TNF

family"), des chimiokines comme CXCL13 et CXCL12, l'IL-6 ou encore la lymphotoxine β

(cf Tableau 8).

Facteurs Fonctions

CXCL12 (SDF-1) chimioattractant cellules B et plasmocytes

CXCL13 chimioattractant cellules B

Lymphotoxine-β - organisation de cellules B dans des structures lymphoïdes - induction de CXCL13

IL-5, IL-6, TNF-α favorisent l'accumulation et la survie de cellules B

BAFF survie et prolifération de cellules B immatures et matures

APRIL survie de cellules B matures et de plasmocytes

TNF-α et IFN-γ augmentation de production de BAFF et APRIL

Tableau 8 : Facteurs capables de favoriser l'accumulation de cellules B dans le synovium. D'après (Mauri and Ehrenstein 2007).

Dans les tissus lymphoïdes périphériques, les cellules B expriment constitutivement

la lymphotoxine-αβ (LT-αβ), qui peut s'engager avec le récepteur LT-β sur les cellules

stromales. En retour ces dernières vont produire une chimiokine CXCL13, capable d'attirer

les lymphocytes B qui expriment à leur surface le récepteur à cette chimiokine, CXCR5

(Silverman 2006). La chimiokine CXCL12 est également présente dans le synovium

rhumatoïde. CXCL12 et CXCL13, produites par les fibroblastes synoviaux, jouent un rôle

important dans l'accumulation de lymphocytes B dans les structures lymphoïdes ectopiques

du synovium rhumatoïde. BAFF (également appelé BLyS), facteur de survie de la famille du

TNF, est présent à des concentrations élevées dans le liquide synovial rhumatoïde, ce qui

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suggère que ce facteur, d'une part, soit produit localement dans les articulations

enflammées, et d'autre part contribue à l'accumulation de lymphocytes B dans ce tissu

(Tan et al. 2003).

Le rôle des lymphocytes B dans le maintient des structures de type CG, a été

abordé dans un modèle de souris chimériques immunodéficientes SCID, greffées avec des

fragments de membrane synoviale de patients atteints de PR. La déplétion des cellules B à

l’aide d’un anticorps anti-CD20 s'est accompagnée de la déstructuration des

microstructures lymphoïdes (Takemura et al. 2001).

2.4.2. Cellules B en tant que cellules présentatrices d'antigène

Les cellules B sont des cellules présentatrices d'antigène (CPA) efficaces. Elles

capturent l'antigène via leur récepteur de membrane spécifique d'antigène (BCR), au

contraire d'autres CPA conventionnelles comme les macrophages, capturant l’antigène de

manière non spécifique. Les cellules B vont internaliser l'antigène, l'apprêter puis le

présenter sur les molécules de CMH de classe II et le présenter de manière efficace aux

lymphocytes T CD4+.

Dans le modèle de souris chimériques décrit précédemment, Takemura et ses

collaborateurs ont également étudié le rôle joué par les cellules B dans l'activation de

cellules T CD4. Des clones de cellules T CD4 ont été isolés par microdissection à partir de

follicules lymphoïdes de membranes synoviales rhumatoïdes humaines, et transférés à des

souris SCID greffées avec du tissu synovial autologue. Le transfert a induit une

augmentation de la transcription de l'IFN-γ, du TNF-α et de l'IL-1β. Par contre, la

déplétion des lymphocytes B par un anti-CD20, a provoqué une diminution de l'activation

des cellules T CD4 et notamment des transcrits de l'IFN-γ et de l'IL-1β. La présence de

CPA autres que les cellules B n'était donc pas suffisante pour maintenir une activation des

lymphocytes T (Terakawa et al. 1991).

En outre, l'implication des cellules B dans la préactivation de cellules T a été

disséquée dans un modèle d'arthrite induite au protéoglycanne (PG) en utilisant des souris

déficientes dans la sécrétion d'anticorps (souris mIgM). Ces souris expriment un transgène

codant pour une IgM de membrane spécifique d'un haptène : le 4-hydroxy-3-nitro-phenyl

acétyl (NP). Des cellules T isolées de souris mIgM immunisées par du PG ont été

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incapables d'induire une arthrite dans des souris SCID, même lorsqu'elles étaient co-

injectées avec des cellules B provenant de souris arthritiques (arthrite induite au PG), ce

qui suggérait que les cellules T n'étaient pas activées efficacement et que des cellules B

spécifiques d'antigène pourraient être requises. En effet, le ciblage du PG sur les cellules B

en utilisant du NP couplé à du PG, a permis la différenciation de cellules T

arthritogéniques capables de transférer la maladie. De plus, le transfert d'auto-anticorps a

également été essentiel au développement d'une maladie sévère, ce qui indique que les

cellules B jouent deux rôles complémentaires dans la pathogenèse de la maladie

correspondant à la fois à l'activation de cellules T et à la production d'anticorps (O'Neill et

al. 2005).

2.4.3. Rôle des cellules B dans des modèles murins d'arthrite

2.4.3.1. Modèle d'arthrite induite au collagène (CIA, "Collagen-induced arthritis")

L'immunisation de souches de souris prédisposées DBA/1 (H2q) avec du collagène

de type II (CII) induit une arthrite. A la fois l'immunité des cellules T et B au collagène a été

impliquée dans l'induction de la maladie.

Bien que les cellules T jouent un rôle important dans la pathogenèse de la CIA, les

anticorps anti-CII paraissent être les médiateurs principaux de l'immunopathogenèse. En

effet, une arthrite, même si elle n'est pas aussi sévère qu'après immunisation avec du CII,

peut être induite dans des souches non-sensibles par transfert d'anticorps anti-CII purifiés à

partir de souris arthritiques ou d'un mélanges d'anticorps monoclonaux anti-CII (Terato et

al. 1992). L'arthrite peut aussi être induite par transfert d'anti-CII dans des souris

déficientes à la fois en cellules B et en cellules T (Nandakumar et al. 2004). De plus, chez

les souris DBA/1, un seul anticorps monoclonal IgG anti-CII peut induire une arthrite

persistante avec une infiltration cellulaire et une destruction cartilagineuse et osseuse

(Nandakumar et al. 2003).

Les fonctions effectrices activées par les IgG spécifiques sont nécessaires à

l'induction d'une arthrite. En effet, l'utilisation de fragments F(ab')2 d’anticorps anti-CII ne

permet pas d'induire une arthrite (Kagari et al. 2003). En outre, en dépit de fortes

concentrations en anticorps anti-CII, les souris de fond génétique DBA/1, ont une arthrite

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modérée en absence de certaines fractions du complément, C3 ou le facteur B, et sont

complètement résistantes en absence de C5 (Hietala et al. 2004). A la fois les voies

classique et alterne du complément sont impliquées dans la pathogenèse de la CIA.

Enfin, bien que des réponses T et B soient toujours induites par une immunisation

avec du CII, aucune arthrite n'est induite dans des souris déficientes pour les gènes codant

pour le récepteur FcγRIII (Diaz de Stahl et al. 2002), ce qui met en évidence une

contribution également des FcγR dans la pathogenèse de ce modèle murin d'arthrite

induite.

2.4.3.2. Modèle K/BxN

Ce modèle a été découvert, par l'équipe de Benoist et Mathis, de façon fortuite,

lors d'un croisement entre une souris KRN (de fond génétique C57Bl/6) et une souris

NOD (Kouskoff et al. 1996). La souris KRN, porte un transgène codant pour un TCR

spécifique de la ribonucléase bovine. Par pure coïncidence, dans le contexte de molécules

de classe II Ag7 des souris NOD, ce récepteur reconnaît également un peptide d’une

enzyme de la glycolyse : la glucose-6-phosphate isomérase (GPI) (Matsumoto et al.

1999). L'arthrite qui résulte de ce croisement est très similaire à la PR (inflammation

symétrique des articulations, formation d'un pannus, accumulation de neutrophiles dans la

cavité articulaire). De plus, l'arthrite peut être transférée directement à d'autres souris via

l'administration de sérum de souris K/BxN (Korganow et al. 1999).

Bien que les cellules T et B soient requises pour initier la maladie, elles ne jouent

pas un rôle crucial. Les anticorps anti-GPI ont en effet permis d'induire une arthrite chez

des souris receveuses déficientes en lymphocytes (RAG-/-). Par contre, des souris déficientes

pour certains composants de la voie alterne du complément (C3 et facteur B) se sont

révélées résistantes, tout comme des souris déficiente en C5a ou son récepteur. La voie

alterne du complément semble cruciale pour induire une inflammation, au contraire de la

voie classique du complément. En outre, le récepteur FcγRIII mais pas FcγRI est

indispensable (Ji et al. 2002).

Enfin, d'autres expériences ont montré que des souches de souris déficientes en

mastocytes étaient résistantes au développement d'une inflammation articulaire et que leur

sensibilité est restaurée après injection de mastocytes. Dans le modèle K/BxN, les

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mastocytes pourraient servir de lien cellulaire entre les anticorps, les médiateurs solubles et

les autres populations de cellules effectrices. Elles agiraient en libérant des médiateurs

inflammatoires après leur activation et leur dégranulation rapide suite au transfert de

sérum arthritique (Lee et al. 2002).

Mais comment un antigène ubiquiste, ici une enzyme cytoplasmique, peut-il induire

une maladie auto-immune spécifique des articulations ? Pour répondre à cette question,

Matsumoto et ses collaborateurs ont tout d'abord étudié plus en détail la GPI et montré

qu'il n'y avait, par rapport à d’autres tissus, aucune modification dans la forme ou même

la quantité de GPI exprimée au sein des articulations. Par contre, ils ont montré par

immunohistologie que dans une cavité articulaire saine, la GPI s'accumulait

extracellulairement, majoritairement le long de la surface cartilagineuse. Chez les souris

arthritiques, ces dépôts étaient encore plus importants et colocalisaient avec la fraction C3

du complément ainsi qu'avec des IgG. Les auteurs ont ainsi proposé que des complexes

GPI/anti-GPI à la surface articulaire puissent initier une cascade inflammatoire via

l'activation de la voie alterne du complément, qui ne serait pas correctement régulée du

fait de l'absence d'inhibiteurs physiologiques au niveau de la surface cartilagineuse non-

cellulaire (Matsumoto et al. 2002).

Qu'en est-il chez l'homme ? Tout comme chez les souris K/BxN, chez les patients

atteints de PR, des dépôts similaires de GPI ont été observés au niveau de la surface

érosive du pannus (Matsumoto et al. 2002). Concernant les auto-anticorps anti-GPI, ils

ont été retrouvés chez les patients atteints de PR. Cependant, leur détection ne semble pas

avoir un grand intérêt. En effet, bien que certains patients aient révélé des titres assez

élevés d'anti-GPI, au total, seulement 15% des patients atteints de PR avaient ces

anticorps, fréquence similaire à celle observée chez des patients contrôles atteints d'autres

maladies rhumatologique et/ou auto-immunes (Matsumoto et al. 2003).

2.4.4. Complexes immuns dans la polyarthrite rhumatoïde

L'interaction d'antigènes avec des anticorps permet la formation de complexes dont

la taille dépendra du ratio Ag/Ac et du type d'anticorps impliqué (les IgG ont deux sites de

fixation à l'antigène alors que les IgM pentamériques en on dix). Ces complexes peuvent

se former dans la circulation ou par fixation d'anticorps à un antigène dans l'espace

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extravasculaire. Cette formation de complexes immuns est un événement classique dans la

réponse immune humorale et qui permet l’activation du complément ou de cellules

portant des récepteurs Fc (cf ci-après).

2.4.4.1. Complexes immuns circulant dans la polyarthrite rhumatoïde

De nombreuses études se sont intéressées à la prévalence des CI circulants chez les

patients atteints de PR. Généralement, plus de la moitié des patients atteints de PR ont des

CI de taille variable (du simple dimère de FR au complexe antigène/anticorps dans le

sang). Du FR est très fréquemment présent dans ces complexes mais pas de manière

systématique (Mageed et al. 1991). Les concentrations en CI peuvent être corrélées avec

l'activité de la maladie, et, de façon caractéristique, leur concentration ainsi que leur taille

sont élevées chez les patients présentant des manifestations extra-articulaires.

2.4.4.2. Complexes immuns dans l'articulation rhumatoïde

L'activation importante de la voie classique du complément dans le liquide synovial,

a suggéré l'implication de complexes immuns fixant le complément qui sont effectivement

régulièrement observés au sein de l'articulation rhumatoïde. Des études

immunohistologiques du synovium rhumatoïde ont révélé un marquage inégal d'IgG dans

la couche bordante, la sous-intima et les vaisseaux. L'agrégation de ces IgG dans des CI a

été supposée en raison de la nature granulaire de ces dépôts et de la co-localisation avec

les fractions C3 et C4 du complément, dans le tissu synovial.

Des CI ont aussi été identifiés dans le liquide synovial chez la majorité des patients,

souvent à des quantités significativement supérieures à celle des sérums appariés (pour

revue cf (Nigrovic and Lee 2006)). La formation de tels complexes pourrait être favorisée

par la présence d'acide hyaluronique dans l'articulation, qui augmenterait l'avidité du FR

par un mécanisme mal connu (Faaber et al. 1989).

Un autre site potentiellement important pour des dépôts de CI dans l'articulation est

le cartilage. Des études dans un modèle d'arthrite induite chez le lapin ont révélé un

attachement préférentiel et prolongé de complexes Ag/Ac au niveau du cartilage du

ménisque et des ligaments tandis qu’au niveau de la bordure synoviale ces CI étaient

rapidement éliminés. Ce phénomène a été observé dans d'autres modèles d'arthrite ainsi

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que chez l'homme, notamment au niveau du cartilage articulaire et du ménisque de la

plupart des patients atteints de PR.

La présence de CI dans le sérum et le liquide synovial de patients atteints de PR, a

naturellement encouragé la recherche des antigènes contenus à l'intérieur de ces

complexes immuns. De nombreux antigènes potentiels ont été identifiés, parmi lesquels

l'ADN, ou encore le collagène de type II (Marcus and Townes 1971; Clague and Moore

1984). Le FR étant régulièrement présent au sein des complexes, les IgG elles mêmes ont

été identifiées comme antigène.

2.4.5. Activation du complément

2.4.5.1. Généralités

Le complément est le constituant soluble de l'immunité innée le mieux caractérisé.

C'est un système contrôlé, qui intervient de manière rapide et localisée. Le complément se

compose d'environ 35 protéines et s'active en cascade pour conduire à la C3 convertase

selon trois voies différentes (cf Figure 4):

- la voie classique, lorsque le complexe C1 interagit avec des CI, certaines

bactéries ou virus

- la voie alterne, par l'hydrolyse de la fraction C3 initiée par la surface de bactéries

par exemple

- la voie des lectines, similaire à la voie classique, à la différence qu'elle est activée

par la reconnaissance de résidus sucrés microbiens via des lectines comme la MBL

("Mannose binding lectin").

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Figure 4 : Cascade d'activation du complément

Le complément va ainsi participer à diverses fonctions biologiques comme

l'élimination de cellules apoptotiques, de complexes immuns (via les fractions C1, C2 et

C4), l'opsonisation et la phagocytose (C3b) ou encore l'inflammation et le chimiotactisme

(C3a et le C5a).

2.4.5.2. Activation du complément dans la PR

L'implication du système du complément dans la PR a été très étudiée (pour revue

cf (Nigrovic and Lee 2006)). Des analyses immunohistologiques ont démontré la présence

de dépôts des fractions C3 et C4 dans la majorité des articulations rhumatoïdes, au

niveau de la bordure synoviale, sur la surface cartilagineuse et autour des vaisseaux. Au

sein de l'articulation rhumatoïde, le complément est consommé, et plus particulièrement

chez les patients séropositifs pour le FR. L'activation de la voie classique a été mise en

évidence, du fait de la diminution de la concentration des fractions C1, C4 et C2.

L'activation de la voie alterne a également été décrite dans le liquide synovial des patients

atteints de PR, avec une augmentation des produits de clivage du facteur B. En outre, les

fractions chimiotactiques C3a et C5a sont fréquemment détectées, tout comme les

fractions C5b-C9 du complexe d'attaque membranaire. D'autres expériences ont enfin

décrit la présence de fractions du complément C1q, C3 et C4, en association avec des

complexes immuns contenant des IgG et/ou des IgM, à l'intérieur de vésicules de

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phagocytose des neutrophiles du liquide synovial et des macrophages de la bordure

(Britton and Schur 1971).

Enfin, l'activation du complément chez les patients atteints de PR n'est pas restreinte

aux articulations. Des preuves de la fixation de complément au cours de vascularites ou

dans des nodules rhumatoïdes ont été apportées (Kato et al. 2000). Dans la plupart des

cas, la consommation de complément extra-articulaire se produit souvent (mais pas

exclusivement) chez les patients séropositifs.

2.4.6. FcγR et PR

2.4.6.1. Caractéristiques des FcγR

Les FcR sont une famille de glycoprotéines exprimées à la surface des cellules de

l'immunité, capables de fixer le fragment cristallisable (Fc) des Ig. Il existe des FcR pour

chaque isotype d'Ig, notamment pour les IgG, les FcγR qui sont les plus représentés. Chez

l'homme il existe trois classes de FcγR : FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) et FcγRIII (CD16) (les

souris possèdent une classe supplémentaire : FcγRIV). Chaque récepteur possède des

caractéristiques spécifiques d'affinité pour les différentes sous-classes d'IgG, de structure

moléculaire, de profil d'expression cellulaire ou encore de fonction biologique (cf Figure 5)

(pour revue cf (Takai 2005).

Tous les FcγR, à l'exception du FcγRIIb, possèdent dans leur partie

intracytoplasmique des sites de phosphorylation au sein de motifs ITAM, qui vont permettre

d'ancrer des protéines impliquées dans la transduction du signal et l'activation cellulaire.

Au contraire, le FcγRIIb contient un motif ITIM, qui va entraîner la régulation négative ou

l'inhibition de la réponse cellulaire lorsqu'il sera co-engagé avec les autres FcγR

activateurs. Les FcR vont jouer un rôle critique pour activer ou réguler négativement les

réponses immunes et combiner l'immunité humorale et cellulaire.

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Figure 5 : Vue d'ensemble de la structure et profil d'expression cellulaire des FcγR chez l'homme. D'après (Takai 2005).

2.4.6.2. FcγR dans la PR

La formation de CI a été depuis longtemps impliquée dans la pathogenèse de la

PR, ce qui a donné un intérêt pour l'étude des voies cellulaires et moléculaires par

lesquelles des CI vont pouvoir recruter des composants de l'immunité à la fois innée et

adaptative pour auto-entretenir les processus d'inflammation. La caractérisation des

interactions entre les IgG contenues dans les CI et les FcγR, ainsi que le développement de

modèle murins pertinents ont permis d'examiner l'impact des voies dépendantes des FcγR

dans la pathogenèse de la maladie.

Comme je l'ai décrit précédemment (§ 2.4.3.1 et 2.4.3.2), le rôle des FcγR a été

étudié dans des modèles d'arthrites murins comme par exemple dans la CIA ou dans le

modèle K/BxN. Dans ce modèle K/BxN, le transfert de sérum arthritique à des souris

receveuses déficientes pour la chaîne γ commune aux récepteurs FcγR n'a pas provoqué le

développement d'une arthrite. Des analyses complémentaires ont montré que, à la

différence des souris déficientes pour le FcγRI dans lesquelles l'absence de ce récepteur

n'avait aucune incidence sur le développement d'une arthrite, les souris déficientes pour le

FcγRIII développaient une arthrite beaucoup plus modérée. Dans ce modèles, les FcγR

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jouent donc un rôle critique dans le développement d'une arthrite qui dépend largement

du FcγRIII (Ji et al. 2002).

En outre, une étude in vitro sur des monocytes adhérents a montré, que la seule

stimulation du FcγRIII, à l'aide d'un anticorps monoclonal, induit le relargage par ces

cellules de TNF-α et d'IL-1β, suggérant que ce récepteur puisse jouer un rôle important

dans l'activation des macrophages et dans l'inflammation dans le synovium rhumatoïde

(Abrahams et al. 2000).

D'autre part, des macrophages obtenus en culture à partir de monocytes du sang

de patients atteints de PR, produisent plus de TNF-α et de MMP1 que ceux provenant

d'individus sains en réponse à une stimulation par des IgG agrégées par la chaleur. De

plus, chez les patients atteints de PR, l'expression des FcγRII et FcγRIII est augmentée dans

les monocytes du sang périphérique ainsi dans des macrophages différenciés en culture,

par rapport à des individus sains. La proportion de monocytes FcγRIII+ est également

augmentée chez les patients atteints de PR (Blom et al. 2003; Hepburn et al. 2004).

Il est ainsi concevable d'imaginer que des dérégulations dans l'expression de ces

FcγR sur les monocytes et macrophages puissent être impliquées dans la physiopathologie

de la PR. Il reste à déterminer si ces changements phénotypiques sont une cause ou bien

simplement le résultat de l'inflammation chronique observée dans la maladie.

2.4.7. Auto-anticorps et polyarthrite rhumatoïde

Les anticorps étant les molécules effectrices des lymphocytes B, dans cette partie

j'évoquerai brièvement les auto-anticorps produits dans la PR, à l'exception des auto-

anticorps anti-protéines citrullinées qui seront détaillés dans la section suivante.

2.4.7.1. Facteurs rhumatoïdes

Les facteurs rhumatoïdes (FR) ont été décrits il y a plus de 65 ans par Waaler.

Depuis de nombreuses études ont été réalisées sur leur prévalence, leur spécificité, leur

nature et ils constituent le marqueur sérologique de la PR le mieux caractérisé. Les FR sont

des anticorps dirigés contre la partie Fc des IgG. On distingue les FR lourds (IgM anti-IgG)

et FR légers (IgG, IgA, IgE anti-IgG), mais c’est le FR lourd qui est généralement mesuré

en pratique médicale courante et au cours des essais cliniques. Les FR sont considérés

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comme présents chez 60-80 % des patients atteint de PR et ainsi plutôt sensibles.

Cependant, outre dans la PR, on les retrouve aussi dans beaucoup d'autres maladies,

comme le syndrome de Gougerot-Sjögrenet également, à des fréquences plus faibles (et

généralement aussi à des titres plus bas), dans tous les autres désordres rhumatologiques

auto-immuns, et, par ailleurs, chez des individus âgés sains. D'autre part, dans la PR, la

sensibilité diagnostique peut varier de 26 à 66 % pour des spécificités diagnostiques de

respectivement 95 et 72 % (pour revue cf (Steiner and Smolen 2006)). Bien que très peu

spécifiques, la détection du FR lourd est un des critères de l'ACR pour la classification de

la PR et reste encore aujourd'hui très utilisée.

2.4.7.2. Anticorps anti-A2/ RA33

Ces anticorps ont été pour la 1ière fois décrits en 1989, et reconnaissent une

protéine nucléaire, la hnRNP-A2, impliquée dans l'épissage et le transport d'ARNm. Ces

anticorps peuvent être détectés chez environ 1/3 des patients atteints de PR, mais

également chez 20 à 30 % des patients lupiques. En outre leur spécificité ne dépasse pas

les 90 % (Meyer et al. 1993; Steiner and Smolen 2006). L'antigène ciblé est plus ou moins

exprimé de manière ubiquitaire bien que les niveaux d'expression puissent varier d'un tissu

à un autre. De manière intéressante, une étude récente a indiqué que cette protéine

hnRNP-A2/ RA33 est surexprimée dans les membranes synoviales de patients atteints de

PR (Fritsch et al. 2002).

2.4.7.3. Anticorps anti-BiP

Des auto-anticorps dirigés contre une glycoprotéine de 68 kDa exprimée de façon

ubiquitaire ont été décrits en 1995 et détectés dans plus de 60 % des sérums rhumatoïdes

(Blass et al. 1995). La cible de ces auto-anticorps a part la suite été identifiée et

correspondait à la protéine de stress BiP ("immunoglobulin heavy chain binding protein"),

un membre de la famille des protéines de choc thermique de 70 kDa localisées dans le

réticulum endoplasmique (Blass et al. 2001). La spécificité initiale de ces anticorps était

annoncée à 99 % mais depuis aucune étude n'a confirmé ces données.

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Introduction

- 47 -

2.4.7.4. Autres auto-anticorps

Beaucoup d'autres auto-anticorps ont été décrits dans les sérums de patients de PR

bien qu'ils se soient révélés peu spécifiques de la maladie. On peut citer les anti-

calpastatine, les anti-GPI, les anticorps anti-nucléaires (ANA) ou encore les anticorps anti-

cytoplasme de neutrophiles (ANCA).

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Introduction

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3. Auto-immunité anti-protéines citrullinées

Les maladies auto-immunes sont caractérisées par la présence d'auto-anticorps.

Excepté dans quelques rares exceptions, ces auto-anticorps ne jouent pas nécessairement

un rôle pathogénique mais constituent des outils très utiles pour le diagnostic. Peu

d'anticorps sont réellement spécifiques de maladie, et leur prévalence est généralement

inférieure à 50%. Ceci est aussi vrai pour beaucoup d'anticorps retrouvés dans la PR

généralement peu spécifiques de la maladie.

Parmi tous les auto-anticorps décrits dans la PR, les auto-anticorps anti-protéines

citrullinées (ACPA, "anticitrullinated protein autoantibodies") souvent aussi appelés anti-

CCP suite au développement d’une méthode pour leur détection utilisant des peptides

citrullinés cycliques ("cyclic citrullinated peptides", CCP), sont les plus spécifiques de la

maladie.

3.1. Étapes de la découverte des auto-anticorps anti-protéines

citrullinées

3.1.1. Anticorps anti-kératine (AKA, "anti-keratin antibodies")

En 1979, une équipe anglaise a montré qu'environ la moitié des patients atteints

de PR présentaient des anticorps circulants capables de marquer, en immunofluorescence

indirecte, la couche cornée de l'épithélium malpighien qui revêt l'œsophage de rat (Young

et al. 1979). Les kératines étant les plus abondantes dans cette couche épithéliale, et en

dépit du fait que l'antigène reconnu n'ait pas été clairement identifié, ces anticorps ont été

de façon impropre dénommés anticorps anti-kératine (AKA). Bien que moins sensibles que

le FR, ces anticorps se sont révélés beaucoup plus spécifiques de la maladie (Vincent et al.

1989).

Par la suite, des expériences d'immuno-absorption réalisées au sein du laboratoire

n'ont pas permis de confirmer la réactivité des AKA vis-à-vis de la kératine. Les antigènes

reconnus dans la couche cornée de l’épithélium d’œsophage de rat ont été identifiés à 3

protéines non glycosylées et non phosphorylées, spécifiques des étapes tardives du

programme de différenciation épidermique. Les protéines A et B de respectivement 210 et

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Introduction

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120 à 90 kDa présentaient des variations de pI entre 5,8 et 8,5; la protéine C, quant à

elle, présentait des variations de pI de 4,5 à 7,2 avec un poids moléculaire compris entre

130 et 60 kDa (Girbal et al. 1993).

En parallèle, toujours au sein du laboratoire, une protéine antigénique cible des

AKA a été extraite à partir d'épiderme humain. Cette protéine de 37 à 40 kDa, et de pI

variant entre 5,8 et 7,2 a été identifiée comme étant un variant acide/neutre de la

filaggrine, une protéine agrégeant les filaments intermédiaires de kératine (pour plus de

détail, cf paragraphe 4.4.1.1.1) (Simon et al. 1993).

Ainsi, les AKA reconnaissent une forme acide-neutre de la filaggrine épidermique

humaine et différentes formes moléculaires de (pro) filaggrine murine présentes dans la

couche cornée de l'épithélium d'œsophage de rat auxquelles correspondent très

probablement les protéines A, B et C.

3.1.2. Facteur anti-périnucléaire (APF, "anti-perinuclear factor")

Quinze années avant la découverte des AKA, Nienhuis et Mandema ont décrit des

anticorps présents dans le sérum de patients atteints de PR, marquant, en

immunofluorescence indirecte, des granules de kératohyaline périnucléaires, au sein des

cellules épithéliales de la muqueuse jugale humaine. Ces anticorps ont alors été appelés

facteur anti-périnucléaire, par analogie avec le facteur rhumatoïde (Nienhuis and

Mandema 1964). En 1995, l'antigène cible des APF a été identifié au laboratoire. Cet

antigène, reconnu par 4 anticorps monoclonaux spécifiques de différents épitopes de la

filaggrine, correspondait à une protéine de 200 à 400 kDa, apparenté à la (pro)filaggrine

épidermique humaine (Sebbag et al. 1995).

En outre, des expériences complémentaires ont révélé que les AKA, purifiés à partir

de sérum rhumatoïde, étaient aussi capables d'immunodétecter cette protéine de 200 à

400 kDa et de marquer les granules périnucléaires de cellules épithéliales buccales

humaines. Ainsi, les AKA et les APF, initialement considérés comme deux familles

différentes d'auto-anticorps, constituent en réalité deux sous-ensembles largement

recouvrants d'une seule et même famille : celle des auto-anticorps anti-filaggrine (AFA,

"antifilaggrin autoantibodies") (Sebbag et al. 1995).

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3.1.3. Caractérisation de la cible articulaire des AFA

3.1.3.1. Caractérisation des épitopes des AFA

Les cibles antigéniques des AKA et des APF, identifiées dans différents tissus

épithéliaux, correspondent à des formes moléculaires de (pro)filaggrine, mais, à la

différence de la filaggrine basique épidermique, elles possèdent un pI acide/neutre. De

plus, de la filaggrine humaine recombinante produite chez E. Coli n'était pas reconnue par

un pool de sérum PR présentant de hauts titres en AFA (Girbal-Neuhauser et al. 1999).

Ces résultats ont donc suggéré que les épitopes-cibles des AFA étaient générés suite à une

modification post-traductionnelle de la (pro)filaggrine. La modification biochimique

capable d'influencer la charge de pro(filaggrine) a été identifiée à la transformation de

résidus arginyl, basiques, en résidus citrullyl, neutres. Cette modification ainsi que les

enzymes qui la catalysent, les PAD, sera beaucoup plus détaillée dans le chapitre 4. Deux

études ont permis une avancée énorme concernant la nature des épitopes reconnus par

les AFA.

En 1998, l’équipe de W. van Venrooij a montré que les résidus citrullyls étaient un

constituant indispensable des épitopes reconnus par les auto-anticorps présents dans les

sérums de patients atteints de PR. En effet, ils ont synthétisé des peptides dérivés de la

séquence de filaggrine, parmi lesquels certains ont eu un ou deux résidus arginyl substitué

par un résidu citrullyl. A l'inverse des peptides non substitués, les peptides porteurs de

résidus citrullyl ont été reconnus par des sérums rhumatoïdes. En outre, les anticorps

purifiés sur une colonne greffée avec un des peptides citrullinés (cfc1, 306-324), se sont

révélés immunoréactifs en immunotransfert avec de la filaggrine extraite d'épiderme

humain. De plus, en immunofluorescence indirecte, ces anticorps ont présenté les

marquages caractéristiques réalisés par les AKA ou l’APF respectivement sur cryocoupes

d'œsophage de rat et sur frottis de cellules jugales humaines (Schellekens et al. 1998).

En 1999, au sein du laboratoire, il a été montré que les différents variants

acide/neutres de la filaggrine épidermique humaine cibles des AFA étaient reconnus par

un anticorps anti-citrulline et donc citrullinés. La désimination (citrullination) in vitro d'une

filaggrine humaine recombinante par une PAD génère les épitopes des AFA sur la

protéine. De plus, parmi 3 peptides synthétiques dérivés de la séquence de la filggrine

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avec une citrulline en position centrale, 2 ont été largement et spécifiquement reconnus

par des AFA purifiés à partir des sérums d'une série de patients atteints de PR. Ces résultats

indiquaient donc que les résidus citrullyls étaient des constituants essentiels des épitopes

des AFA, dans le contexte de séquences en acides aminés spécifiques présentes sur la

filaggrine (Girbal-Neuhauser et al. 1999).

3.1.3.2. Synthèse des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde

En 2000, au sein de notre laboratoire, il a été mis en évidence que les AFA étaient

produits au sein des articulations synoviales rhumatoïdes. La comparaison des taux d'AFA

dans des échantillons appariés de liquide synovial et de sérum de 31 patients atteints de

PR n'a pas permis de mettre en évidence de différences significatives, indiquant que les

AFA n'étaient pas particulièrement concentrés dans le liquide synovial. Au contraire, les

AFA se sont avérés enrichis au sein des membranes synoviales, la concentration des AFA

dans des extraits de tissu synovial représentant une proportion des IgG totales en moyenne

7,5 fois supérieure à celle du sérum correspondant. En outre, lors de cultures d'explants de

tissu synovial de patients atteints de PR, une synthèse de novo d'AFA, dosés à partir du

surnageant de culture, a pu être mise en évidence sur une période de 5 semaines.

Ainsi, les plasmocytes responsables de la sécrétion sont présents dans le tissu

synovial rhumatoïde et les AFA représentent une proportion significative des IgG sécrétées

au sein du pannus rhumatoïde (Masson-Bessiere et al. 2000).

3.1.3.3. Identification de la cible des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde

Les résultats précédents suggéraient l'existence d'une cible de ces auto-anticorps au

sein même des articulations rhumatoïdes. Cependant, il n'existe pas dans la PR d'atteinte

epithéliale particulière et la (pro)filaggrine n'est pas présente au sein du tissu articulaire

(Masson-Bessiere et al. 2001). Il a donc été émis l'hypothèse qu'in vivo, les AFA ne soient

pas dirigés contre la (pro)filaggrine citrullinée, mais plutôt contre une autre protéine

citrullinée, présente dans le tissu synovial rhumatoïde et reconnue de manière croisée

puisque porteuse des mêmes épitopes. L'analyse histologique de membranes synoviales

rhumatoïdes à l'aide d'un anticorps anti-citrulline a montré un marquage de dépôts

amorphes interstitiels et de cellules mononucléées de différents types. Des analyses

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immunochimiques d'extraits séquentiels de ces mêmes tissus ont montré qu'ils contenaient

plusieurs protéines citrullinées parmi lesquelles deux protéines, p64-78 et p55-61, étaient

spécifiquement reconnues par les AFA. Un séquençage amino-terminal a permis de les

identifier : elles correspondent à des formes citrullinées des chaînes α et β de la fibrine.

L'identité de ces protéines a été confirmée grâce à l'utilisation de plusieurs anticorps

spécifiques des chaînes Aα et/ou Bβ de la fibrine (ou du fibrinogène). De plus, les AFA

purifiés se sont montrés réactifs vis-à-vis des chaines Aα et Bβ du fibrinogène humain,

seulement après sa citrullination in vitro. Enfin, des auto-anticorps purifiés à partir d'un

pool de sérum de patients atteints de PR sur du fibrinogène citrulliné ont été réactifs vis-à-

vis de toutes les cibles épithéliales et synoviales des AFA. Les AFA et les auto-anticorps

dirigés contre les chaînes Aα et / ou Bβ du fibrinogène désiminé constituent donc des

populations d'auto-anticorps très largement recouvrantes et l’'ensemble de ces résultats a

permis d'affirmer que la cible majeure des AFA au sein des membranes synoviales

rhumatoïdes était la fibrine citrullinée (Masson-Bessiere et al. 2001).

Enfin, en 1994, un nouveau système antigène/anticorps, Sa/ anti-Sa, spécifique de

la PR a été décrit (Despres et al. 1994). Les anticorps, reconnaissaient un antigène

abondement présent dans le placenta humain. En 2000, l’hypothèse que l'antigène Sa soit

une forme citrullinée de vimentine, une protéine des filaments intermédiaires, a été émise,

(Menard et al. 2000). La preuve expérimentale que l'antigène Sa, cible des anticorps anti-

Sa, était identique à de la vimentine citrullinée a été apportée récemment (Vossenaar et al.

2004).

Ainsi, les AFA, les anti-Sa (anti-vimentine citrullinée) et les auto-anticorps anti-

fibrine citrullinée, constituent une seule et même famille d'auto-anticorps anti-protéines

citrullinées, spécifiques de la PR : la famille des ACPA.

3.1.3.4. La Fibrine

Le fibrinogène est une glycoprotéine plasmatique dimérique de 340 kDa, formée

de deux sous-unités reliées par des ponts disulfures. Chaque sous-unité est constituée de 3

chaînes polypeptidiques Aα, Bβ, et γ associées entre elles par des ponts disulfures. Au

cours de la coagulation, la thrombine (facteur IIa) permet la transformation du fibrinogène

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soluble en fibrine insoluble en clivant les 2 fibrinopeptides A et B à l’extrémité amino-

terminale des chaînes respectivement Aα et Bβ. Ce clivage, en modifiant la charge des

extrémités, va favoriser des interactions inoniques avec des sites de charge opposée, sur

un autre monomère de fibrine. L'ensemble des diverses molécules de fibrine alignées bout

à bout et reliées par ces liaisons non covalentes est ensuite stabilisé par le facteur XIII, qui

après son activation par la thrombine crée des liens covalents ε(γ-glutamyl)-lysine, rendant

le caillot de fibrine insoluble, très solide et stable (cf Figure 6).

Figure 6 : Structure schématique du fibrinogène et fibrinoformation. Extrait de (Boneu and Cazenave 1997).

La dégradation du caillot de fibrine est assurée par le processus de fibrinolyse sous

l'effet de la plasmine. Celle-ci résulte de l'activation du plasminogène inactif par le t-PA

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("tissue-plasminogen activator") ou l'u-PA ("urokinase-type plasminogen activator")

préférentiellement à la surface de la fibrine, qui offre des sites de liaison pour le

plasminogène et ses activateurs. L'action de la plasmine sur la fibrine aboutit à la

formation et à la libération de produits de dégradation de la fibrine (PDF) solubles, dont

les principaux sont appelés les D-Dimères. Dans le plasma, sont également présents des

inhibiteurs de la plasmine et des inhibiteurs des activateurs du plasminogène (PAI,

"plasminogen activator inhibitor"), qui limitent une activation non spécifique de la plasmine

à distance du caillot à éliminer (cf Figure 7).

Figure 7 : Schéma de la fibrinolyse (d'après un schéma original de Cyril Clavel)

Le t-PA, principal activateur du plasminogène, est une sérine protéase circulant

dans le plasma sanguin sous forme liée à son inhibiteur, le PAI-1. Le t-PA présente une

très forte affinité pour la fibrine mais pas pour le fibrinogène et, en l'absence de fibrine,

son affinité pour le plasminogène est négligeable. Dès que la fibrine se forme, le t-PA, le

plasminogène et la fibrine s'associent en complexe, ce qui augmente l'activité de catalyse

du t-PA.

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L'u-PA (ou urokinase) est une sérine protéase dont le rôle dans l'élimination de la

fibrine apparaît plus secondaire. L'u-PA se lie de façon spécifique à son récepteur

cellulaire ("u-PA receptor") et n'a par contre pas d'affinité pour la fibrine (Bachmann 1994).

3.2. Intérêt clinique des auto-anticorps anti-protéines citrullinées

3.2.1. Valeur diagnostique

En raison de la diversité des substrats initialement décrits et des découvertes plus

récentes concernant la nature des épitopes reconnus, de nombreux tests pour détecter les

ACPA ont été développés et existent encore.

Les tests initiaux de détection de ces auto-anticorps correspondaient au marquage

des APF et des AKA, réalisés en immunofluorescence indirecte, respectivement sur frottis

de cellules jugales humaines et sur cryocoupes d'œsophage de rat. Une méta-analyse de

la littérature de l’époque révèle que la détection des AKA permettait d'obtenir une

sensibilité diagnostique de 46% pour une spécificité de 97% et celle des APF, une

sensibilité diagnostique de 72 % pour une spécificité diagnostique de 92 %. Bien que les

APF soient des marqueurs sensibles de la PR, ils restaient cependant moins spécifiques que

les AKA (Vincent et al. 1999).

Progressivement, de nouveaux tests ont été développés, grâce à la caractérisation

des cibles épithéliales et synoviales des ACPA. Les premiers tests étaient basés sur la

détection, en immunotransfert, de (pro)filaggrine extraite d'épithélium d'œsophage de rat

(Gomes-Daudrix et al. 1994) ou d'épiderme humain (Vincent et al. 1998). Bien que

l'immunotransfert utilisant les antigènes de rat ait eu une meilleure performance

diagnostique que les méthodes classiques, son interprétation délicate en a limité l'usage.

Le second test, en revanche, a été plus largement utilisé et, en combinaison avec le test de

détection des AKA a permis d'obtenir une sensibilité diagnostique de 60 % pour une

spécificité haute de 99 % (Vincent et al. 1999).

La découverte du rôle clé joué par la citrullination dans la genèse des épitopes

reconnus par les AFA a conduit au développement de nouveaux tests diagnostiques qui

sont des ELISAs ("Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay") utilisant de la filaggrine

recombinante citrullinée humaine (Nogueira et al. 2001; Suzuki et al. 2003) ou murine

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(Vincent et al. 2002). Les performances diagnostiques de l'ELISA avec de la filaggrine

humaine recombinante désiminée in vitro sont comparables à celle des AKA. Par contre

l'ELISA utilisant de la filaggrine recombinante de rat citrullinée in vitro (ArFA-ELISA), a

montré des performances diagnostiques plus élevées, avec une sensibilité de 65 % pour

une spécificité de 99 % (Vincent et al. 2002).

D'autres tests ELISA, basés sur la reconnaissance de peptides citrullinés synthétisés à

partir de séquences de filaggrine humaine ont été développés en parallèle. Un tel ELISA a

permis de détecter les auto-anticorps dans 76 % des sérums de patients atteints de PR

avec une spécificité de 96 % (Schellekens et al. 1998). L'un de ces peptides, cfc1, a par la

suite été utilisé pour le développement d'un test ELISA après que deux de ses résidus séryl

aient été substitués par des résidus cysteyl, permettant la cyclisation du peptide ("cyclic

citrullinated peptide" : CCP) (Schellekens et al. 2000). La sensibilité de ce CCP1-ELISA

(pour test CCP de première génération) était pultôt modérée : entre 50 et 70 % pour une

spécificité de 98 % (van Venrooij et al. 2004). Des tests de seconde (CCP2-ELISA) et

même de troisième génération (CCP3-ELISA), présentant de meilleures performances

diagnostiques sont à présent disponibles (Nijenhuis et al. 2004). Le mélange de peptides

synthétiques cycliques utilisé n'est pas connu. La sensibilité diagnostique calculée du test

CCP2 était de 77 % pour une spécificité de 97 %. Ces tests, aujourd'hui largement

commercialisés, sont les plus utilisés dans les études cliniques mais aussi en usage

diagnostique.

Suite à la démonstration que les cibles synoviales des AFA (ACPA) correspondaient

à des formes citrullinées des chaînes α et β de la fibrine, un nouveau test ELISA, utilisant

du fibrinogène humain citrulliné in vitro, et détectant donc les anticorps anti-fibrinogène

humain citrulliné (AhFibA, "anti-human fibrinogen antibodies") a été développé au sein de

notre laboratoire. Cet ELISA permet de détecter 76 % des patients atteints de PR avec une

spécificité diagnostique de 98.6 % (Vincent et al. 2005).

D'autres tests basés sur la reconnaissance d'autres protéines citrullinées ont été

décrits. Par exemple, les anticorps anti-Sa, détectés après immunotransfert d'extraits de

placenta ou de rate humains, étaient décelables chez environ 40 % des patients atteints de

PR avec une spécificité de 99 % (Despres et al. 1994). Ces données ont été confirmées

par plusieurs études indépendantes et, en moyenne, les anti-Sa pouvaient être détectés

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dans 37 % des cas de PR avec une spécificité de 97 % (pour revue cf (Nijenhuis et al.

2004). Récemment, un test ELISA utilisant de la vimentine citrullinée modifiée a été mis au

point, avec toutefois des performances dignostiques inférieures au test ELISA CCP2

(Dejaco et al. 2006).

Enfin, une équipe italienne a très récemment mis au point un test ELISA basé sur la

reconnaissance d'un peptide synthétique citrulliné correspondant à la séquence en position

35-38 de la protéine EBNA-1 du virus d’Epstein-Barr,. Les anticorps spécifiques de ce

peptide ont été détectés dans 50 % des sérums de patients atteints de PR et dans moins de

5 % des sérums contrôles (sains ou d'autres maladies rhumatologiques) (Pratesi et al.

2006).

Ainsi, pour des spécificités diagnostiques égales, toutes les méthodes de détection

des ACPA ne présentent pas des sensibilités équivalentes, les plus élevées ayant été

obtenues pour les test ELISA, et plus particulièrement celui développé au laboratoire, le

test AhFibA (cf Tableau 9 et Figure 8) (Vincent et al. 2005).

Test Sensibilités

AhFibA 76,2 %

ArFA 69,6 %

CCP 56,9 %

AKA 42,5 %

FR 16,0 %

Tableau 9 : Sensibilités diagnostiques de différents tests de détection des auto-anticorps anti-protéines citrullinées et du facteur rhumatoïde calculées, pour une même spécificité diagnostique de 98,6 %, sur une cohorte de 617 patients atteints de PR et d’autres maladies rhumatologiques établies. Les tests sont classés par sensibilités décroissantes

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Figure 8 : Courbes ROC (Receiver Operating Characteristics) de 4 tests de détection des anticorps anti-protéines citrullinées tracées à partir des données de sensibilité et spécificité diagnostiques calculées sur une cohorte de 617 patients atteints de PR et d’autres maladies rhumatologiques établies. Seule la partie correspondant à de hautes valeurs de spécificité (> 90%) est représentée.

Les valeurs diagnostiques des différents tests ont été établies à partir de séries de

patients présentant des maladies établies. Or, les ACPA sont détectables chez une

proportion importante de patients à des stades très précoces de la maladie (Goldbach-

Mansky et al. 2000; van Gaalen et al. 2004) et souvent même plusieurs années avant

l'apparition des premiers signes cliniques de PR (Kurki et al. 1992; Rantapaa-Dahlqvist et

al. 2003; Nielen et al. 2004). Leur grande spécificité ainsi que leur précocité d'apparition

font de ces auto-anticorps des outils majeurs pour le diagnostic de la PR.

3.2.2. Valeur pronostique

Des études transversales ont permis d'établir des corrélations significatives entre la

présence et/ou le titre des ACPA et divers critères cliniques, radiologiques ou biologiques

d’activité et/ou de sévérité de la PR (nodules rhumatoïdes, CRP, complexes immuns

circulants, destructions articulaires…) (Vincent et al. 1989; Paimela et al. 1992). Des

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études longitudinales plus récentes ont confimé la valeur pronostique des ACPA et, en

particulier, leur corrélation avec l'érosion osseuse après plusieurs années d'évolution

(Forslin et al. 2001; Meyer et al. 2003; Vencovsky et al. 2003).

La détection des ACPA présente donc un intérêt clinique majeur, à la fois du fait de

leur valeur diagnostique, dès les stades précoces de PR, mais aussi de leur valeur

pronostique, permettant d'établir des stratégies thérapeutiques adaptées aux patients, dès

les stades les plus précoces de la maladie.

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4. Les peptidyl-arginine désiminases

4.1. Introduction

La Citrulline est un acide aminé ubiquiste chez les mammifères, dont le nom dérive

du latin Citrullis vulgaris, le melon d'eau (pastèque), contenant de très grandes quantités

de cet acide aminé. La Citrulline est un acide aminé non essentiel; il n'est pas généré au

cours de la synthèse protéique classique par traduction d'un codon spécifique mais peut

être fabriqué par l'organisme à partir d'autres acides aminés présents dans le corps. Chez

les mammifères, on distingue 2 catégories de citrullines: les citrullines libres, dont je

parlerai brièvement et les peptidyl-citrullines (présentes dans les protéines citrullinées), que

je développerai plus en détail (pour revue cf (Curis et al. 2005).

Chez les mammifères, le métabolisme des citrullines libres peut être divisé en 3

voies impliquant 3 enzymes principales. Deux de ces voies métaboliques concernent la

synthèse de citrulline libre : le cycle de l'urée et le métabolisme du monoxyde d'azote (NO,

pour "nitric oxide"), et ceci, respectivement, grâce à 2 catégories d’enzymes : l'ornithine

carbamoyltransférase (OCT, EC 2.1.3.3) et les NO-synthases (NOS, EC 1.14.13.39).

Chez l'homme, l'OCT, aussi appelée ornithine trans-carbamylase, est présente au

niveau du foie et de la muqueuse intestinale. Plus généralement, chez les eucaryotes

supérieurs tels que les mammifères, l'OCT est une enzyme située au niveau de la matrice

mitochondriale, qui joue un rôle clé au cours du cycle de l'urée en catalysant la

conversion de l'ornithine en citrulline selon la réaction suivante :

ornithine + carbamoylphosphate citrulline + phosphate.

Les NOS, comme leur nom l'indique, sont des enzymes responsables de la synthèse

du NO, qui a lieu dans la plupart des tissus. Il existe 3 familles différentes de NOS qui

diffèrent par leur niveau d'expression et leur localisation : la NOS neuronale (nNOS) et la

NOS endothéliale (eNOS) exprimées contitutivement, ainsi que la NOS inductible (iNOS).

La nNOS et la eNOS, comme leurs noms l'indiquent, sont présentes respectivement dans

les cellules neurales et les cellules endothéliales, et la iNOS dans les macrophages

majoritairement (suite à un stimulus cytokinique). Toutes ces enzymes partagent le même

mécanisme de synthèse du NO à partir d'arginine, avec relargage de citrulline, et

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- 61 -

requièrent des cofacteurs tels que la nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

(NADPH), la Flavine mononucléotide (FMN) et la bioptérine selon la réaction suivante :

arginine + O2 N-hydroxyarginine citrulline + NO

La troisième voie du métabolisme des citrullines libres concerne son catabolisme,

qui est assuré par une seule enzyme, présente chez presque tous les organismes:

l'arginosuccinate synthase (ASS, EC 6.3.4.5). Cette enzyme cytosolique est assez ubiquiste,

avec des niveaux d'expressions plus élevés au niveau du foie et des reins. Elle, est capable

de catalyser la réaction suivante :

citrulline + aspartate + ATP arginosuccinate + pyrophosphate + AMP,

l’arginosuccinate étant ensuite transformé en arginine au cours du cycle de Krebs).

Ainsi, le métabolisme des citrullines libres apparaît très associé à celui des

arginines libres. Ceci est également vrai pour les peptidyl-citrullines. En effet la citrulline,

fait partie des alpha-amino acides, et donc partage des réactivités communes à cette

famille. En particulier, la citrulline peut former des liaisons peptidiques et peut ainsi être

incorporée dans les protéines. Cependant, comme il n'existe pas de codon spécifique pour

cet acide aminé, sa présence au sein d'une protéine est toujours le résultat d'une

modification post-traductionnelle des protéines appelée la désimination ou citrullination.

4.1.1. La désimination ou citrullination

La désimination ou citrullination est la modification post-traductionnelle la plus

récemment décrite. Elle consiste en la transformation de résidus peptidyl-arginyl, résidus

d’arginine engagée dans une liaison peptidique, en résidus peptidyl-citrullyl. Cette

réaction est catalysée par des enzymes appelées peptidyl-arginine désiminases (PAD,

protein-arginine deiminase, protein-L-arginine iminohydrolase, EC 3.5.3.15) (cf Figure 9).

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Introduction

- 62 -

- résidu arginyl - - résidu citrullyl -

PAD

Ca2+

NH2IC = NH2

+

NH + H2O

(CH2)3

– NH – CH – CO –

I

I

I

NH2IC = O

NH + NH3

(CH2)3

– NH – CH – CO –

I

I

I

(groupe guanidino) (groupe uréido)

- résidu arginyl - - résidu citrullyl -

PAD

Ca2+

NH2IC = NH2

+

NH + H2O

(CH2)3

– NH – CH – CO –

I

I

I

NH2IC = O

NH + NH3

(CH2)3

– NH – CH – CO –

I

I

I

(groupe guanidino) (groupe uréido)

Figure 9 : Réaction de désimination ou citrullination. Transformation d'un résidu arginyl en résidu citrullyl sous l'action d'un enzyme appelée peptidyl-arginine désiminase (PAD), en présence de calcium. Au cours de la réaction, le groupement latéral guanidino chargé positivement de l'arginine (bleu), est converti en un groupement uréido non chargé de la citrulline (vert).

4.1.2. Caractéristiques générales des peptidyl-arginine désiminases

La citrulline, normalement acide aminé "libre", a pour la première fois été décrite

en tant que constituant de protéines en 1953, après isolement et purification de protéines

de la médulla des piquants de porc-épic africain ainsi que de protéines de la gaine

épithéliale interne du follicule pileux de cochon d'inde (Steinert et al. 1969). Ce n'est qu'en

1977, que Rogers et Taylor ont pour la première fois décrit une activité enzymatique

présente au niveau du follicule pileux et capable de convertir des peptidyl-arginine en

peptidyl-citrulline en présence de calcium (Rogers and Taylor 1977). La cible de cette

activité au sein du follicule pileux a par la suite été caractérisée et correspond à la

trichohyaline (cf paragraphe 4.4.2). En 1981, c'est une équipe japonaise qui a purifié et

caractérisé l'enzyme responsable de la conversion des résidus arginyl en résidus citrullyl, à

partir d'un extrait protéique d'épiderme de rat. Ils ont montré que l'activité enzymatique, en

plus de nécessiter la présence de calcium, est augmentée par l'ajout d'un agent réducteur,

le dithiothréitol. Du fait de sa spécificité pour des arginines et des dérivés d'arginine dont

les groupements alpha-carboxyl ou alpha-amino sont engagées dans une liaison

peptidique, et de son activité négligeable sur des L-arginine libres, les auteurs ont proposé

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de nommer cette enzyme : "peptidyl-arginine désiminase", afin de la différencier de

"l'arginine désiminase" catalysant la désimination d'arginines libres (Fujisaki and Sugawara

1981).

Dès les premières études, la présence d'une activité PAD a été mise en évidence

dans de nombreux tissus de mammifères : épiderme de rat nouveau-né (Fujisaki and

Sugawara 1981), muscle squelettique de lapin (Sugawara et al. 1982; Takahara et al.

1983) ou encore cerveau et épiderme de bœuf (Kubilus and Baden 1983; Kubilus and

Baden 1985). Une étude a également rapporté la présence d'une activité PAD dans

chacune des classes représentatives de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux

et mammifères. En effet, une activité de l'enzyme a été mise en évidence chez tous les

animaux testés (carpe, grenouille, tortue, poulet, vache et homme) mais pas au sein de

tous les tissus d'un même animal. Des activités enzymatiques élevées ont été mesurées

dans des extraits de cerveaux et de muscle squelettique de la plupart des animaux. Une

activité en quantité importante à également été retrouvée dans des extraits d'oeil et en plus

faible quantité dans des extraits d'épiderme et de nerf périphérique (Kubilus and Baden

1985). Bien que toutes ces enzymes provenant de différents tissus et espèces soient

capables de convertir des peptidyl-arginine en peptidyl-citrulline, des différences en termes

de poids moléculaire ou encore d'activité vis-à-vis de substrats synthétiques ont suggéré

que plusieurs PAD puissent exister. C'est ainsi que l'équipe japonaise de T. Senshu, grâce

à une étude à la fois biochimique et immunohistologique visant à caractériser plus

précisément les PAD présentes dans divers tissus de mammifères, a proposé l'existence

d'au moins trois types de PAD: la PAD de type "épidermique", celle de type "musculaire" et

celle du "follicule pileux" (Watanabe et al. 1988). Cependant dans cette étude, les

enzymes ont été extraites à partir de différentes espèces d'animaux (rat et boeuf) ce qui ne

permet pas d'attribuer de façon certaine les différences entre les 3 PAD à des spécificités

tissulaires. C'est en 1991 que Terakawa et col. ont enfin purifié par chromatographie

d'échange d'ion les PAD de plusieurs tissus murins et observé sur les chromatogrammes

obtenus, des variabilités dans le nombre et la position des pics d'élution d'activité PAD, en

fonction des tissus (Terakawa et al. 1991). Dans l'extrait d’épiderme, 3 pics possédant une

activité PAD ont été observés et les auteurs ont ainsi proposé de les nommer PAD de type

1, de type 2 et de type 3, en fonction de leur ordre d'apparition au cours de la

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purification. La PAD de type 2 apparaissait être la plus ubiquiste puisque présente dans la

plupart des tissus testés : muscle squelettique, moelle épinière, pancréas, glande salivaire,

utérus et peau. A l'inverse les PAD de type 1 et 3 présentaient des profils d'expression plus

restreints puisqu'elles n'ont été détectées que dans respectivement la peau et l'utérus ou la

peau et le follicule pileux. En plus de leurs profils d'expression tissulaire différents, les PAD

se distinguaient par leur poids moléculaire et leur spécificité vis-à-vis de substrats

synthétiques (Terakawa et al. 1991).

A ce jour, les données génomiques disponibles ont permis de révéler l'existence de

5 isotypes de PAD chez les mammifères, de 3 isotypes chez les oiseaux (Gallus gallus) et

d’un seul chez les amphibiens (Xenopus laevis) ainsi que chez les poissons (Danio rerio,

Takifugu rubripes et Tetraodon nigroviridis). Dans la suite de ce chapitre je vous parlerai

plus en détail des PAD de mammifères (homme, souris et rat).

4.2. Caractéristiques des PAD : clonage, profil d'expression,

conservation, activité.

Au moment où j’ai initié mon travail, 4 isotypes de PAD avaient été clonés chez

l'homme, la souris et le rat. Au cours de mes recherches, une cinquième PAD, la PAD6, a

été décrite au sein du laboratoire. Elle a été clonée chez l'homme (Chavanas et al. 2004)

ainsi que chez la souris (Wright et al. 2003).

Dans ce chapitre, je discuterai du clonage des isotypes murins et humains et la

terminologie suivante sera utilisée :

- PAD et Pad désigneront respectivement les peptidyl-arginine désiminases

humaines et murines

- PADI et Padi désigneront respectivement les gènes codant les peptidyl-arginine

désiminases humaines et murines.

4.2.1. Clonage et profil d'expression des Pad murines

4.2.1.1. Pad1

L'ADNc du gène padi1 de rat a été isolé par criblage d'une banque d'ADNc

construite à partir d'une lignée kératinocytaire de rat nouveau né, traitée à l'acide

rétinoïque durant 4 jours. L'ADNc contient un cadre de lecture ouvert de 1989 pb codant

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pour une protéine de 662 acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 73 856

Da. Un signal de polyadénylation a été localisé aux nucléotides 3717-3723 (Ishigami et

al. 1998).

L'ADNc complet du gène Padi1 de souris a été isolé par criblage d'une banque

d'ADNc d'utérus puis cloné en utilisant la méthode de RACE-PCR. Cet ADNc contient un

cadre de lecture ouvert d’également 1989 pb codant pour une protéine de 662 acides

aminés avec un poids moléculaire théorique de 73823 Da. Un signal de polyadénylation

a été localisé au niveau des nucléotides 3730-3735 (Rus'd et al. 1999).

L'analyse comparative, par RT-PCR, de l'expression du gène Padi1 dans un panel

de différents tissus de souris a montré que le transcrit n'était présent que dans l'épiderme et

l'utérus (Rus'd et al. 1999). Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment par la

même équipe qui suggéraient un profil d'expression de la Pad1 plutôt restreint. En effet,

une activité Pad1 avait seulement été mise en évidence dans l'épiderme et l'utérus

(Terakawa et al. 1991). De plus, l'expression de Padi1 semble sous le contrôle d'hormones

sexuelles stéroïdiennes, puisque l'administration d'œstrogène à des souris adultes ayant

subies une ovariectomie, augmente la présence de transcrits Padi1 de 3.8 kb dans l'utérus

(Rus'd et al. 1999).

4.2.1.2. Pad2

L'ADNc du gène Padi2 de rat a été isolé puis cloné par criblage d'une banque

d'ADNc construite à partir de muscle squelettique de rat. L'ADNc contient un cadre de

lecture ouvert de 1998 pb qui code pour un polypeptide de 665 acides aminés. Deux

signaux de polyadénylation ont été décrits aux nucléotides 4482-4487 et 4492-4497

(Watanabe and Senshu 1989).

L'ADNc complet du gène Padi2 de souris a été isolé par criblage d’une banque

d’ADNc d’utérus de souris et cloné en deux fois. L'ADNc contient un cadre de lecture

ouvert codant pour une protéine de 673 acides aminés avec un poids moléculaire

théorique de 76260 Da. Il contient également deux séquences de polyadénylation

localisées à 27 et 37 pb respectivement en amont de la queue poly A (Tsuchida et al.

1991; Tsuchida et al. 1993).

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L'analyse de l'expression du gène Padi2 de rat par Northern-blotting, a permis de

montrer la présence d'un transcrit de ~ 4.5 – 5 kb au niveau de la moelle épinière, des

glandes sous-maxillaires, du cerveau et du cervelet, ainsi que dans le muscle squelettique

mais pas au niveau du foie ou du rein (Watanabe and Senshu 1989). Une analyse par

immunotransfert réalisée par le même groupe a permis de non seulement confirmer ces

résultats au niveau protéique, mais en plus de détecter la protéine Pad2, en plus faible

quantité dans d'autre tissus/organes comme l'estomac, le thymus, l’hypophyse, ou encore

la glande surrénale. Les intensités relatives des bandes immunoréactives dans tous les

extraits de tissu et organes testés semblaient de plus concordante avec les activités Pad

relatives purifiées par immunoprécipitation avec un anticorps anti-Pad2 à partir de ces

mêmes extraits (Watanabe et al. 1988).

Enfin, tout comme pour le gène Padi1 de souris, l'expression de Padi2 semble

également sous le contrôle d'hormones sexuelles stéroïdiennes. En effet, l'ovariectomie de

souris adultes s'accompagne d'une diminution considérable de la quantité de l'enzyme

correspondante au niveau de l'utérus. Or, l'administration d'œstrogène à ces souris

s'accompagne d'une augmentation de l'activité de l'enzyme de façon dose- et temps-

dépendante au niveau de l'utérus. Des analyses par immunotransfert et Northern-blotting

ont confirmé ces résultats en montrant respectivement une augmentation graduelle de la

quantité de l'enzyme et des transcrit Padi2, suite à l'injection d'œstrogène. Ceci suggère

une régulation pré-traductionnelle par les hormones stéroïdiennes de l'expression de

l'enzyme Pad2 (Takahara et al. 1992).

4.2.1.3. Pad3

L'ADNc complet du gène Padi3 de rat a été cloné par RT-PCR et RACE-PCR à partir

d'ARN isolés d'épiderme de rat nouveau-né. L'ADNc contient un cadre de lecture ouvert de

1995 pb qui code pour une protéine de 664 acides aminés avec un poids moléculaires

théorique de 75036 Da (Nishijyo et al. 1997).

L'ADNc du gène Padi3 de souris a été cloné à partir d’ADNc d’épiderme de souris.

Le cadre de lecture ouvert de l'ADNc code pour une protéine de 664 acides aminés avec

un poids moléculaire théorique de 75098 Da (Rus'd et al. 1999).

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L'analyse par RT-PCR semi-quantitative d'un panel de tissus de rat a montré que le

gène Padi3 présente un profil d'expression plutôt restreint. Son transcrit n'a en effet été

retrouvé que dans l'épiderme et le follicule pileux (Nishijyo et al. 1997). Ces résultats sont

en accord avec ceux obtenus par Terakawa et col. qui n’ont détecté une activité Pad3 de

souris que dans l'épiderme, la peau ainsi que le follicule pileux (Terakawa et al. 1991).

4.2.1.4. Pad4

L'ADNc du gène Padi4 de rat a été cloné, tout comme le gène codant pour la Pad1

de rat, à partir d'une banque d'ADNc d'une lignée kératinocytaire de rat nouveaux-né

traitée à l'acide rétinoïque (Ishigami et al. 1998). Il a également été cloné en parallèle à

partir d'ADNc d'épiderme de rat (Yamakoshi et al. 1998). L'ADNc du gène Padi4 de rat

contient un cadre de lecture ouvert de 1998 pb codant pour une protéine de 666 acides

aminés avec un poids moléculaire théorique de 74466 Da (Ishigami et al. 1998;

Yamakoshi et al. 1998).

L'ADNc du gène Padi4 de souris a été cloné à partir d’ADNc d’épiderme de souris.

Cet ADNc contient un cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 666 acides

aminés avec un poids moléculaire théorique de 74475 Da (Rus'd et al. 1999).

L'analyse de l'expression du gène Padi4 par RT-PCR semi-quantitative sur un panel

de plusieurs tissus de rat, a révélé la présence de transcrits dans la plupart d'entre eux. Des

niveaux d'expression significatifs ont été mis en évidence dans le pancréas, la rate, les

ovaires mais aussi dans le foie, le poumon, le rein, le derme…. Par contre les transcrits

ont été très faiblement détectés au niveau du cerveau, du cœur ou encore de l'épiderme,

tissu à parti duquel le gène a pourtant été cloné (Yamakoshi et al. 1998).

4.2.1.5. Pad6

La séparation de protéines extraites d'ovocytes de souris, et des analyses par

spectrométrie de masse ont permis d'identifier une nouvelle protéine abondante des

ovocytes avec un poids moléculaire ~ de 75 kDa et un pI de 5.5 (Wright et al. 2003). Un

ADNc de 2374 pb codant pour cette protéine a été cloné à partir d'une banque issue

d'ovaire de souris. Le cadre de lecture ouvert de 2049 pb, code pour une protéine de 683

acides aminés. La comparaison de sa séquence en acides aminés avec celles d’autres

protéines contenues dans des bases de données a montré que cette nouvelle protéine

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présentait ~ 40 % d'identité avec les enzymes de la famille PAD. Ainsi, du fait de son

abondance dans les ovocytes, et de sa relative conservation avec les PAD, cette protéine a

été baptisée ePAD pour "Egg and embryo-abundant peptidylarginine deiminase" (Wright et

al. 2003). Cette enzyme a par la suite été désignée comme étant le cinquième isotype de

la famille des PAD, et pour rester dans la nomenclature des PAD existantes renommée

Pad6 (Vossenaar et al. 2003) (et non Pad5, ceci pour éviter une confusion avec la Pad4

car comme nous le verrons plus loin, l’orthologue humain de la Pad4 murine —

logiquement la PAD4 humaine — avait été clonée à partir de cellules promyeloblastiques

et malencontreusement baptisée PAD5) .

Des analyses par hybridation in situ et RT-PCR ont montré un profil d'expression du

gène Padi6 restreint puisque ses transcrits détectés au sein de l'ovaire, et très faiblement

dans le testicule, n'ont pas été retrouvés dans les autres tissus et organes testés (Wright et

al. 2003). Des expériences d'immunohistochimie ont permis de préciser la localisation de

la Pad6 (ePAD) au niveau des granules corticales d'ovocytes de souris immatures et son

relargage à partir des ovocytes matures fertilisés. Après son relargage, la Pad6 a été

observée dans l'espace péri-vitellin, une certaine quantité de protéine restant associée

avec la membrane plasmique des blastomères et ce, jusqu'au stade blastocyste (Liu et al.

2005).

4.2.2. Clonage des PAD humaines

4.2.2.1. PAD1

C'est au sein du laboratoire que l’ADNc complet du gène PADI1 a été cloné à

partir d'ADNc d'épiderme humain. Cet ADNc, long de 2711 pb contient un cadre de

lecture ouvert codant pour une protéine de 663 acides aminés avec un poids moléculaire

théorique de 74.6 kDa. Cet ADNc contient également des régions 5' et 3' non traduites de

respectivement 83 pb et 639 pb (Guerrin et al. 2003).

4.2.2.2. PAD2

Afin d’isoler et caractériser la PAD exprimée dans une lignée cellulaire humaine

issue d’un carcinome basocellulaire, HSC-1 (Kondo and Aso 1981), Ishigami et col. ont

utilisé une stratégie de clonage par contruction et criblage d'une banque d’ADNc à 7 jours

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de culture. Après analyse de sa séquence, l’ADNc obtenu a été caractérisé, grâce à sa

forte identité avec les séquences des Pad de type 2 de rat et de souris, comme étant

l’ADNc du gène PADI2. Long de 2348 pb, cet ADNc complet se compose d'une région 5'

non traduite de 64 pb, d'un cadre de lecture ouvert de 1998 pb et d'une région 3' non

traduite longue de 286 pb. Le cadre de lecture ouvert code pour une protéine de 665

acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 75 kDa. (Ishigami et al. 2002).

4.2.2.3. PAD3

L'ADNc complet du gène PADI3 humain (3142 pb) a été cloné à partir de

kératinocytes primaires en culture, par la méthode de RT- et RACE-PCR. Cet ADNc se

compose d'une région 5' non traduite de 41 pb, et d'une région 3' non traduite longue de

1147 pb dans laquelle un signal de polyadénylation a été localisé en position 3124-

3129. Le cadre de lecture ouvert de 1995 pb, code pour une protéine de 664 acides

aminés avec un poids moléculaire théorique de 74770 Da (Kanno et al. 2000).

4.2.2.4. PAD4

L'ADNc du gène PADI4 humain (2286 pb) a été isolé par criblage d'une banque

d'ADNc construite à partir de cellules pro-myélobastiques HL-60, différenciées en

granulocytes par traitement avec de l'acide rétinoïque durant 3 jours. Cet ADNc se

compose d'une région 5' non traduite de 26 pb, et d'une région 3' non traduite de 268 pb

contenant un signal de polyadénylation localisé aux nucléotides 2264-2286. Le cadre de

lecture ouvert de 1992 pb, code pour une protéine de 663 acides aminés avec un poids

moléculaire théorique de 74100 Da (Nakashima et al. 1999). Sur la base du profil

d’activité d’une forme recombinante de cette protéine sur différents substrats synthétiques

qui s’est avéré être différent de celui de la Pad4 murine, cette enzyme a d’abord été

considéré comme un nouvel isotype et été baptisée PAD5 alors que les analyses

phylogénétiques ultérieures l’ont clairemeent identifiée à l’orthologue de la Pad4 murine.

De nos jours on l’appelle PAD4.

4.2.2.5. PAD6

Tout comme pour la PAD1, c'est au sein du laboratoire que l'ADNc codant pour la

PAD6, cinquième istotype récemment décrit, a été cloné à partir d'une banque d'ADNc

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d'ovaires humains. Un cadre de lecture ouvert de 2082 pb a été décrit, et code pour une

protéine de 694 acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 77.7 kDa

(Chavanas et al. 2004). L'ADNc codant pour la PAD6 a également été cloné par une

équipe chinoise à partir d'une banque d'ADNc de cerveau fœtal humain (Zhang et al.

2004).

4.2.3. Profil d'expression des différentes PAD humaines

Tout comme pour les Pad murines, les PAD humaines semblent exprimées dans la

plupart des tissus et organes, bien que chaque isotype présente également un profil

d'expression particulier.

4.2.3.1. Expression des gènes PADI au niveau ARNm

Des analyses par RT-PCR réalisées sur un panel de tissus, organes ou cellules

humains ont permis de mettre en évidence que chacun d'entre eux exprimaient au moins

un des gènes PADI (cf Tableau 10).

On peut remarquer que le gène PADI2 est le plus ubiquiste puisque l'ARNm

correspondant a été détecté dans tous les tissus/organes testés. De plus c'est le seul

exprimé au niveau du cerveau (Guerrin et al. 2003). Les gènes PADI1 et 4 semblent

exprimés dans de nombreux tissus à la différence des gènes PADI3 et 6 qui présentent un

profil d'expression plus restreint (Guerrin et al. 2003; Chavanas et al. 2004; Nachat et al.

2005). On peut noter que seuls 3 gènes, PADI2, 4 et 6 sont transcrits dans les leucocytes

du sang périphérique (Vossenaar et al. 2004; Zhang et al. 2004; Nachat et al. 2005;

Chavanas et al. 2006). De même dans l'épiderme, seuls les gènes PADI1, 2 et 3 sont

exprimés (Guerrin et al. 2003; Nachat et al. 2005).

L'analyse de banques d'EST (UniGene) permet de confirmer les résultats obtenus

par RT-PCR. On retrouve en effet l'expression de PAD dans un grand nombre de tissus

avec la confirmation du caractère très ubiquiste du gène PADI2 (cf Tableau 11).

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Introduction

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PADI1 PADI2 PADI3 PADI4 PADI6

cerveau - + - - - cflur - + - + - colon + + + - -

épiderme + + + - - foie + + - + +

HL-60 - + + + - intestin grêle - + + + - leucocytes - + - + +

muscle squelettique - + - - + ovaire - + - + +

pancréas + + + + - peau - + + + -

placenta + + - + - poumon + + + + + prostate + + + + -

rate + + - + + rein - + + + -

testicule + + + + + thymus + + + + -

Tableau 10 : Expression des 5 gènes PADI au niveau ARNm, dans différents tissus, organes ou cellules humains. (+) : détection d'un signal par RT-PCR, (-) : absence de signal par RT-PCR (d'après (Guerrin et al. 2003; Chavanas et al. 2004; Nachat et al. 2005)).

EST (nombre) tissus / organes / cellules

homme souris rat homme

PADI/Padi1 57 25 6 cerveau, ganglion spinal, œsophage, peau, placenta, trachée, utérus, yeux

PADI/Padi2 126 219 30 cerveau, colon, foie, leucocytes, muscle, nerf optique,

ganglion lymphatique, ovaire, pancréas, peau, poumon, prostate, thymus, trachée, yeux

PADI/Padi3 20 22 0 aucune séquence dans des tissus sains

PADI/Padi4 91 80 8 cerveau, leucocytes / sang, moelle osseuse, poumon, rate, yeux

PADI/Padi6 16 142 0 épiderme

Tableau 11 : Analyse des banques d'EST chez l'homme, la souris et le rat (Analyse d’après les données sur la base de données UniGene disponibles en mai 2007).

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Toutefois, il est important de noter que l'expression d'un gène (présence d'un

transcrit ou EST) dans un tissu ou organe donné n'est pas l'assurance que la protéine

correspondante le soit elle aussi. En effet, par exemple, bien que dans des monocytes

humains purifiés et dans des macrophages dérivés, les transcrits du gène PADI2 soient

présents, la protéine correspondante n'a été détectée que dans les macrophages. Les

auteurs ont montré que la traduction du messager pouvait être régulée par la très longue

région 3' non traduite, par une approche gène rapporteur luciférase (Vossenaar et al.

2004). L'expression des PAD pouvant être régulée au moins au niveau traductionnel

l'étude de l'expression et de la régulation de l'expression des PAD au niveau protéique

reste donc très importante.

4.2.3.2. Expression des PAD au niveau protéique

L'expression des PAD au niveau protéique a également été décrite dans de

nombreux tissus et organes.

En dépit du fait que le gène PADI1 présente un profil d'expression assez large, les

études portant sur l'analyse de l'expression de la protéine correspondante ont surtout été

réalisées au niveau de l'épiderme et des annexes cutanées. La protéine PAD1 a ainsi été

retrouvée au niveau de toutes les couches vivantes de l'épiderme, au niveau du follicule

pileux (Mechin et al. 2005; Nachat et al. 2005), des muscles arrecteurs de poil et des

glandes sudoripares (Nachat et al. 2005).

La PAD2, tout comme cela était suggéré par la présence des transcrits du gène

PADI2 dans tous les tissus testés, est largement exprimée. On la retrouve, comme la

PAD1, dans l'épiderme au niveau des couches vivantes (Ishigami et al. 2002; Nachat et

al. 2005), dans les muscles arrecteurs de poils ou encore les glandes sudoripares (Urano

et al. 1990; Nachat et al. 2005). En accord avec les résultats obtenus au niveau

transcriptionnel, son expression a également été décrite au sein des leucocytes et plus

particulièrement de macrophages différenciés in vitro à partir de monocytes du sang

périphérique (Vossenaar et al. 2004). Elle est de plus le seul isotype exprimé au sein du

cerveau au niveau des astrocytes (Sambandam et al. 2004; Ishigami et al. 2005).

La PAD3 semble être présente dans un nombre de tissus ou organes plutôt restreint.

Son expression a seulement été rapportée dans la couche granuleuse et les couches les

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plus profondes de la couche cornée de l'épiderme, ainsi qu'à plusieurs couches du

follicule pileux (Kanno et al. 2000; Mechin et al. 2005; Nachat et al. 2005; Nachat et al.

2005).

La PAD4, quant à elle, est la seule parmi les 5 isotypes de PAD, a posséder une

séquence de nucléarisation. C'est ainsi que son expression au sein des noyaux de

granulocytes a été décrite (Nakashima et al. 2002). Plus généralement, l'expression de la

PAD4 a surtout été recherchée dans les cellules hématopoïétiques. Même si les résultats

des différentes études ne sont pas toujours totalement concordants, la PAD4 a été

retrouvée dans plusieurs types cellulaires et principalement dans les granulocytes,

monocytes et macrophages (Nakashima et al. 1999; Asaga et al. 2001; Vossenaar et al.

2004; Chang et al. 2005).

Enfin, concernant la PAD6, aucune donnée concernant son expression dans des

tissus ou organes humains n'avait été encore réalisée avant notre travail.

4.2.4. Conservation des différentes PAD

4.2.4.1. Organisation génomique et conservation des gènes PADI/Padi

Chez les mammifères, les cinq gènes codant pour les 5 isotypes de PAD sont tous

regroupés en un locus unique sur le chromosome 1 chez l'homme, le chromosome 4 chez

la souris et le chromosome 5 chez le rat (cf Figure 10). Chez l'homme, les cinq gènes PADI

s'étendent sur une région de 355 kb en position 1p35-36. Chez la souris et le rat, les cinq

gènes sont regroupés dans des régions d'environ 240 kb respectivement en position 4E1

et 5q36. Les positions relatives des 5 gènes PADI/Padi sont conservées selon l'ordre

suivant : télomère – PADI/Padi2 - PADI/Padi1 - PADI/Padi3 - PADI/Padi4 - PADI/Padi6.

L'orientation des gènes est également conservée avec le gène PADI/Padi2 à l'opposé des 4

autres PADI/Padi, en direction du télomère (Vossenaar et al. 2003; Chavanas et al.

2004).

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Figure 10 : Organisation génomique du locus PADI/Padi chez l'homme, la souris et le rat. Idéogramme du chromosome 1 humain, du chromosome 4 de souris et du chromosome 5 de rat montrant la localisation et l'orientation des gènes PADI/Padi. Le gène PADI/Padi2 est orienté dans la direction inverse aux quatre autres PAD. Hs : Homo sapiens, Mm : Mus musculus, Rn : Rattus norvegicus. (Vossenaar et al. 2003).

Les 5 gènes PADI/Padi qui ont été décrits, présentent une organisation semblables :

ils sont tous subdivisés en 16 exons et la position des jonctions introns/exons est

conservée. En revanche, la taille des gènes est plus variable. Les gènes PADI1 à 6

s'étendent respectivement sur 40.9, 50.7, 35.1, 55.5 et 29.5 kb. De la même façon, chez

la souris, les gènes Padi1 à 6 s'étendent respectivement sur 32.8, 46.2, 25.3, 27.4 et

15.2 kb. La taille des régions inter-génique est également plutôt hétérogène et varie de

3.1 kb (entre PADI1 et 3) à 86 kb (entre PADI 2 et 1) chez l'homme, ou de 2.5 kb (entre

Padi 1 et 3) à 62 kb (entre Padi 2 et 1) chez la souris (Chavanas et al. 2004).

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4.2.4.2. Conservation des séquences des PAD

La forte conservation entre les différentes PAD a été décrite dans de nombreuses

études. Chez les mammifères, les différents isotypes de PAD à l'intérieur d'une même

espèce (PAD paralogues) sont assez bien conservés et présentent 44 à 57 % d'identité en

acides aminés (cf Tableau 12).

Tableau 12 : Conservation entre les différentes PAD humaines. Les pourcentages d'identité et de similarité en acides aminés entre les différentes PAD humaines ont été calculés après alignement des séquences protéiques sur "Blast" et sont données respectivement en bleu et en rouge.

Cette conservation est encore plus élevée entre PAD orthologues puisque leurs

séquences en acide aminés présentent entre 67 et 92 % d'identité et de 82 à 96 % de

similarité (cf Tableau 13). La PAD6 humaine apparaît être l'isotype le moins conservé avec

seulement 44 % d'identité avec les autres PAD humaines et 66% d'identité avec son

orthologue chez la souris. Au contraire la PAD de type 2 semble être la plus conservée

entre les différentes espèces de mammifères, la PAD2 humaine étant conservée à plus de

90 % avec son orthologue murin (cf Tableau 13).

Comparaison des

séquences protéiques % d'identité % de similarité

PAD1/ Pad1 76 85

PAD2/ Pad2 92 96

PAD3/ Pad3 87 93

PAD4/ Pad4 73 85

PAD6/ Pad6 66 82 Tableau 13 : Comparaison des séquences protéiques des PAD humaines (PAD1-6) et de souris (Pad 1-6).

Identité / similarité (%) PAD1 PAD2 PAD3 PAD4 PAD6

PAD1 100 51 / 67 57 / 70 56 / 72 44 / 61

PAD2 100 51 / 67 50 / 65 44 / 61

PAD3 100 55 / 69 43 / 62

PAD4 100 44 / 64

PAD6 100

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La forte homologie de séquence entre les différents isotypes de PAD, la

conservation de la structure des exons ainsi que de l'organisation en locus indiquent que

chez les mammifères, les 5 enzymes PAD sont le résultat d'une série de duplications

géniques ayant eu lieu avant la divergence des différentes espèces de mammifères

(Vossenaar et al. 2003).

La réalisation d'arbres phylogénétiques a permis de mieux comprendre les

différentes étapes de l'évolution des différentes PAD. Le gène PADI2 aurait divergé en

premier par duplication à partir de l'ancêtre commun. De plus, la longueur des branches

(corrélée au taux d'évolution des séquences) a fait ressortir que certains gènes de PAD ont

évolué plus vite que d'autres. La longueur des branches plus longue pour le groupe des

gènes PADI/Padi6 que pour le groupe des gènes PADi/Padi2 signifie que les similarités

entre espèces sont plus grandes dans le groupe "PAD-2" que dans le groupe "PAD-6" et

que le groupe PAD-2 est le plus conservé. En outre, la distance par rapport à l'ancêtre

commun est plus courte pour le groupe PAD-2 ce qui suggère que le groupe a été soumis

à une pression de sélection négative importante et a probablement conservé les fonctions

biochimiques ancestrales. Les autres PAD auraient subi une spécialisation d'expression

tissulaire ou une modification importante des propriétés biochimiques. La comparaison

des taux d'évolution des séquences (longueur des branches) avec les largeurs de profils

d'expression des différentes PAD fait ressortir une corrélation inverse entre les deux. Ceci

est d'autant plus remarquable lorsque l'on compare la taille des branches et la distribution

tissulaire de PADI2 (branches courtes et distribution tissulaire variée) et de PADI6 (branches

longues, distribution tissulaire très limitée) (cf Figure 11) (Balandraud et al. 2005).

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Figure 11 : Relation phylogénétique et profil d'expression au sein de la famille des PAD. Les numéros dans les carrés correspondent à différents tissus adultes : 1: os, 2: cerveau, 3: colon, 4:oeil, 5 : rein, 6: foie, 7: poumon, 8: glande mammaire, 9: pancréas, 10: placenta, 11: peau, 12: thymus, 13: utérus, 14: ovaires, 15: oreille interne et 16: tissu olfactif. Un carrés gris indique la présence ou l'expression dans le tissu correspondant (au 1er janvier 2005) et un carré blanc indique qu'aucune expression n'a été décrite dans le tissu. Les cercles ronds indiquent une duplication (Balandraud et al. 2005).

4.2.5. Substrats et spécificités des PAD

Rappelons qu’une activité PAD a été détectée chez tous les vertébrés et dans la

plupart des organes, tissus et cellules. Comparativement au caractère ubiquiste de cette

activité enzymatique , peu de substrats in vivo ont été identifiés. Il s’agit essentiellement de

protéines structurales : des protéines des filaments intermédiaires comme les kératines, la

vimentine ou encore la GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), ainsi que des protéines

associées aux filaments intermédiaires de kératine comme la trichohyaline et la filaggrine

(Rogers et al. 1977; Senshu et al. 1996; Asaga et al. 1998; Nicholas et al. 2004).

D'autres protéines cibles ont été décrites : des protéines nucléaires telles que les histones

ou la nucléophosmine/B23 (Hagiwara et al. 2002; Nakashima et al. 2002) mais

également des protéines extra-cellulaires comme la fibrine ou la fibronectine (Masson-

Bessiere et al. 2001; Chang et al. 2005), (pour plus de détail voir les paragraphes 4.4 et

4.5).

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Généralement, ces protéines sont des protéines relativement abondantes, elles

contiennent un pourcentage élevé de résidus arginyl dans leur séquence et sont souvent

des protéines basiques (ou contenant des domaines basiques) alors que les PAD sont

plutôt acides du fait de leur point isoélectrique (cf Tableau 14). Ceci favorise probablement

les interactions entre l'enzyme et son substrat (Mechin et al. 2007).

PAD1 PAD2 PAD3 PAD4 PAD6 pI 6,07 5,4 5,3 6,15 5.13

Tableau 14 : Point isoélectrique des différentes PAD humaines. Les points isoélectriques théoriques des différentes PAD1 à 6 humaines ont été calculés grâce à l'outil " Compute pI/Mw" sur ExPASy. Ces données ont été calculées à partir des séquences des PAD1 à 6 correspondant, respectivement, aux numéros GenBank suivants : AB033768, AB030176, AB026831, AB017919 et AT422079.

N'importe quel résidu arginyl au sein d'une protéine n'est pas la cible des PAD. En

effet, la désimination d'un résidu arginyl par une PAD dépend de plusieurs facteurs tels

que la position du résidu arginyl, la nature des résidus amino-acyl environnant ou encore

les contraintes structurales (Tarcsa et al. 1996). Quelques uns de ces facteurs ont été

résumés dans le Tableau 15 suivant.

Structure primaire

N-Arg-Glu-C citrullination lente, jusqu'à 10% d'efficacité

N-Arg-Asp-C citrullination rapide, jusqu'à 100% d'efficacité

Arg proche de N-ter faiblement citrulliné

N-Arg-Arg-C le plus proche de C-ter : faiblement citrulliné

N-Pro-Arg-Pro-C jamais citrulliné

Structure secondaire

Hélice α difficilement citrulliné

Coude β (β turn) région très sensible à la citrullination

Désordonnée citrullination rapide, jusqu'à 95% d'efficacité

Feuillet β aucune donnée disponible Tableau 15 : Quelques règles de désimination. Ce tableau révèle quelques "préférences" des PAD vis-à-vis des structures primaires et secondaires du substrat (Tarcsa et al. 1996). N : extrémité N-terminale, C : extrémité C-terminale des protéines. D'après (Gyorgy et al. 2006).

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Pour résumer, les données tirées de l’analyse de la désimination de la filaggrine de

souris, de la trichohyaline humaine et de peptides synthétiques (cf Tableau 15) ont permis

de montrer qu'un résidu arginyl proche de l'extrémité N-terminale est faiblement citrulliné.

Des résidus arginyl au sein de structures protéiques hautement α-hélicoïdales (comme la

trichohyaline) sont difficilement modifiés et de manière lente alors que des résidus arginyl

au sein de protéines moins structurées (comme la filaggrine) sont efficacement modifiés

par la Pad2 purifiée à partir de muscle squelettique de lapin. De plus, un résidu arginyl

suivi d'un résidu d'acide glutamique est très peu modifié dans une protéine α-hélicoïdale,

mais significativement modifié dans des protéines moins structurées. Enfin, dans des cas

rares où 2 résidus arginyl sont consécutifs, le premier est citrulliné beaucoup plus

efficacement que le second. Ainsi, l'action d'une PAD est dépendante à la fois de la

structure du substrat et des résidus amino-acyl environnant le résidu arginyl (Tarcsa et al.

1996).

Chaque isotype de PAD présente des spécificités de substrats différentes. Par

exemple, bien que les PAD1, 2 et 3 recombinantes soient capables de désiminer la

filaggrine, toutes ne le font pas avec la même efficacité. La PAD2 présente une activité

maximale après seulement 20 min d'incubation, contre 2H ou 19h pour respectivement les

PAD1 et 3 (Mechin et al. 2005). De plus, l'activité des 3 formes de PAD recombinantes

purifiées sur des substrats synthétiques dérivés de l'arginine peut également varier en

fonction de l'isotype. La PAD2, par exemple est plus active sur les substrats synthétiques

Tosyl-L-Arg-O-Me ou Benzoyl-L-Arg-O-Et que la PAD1 ou la PAD3 (cf Tableau 16)

(Mechin et al. 2007). Finalement bien que les différents isotypes de PAD semblent

présenter des activités relatives différentes sur différents substrat synthétiques, pour un

même isotype les formes recombinantes ou purifiées à partir de divers tissus semblent

posséder des activités relatives plutôt similaires (cf Tableau 16). Ceci suggère donc que les

PAD ne requièrent pas de modification post-traductionnelle spécifiques aux eucaryotes

pour être actives.

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Activité relative (%) recPAD1 mPad1 bPad1 recPAD2 mPad2† rPad2 mPad2‡ rabPad2 recPAD3 mPad3 rPad3

Bz-L-Arg-O-Et 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Bz-L-Arg-O-Me 88,7 71,4 / 46,5 83,0 77,9 68,3 83,9 57,6 26,8 / Bz-L-Arg-O-NH2 100,2 150,0 / 50,5 48,7 51,8 48,7 41,4 73,1 88,4 / Tos-L-Arg-O-Me 3,2 19,6 / 62,9 51,6 / 63,0 65,9 18,2 27,4 / Ac-L-Arg-O-Me 105,1 66,7 / 33,0 39,5 44,8 44,7 42,5 26,5 32,1 / Bz-L-Arg 109,6 102,0 106,0 18,7 14,2 18,5 18,4 14,9 19,7 11,6 18,0 Ac-L-Arg 113,2 65,0 / 2,4 13,0 / 3,3 2,6 7,2 11,6 / L-Arg-O-Me 10,3 14,3 / 2,1 2,8 / 2,0 1,8 5,7 15,3 / L-Arg 15,7 15,0 7,0 4,9 3,7 0,8 4,0 2,6 4,2 8,9 2,4 Protamine 109,5 37,5 / 115,3 59,0 / / / 218,6 141,1 /

Tableau 16 : Comparaison des activités relatives des PAD1, 2 et 3 sur des substrats synthétiques ou sur la protamine. Les différentes PAD1 à 3 ont été produites sous forme recombinante (jaune) ou bien purifiées à partir d'épiderme (bleu) ou de muscle squelettique (rose) ou encore de follicule pileux (vert). recPAD1-3 : PAD1-3 humaines recombinantes (Mechin et al. 2005). mPad1 et bPad1 : Pad1 purifiée à partir d'épiderme respectivement de souris (Takahara et al. 1989) et de bœuf (Watanabe et al. 1988). mPad2† et mPad2‡, Pad2 purifiée à partir d'e muscle squelettique, respectivement (Terakawa et al. 1991) et (Takahara et al. 1989). rPad2 et rabPad2 : Pad2 purifiée à partir de muscle squelettique respectivement de rat (Watanabe et al. 1988), et de lapin (Takahara et al. 1983). mPad3 et rPad3, Pad3 purifiée respectivement à parti d'épiderme de souris (Terakawa et al. 1991) et de follicule pileux de rat (Watanabe et al. 1988). D'après (Mechin et al. 2007).

4.3. Relations structure / fonction : structure cristallographique de la

PAD4

4.3.1. Structure générale

La structure de la PAD4 humaine a été déterminée après la réalisation de cristaux

de PAD4 humaine libre ou en complexe avec des substrats synthétiques (benzoyl-L-

arginine amide, BA) et naturels (peptides N-terminaux des histones H3 et H4) et la mesure

et l'analyse de la diffraction des rayon X à des résolutions de, respectivement, 2.8 et 2.3 Å

(Arita et al. 2004; Arita et al. 2006).

Ces données ont ainsi révélé que la chaîne polypeptidique de la PAD4 est repliée

en 2 domaines : le domaine N-terminal, des résidus methionyl 1 à prolyl 300 (Met1-

Pro300), et le domaine C-terminal, des résidus asparagyl 301 à prolyl 663 (Asn301-

Pro663) (cf Figure 12).

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Le domaine N-terminal est divisé en 2 sous-domaines "immunoglobulin-like" : le

sous-domaine1, composé de 9 feuillets β (β1− β9) et le sous-domaine 2 composé de 10

feuillets β (β10 −β19) et 4 hélices α courtes (α1- α4). Le domaine C-terminal possède une

structure constituée de 5 modules ββαβ circulaires et pseudo-symétriques appelés "α/β

propeller" en anglais. L’ensemble constitué par les premiers feuillets β de chacun de ces 5

modules, forme un site actif sous forme d'un sillon qui fixe le substrat au cœur des

modules. La bonne conservation de la partie C-terminale des séquences protéiques de

toutes les PAD suggère que les structures tertiaires des domaines C-terminaux sont

similaires.

4.3.2. Sites de fixation au calcium

Cinq ions Ca2+ désignés Ca1, Ca2, Ca3, Ca4 et Ca5 se fixent à la PAD4. Les

sites de fixation de ces ions calcium sont différents de ceux des protéines à main EF, qui

possèdent des motifs hélice-boucle-hélice pour lier les ions Ca2+.

Ca1 et Ca2 sont positionnés dans le domaine C-terminal. Ca1 s'organise avec 5

résidus amino-acyl (Gln349, Glu353, Glu 411, Phe407 et Leu410) et deux molécules

d'eau tandis que Ca2 s'assemble avec 4 résidus amino-acyl (Glu351, Asp 369, Asn373 et

Figure 12 Structure de la PAD4 : représentation sous forme de monomère en complexe avec un substrat synthétique. Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sous forme de boules noires, et le substrat, benzoyl-L-arginine amide, est représenté en bleu foncé selon le modèle " boules et bâtons". Les sous-domaines N-terminaux 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement en jaune, vert et rouge. La région correspondant à la séquence de nucléarisation (NLS) est indiquée sous forme de pointillés (Arita et al. 2004).

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Introduction

- 82 -

Ser370) et une molécule d'eau. Presque tous ces résidus qui servent de ligand pour Ca1 et

Ca2 sont conservés chez les autres PAD excepté PAD6. Ces résidus sont donc

probablement des ligands des ions Ca2+ dans les PAD1, PAD2 et PAD3 (cf Figure 13).

Ca3, Ca4 et Ca5 sont localisés en N-terminal dans le sous-domaine 2. Ca3 et C4

interagissent l'un avec l'autre et se coordonnent respectivement avec 6 résidus amino-acyl

(Asn153, Asp155, Asp157, Asp165, Asp176 et Asp179) et 4 résidus amino-acyl (Asp155,

Asp157, Asp179 et Asp388). Ca5 quant à lui, s'assemble avec 3 résidus amino-acyl

(Asp168, Asp165 et Glu170) et deux molécules d'eau (cf Figure 13).

349 353 407 410 411PAD 1 Q E F L D

2 Q E F L E3 Q E F L E4 Q E F L E6 Q A I L M

351 369 370 373PAD 1 E D S N

2 E D S D3 E D S N4 E D S N6 E D T A

153 155 157 165 176 179PAD 1 N D D D D D

2 N D E D D D3 N D D D D D4 N D D D D D6 N N A D E N

155 157 179 388PAD 1 D D D D

2 D E D D3 D D D D4 D D D D6 N A N G

165 168 170PAD 1 D H W

2 D D K3 D D H4 D D E6 D T K

Site Ca1 : acides aminés

Site Ca5 : acides aminés

Site Ca4 : acides aminés

Site Ca3 : acides aminés

Site Ca2 : acides aminés

Figure 13 : Sites de fixation des 5 ions Ca2+ (Ca1 à Ca5) : composition en acide aminés et conservation entre les différentes PAD paralogues humaines. D'après (Arita et al. 2004).

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Introduction

- 83 -

4.3.3. Implications fonctionnelles dans le domaine N-terminal

La fixation des ions Ca2+ dans le domaine N-terminal provoque une modification

nette dans la conformation de la région comprise entre les résidus amino-acyl Asn158 et

Val171. Cette région est en effet désorganisée dans la PAD4 "libre" sans calcium mais se

structure après fixation de Ca3, Ca4, Ca5 et de 2 molécules d'eau. Ces changements

conformationnels dans le domaine N-terminal de la PAD4 pourraient être impliqués dans

un mécanisme de régulation dépendant du calcium ou dans une interaction protéine –

protéine.

La PAD4 est le seul des 5 isotypes de PAD à posséder une séquence de localisation

nucléaire (Nuclear Localisation Sequence : NLS) (56-PPAKKKST-63) et à être localisée

dans le noyau (Nakashima et al. 2002). Cette séquence NLS est positionnée à la surface

de la molécule dans une boucle située dans la région N-terminale entre β5 et β6 du sous-

domaine 1 (cf Figure 12). Cette région boucle est désorganisée quelle que soit la structure

adoptée par la PAD4 (+/- calcium ou +/- en complexe avec un substrat). Cette région

pourrait se "structurer" au cours de l'interaction de la NLS avec le récepteur du transport

nucléaire proche de l'enveloppe nucléaire. En effet, ce phénomène a été décrit dans des

analyses cristallographiques de reconnaissance d'une NLS par un facteur d'importation

nucléaire, la Karyophérine α (Conti et al. 1998).

4.3.4. Implications fonctionnelles dans le domaine C-terminal

Comme indiqué, les premiers feuillets β (β41, β22, β25, β30 et β36) de chacun

des 5 modules ββαβ du domaine C-terminal, forment ensemble un "sillon" dans la

structure de la PAD4 lorsqu'elle est liée au calcium (en complexe ou non), à l'intérieur

duquel sont situés les résidus catalytiques.

Les 5 modules ββαβ sont également présents dans d'autres enzymes de

transformation des arginines, indépendantes du calcium, telles que la L-arginine:glycine

amidinotransferase (AT; EC 2.1.4.1) (Humm et al. 1997) et la diméthylarginine

dimethylaminohydrolase (DDAH; EC 3.5.3.18) (Murray-Rust et al. 2001). Récemment, les

structures crystallographiques d'arginine désiminases (ADI; EC 3.5.3.6) de Pseudomonas

aeruginosa (Pa-ADI) et de Mycoplasma arginini (Ma-ADI) ont été déterminées

respectivement sous forme "libre" et "compléxée" à un substrat avec les différents

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intermédiaires de réaction. Les structures des Pa-ADI et Ma-ADI comprennaient 5 modules

ββαβ similaires à ceux retrouvés dans les AT, DDAH et dans le domaine C-terminal de la

PAD4. La comparaison des ADIs avec les domaines C-terminal de la PAD4 sous forme

liée au calcium ou complexée à un substrat montre que les résidus catalytiques des ADI se

superposent bien aux résidus Asp350, His471, asp473 et Cys645 de la PAD4. Ceci

indique que, plus généralement, les PAD appartiennent à la surperfamille des enzymes de

transformation d'arginine et que les résidus Asp370, His470, Asp473 et Cys645 situés

dans le sillon de PAD4 sont probablement les résidus catalytiques de la PAD4 et des PAD1

à 3, chez lesquelles ils sont conservés (cf Figure 14). D'ailleurs, le rôle potentiel de ces

résidus a été déterminé expérimentalement grâce à des mutants alanine (D350A, H471A,

D473A et C645A); aucun d'entre eux ne présentait une activité enzymatique détectable en

présence de calcium (Arita et al. 2004).

350 471 473 645PAD 1 D H D C

2 D H D C3 D H D C4 D H D C6 D H D A

Site catalytique : acides aminés

Figure 14 : Site catalytique : composition en acides aminés déterminés par étude cristallographique du complexe PAD4/BA et conservation chez les différentes PAD paralogues humaines 1, 2, 3 et 6. D'après (Arita et al. 2004).

4.3.5. Site actif en forme de sillon

La structure du domaine C-terminal de la PAD4 liée au calcium est presque la

même que celle de la PAD4 complexée à un substrat. Ceci indique donc que la fixation

du substrat n'a pas d'effet sur la formation du site actif en forme de sillon. Au contraire, il

existe de grandes différences conformationnelles dans le domaine C-terminal de la PAD4

"libre" (sans calcium) et celui de la PAD4 liée au calcium. Une surface concave, composée

de nombreux résidus acides, est exposée aux solvants dans la PAD4 "libre" à cause des

résidus Ile313-Ile320, pro338-Met348, Pro371-Pro387, Pro396-Gly403 et Phe633-

His644, hautement désordonnés. Ces mêmes résidus sont bien ordonnés dans l'enzyme

liée au calcium et créent le site actif en forme de sillon après fixation de Ca1 et Ca2.

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Les changements conformationnels qui s'opèrent autour du site actif, suggèrent

fortement que la fixation de Ca1 et Ca2 à la surface concave acide du domaine C-

terminal est cruciale à la reconnaissance du substrat. Le remplacement d'un des résidus

Gln349, Glu353, Glu411, Asp369 et Asn373, qui sont des ligands de Ca1 et Ca2, par

une alanine, abolit toute activité de l'enzyme. Par contre le remplacement par une alanine

du résidu Asp388, un ligand de Ca4 qui est le plus proche du site actif parmi tous les

autres ligands de Ca3, Ca4 ou Ca5, provoque un baisse de seulement 18% de l'activité

enzymatique. Ainsi, à l'inverse de Ca3, Ca4 et Ca5, Ca1 et Ca2 sont essentiels à la

catalyse.

Cette formation du site actif induite par la fixation de calcium n'a pas été retrouvée

dans d'autres enzymes dépendantes du calcium telles que la transglutaminase 3 ou la

calpaïne (Ahvazi et al. 2002; Khorchid and Ikura 2002), où la fixation d'ions Ca2+ induit

bien des changements conformationnels au niveau du site actif mais ne contribue pas à la

formation du site de fixation du substrat en stabilisant des régions déstructurées. La PAD4

présenterait donc un nouveau mécanisme encore inconnu d'activation enzymatique par

des ions Ca2+ (Arita et al. 2004).

4.3.6. Dimérisation de la PAD4

L’analyse crystallographique suggère que la PAD4 forme des dimères formés par

l’association du domaine N-terminal d'une première molécule avec le domaine C-terminal

de la deuxième et vice versa (cf Figure 15).

Figure 15 Structure de la PAD4 : représentationsous forme de dimère en complexe avec unsubstrat synthétique (benzoyl-L-arginine amide).Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sousforme de ronds noirs, et le substrat est représentéen bleu foncé selon le modèle " boules et bâtons". Les sous-domaines 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement en jaune, vert etrouge. L'axe cristallographique est orientéverticalement à travers le centre du dimère (Aritaet al. 2004).

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De plus d'autres analyses ont montré que la PAD4 en solution possède une forme

et taille similaire à celle du dimère formé dans le cristal. Ces résultats illustrent que l'unité

fonctionnelle de la PAD4 est un dimère comme celui formé dans le cristal. La question est

maintenant de savoir si cette forme dimérique est spécifique à la PAD4 ou bien commune

à toutes les PAD, bien que les résidus impliqués dans sa formation soient partiellement

conservés.

4.3.7. Reconnaissance de substrats naturels : les histones

La reconnaissance d'un substrat synthétique artificiel, le BA, par la PAD4 étant

probablement différente de la reconnaissance de substrats physiologiques, le même

groupe a également étudié la reconnaissance moléculaire de protéines cibles naturelles

de l'enzyme, en utilisant comme substrats, les portions N-terminales des histones. Ils ont

ainsi réalisé des cristaux de la PAD4 liée au calcium et en complexe avec 3 peptides

dérivés de la partie N-terminale des histones H3 (2 peptides) et H4 (1 peptide). Les

structures respectives de la PAD4 en complexe avec chacun des 3 peptides sont similaires

les unes par rapport aux autres et également par rapport à la structure précédemment

décrite en complexe avec le BA (cf Figure 16).

Figure 16 : (A) Structure de la PAD4 liée au calcium en complexe avec un peptide de la queue N-terminale de l'histone H3. Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sous forme de boules jaunes, et le substrat, le peptide H3, est représenté en vert selon le modèle de Dreiding. Les sous-domaines 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement colorés en vert, bleu et rouge. La région correspondant à la NLS est indiquée sous forme de pointillés. (B haut) représentation schématique de la structure montrée en (A). Les couleurs des différents sous-domaines sont les mêmes qu'en (A). Les lignes pointillées représentent les liaisons hydrogènes. (B bas) En référence, la structure de la PAD4 liée au calcium est représentée.

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Les portions N-terminales des histones sont connues pour être flexibles et dépasser

du cœur du nucléosome (cf Figure 17). Cependant, pour les différents peptides N-

terminaux des histones fixés à la PAD4, 5 résidus amino-acyls successifs, avec en position

centrale le résidu arginyl cible de la PAD4, adoptent une conformation courbée avec une

structure ordonnée. Sur la PAD4, l’Arg-374 établit de multiples liaisons hydrogènes avec

chacun des peptides favorisant ainsi leur courbure. Le rôle important de l’Arg-374 a été

confirmé expérimentalement : son remplacement par une peptidyl-alanine (R374A)

diminue l'activité de l'enzyme vis-à-vis des 3 peptides dérivés de l'histone et du BA à moins

de 6 % de celle de l'enzyme sauvage (Arita et al. 2006).

Figure 17 : Possible changement conformationnel de la portion N-terminale de l'histone au cours de sa citrullination. La portion N-terminale qui dépasse du cœur du nucléosome est représentée sous forme d'un ruban vert et la PAD4 est schématisée comme dans la figure précédente.

Il semble donc important, pour la reconnaissance de l'arginine ciblée par la PAD4,

que le peptide portant le résidu arginyl cible adopte une conformation hautement

désordonnée (destructurée). En effet, l'enzyme reconnait un peptide non structuré / flexible

à la surface moléculaire proche du site actif en forme de sillon, et induit une courbure

proche de celle d'un feuillet β (cf Figure 17). Il serait intéressant de savoir si la citrullination

par la PAD4 entraine le changement de cette "courbure" en une conformation de feuillet β

plus stable via la formation de liaisons (ponts ?) hydrogène provoquant ainsi le relargage

du produit citrulliné de l'enzyme (cf Figure 17).

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Concernant la spécificité de séquence, à l'inverse de la majorité des enzymes qui

modifient les histones, la PAD4 ne semble pas reconnaitre un résidu amino acyl particulier

de manière séquence-spécifique. D'après les résultats qu'ils ont obtenus, les auteurs ont

proposé que la PAD4 reconnaissent cinq résidus successifs avec comme séquence

consensus "φXRXX" dans laquelle φ représente un acide aminé avec une chaine latérale

petite, et X un acide aminé quelconque. L'enzyme parait en effet peu spécifique de

séquence et peut cibler plusieurs résidus arginyl différents dans les portions N-terminales

des histones.

Les études de la structure cristallographique de la PAD4 permettent donc de mieux

comprendre les interactions de la PAD4 avec ses substrats et constituent un outil très utile

pour le développement d'inhibiteurs de la PAD4 et pourquoi pas d'autres PAD, au moins

des PAD1 à 3, qui présentent des sites catalytique et de fixation au calcium assez

conservés.

4.4. PAD, désimination et processus physiologiques

Les PAD sont exprimées dans la plupart des tissus. En dépit de ce large profil de

distribution qui suggère un rôle important de ces enzymes dans de nombreuses fonctions

biologiques, comme nous l’avons dit, peu de cibles in vivo sont connues et le rôle exact

de ces enzymes reste encore assez obscur.

4.4.1. Désimination et différenciation épidermique

La peau est un organe complexe qui constitue une véritable barrière entre

l'organisme et l'environnement extérieur. L'épiderme, partie la plus externe de la peau, est

un épithélium pluristratifié constitué à 90% de cellules épithéliales, les kératinocytes. Ces

derniers vont migrer de la couche la plus profonde de l'épiderme vers la surface au cours

d'un processus complexe de différenciation qui se traduit par de nombreuses modifications

morphologiques et structurales. Dans les dernières étapes de ce processus, les

kératinocytes vont se transformer en cornéocytes, cellules anucléées, qui, par empilements

successifs, forment la couche cornée. Les différentes couches cellulaires qui composent

l'épiderme se nomment, de la plus profonde à la plus externe : couche basale ou stratum

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basale (SB), couche épineuse ou stratum spinosum (SS), couche granuleuse ou stratum

granulosum (SG) et couche cornée ou stratum corneum (SC) (cf Figure 18).

Figure 18 : Représentation schématique de l'ultrastructure de l'épiderme (d'après un schéma original de Christian Vincent).

4.4.1.1. Désimination et Facteur naturel d'hydratation

La couche cornée joue un rôle clé dans les fonctions de protection et de barrière

de l'épiderme. Pour assurer cette fonction, la couche cornée doit être hydratée. Le

maintien de cette hydratation dépend de deux facteurs principaux :

- la mise en place, dans les espaces inter-cornéocytaires, d'un matériel lipidique

imperméable à l'eau, ainsi que

- la formation, intra-cornéocytaire, du facteur naturel d'hydratation (FNH).

Ce FNH est formé (pour près de 50%) d'un "pool" d'acides aminés, d'acide

urocanique (dérivé de l'histidine qui participe à l'absorption des rayons ultra-violets), de

dérivés hygroscopiques de divers acides aminés et de lactate. En maintenant l'hydratation

de la couche cornée, le FNH permet à de nombreuses enzymes cornéocytaires d'être

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actives, et joue un rôle clé dans le maintien de la fonction barrière de l'épiderme. Les

acides aminés et dérivés qui constituent le FNH sont pratiquement tous issus de la

protéolyse d'une seule protéine : la filaggrine (Scott et al. 1982; Rawlings et al. 1994).

4.4.1.1.1. Désimination de la filaggrine et FNH

La filaggrine (filament aggregating protein) est une protéine basique, riche en

histidine, qui appartient à la famille des IFAP (Intermediate Filament Associated Protein).

Comme son nom l'indique, elle s'associe aux filaments intermédiaires de kératines et

permet leur aggrégation sous forme de macrofibrilles qui forment une matrice fibreuse

dense intra-cornéocytaire (Steinert et al. 1981; Dale et al. 1985). Chez l'homme, cette

protéine de 37 kDa est synthétisée tardivement au cours de la différenciation

kératinocytaire sous la forme d'un précurseur, la profilaggrine, constituée de la répétition

de 10 à 12 unités de filaggrine reliées entre elles par de courts peptides de liaison (Gan et

al. 1990). Le gène codant pour la profilaggrine est localisé chez l'homme en 1q21, au

niveau du "Complexe de Différenciation Epidermique" (CDE), locus regroupant plusieurs

gènes codant également pour des protéines exprimées au cours de la différenciation

terminale des kératinocytes.

Le métabolisme de la (pro)filaggrine est complexe (cf Figure 19). La profilaggrine est

une protéine insoluble de haut poids moléculaire (environ 400 kDa) et hautement

phosphorylée. Elle est synthétisée par le kératinocyte granuleux dans lequel elle s'accumule

au niveau des granules de kératohyaline. Au cours de la transition kératinocyte granuleux

/ cornéocyte, la profilaggrine va être déphosphorylée puis les peptides de liaison vont être

clivés séparant ainsi les différentes unités de filaggrine. Les monomères de filaggrine

libérés s'associent alors aux filaments intermédiaires de kératines et permettent leur

aggrégation sous forme de macrofibrilles. Plus tardivement dans la couche cornée, la

filaggrine devient la cible des PAD (Senshu et al. 1996) qui transforment les résidus arginyl

(basique) en résidus citrullyl (neutre) et modifient la charge globale de la protéine. La

filaggrine devient ainsi acide / neutre et perd son affinité pour les filaments intermédiaires

de kératines dont elle se détache. La filaggrine est par la suite totalement dégradée en un

mélange d'acides aminés, composants du FNH.

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Ainsi, la désimination de la filaggrine pourrait être une étape cruciale permettant sa

protéolyse et donc être indirectement impliquée dans le maintient de l'hydratation de

l'épiderme et sa fonction barrière.

Figure 19 : Représentation schématique du métabolisme de la filaggrine (d'après un schéma original de Cécile Caubet).

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4.4.1.1.2. PAD impliquées dans la désimination de la filaggrine

Au sein du laboratoire, des analyses par RT-PCR ont permis d'identifier au niveau

de l'épiderme humain, les transcrits de seulement 3 des 5 isotypes de PAD : les PAD1, 2 et

3. Ces résultats confirmés par l'immunodétection des enzymes correspondantes dans des

extraits protéiques d'épiderme humain, à l'aide d'antisérum spécifiques de chaque isotype

produits au sein du laboratoire, montrent que seules ces trois PAD sont exprimées dans

l'épiderme (Guerrin et al. 2003; Nachat et al. 2005). Afin de rechercher la ou les

candidates à la désimination de la filaggrine in vivo, l'activité des PAD 1, 2 et 3 produite

sous forme recombinante active a été mesurée in vitro sur de la filaggrine humaine

recombinante purifiée ou enrichie à partie d'un extrait d'épiderme. Les résultats ont montré

que les 3 isotypes sont capables de désiminer la filaggrine in vitro avec toutefois des

efficacités différentes. En effet, la PAD2 a présenté une activité maximale après seulement

20 min alors que les PAD1 et 3 après respectivement 2 et 19 heures (Mechin et al. 2005).

Des immunomarquages réalisés sur cryocoupes d'épiderme humain, à l'aide des

anticorps dirigés contre les 3 PAD épidermique et d'un anticorps anti-(pro)filaggrine ont

montré que les PAD1 et 2 sont présentes dans tous les kératinocytes vivants alors que

l'expression de la PAD3 est restreinte aux kératinocytes granuleux et aux cornéocytes les

plus profonds. De plus à la différence des PAD1 et 3 qui co-localisent avec la (pro)

filaggrine au sein des kératinocytes granuleux, la PAD2 présente une localisation

péricellulaire. Ainsi, même si la PAD2 parait être la plus efficace pour désiminer la

filaggrine in vitro, du fait de sa localisation, elle ne pourrait être active directement sur la

filaggrine in vivo (Nachat et al. 2005).

En outre, des analyses immuno-structurales ont montré que la PAD1 est présente

dans le cytoplasme des kératinocytes depuis la couche basale jusqu’à la couche

granuleuse, avec un marquage persistant jusqu'à la surface de la peau. Plus précisément,

au sein des kératinocytes granuleux, elle est retrouvée au niveau des filaments

intermédiaires de kératine et dans les granules de kératohyaline où elle co-localise avec la

(pro)filaggrine et, dans la matrice fibreuse des cornéocytes les plus profonds, elle co-

localise avec la filaggrine. Concernant la PAD3, son marquage est plus limité puisqu'elle

n'est présente que dans les kératinocytes granuleux, au sein des granules de kératohyaline,

et dans les cornéocytes les plus profonds au niveau de la matrice fibreuse. Cependant,

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tout comme la PAD1, elle co-localise avec la (pro)filaggrine dans les granules de

kératohyaline et avec la filaggrine au niveau de la matrice intracornéocytaire (Mechin et

al. 2005).

En conclusion, ces données suggèrent que la PAD1 et la PAD3, même si cette

dernière apparait moins active sur la filaggrine in vitro, sont les enzymes impliquées dans

la désimination de la filaggrine in vivo.

4.4.1.2. Désimination des filaments intermédiaires de kératines

Outre la filaggrine, d'autres protéines sont citrullinées dans l'épiderme. Elles ont pu

être initialement détectées au niveau de la couche cornée et plus faiblement au niveau de

la couche granuleuse de l'épiderme de rat, grâce à l'utilisation d'un anticorps anti-citrulline

particulier. Cet anticorps, développé par T. Senshu et ses collborateurs, reconnait en effet,

des citrullines modifiées chimiquement par un traitement avec du monoxime et de

l’antipiryne dans un mélange très acide (Anti-Modified Citrulline, AMC) (Senshu et al.

1992). Des analyses par gel bi-dimentionnel, ont permis d’identifier des protéines

citrullinées dans des extraits d’épiderme de rat adulte. Elles correspondent, outre la

filaggrine, à des kératines : des variants acides de kératine de 60 kDa, composant

désiminé majoritaire, ainsi qu’un spot minoritaire de kératine désiminée de 55kDa (Senshu

et al. 1995). Cependant, faute d'outils immunologiques disponibles chez le rat,

l’identification précise des kératines désiminées n'avait pu être réalisée. Par la suite, ce

même groupe s’est donc naturellement intéressé à l’analyse des protéines citrullinées

extraites à partir d’épiderme humain. Les protéines désiminées identifiées correspondaient

également à de la filaggrine et à des filaments intermédiaires de kératines :

majoritairement de la kératine K1 partiellement dégradée, liée par des ponts disulfures et,

plus minoritairement des composants dérivés de la kératine K10 (Senshu et al. 1996). Tout

comme chez le rat, ces protéines désiminées ont été détectées dans les cornéocytes, et

beaucoup plus occasionnellement dans les kératinocytes granuleux. L’utilisation d’un

anticorps dirigé contre un peptide désiminé dérivé de la séquence du sous-domaine V2 de

la kératine 1, a enfin permis de localiser plus précisément la kératine 1 désiminée au

niveau des cornéocytes les plus superficiels (Ishida-Yamamoto et al. 2002). De plus,

comme nous l’avons mentionné, les analyses immuno-structurales ont indiqué que seule la

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Introduction

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PAD1 est présente jusqu’à la surface de la couche cornée (Mechin et al. 2005). La PAD1

est donc probablement l’enzyme qui désimine la kératine 1 dans les étapes les plus

tardives de la différenciation.

Afin de mieux caractériser les sites de désimination de la kératine K1, Senshu et

col. ont analysé sa composition en acides aminés à partir d'une fraction enrichie en

kératine 1 partiellement dégradée, obtenue à partir de couche cornée d'épiderme de

souris. Deux sites préférentiels de désimination ont ainsi été identifiés dans les sous-

domaines globulaires variables V1 et V2 de la kératine 1, situés respectivement aux

extrémités N-et C-terminales. Ces deux domaines variables, très riches en sérine et glycine

pourraient s'organiser en structure "boucle glycine" et posséder des propriétés adhésives

(Steinert et al. 1991; Caubet et al. 2004). La désimination de ces domaines pourrait, via

la modification de charge et/ou de structure qu’elle induit, moduler les interactions de la

kératine 1 avec d'autres kératines par exemple, et donc moduler l'organisation ou la

compaction des filaments intermédiaires de kératine. Même si le rôle exact de la

désimination des kératines dans la différenciation épidermique n'est pas clairement connu,

des défauts de désimination de la kératine 1 ont été observés au cours de deux

pathologies cutanées : le psoriasis et l'érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse (cf

paragraphe 4.5.4).

4.4.2. Désimination et différenciation du follicule pileux

Les follicules pileux font partie des mini-organes les plus complexes du corps

humain. Caractéristiques des mammifères, ils sont chargés de produire les poils ou les

cheveux. Ils servent à la fois d'organe sensoriel mais aussi d'instruments de

communication, d'excrétion et de protection. Le follicule pileux est le seul organe des

mammifères à subir tout au long de la vie des cycles de croissance rapide (phase

anagène), de régression (phase catagène) et de repos ou latence (phase télogène) (Krause

and Foitzik 2006) (cf Figure 20).

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Introduction

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Figure 20 : Représentation schématique des trois phases du cycle du follicule pileux. Bulbe : Bulbe pileux, Bulge : renflement, GEE : Gaine Epithéliale Externe, GEI : Gaine Epithéliale Interne, GS : Glande Sébacée, Ma : Matrice, PD : Papille Dermique, TP : Tige Pilaire. D'après (Tong and Coulombe 2006).

La structure du follicule pileux anagène mature est très complexe.

Anatomiquement, une unité pilo-sébacée se compose de plusieurs couches : une gaine

conjonctive fibreuse, une gaine épithéliale externe (GEE), une gaine épithéliale interne

(GEI) et la tige pilaire (pour plus de détail cf Figure 21). Une glande sébacée et un muscle

arrecteur de poil complètent cette unité.

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Introduction

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Figure 21 : Représentation schématique de la structure du follicule pileux en phase anagène. D'après (Johnstone and Albert 2002).

La trichohyaline (THH) est la protéine structurale majeure du follicule pileux. Elle est

présente au sein de la gaine épithéliale interne (GEI) et de la médulla, mais on la retrouve

également, dans d'autres tissus épithéliaux spécialisés comme l'épiderme de prépuce

humain, le palais dur ou encore le lit de l'ongle (Tarcsa et al. 1997). La trichohyaline a été

immunohistologiquement repérées sous 3 formes différentes grâce à l'utilisation de 3

anticorps monoclonaux (O'Guin et al. 1992). Ces localisations différentes de la THH

représentent différents stades de maturation de la trichohyaline allant de son

accumumation intiale dans des petites granules de kératohyaline, en passant par le

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relargage de ces granules, à finalement son association avec les filaments intermédiaires

de kératine au sein de la GEI (couche de henlé et huxley cornifiées) (O'Guin et al. 1992).

Tout comme pour la profilaggrine, le gène codant pour la THH est localisé chez

l'homme en 1q21, au niveau du CDE (Lee et al. 1993) et code pour une protéine de haut

poids moléculaire (près de 248 kDa), hautement insoluble. Des prédictions de sa structure

secondaire ont montré que la THH adoptait une conformation en hélice alpha; deux

paires de courts segments alpha-hélicoïdaux ont été prédits dans les 90 premiers résidus

amino-acyl suivis par une série de segments alpha-hélicoïdaux de 50 à 600 résidus de

long qui couvrent toute la protéine à l'exception d'un domaine carboxy-terminal de 40-50

résidus amino acyl de long (Lee et al. 1993). Au cours de la cornification des différentes

couches de la GEI, la THH va s'associer à elle-même et à d'autres protéines comme les

kératines grâce à des liaisons covalentes catalysées par une transglutaminase (Steinert et

al. 2003). La THH joue en effet un rôle très important dans l'organisation des filaments

intermédiaires de kératine et assure donc le renforcement de la GEI permettant de guider

la croissance directionnelle de la tige pilaire.

La THH est une cible des PAD, et la première protéine porteuse de résidus citrullyl

décrite (Rogers et al. 1977). Des expériences d'hybridation in situ ont permis de mettre en

évidence une co-expression des ARNm de la PAD3 et de la THH à la fois au niveau de la

GEI et de la médulla du follicule pileux (Rogers et al. 1997). De plus un marquage par

immunofluorescence a montré que la PAD3 et la THH co-localisaient au sein des follicules

pileux humains (Kanno et al. 2000). Enfin, des immunomarquages sur cryocoupes de cuir

chevelus, analysés par microscopie confocale ont permis de confirmer précisément la

présence de PAD3 dans le follicule pileux au niveau de la GEI et de la médulla. La PAD1

a également été détectée au niveau de la couche de huxley et de la cuticule de la GEI.

Ces données démontrent donc que la PAD3 est l'enzyme responsable de la désimination

de la THH au niveau de la médulla et de la GEI (Nachat et al. 2005). En outre, il a été

montré in vitro, que la PAD3 humaine recombinante est capable de désiminer la THH

(Kanno et al. 2000).

L’ensemble de ces résultats indique qu'à la fois la PAD1 et la PAD3 participent au

programme de différenciation des follicules pileux (Nachat et al. 2005).

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Un modèle de maturation de la THH en quatre étapes a ainsi été proposé par

l'équipe de P. Steinert (Tarcsa et al. 1997) (cf Figure 22).

Dans un premier temps, la THH structurée en hélice-alpha s'accumule sous la

forme de granules insolubles (A). Par la suite, l'initiation de la modification de THH à la

périphérie de ces granules par une PAD cytosolique, entraine des modifications de la THH

en une structure "ordonnée", augmentant sa solubilité, et contribuant à la dispersion de la

THH hors des granules (B). Puis, l'augmentation de solubilité de la THH favorise son

accessibilité à la transglutaminase 3 permettant le cross-linking entre molécules de THH

ou, au niveau de la GEI, entre THH et filaments intermédiaires de kératines qui deviennent

alors plus alignés (C). Ces événements résultent en une structure rigide et hautement

insoluble (D).

Dans la médulla, en l'absence de filaments intermédiaires de kératine, le cross-

linking de THH forme des agrégats de protéines dénaturées laissant une structure

vacuolisée à l'intérieur des cellules.

Figure 22 : Modèle de maturation de la THH au sein de la GEI et de la médulla. (A) : accumulation de THH hautement insoluble sous forme de goutellettes (rouge) dispersées parmi les filaments de kératine (vert). (B) : désimination de la THH par une PAD qui augmente sa solubilité (ronds jaunes : THH soluble). (C) : action de transglutaminase sur la THH soluble (traits bleu : cross-linking de THH). (D) : formation d'une structure rigide hautement insoluble. D'après (Tarcsa et al. 1997).

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4.4.3. Désimination et apoptose

Les ions Ca2+ jouent un rôle important dans les événements de signalisation

précoces conduisant à l'apoptose. Ainsi, des ionophores calciques tels que par exemple la

ionomycine, facilitant l'influx de calcium du milieu extracellulaire vers le cytosol, sont

connus pour induire l'apoptose dans de nombreux types cellulaires (Tombal et al. 2002).

De façon intéressante, plusieurs études se sont intéressées aux protéines citrullinées au

cours de l'apoptose induites par influx calcique. En effet, le traitement d'une lignée de

kératinocytes de rat par la ionomycine en présence de calcium, s'accompagne de

l'apparition d'une protéine citrullinée de 70 kDa localisée à la périphérie de noyaux

apoptotiques (Mizoguchi et al. 1998). De la même façon, dans des macrophages

péritonéaux de souris, l'influx calcique provoqué après traitement à la ionomycine induit la

désimination de vimentine qui a également été localisée à la périphérie de noyaux

"arrondis", signe morphologique précoce d'apoptose (Asaga et al. 1998). Enfin, le même

traitement à la ionomycine, en présence de calcium, de monocytes humains purifiés ou de

macrophages différenciés ex vivo, active la citrullination de protéines, identifiées après

immunoprécipitation comme étant de la vimentine ou des produits de dégradation de

vimentine citrullinée (Vossenaar et al. 2004). Dans toutes ces études, la désimination de

ces protéines est probablement la conséquence de l'activation d'une PAD, causée par

l'influx calcique provenant du milieu extracellulaire. En effet, aucune désimination

significative n'a été observée dans les cellules également traitées à la ionomycine mais

dans un milieu sans calcium (Asaga et al. 1998).

Toutefois, même si l'activation des PAD et la citrullination semblent liées à l'influx

calcique, et donc étroitement à l'apoptose, l'important est de déterminer si elles en sont

une des causes ou bien simplement une conséquence. A cet égard, il est intéressant de

mentionner qu’une étude récente a évalué l’effet de la surexpression de PAD4 sur la

viabilité cellulaire (Liu et al. 2006). Ainsi, la transfection de cellules HL-60 ou jurkat par un

plasmide codant pour PAD4, entraîne une diminution de la viabilité de ces cellules de

façon dose- et temps-dépendant(e). La surexpression de PAD4 provoque l'arrêt des cellules

en phase G1 du cycle cellulaire avant leur entrée en apoptose. De plus, la PAD4

provoque une augmentation de l’expression de p53, protéine indispensable au maintien

de l’intégrité de la cellule et de ses composants, mais aussi d'autres molécules telles que

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p21, intervenant dans le contrôle du cycle cellulaire, ou encore Bax impliqué dans le

relargage de cytochrome c de la mitochondrie vers le cytosol, et dans l'activation de la

voie des caspases (Liu et al. 2006). Comment la surexpression de PAD4 favorise-t-elle la

mort des cellules par apoptose ? Plusieurs explications et/ou hypothèses sont possibles. La

première serait que la PAD4 via la désimination des histones et la modification de la

confomation de la chromatine (cf paragraphe 4.4.4.2), puisse provoquer des dommages

de l'ADN et ainsi l'accumulation de p53. En retour p53 pourrait contrôler l'arrêt du cycle

cellulaire, via l'activation de la transcription de gènes en aval tel que p21, ou au niveau

du cytosol interagir avec des partenaires impliqués dans les voies apoptotiques. Une autre

hypothèse serait basée sur la citrullination des filaments intermédiaires de vimentine. En

effet, la citrullination de protéines des filaments intermédiaires telle que la vimentine, mais

aussi la desmine, interfère avec leur polymérisation. De plus, la citrullination directe de

filaments intermédiaires de vimentine ou de desmine favorise leur désassemblage (Inagaki

et al. 1989). Cet effet sur la désorganisation du réseau de filaments intermédiaires

pourrait favoriser certaines manifestations morphologiques observées au cours de

l'apoptose telles que l'arrondissement des cellules ou la désorganisation de la membrane

plasmique (Byun et al. 2001).

Même si la PAD4, ou du moins sa surexpression, semble être impliquée dans des

événements apoptotiques, aucune information n'a été donnée concernant l'effet de cette

surexpression sur la désimination d'un point de vue quantitatif et qualitatif. Dans ce

modèle, l'identification exacte des protéines ciblées par l'enzyme ainsi que leur implication

dans la cascade apoptotique restent encore à préciser.

4.4.4. Désimination et régulation génique

4.4.4.1. Généralités

Chez les eucaryotes, l'ADN est compacté

sous forme de chromatine à l'intérieur d'un

compartiment séparé de la cellule (le noyau).

L'unité de base fondamentale de ce compactage

est le nucléosome, dans lequel environ 146 pb

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d'ADN double hélice s'enroulent (1 tour ¾) autour d'un octamère protéique composé de 2

copies de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4. A l'aide d'une cinquième histone,

H1, des états chromatiniens encore plus condensés peuvent se former allant jusqu'au

chromosome mitotique, compact et individuel. Dans les cellules en interphase, la

chromatine apparaît distribuée dans le noyau et organisée en régions "condensées"

(Hétérochromatine) et en régions plus ouvertes, "décondensées" (Euchromatine). Ces

différents états de la chromatine modulent l'accessibilité de la chromatine à diverses

réactions biochimiques telle que la transcription par exemple (Felsenfeld and Groudine

2003). Deux types de complexes protéiques peuvent être recrutés pour modifier la

structure de la chromatine :

- les complexes ATP-dépendant qui peuvent faire déplacer les nucléosomes et ainsi

exposer ou cacher des séquences ADN en les rendant donc plus ou moins accessibles et

- les complexes qui modifient de façon covalente les nucléosomes, notamment

certains résidus des extrémités amino-terminales des histones, ce qui aboutit à une

chromatine plus ouverte ou plus condensée selon le type de modifications subies (Narlikar

et al. 2002). Il a été proposé que la nature et la combinaison des modifications post-

traductionnelles que subissent les histones formaient un "code", le code des histones, qui

serait traduit en un état chromatinien particulier (actif, permissif, restrictif ou inactif) et

pourrait donc être impliqué dans la régulation de l'expression génique (Jenuwein and Allis

2001). Les principales modifications connues des histones sont : l'acétylation, la

méthylation, la phosphorylation et l'ubiquitinylation (cf Figure 23)

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Figure 23 : Modifications des histones. Ce schéma illustre les portions N-terminales à la surface ou à l'intérieur du cœur du nucléosome, de chacune des histones (H2A, H2B, H3 et H4). Chaque modification post-traductionnelle est représentée par une couleur et est annotée à coté de la position de l'acide aminé concerné. On note que les histones peuvent être acétylée (Ac), ubiquitinylées (Ub), méthylées (Me) et phosphorylées (P). D'après (Felsenfeld and Groudine 2003).

4.4.4.2. Rôle de la PAD4 dans la régulation transcriptionnelle

Les modifications des portions N-terminales des histones sont dynamiques. Par

exemple, les niveaux d'acétylation et de phosphorylation des histones dans la cellule sont

le résultat d’un équilibre entre réactions contraires catalysées respectivement par, des

couples d’enzymes acétylase/désacétylase et kinase/phosphatase. De même, la

méthylation de résidus arginyl et lysyl est également régulée de manière dynamique bien

que jusqu'en 2004 aucun mécanisme antagoniste à la méthylation n'ait encore été mis en

évidence (Bannister et al. 2002). La découverte très récente que la PAD4, isotype

nucléaire, était capable de désiminer les histones H2A, H3 et H4 (Nakashima et al. 2002)

a fortement suggéré que cette enzyme pourrait agir en tant que que co-régulateur de la

transcription. Ainsi, la combinaison de techniques protéomiques a permis de déterminer

les sites, in vivo, de la citrullination qui s'opère dans les portions N-terminales des histones

H2A, H3 et H4 : il s’agit de l’Arg3 des histones H2A et H4, et des Arg2, 8, 17 et 26 de

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l'histone H3 (Cuthbert et al. 2004; Wang et al. 2004; Hagiwara et al. 2005). De plus,

deux des études correspondant à ces résultats ont confirmé l'action de co-régulateur de la

transcription de PAD4. Par exemple, Wang et col. (Wang et al. 2004) ont mesuré les effets

de la transfection de quantités croissantes de constructions codant pour la PAD4 dans des

cellules MCF7, cellules épithéliales d'adénocarcinome de glandes mammaires, sur la

transcription d'un gène rapporteur codant pour la luciférase en aval d’un promoteur activé

par les oestrogènes. Dans ces expériences, la PAD4 agit clairement en tant que répresseur

transcriptionnel de façon dose-dépendante, l'activité catalytique de l'enzyme étant

nécessaire à cette fonction. De plus, Cuthbert et col. (Cuthbert et al. 2004) ont montré,

dans la lignée de cellules épithéliales rénales transformées 293T, que la PAD4 pouvait

également agir comme co-répesseur transcriptionnel sur un promoteur endogène, celui du

VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A). En effet, à l'inverse d'un mutant inactif, la

PAD4 "sauvage", ciblée sur le promoteur VEGF-A, peut réprimer l'activation

transcriptionnelle de ce gène induite en réponse à une hormone ovarienne (oestradiol) ou

thyroïdienne (T3).

Dans ces deux études, des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP)

ont été réalisées dans des cellules MCF-7 traitées à l'oestradiol et exprimant la PAD4. Les

résultats obtenus ont permis de démontrer que la PAD4 est constitutivement associée au

promoteur pS2, son niveau augmentant après l'ajout d'oestradiol pour revenir par la suite

à des taux basaux. Avec la même cinétique, la quantité de citrulline présente dans les

portions N-terminales des histones H3 et H4 augmente puis diminue. Les niveaux de PAD4

et des histones citrullinées sur le promoteur pS2 corrèlent aussi avec sa fonction présumée

de corépresseur transcriptionnel puisque les niveaux de RNA polymérase II sur ce

promoteur sont élévés quand les taux de PAD4 et d'histones citrullinées sont bas et vice

versa. Ces résultats démontrent donc que la PAD4 est un corégulateur de la transcription.

Ses effets répresseurs sur la régulation génique sont probablement dus à sa capacité à

catalyser la désimination de résidus spécifiques présents dans les portions N-terminales

des histones H3 et H4 (et probablement H2A).

Les récepteurs hormonaux nucléaires, activent la transcription via le recrutement de

multiples coactivateurs au niveau des promoteurs de gènes cibles spécifiques. La méthyl-

transférase CARM1, outre l'histone H3, est capable de méthyler, entre autres, le

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coactivateur p300. En plus de la région N-terminale de p300, CARM1 cible également

l’Arg-2142, située dans son domaine C-terminal de fixation à GRIP1 (GRIP1 binding

domain, GBD). Dans ce GBD, à la fois l’Arg-2088 et l’Arg-2142 sont importants pour la

fixation de GRIP1. La méthylation de l’Arg-2142 empêche l'interaction bi-moléculaire de

GRIP1 à p300 in vitro et in vivo. La PAD4 est capable, in vitro, de catalyser la citrullination

du GBD de p300, et donc d'avoir un effet antagoniste sur la méthylation de ce domaine

en favorisant l'interaction de p300 à GRIP1. Ceci suggère que, en plus de la citrullination

des histones, la désimination de corégulateurs transcriptionnels pourrait participer à la

fonction de "corépresseur transcriptionnel" de la PAD4 (Lee et al. 2005).

4.4.4.3. La PAD4 catalyse-t-elle la déméthylimination?

En plus de la citrullination, les résidus arginyl des portions N-terminales des

histones H3 et H4 sont alternativement monométhylées et diméthylées de façon

asymétrique. Ces méthylation sont catalysées par des protéines-arginine-methyl-

transférases (PRMT) de type I : PRMT1 et CARM1 (PRMT4), capables de former des

peptidyl-arginines monométhylées (mono-methylarginine, MMA) et des peptidyl-arginines

diméthylées de façon asymétrique (asymmetric dimethylarginine, ADMA). Les PRMT de

type II, quant à elles, catalysent la formation de peptidyl-MMA et de peptidyl-arginines

diméthylées de façon symétrique (symmetric dimethylarginine, SDMA) (cf Figure 24).

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Figure 24 : Méthylation de peptidyl-arginine (Peptidyl-Arg). Structure moléculaire des peptidyl-Arg, peptidyl-arginine monométhylée (peptidyl-MMA), peptidyl-arginine diméthylée de façon asymétrique (peptidyl-ADMA) et symétrique (peptidyl-SDMA). Les protéines-arginine-méthyl-transférases (PRMT) de type I et II catalysent respectivement la formation de peptidyl-ADMA et peptidyl-SDMA. D'après (Thompson and Fast 2006).

De façon intéressante, les sites de désimination par la PAD4, se superposent aux

sites de méthylation des arginines. Par exemple, CARM1 méthyle les résidus Arg2, 17 et

26 dans l'histone H3 et PRMT1 méthyle le résidu Arg3 dans l'histone H4. Ces enzymes

agissent en tant que co-activateurs transcriptionnels pour de nombreux facteurs de

transcription (comme par exemple le récepteur aux œstrogènes), et leur activité

méthyltransférase est nécessaire à cette fonction.

Cette superposition des sites de désimination et méthylation renforce l'idée de

Bannister et col. (Bannister et al. 2002) selon laquelle la PAD4 pourrait contrecarrer la

fonction de "coactivateur transcriptionnel" assurée par les methyltransférases en

convertissant des peptidyl-MMA en peptidyl-citrulline avec relargage de méthylamine (cf

Figure 25). Cette réaction, catalysée par la PAD4, et qualifiée de réaction de

"déméthylimination", nécessite la reconnaissance d'arginines méthylées comme substrats,

mais ne constitue pas une "réelle" modification inverse puisque le produit final n'est pas

une peptidyl-arginine mais une peptidyl-citrulline. La véritable réversibilité par une arginine

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déméthylase n'a jamais encore été découverte, mais la PAD4 est capable de supprimer

toute marque de méthylation introduite par une méthyltransférase.

Figure 25 : Réaction de déméthylimination.

Dans les expériences de ChIP réalisées dans les cellules MCF-7 en réponse à

l’oestradiol, l'apparition de citrulline sur à la fois l'histone H3 et l'histone H4 au niveau du

promoteur pS2 corrèle avec des quantités décroissante d’ADMA. De la même façon, les

quantités d'histones méthylées : H3 Arg 17 et H4 Arg3 sont réduites dans les granulocytes

HL60 (connus pour exprimer la PAD4), après traitement avec un ionophore calcique

(Wang et al. 2004). La disparition de ces épitopes corrèle avec l'apparition de citrulline sur

les histones H3 et H4.

Bien que in vivo les résultats apparaissent être en faveur d'une activité de

déméthylimination de la PAD4, les études in vitro le sont moins, et dans la plupart des cas,

même contradictoires. Par exemple, Kearney et col. (Kearney et al. 2005) ont évalué la

capacité de plusieurs petites molécules et peptides contenant des MMA, ADMA et SDMA à

être des substrats de la PAD4. Même si ces composants sont déméthyliminés par la PAD4,

la vitesse de la réaction est beaucoup plus lente que celle de désimination des peptidyl-

arginines correspondantes non méthylées, de l'ordre de 150 à 20 000 fois plus. En outre,

la réaction de déméthylimination catalysée par la PAD4 in vitro est ~ 1000 fois plus lente

que la réaction de méthylation de résidus arginyl dans l'histone H3 catalysée par CARM1

(Schurter et al. 2001); ceci fait donc de la PAD4 une déméthyliminase relativement peu

efficace. Des résultats similaires ont été rapportés par différents groupes. Hidaka et col.

(Hidaka et al. 2005) ont démontré que des dérivés synthétiques de l'arginine sous forme

méthylée ne sont ni de bons substrats ni de bons inhibiteurs de PAD4. De même Cuthbert

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et col. (Cuthbert et al. 2004) ont montré que des peptides contenant des ADMA ou SDMA

ne sont pas déméthyliminés par la PAD4. Enfin, Raijmakers et col. (Raijmakers et al. 2007)

ont étudié l’activité de déméthylimination de plusieurs PAD, in vitro, sur des peptides

synthétiques dérivés des histones H3 et H4, de la protéine MOG (Myelin oligodendrocyte

glycoprotein) et de la filaggrine, contenant des peptidyl-Arg, ou des peptidyl-MMA,

peptidyl-SDMA ou encore peptidyl-ADMA. Ils ont montré que, les hPAD2, hPAD3 et

hPAD4 recombinantes ne pouvaient convertir en peptidyl-citrulline que des peptidyl-

arginine non méthylées. Ils ont obtenu des résultats similaires avec des extraits préparés à

partir de plusieurs échantillons de tissus murins (muscle, rate et cerveau) connus pour

contenir une activité PAD. En outre et de la même façon, les auteurs ont examiné la

composition en acides aminés d’échantillons d’histones bovines totales, après incubation

avec les différentes hPAD recombinantes. A l’inverse des niveaux d’arginine qui diminuent

significativement et ceci de façon concomitante à des quantités croissantes des niveaux de

citrulline, les taux de peptidyl-MMA ne varient pas après traitement avec une PAD.

Ainsi, la méthylation des peptidyl-arginines semble interférer avec la désimination

puisque les PAD ne semblent pas être capables de convertir des peptidyl-MMA en

peptidyl-citrulline dans le contexte de peptides synthétiques ou d’extraits d’histones. Ainsi,

la citrullination des histones observée dans les cellules vivantes pourrait avoir une fonction

antagoniste à la méthylation, non pas par "déméthylimination" mais par le simple fait

qu’elles privent les méthyltransférase de leur substrat en transformant les peptidyl-arginines

en peptidyl-citrullines.

4.5. PAD, désimination et pathologies autres que la PR

Les PAD ou certains de leurs substrats protéiques ont été associés à des maladies

humaines. Dans ce chapitre nous discuterons de l'implication ou du rôle des PAD et de la

désimination dans différentes pathologies parmi lesquelles la sclérose en plaque, la

maladie d'Alzheimer ou encore le cancer.

4.5.1. Maladies neurodégénératives

Le système nerveux de tous les mammifères est divisé en deux parties : le système

nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (SNP). Le SNC comprend les

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parties du système nerveux enfermées dans des structures osseuses : l'encéphale (cerveau,

cervelet et tronc cérébral) et la moelle épinière. Dans ce paragraphe, je traiterai de 2

maladies neurodégénératives touchant le SNC : la sclérose en plaque et la maladie

d'Alzheimer.

4.5.1.1. La Sclérose en plaque

La sclérose en plaque (SEP) est une affection inflammatoire démyélinisante du SNC.

Elle est un peu plus fréquente chez la femme que chez l'homme et débute généralement

entre 20 et 40 ans. Habituellement, la SEP évolue par poussées donnant lieu à des lésions

disséminées dans le temps et dans l'espace. Elle s'accompagne de troubles sensitifs,

moteurs ou sensoriels pouvant conduire à un handicap important. Le déclenchement de la

SEP semble dépendre de nombreux facteurs à la fois génétiques, environnementaux

(viraux) et immunologiques. Toutefois, même si l'origine précise de la maladie n'est pas

vraiment connue, la cause des troubles moteurs ou sensoriels est tout à fait claire. La SEP

affecte en effet, la gaine de myeline qui entoure certains groupes d'axones situés dans la

substance blanche au niveau du SNC.

La conduction de l'influx nerveux est plus rapide dans les axones de gros diamètre.

Ces axones prenant beaucoup de place, les vertébrés ont développé une autre façon

d'augmenter la vitesse de conduction de l'influx nerveux : en isolant l'axone au moyen

d'une gaine de myéline. Cette gaine n'est pas continue sur toute la longueur de l'axone.

Elle est interrompue à intervalles réguliers tous les 0.2 à 2 mm (selon le diamètre de

l'axone) par les nœuds de Ranvier où se concentrent les canaux sodiques dépendant du

potentiel d'action (cf Figure 26).

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Introduction

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Figure 26 : Représentation d'un oligodendrocyte.

La myéline est constituée de plusieurs enroulements de membranes produits par

des cellules gliales : les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. La distinction entre

oligodendrocytes et cellules de Schwann est essentiellement due à leurs localisations

différentes (SNC et SNP respectivement) et au fait qu'un oligodendrocyte contribue à la

formation de la myéline de plusieurs axones, alors que la cellule de Schwann ne myélinise

qu'un seul axone (Mark F. Bear 2002).

La myéline est un composant essentiel de la substance blanche au sein du SNC.

Elle est constituée en majorité de lipides (cholestérol, phospholipides et glycolipides) et de

protéines qui représentent respectivement ~ 70% et 30% du poids sec de la myéline. Les

deux catégories de protéines majoritaires au sein de la gaine de myéline dans le SNC, les

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protéolipoprotéines (PLP) et la protéine basique de la myéline (MBP) constituent 80% des

protéines totales (50% et 30 % respectivement).

La MBP est traduite à partir de différents ARNm produits par de nombreux

épissages alternatifs d'un seul ARNm. Chez la souris, le gène de la MBP comprend 7

exons numérotés de I à VII, et il existe 5 isoformes provenant de différents épissages. Chez

l'homme la structure du gène est similaire à celui de la souris et 4 isoformes sont formées

de 21.5, 20.2, 18.5 et 17.2 kDa (cf Figure 27)(Harauz et al. 2004)

Figure 27 : Variants d'épissage du gène codant pour la MBP chez la souris (A) et chez l'homme (B) et isoformes correspondantes. (Harauz et al. 2004).

Le terme de "MBP" désigne généralement l'isoforme de 18.5 kDa, qui est l'une des

protéines les plus abondantes des gaines de myéline du SNC chez l'adulte. Cette isoforme

comprend 170 acides aminés dont 19 résidus arginyl et 12 résidus lysyl qui lui confèrent

son caractère extrêmement basique (pI>10). Elle n'a jamais pu être cristallisée du fait

qu'elle existe sous forme de très nombreux isomères de charge, résultant d'une myriade de

modifications post-traductionnelles telles que l'acétylation (en N-terminal), la

phosphorylation, la méthylation, l'ADP-ribosylation, la déamidation ou encore la

citrullination, qui ajoutent encore de la diversité à la famille "MBP". Ces isomères de

charge, ou composants de charge de la MBP humaine (hMBP) ont été isolés à partir des

protéines basiques extraites de cerveau humain sain puis séparés par chromatographie sur

colonne échangeuse de cations (CM52) et nommés de C1 à C8 (Wood and Moscarello

1989). L'isomère C1 (hMBP/C1) est le plus cationique et aussi le moins modifié

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contrairement au composant C8 (hMBP/C8) qui est le plus modifié et le moins cationique

et les composants C1 à C5 diffèrent par la perte successive d'une charge positive.

Une modification post-traductionnelle qui semble jouer un rôle important au cours

de la SEP est la citrullination. La présence de citrulline au sein d'un extrait brut de MBP,

obtenu à partir de myéline humaine saine, fut pour la première fois décrite par l'équipe de

Moscarello en 1971 (Finch et al. 1971). A chaque isomère de charge correspond un état

de citrullination: hMBP/C1 correspond à l'isoforme non-citrullinée (hMBP-Cit0) et

hMBP/C8 correspond à l'isoforme comprenant au moins 6 résidus citrullyl (Wood and

Moscarello 1989). Durant le développement du cerveau humain, la proportion de MBP

citrullinée (C2 à C8) par rapport à la MBP totale (C1 à C8) varie. Ainsi, jusqu'à l'âge de 2

ans, 100% de la MBP est citrullinée. A partir de 4 ans ce pourcentage diminue à 20% et

reste stable jusqu'à l'âge adulte. Ce taux varie de nouveau au cours de la SEP, où 45% de

la MBP totale est citrullinée voire même 100% au cours du syndrome de Marburg, un cas

rare de SEP aiguë (Moscarello et al. 1994). Ainsi, chez un individu sain adulte, la forme

citrullinée majoritaire comprent 6 résidus citrullyl (hMBP-Cit6) et le ratio de C8/C1 est de

0.82 alors que, chez un patient atteint de SEP, ce ratio atteint 2,45, un ratio similaire à

celui observé dans un cerveau de très jeune enfant, ce qui a conduit à qualifier

d’" immature " la myéline des patients atteints de SEP (Moscarello et al. 1994). Au cours

du syndrome de Marburg, une hMBP presque totalement citrullinée (18/19 résidus arginyl

affectés), nommée hMBP-Cit18 est observée et représenterait une forme de MBP encore

plus immature. Le ratio C8/C1 est alors égal à 6,7 soit près de 8 fois plus qu'en situation

adulte normale (Wood et al. 1996).

Au cours du modèle de SEP que constitue l’encéphalomyélite auto-immune

expérimentale chez la souris, aucune hausse du taux de MBP citrullinée n'a été constatée,

laissant suggérer que l'inflammation cérébrale elle-même n'est pas la cause de la

désimination de la MBP (Mastronardi et al. 1996). Par contre, dans un autre modèle de

SEP, obtenu spontanément dans une lignée de souris transgéniques (ND4) comportant 70

copies d'un transgène codant pour une PLP (DM20) (Mastronardi et al. 1993), une

augmentation de la quantité de PAD associée à la myéline précèdant une augmentation

de la citrullination de la MBP ainsi que les premiers signes cliniques de démyélinisation a

été mise en évidence (Moscarello et al. 2002). Il a ainsi été proposé par Moscarello et

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col., que cette apparition de MBP citrullinée chez les patients atteints de SEP, ne soit pas

liée à une augmentation d'une activité PAD existante mais plutôt associée à une

augmentation de la quantité d'enzyme PAD présente.

Les effets de la désimination sur la structure protéique et les interactions protéines-

lipides au sein de la myéline sont divers. La citrullination de la MBP réduit sa charge

positive nette, perturbant ainsi ses interactions avec elle-même et avec les phospholipides

(phosphatidylsérine) chargés négativement. En effet, la citrullination de la MBP diminue sa

capacité à agréger in vitro des vésicules lipidiques (Wood and Moscarello 1989;

Mastronardi et al. 1996; Boggs et al. 1997), causant même leur fragmentation, en ce qui

concerne la forme MBP-Cit18 (Boggs et al. 1999). De même, les propriétés d'auto-

assemblage et d'organisation ou d'interaction de la MBP citrullinée avec des couches

lipidiques sont altérées (Beniac et al. 2000; Ishiyama et al. 2001). De plus, la MBP

citrullinée est plus sensible à la digestion par des protéases telles que la Cathepsine D,

une metalloprotéinase clivant les liaisons Phe-Phe au sein des protéines. En effet, la forme

MBP-Cit18 est digérée 45 fois plus vite que la MBP-Cit0 par la Cathepsine D,

probablement parce que la citrullination influe sur la conformation de la MBP et lui

confère une structure plus ouverte et plus accessible à la protéase (Pritzker et al. 2000).

Les auteurs ont alors proposé que la citrullination en favorisant la dégradation de

la MBP, participe à la genèse de peptides qui sensibiliseraient des lymphocytes T et

permettrait le développement d'une réponse auto-immune anti-MBP dans la SEP. Des

auto-anticorps et des lymphocytes T dirigés contre la MBP avaient déjà été décrits dans le

sérum et le liquide céphalorachidien de patients atteints de SEP (Ota et al. 1990; Reindl et

al. 1999). Des lymphocytes T spécifiques des formes citrullinées de MBP ont également été

décrits mais ces résultats n'ont jamais été reproduits (Tranquill et al. 2000). Enfin, aucune

différence significative n’existe entre les titres d'auto-anticorps anti-MBP citrullinée dans la

SEP et ceux retrouvés chez des individus contrôles sains ou atteints d'autres désordres

neurologiques (de Seze et al. 2001).

A noter aussi que le taux de GFAP citrullinée augmente chez les patients atteints de

SEP (Nicholas et al. 2004) bien qu’on n’ait pas encore à ce jour une idée précise de la

façon dont ce phénomène pourrait avoir une incidence sur la maladie.

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Au sein du cerveau, la seule PAD mise en évidence au niveau ARNm et protéique

est la PAD2 (Ishigami et al. 2005; Nachat et al. 2005). La PAD2 semble donc être

l'isotype impliqué dans la désimination de la MBP (et de la GFAP) au sein du SNC. Chez

le rat, son expression est augmentée dans les cellules microgliales activées suite à une

neurodégénérescence induite par le kainate, un analogue cyclique du glutamate (Asaga et

al. 2002). II a été montré que le paclitaxel (ingrédient actif du taxol) est capable d'inhiber

l'activité de la PAD2 isolée et purifiée à partir cerveau de bœuf dans des essais in vitro

(Pritzker and Moscarello 1998). Or, dans le modèle de souris transgénique DM20 décrit

auparavant, un traitement par du paclitaxel atténue les signes cliniques de démyélinisation

spontanée et induit même une remyélinisation (Moscarello et al. 2002). Des thérapies

visant à inhiber la PAD2 pourraient donc présenter un grand intérêt dans la SEP.

Tout comme dans la PR, les gènes PADI sont des gènes candidats pour la

prédisposition à la SEP. En effet, Deux analyses systématiques du génome (études de

liaisons) ont révélé l'existence possible d'une facteur génétique de la SEP dans la région du

chromosome 1 où se situe le locus des gènes PADI (en 1p36) (Dyment et al. 2004;

Kenealy et al. 2004). Une seul étude familiale portant exclusivement sur le gène PADI4 a

été effectuée, mais n'a pas permis de mettre en évidence une quelconque implication de

ce gène dans la prédisposition à la SEP (Tommasi et al. 2006). Cependant des études

réplicatives et des études portant sur les autres gènes codant pour les autres isotypes de

PAD et en particulier PADI2 doivent être réalisées afin de pouvoir conclure définitivement

sur l'implication ou non d'un ou plusieurs gène(s) PADI dans la susceptibilité à la SEP.

4.5.1.2. Maladie d'Alzheimer

La démence correspond à une altération progressive de la mémoire et de

l'idéation, suffisamment marquée pour handicaper les activités de la vie quotidienne. La

prévalence de la démence est ~ 1% chez des individus âgés de 60 à 64 ans et augmente

de façon quasi-exponentielle avec l'âge puisque chez les sujets âgés de 85 ans ou plus, la

prévalence est ~ 24%. La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de

démence (50 à 60% des cas). La MA est une démence neurodégénérative qui résulte de

l'installation progressive, et irréversible, de 2 types de lésions dans l'ensemble du cortex

cérébral : les plaques séniles (PS) et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF).

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Introduction

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Les PS sont des lésions extracellulaires constituées de dépôts d'une protéine amyloïde

colorable au rouge Congo : la protéine bêta-amyloïde (Aβ). Les DNF, quant à elles,

correspondent à des inclusions intraneuronales formées par l'agglutination de

neurofibrilles du cytosquelette sous la forme de filaments hélicoïdaux, le principal

constituant étant une isoforme anormalement phosphorylée de la protéine TAU (tubuline

associated units). Ces lésions caractéristiques mais non spécifiques de la MA conduisent

progressivement à la mort des neurones, entraînant ainsi l'apparition des signes cliniques

de perte de mémoire, puis de démence (Blennow et al. 2006).

Dans des extraits de cerveaux humains d’individus sains, les protéines citrullinées

sont faiblement détectables alors que la PAD2 est bien présente. Par contre, dans des

extraits de cerveaux de patients atteints de la MA, des protéines citrullinées s'accumulent,

et ceci en parallèle d'une activation également anormale de la PAD2 (Ishigami et al.

2005). L’analyse par électrophorèse 2D et spectrométrie de masse des protéines

citrullinées de la région hippocampe du cerveau de patients a permis d'identifier 2

protéines citrullinées : la vimentine et la GFAP. Les auteurs de ce travail ont également

montré la présence de MBP citrullinée en quantité nettement accrue par rapport à la

même zone provenant de cerveaux sains (Ishigami et al. 2005). Il apparaît donc que

l’acroissement du niveau citrullination observé au cours de la SEP correspond à un

évènement non spécifique, probablement commun aux phénomènes de

neurodégénérescence.

Ces résultats sont concordants avec les travaux précédemment évoqués et réalisés

par le même groupe, où l’administration systémique de kainate à des rats induisait une

neurodégénérescence. En effet, dans ces conditions, diverses protéines citrullinées

apparaissent dans les régions de neurodégérescence ce qui laisse suggérer que la PAD2 y

est localement activée (Asaga and Ishigami 2001). Dans ce même modèle, la PAD2

semble activée très tôt dans le processus de neurodégénérescence : elle est

spécifiquement et abondamment exprimée dans les cellules microgliales activées. Par

contre elle est absente des astrocytes hyperplasiques qui s’installent secondairement au

site lésionnel, suggérant une régulation négative ou une suppression de son expression

(Asaga et al. 2002).

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Introduction

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Le ou les mécanisme(s) par le(s)quel(s) la citrullination de protéines a lieu au sein

de l'hippocampe de patients atteints de la MA n’a pas été encore formellement exploré.

Au vu des résultats obtenus chez le rat, l'hypothèse la plus probable serait que la PAD2

soit présente de façon abondante et fonctionnellement active seulement chez les patients

avec la MA. En effet, au cours de la MA, l’expression de PAD2 augmente de façon

notable au niveau de l'hippocampe et, bien que la PAD2 soit également présente dans

des extraits hippocampaux de sujets sains, l'enzyme semble y être inactive. Chez les

patients atteints de la MA, cette activation est probablement liée à une augmentation de la

concentration calcique intracelullaire provoquée par un influx calcique extracellulaire dû

aux dommages astrogliaux, cet influx ayant été décrit in vitro dans des cultures primaires

d'astrocytes (Haun et al. 1992).

4.5.2. Glaucome primaire à angle ouvert

Le terme de glaucome regroupe un ensemble de neuropathies optiques ayant

comme caractéristique commune une dégénérescence lente et progressive des cellules

ganglionnaires de la rétine et de ses axones. La forme de glaucome la plus commune est

le glaucome chronique ou glaucome primaire à angle ouvert (GPAO). Les bases

biologiques de la maladie ainsi que les facteurs contribuant à sa progression ne sont pas

complètement caractérisés. Le seul facteur de risque connu traitable est une pression intra-

oculaire pouvant être plus élevée et conduire à des dommages du nerf optique. Le

glaucome en général affecte environ 66 millions d'individus dans le monde, dont au

moins 6,8 millions atteints de cécité bilatérale. En effet, le glaucome est la seconde cause

de cécité, la perte de vision associée à cette maladie étant irréversible (Weinreb and Khaw

2004). Afin d'avoir un aperçu moléculaire plus précis du GPAO, une étude protéomique a

été réalisée qui comparait les nerfs optiques d'individus sains et atteints de glaucome

(Bhattacharya et al. 2006). Initialement, les auteurs avaient, par des méthodes de

protéomiques classiques, détecté la PAD2 dans des nerfs optiques de patients atteints de

GPAO mais pas de donneurs sains. Des analyses plus « quantitatives » complémentaires

par immunotransfert et immunohistochimie, réalisées sur des échantillons supplémentaires

ont permis de confirmer ce résultat et de montrer par ailleurs que le niveau d’expression

de la PAD2 est élevé et que ceci est associé à la présence de protéines citrullinées dans

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Introduction

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des nerfs optiques. La PAD2 a également été mise en évidence dans un modèle spontané

de glaucome chez la souris : les souris DBA/2J âgées de 8 à 12 mois développent un

glaucome avec présence de PAD2 au niveau du nerf optique alors que, chez les même

souris plus jeunes ou dans des souris contrôles C57BL6J du même âge, la pression intra-

oculaire est normale et la PAD2 n’est pas détectable (Bhattacharya et al. 2006). Chez

l’homme, par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-citrulline suivi d’une

identification par spectrométrie de masse, la MBP s'est avérée être la protéine citrullinée

majeure du nerf optique atteint de glaucome, parmi d'autres protéines telles que la PLP ou

une glycoprotéine associée à la myéline.

En conclusion, que l'expression de PAD2 et la citrullination de protéines

composantes de la myéline, soient des causes de la neurodégénerescence observée chez

les patient atteints de GPAO, ou simplement une conséquence des dommages du nerf

optique, ces données montrent que les phénomènes de citrullination dans le nerf optique

sont impliqués dans la physiopathologie du glaucome.

4.5.3. Cancer

Dans les années 80, une étude par immunofluorescence indirecte a, pour la

première fois, mis en évidence l'expression de la PAD2 dans diverses tumeurs. En effet,

l'utilisation d'un antisérum dirigé contre une PAD purifiée à partir de cerveau d'origine

bovine (Pad2) (Kubilus and Baden 1985) également réactif avec une ou plusieurs PAD de

l'épiderme humain à permis de marquer diverses tumeurs épidermiques, bénignes ou

malignes (Kvedar et al. 1986). Quelques années plus tard, au cours d'une étude

immunohistologique sur cryocoupes de divers tissus humains, Urano et col., ont identifié la

PAD du muscle squelettique (qui aujourd’hui a été identifiée à l’isotype PAD2), comme

nouveau marqueur potentiel des néoplasmes de la peau présentant une différenciation

caractéristique des glandes sudoripares (Urano et al. 1990). Pour cela, les auteurs ont

utilisé un antisérum de lapin dirigé contre la PAD du muscle squelettique de rat (Watanabe

et al. 1988), réagissant de manière croisée avec la PAD du muscle squelettique humain.

Avec ce même anticorps et dans la même étude, dans des prélèvements cutanés

provenant de deux patients atteint de maladie de Paget extra-mammaire (un neoplasme

cutané du sujet âgé), l'expression de la PAD2 a été mise en évidence au niveau de cellules

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Introduction

- 117 -

néoplasiques, avec des intensités de marquage différents dans chacun des cas (Urano et

al. 1990).

De plus, comme décrit auparavant, l'ADNc correspondant à la PAD2 humaine a

été cloné à partir d'une lignée cellulaire issue d'un carcinome épidermoïde humain (HSC-

1). En outre, dans des extraits protéiques de ces mêmes cellules, cultivées entre 3 et 10

jours en présence de calcium, des quantités croissantes de protéines citrullinées ont été

immunodétectées, ce qui témoigne de la présence d'une activité PAD (Ishigami et al.

2002).

Enfin, plus récemment, des expériences d'immunohistochimie ont permis de mettre

en évidence l'expression significative de PAD4 dans de nombreuses tumeurs, plus

particulièrement dans différents types d’adénocarcinomes, en comparaison des tissus sains

correspondants (Chang and Han 2006). Sur des coupes de tissus adjacentes, des

protéines citrullinées ont également été détectées dans la plupart des tumeurs exprimant la

PAD4, alors qu’elles sont absentes dans les tissus normaux contrôles.

Ainsi l'expression de la PAD2 et celle de la PAD4, ainsi que la présence de

protéines citrullinées ont été mises en évidence dans diverses tumeurs. La question d’un

rôle des PAD et de la citrullination dans la pathologie cancéreuse reste ouverte.

4.5.4. Psoriasis et érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse

Le Psoriasis est une dermatose inflammatoire qui affecte environ 2% de la

population. La caractéristique la plus commune de cette pathologie est l'apparition en

plaques de lésions cutanées rouges et squameuses généralement au niveau du cuir

chevelu, des coudes ou genoux, pouvant même être associée à une arthrite sévère

(arthrite psoriasique) (OMIM #177900). Même si l'étiologie exacte du Psoriasis est encore

inconnue, l'infiltration du derme et de l'épiderme par des cellules inflammatoires ainsi que

la prolifération et la différenciation anormale des kératinocytes semblent jouer un rôle

important dans la physiopathologie de cette maladie (Lebwohl 2003).

L'érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse ou hyperkératose

épidermolytique est une génodermatose autosomique dominante rare. Elle se caractérise

par la formation de cloques et d'érythèmes à la naissance, puis par le développement

d'hyperkératoses s'aggravant avec l'âge. Des analyses ultrastructurales révèlent des

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Introduction

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agrégations anormales des filaments de kératines (K) au sein des kératinocytes

suprabasaux. Cette maladie est causée par des mutations dans les gènes codant pour K1

et K10 (Cheng et al. 1992; Rothnagel et al. 1992).

Dans ces deux pathologies cutanées, des défauts de désimination ont été constatés.

En effet, des immunomarquages ont révélé une diminution du taux de protéines citrullinées

et plus particulièrement de la K1, au sein de l'épiderme hyperprolifératif correspondant aux

lésions psoriasiques, en comparaison à de l’épiderme sain ou psoriasique non-lésionnel

(Ishida-Yamamoto et al. 2000). Ce même groupe a également montré que l'agrégation

anormale des kératines observée au cours de l'érythrodermie congénitale ichtyosiforme

bulleuse fait intervenir un domaine spécifique de K1 qui est également impliqué dans sa

désimination et interfère donc avec cette dernière. Une désimination aberrante de K1 ainsi

que d'autres protéines est observée (Ishida-Yamamoto et al. 2002).

A noter qu’un traitement par de la vitamine D (1,25-dihydroxyvitamine D3)

permettant la différenciation de cellules HL-60 en monocytes/macrophages augmente

simultanément l'activité PAD de ces cellules (Nakashima et al. 1999) . Cette même

vitamine augmente aussi l'expression des gènes PADI1-3 (dès 6h de traitement) dans des

kératinocytes humains, primaires ou immortalisés en culture (Lu et al. 2005). Quand on

sait par ailleurs que des analogues de la vitamine D sont utilisés en traitement topique du

psoriasis chez l'homme (Nagpal et al. 2001), il est tentant de proposer qu’une stratégie

visant à augmenter l'activité des PAD épidermiques (PAD1, 2 et 3) pourrait avoir un effet

thérapeutique sur le psoriasis. Mais de façon étonnante, dans une étude pilote prospective

de phase II, le traitement de patients atteints de psoriasis sévère, par du paclitaxel,

ingrédient actif du taxol, a permis de diminuer la sévérité de la maladie (Ehrlich et al.

2004). Or, du fait de sa capacité à inhiber non spécifiquement les PAD, et notamment la

Pad2 purifiée à partir de cerveau de bœuf (Pritzker and Moscarello 1998), on aurait pu

s'attendre à un effet nul ou aggravant du taxol sur le psoriasis. Cependant, le taxol est plus

généralement connu pour ses propriétés anti-prolifératives et anti-inflammatoires qui

compensent probablement son action négative indirecte sur la citrullination et pourraient

expliquer que l'effet net de la molécule est bénéfique.

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Introduction

- 119 -

4.5.5. Néphropathie obstructive

Les reins occupent une position rétropéritonéale dans la région lombaire

supérieure. Une coupe frontale de rein révèle trois parties distinctes. La partie la plus

externe, le cortex, recouvre la médulla. En position latérale par rapport au hile se trouve le

pelvis rénal, ou bassinet, cavité aplatie en forme d'entonnoir. L’uretère, qui transporte

l'urine jusqu'à la vessie, communique au niveau du hile avec le pelvis qui se prolonge vers

l'intérieur du rein par deux ou trois calices rénaux chargés de recevoir l'urine. La formation

de l'urine est assurée par les néphrons, unités structurales et fonctionnelles des reins.

Chaque rein en contient plus d'un million. Chaque néphron est formé d'un corpuscule

rénal associé à un tubule rénal. Le corpuscule rénal est une vésicule constituée de la

capsule glomérulaire rénale ou capsule de Bowman et d'un bouquet de capillaires

artériels appelé glomérule de rein. La capsule de Bowman entoure complètement le

glomérule (comme un gant de baseball entoure une balle) et est formée de 2 feuillets

séparés par une cavité – la chambre glomérulaire ou lumière de la capsule – qui se

prolonge par le tubule rénal.

Dans des expériences d'obstruction unilatérale de l'uretère réalisées chez le rat,

l'expression des 4 isotypes de PAD (PAD1 à 4) a été recherchée au niveau du rein, et seul

l'ARNm du gène PADI2 y a été détecté. Au niveau protéique, les auteurs ont montré que

l'expression de la PAD2 ainsi que la quantité de protéines citrullinées augmentent

considérablement dans le rein ayant subit la ligation de l'uretère en comparaison du rein

controlatéral ou de reins ayant subi une opération factice. Les analyses

immunohistochimiques ont en outre révélé que la PAD2 est préférentiellement exprimée

dans les cellules épithéliales pariétales au sein de la capsule de Bowman où des protéines

sont citrullinées. De plus, la présence de la PAD2 ainsi que la citrullination sont

significativement diminuées suite à la levée de l'obstruction de l'uretère. Enfin des analyses

par électrophorèse 2D et spectrométrie de masse des protéines citrullinées ont permis

d'identifier une protéine du cytosquelette de 40 kDa : l'actine (Feng et al. 2005).

Ainsi, ces résultats mettent en évidence que la PAD2 ainsi que les protéines

citrullinées pourraient non seulement être des marqueurs appropriés de la capsule de

Bowman où elles sont préférentiellement exprimées mais en plus pourraient refléter des

dommages causés à son niveau. Il est connu que la citrullination des protéines modifie

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Introduction

- 120 -

leur charge et interfère avec leur structure. La citrullination de protéines du cytosquelette

au niveau de la capsule de Bowman pourrait ainsi être un mécanisme de "défense" ou

d'adaptation de cette capsule en réponse à un stress mécanique provoqué au niveau du

glomérule rénal.

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Introduction

- 121 -

5. Objectifs

Lorsque nous avons présenté l’autoimmunité anti-protéines citrullinées, nous avons

fait état d’un certains nombre d’éléments qui suggèrent que, très vraisemblablement, elle

a un rôle très important dans la physiopathologie de la PR. Rappelons, que parmi tous les

autres auto-anticorps présents chez les patients atteints de PR, les ACPA sont les plus

spécifiques de la maladie, qu’ils apparaissent très précocement, parfois même avant

l'apparition des premiers signes clinique, et qu’ils sont associés aux PR sévères et actives

(pour revue consulter(Vincent et al. 2005)). Nous avons aussi mentionné qu’ils sont

sécrétés et concentrés au sein du tissu synovial rhumatoïde (Masson-Bessiere et al. 2000),

où leur cible antigénique, la fibrine citrullinée est présente (Masson-Bessiere et al. 2001).

Ainsi, mon laboratoire a proposé un modèle de l’implication physiopathologique des

ACPA dans la synovite rhumatoïde dans lequel ils contribueraient de façon majeure à son

auto-entretien et où la génération de fibrine citrullinée jouerait un rôle essentiel (cf Figure

28).

Dans le tissu synovial rhumatoïde, après sa désimination, la fibrine devient la cible

des ACPA, produits par des plasmocytes locaux. Via l'activation de mécanismes effecteurs

impliquant très probablement le complément et/ou les récepteurs Fcγ, ce conflit

antigène/anticorps va nécessairement avoir des effets pro-inflammatoires. Ces effets vont

favoriser l'extravasation de plasma et de fibrinogène et donc la formation de nouveaux

dépôts de fibrine dans le tissu synovial, qui constituent la cible d'une ou plusieurs PAD

exprimée(s) et activée(s) localement. La fibrine citrullinée nouvellement formée, alimente

alors à nouveau le conflit antigène/anticorps ce qui permet l’entretien de l'inflammation

rhumatoïde.

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Introduction

- 122 -

Figure 28 : Modèle d'auto-entretien de la synovite rhumatoïde. Hypothèses concernant l'implication des ACPA et de la fibrine citrullinée dans la physiopathologie de la PR, et questions faisant l'objet de mon travail de thèse.

La validation de cette hypothèse physiopathologique passe par la résolution de

nombreuses questions sur l'origine et les conséquences physiopathologiques du conflit

immunologique associant fibrine citrullinée et ACPA.

Celles qui ont fait l'objet des investigations de mon travail de thèse sont les suivantes :

- la désimination est-elle spécifique des membranes synoviales rhumatoïdes ou

survient-elle au cours d'autres synovites?

- chez l’animal, peut-on apporter une preuve du rôle pathogène de l’autoimmunité

anti-protéines en montrant que la fibrine citrullinée autologue est immunogène et

arthritogène ?

- parmi les 5 isotypes de PAD, lesquelles sont exprimées dans le tissu synovial

rhumatoïde et impliquées dans la désimination de la fibrine ?

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RRÉÉSULTATS SULTATS EXPEXPÉÉRIMENTAUXRIMENTAUX

DISCUSSION GÉNÉRALE

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

DISCUSSION GÉNÉRALE

INTRODUCTION

DISCUSSION GÉNÉRALE

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Résultats expérimentaux

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Publication N°1 :

Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but commonly

occurs during synovitides.

The Journal of Immunology, 174:5057-5064, 2005.

Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Baeten D, Clavel C, Foulquier C, De Keyser F, Serre G.

Le but de ce travail a été de rechercher si la présence de fibrine citrullinée dans le tissu

synovial était spécifiquement associée à la PR, ce qui pourrait expliquer l'étroite

association qui existe entre ACPA et PR.

Chez 13 patients atteints de PR et 19 patients atteints d’autres maladies

rhumatologiques inflammatoires ou non, des biopsies synoviales de genou ont été

réalisées dans des aires tissulaires inflammatoires identifiées par arthroscopie. Une analyse

histopathologique a confirmé la synovite dans tous les échantillons. Par immunotransfert,

en utilisant des anticorps anti-fibrine, des anticorps spécifiques des résidus citrullyl et des

auto-anticorps anti-fibrinogène citrulliné purifiés à partir de sérums de patients atteints de

PR, la fibrine citrullinée a été détectée dans les extraits synoviaux de tous les patients. De

plus, des variations dans le degré de citrullination de la fibrine ont été observées, sans

relation avec la maladie. Des analyses immunohistochimiques sur coupes sériées de tissu

synovial, utilisant des anticorps anti-résidus citrullyl et un antisérum anti-fibrine, ont

confirmé les résultats en montrant une co-localisation des protéines citrullinées avec la

fibrine chez les patients atteints de PR mais également chez les patients contrôles.

Ainsi la citrullination de la fibrine dans le tissu synovial est un phénomène associé à

l’inflammation synoviale qui n’induit pas nécessairement une réponse auto-immune

humorale avec production d’ACPA.

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Fibrin Deimination in Synovial Tissue Is Not Specific forRheumatoid Arthritis but Commonly Occursduring Synovitides1

Sabine Chapuy-Regaud,* Mireille Sebbag,* Dominique Baeten,† Cyril Clavel,*Celine Foulquier,* Filip De Keyser,† and Guy Serre2*

Autoantibodies to deiminated (citrullinated) proteins are the most specific serological markers of rheumatoid arthritis (RA).Deimination is critical in generating the peptidic epitopes they recognize. In the synovial tissue (ST), deiminated forms of the �-and �-chains of fibrin are their major autoantigenic targets (anti-human fibrin(ogen) autoantibodies (AhFibA)). We investigatedwhether the presence of deiminated fibrin in the ST was specific for RA, because this could explain why AhFibA are RA specific.In 13 patients with RA and 19 patients with various other rheumatological disorders, knee ST biopsies were collected in macro-scopically inflamed areas identified under arthroscopy. Synovitis was histopathologically confirmed in all of the biopsies. Byimmunoblotting, using antisera to fibrin, Abs to citrullyl residues, and AhFibA purified from RA sera, deiminated fibrin wasevidenced in ST extracts from all of the patients. Moreover, variations in the degree of fibrin deimination were observed that werenot related to the disease. Immunohistochemical analysis, using Abs to citrullyl residues and an antiserum to fibrin on adjacentserial sections of ST, confirmed the results because deiminated proteins colocalized with fibrin in RA as well as in control patients.Therefore, fibrin deimination in the ST is a general phenomenon associated to any synovitis, which does not necessarily induce aB autoimmune response with production of AhFibA. The Journal of Immunology, 2005, 174: 5057–5064.

A utoantibodies to deiminated (or citrullinated) proteinsare highly specific for rheumatoid arthritis (RA).3 Theywere first referred to as antifilaggrin autoantibodies

(AFA), which encompass two IgG autoantibody families, the so-called antikeratin Abs and the antiperinuclear factor. Indeed, sev-eral decades after their initial, independent descriptions, weshowed that both anti-keratin Abs and antiperinuclear factor rec-ognize diverse forms of the squamous epithelium protein, filag-grin, or of its precursor, profilaggrin (1–3), and demonstrated thatthey constitute largely overlapping autoantibody families (3). Wealso showed that the filaggrin-related targets of AFA correspond to

deiminated proteins, of which arginyl residues have been post-translationally transformed into citrullyl residues by a peptidyl-arginine deiminase (PAD) (4). Moreover, we and others estab-lished that citrullyl residues are indispensable elements of theepitopes recognized by AFA, but only in the context of specificamino acid sequences (4–6).

We also showed that AFA are produced by plasmocytes of therheumatoid pannus and concentrated in the synovial tissue (ST)interstitium (7). This suggested the presence of a target for theseautoantibodies in diseased synovial joints. However, because ep-ithelial tissues do not correspond to the sites of rheumatoid in-flammation and we showed that (pro)filaggrin is not expressed inarticular tissues (8), we speculated that deiminated (pro)filaggrinwas not the in vivo target of AFA in RA, but rather an Ag cross-recognized in vitro. Indeed, we showed that rheumatoid synovialmembranes contain several deiminated proteins, among which de-iminated forms of the �- and �-chains of fibrin were identified as themajor synovial targets of AFA (8). These results constitute a strongargument for the involvement of AFA/anti-human fibrin(ogen) au-toantibodies (AhFibA) in the pathophysiology of RA because thesimultaneous presence of these autoantibodies and of their targetsin the ST is bound to lead to an immunological conflict thatstimulates rheumatoid tissue inflammation. Moreover, the rolethat this immunological conflict plays in the disease develop-ment and/or maintenance is most probably important because:1) among RA-associated autoantibodies, autoantibodies to de-iminated proteins are largely the most disease specific (9 –11);2) they appear early (12–16), often before clinical symptoms(17–19); and 3) they are positively linked to disease activity andseverity (20 –24).

Fibrin was described for the first time as a PAD substrate whenwe identified its deiminated form as the synovial target of AhFibA(8). Protein deimination, mediated by a family of five PAD iso-forms (25–29), is a posttranslational modification described more

*Laboratory of Epidermis Differentiation and Rheumatoid Autoimmunity, UniteMixte de Recherche 5165 Centre National de la Recherche Scientifique-Toulouse IIIUniversity, Institut Fedératif de Recherche 30 (Centre National de la Recherche Sci-entifique-Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale-Universite PaulSabatier-Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse), Toulouse, France; and †De-partment of Rheumatology, Ghent University Hospital, Ghent University, Ghent, Bel-gium

Received for publication June 2, 2004. Accepted for publication January 11, 2005.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of pagecharges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.1 This study was supported by grants from the Universite Paul Sabatier-Toulouse III,the Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, the Centre National dela Recherche Scientifique, and the Association pour la Recherche sur la Polyarthrite,and by a postdoctoral fellowship from the Societe de Secours des Amis des Sciences(to M.S.) and a postdoctoral fellowship from the Institut National de la Sante et de laRecherche Medicale (to S.C.-R.). D.B. is a Senior Clinical Investigator of Fonds voorWetenschoppeljk Onderzoek-Flanders.2 Address correspondence and reprint requests to Dr. Guy Serre, Unite Differen-ciation Epidermique et Autoimmunite Rhumatoıde, Unite Mixte de Recherche5165 Centre National de la Recherche Scientifique-Universite Paul Sabatier, Ho-pital Purpan, Place du Dr. Baylac, 31059 Toulouse Cedex, France. E-mail address:[email protected] Abbreviations used in this paper: RA, rheumatoid arthritis; AFA, antifilaggrin au-toantibody; AhFibA, anti-human fibrin(ogen) autoantibody; AMC, Ab to modifiedcitrullyl residues; AS, ankylosing spondylitis; MM, multiple myeloma; PAD, pepti-dylarginine deiminase; PsA, psoriatic arthritis; ST, synovial tissue.

The Journal of Immunology

Copyright © 2005 by The American Association of Immunologists, Inc. 0022-1767/05/$02.00

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than 50 years ago (for review, see Ref. 30). Moreover, PADs areexpressed in a wide variety of vertebrate tissues. Nonetheless, onlyvery few physiological PAD substrates have been characterized todate, and the probably very numerous and important biologicalconsequences of this posttranslational modification have not yet allbeen elucidated. In the rheumatoid synovium, deimination of fibrincould make it immunogenic, the deiminated fibrin eliciting or atleast sustaining production of the RA-specific autoantibodies. Tofully consider this hypothesis, it was essential to know whether thepresence of deiminated fibrin was, or was not, specific for therheumatoid ST. Indeed, a close association to RA would explainwhy AhFibA are so highly specific for the disease.

To answer this question, we analyzed synovial biopsy samplesfrom a series of 32 patients with RA or with non-RA rheumato-logical disorders (control patients). The presence of deiminatedfibrin in the ST was analyzed by immunoblotting and immunohis-tology, using Abs directed to citrullyl residues (targeting any de-iminated proteins) and to fibrin, and also AhFibA, immunopurifiedfrom a pool of RA sera.

Materials and MethodsPatients

Among consecutive patients undergoing needle arthroscopy for knee painand/or arthritis in the Department of Rheumatology of Ghent UniversityHospital, 32 were selected who exhibited synovitis as asserted by macro-scopical examination under arthroscopy. Thirteen patients were diagnosedas having RA, according to the American College of Rheumatology clas-sification criteria (31). The other 19 patients (control patients) included 13patients with spondylarthropathies (classified in 4 ankylosing spondylitis(AS), 4 psoriatic arthritis (PsA), 1 reactive arthritis, 4 undifferentiatedspondylarthropathy, according to the criteria of the European Spondylar-thropathy Study Group (32)); 1 patient with systemic lupus erythematosus(33); 4 patients with osteoarthritis of the knee, classified according to theAmerican College of Rheumatology criteria (34); and 1 patient with amultiple myeloma (MM) presenting a synovial extension. All patients gavetheir informed consent as approved by the Ethics Committee of the GhentUniversity Hospital.

Tissues

ST biopsies were obtained during arthroscopy, as previously described(35). Briefly, after careful inspection of the joint cavity, the biopsies (14 perpatient) were collected from the macroscopically inflamed areas using2.7-mm biopsy forceps (Karl Storz). For histological and immunohistolog-ical analyses, 8 biopsies were fixed in 3% formaldehyde and then embed-ded in paraffin. For immunochemical analyses, the remaining 6 biopsieswere snap frozen and stored at �80°C until ST extraction was performed.

Histology and immunohistology

Histological analyses were performed after staining with H&E. To evaluateST inflammation, histological parameters were scored by two independentobservers unaware of the diagnosis and clinical data, as previously de-scribed (36) (see Table I). To assess the presence of fibrin, sections wereprobed with a rabbit antiserum directed to the B�-chain of human fibrinogen(1:4000; Cambio), followed by Abs to rabbit IgG coupled to a peroxidase-based polymer backbone (EnVision reagent; DakoCytomation). On adja-cent sections, the presence of deiminated proteins was probed using an Abto modified citrullyl residues (AMC; purified rabbit IgG, a generous gift ofT. Senshu, Graduate School of Integrated Science, Yokohama City Uni-versity, Yokohama, Japan) (37). AMC was used at 0.66 �g/ml after Agretrieval by a 40-min incubation in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) in aboiling water bath and in situ modification of citrullyl residues, as previ-ously described (38). This procedure was also applied to sections of form-aldehyde-fixed and paraffin-embedded skin, which served as positive con-trols. AMC binding was visualized using biotin-coupled goat IgG to rabbitIgG (H � L specific; Southern Biotechnology Associates), followed bybiotinyl tyramide- and peroxidase-based amplification using the TyramideSignal Amplification Biotin System (PerkinElmer Life and Analytical Sci-ences), as suggested by the manufacturer. Finally, whatever the Ag de-tected, the peroxidase activity was visualized using 3-amino-9-ethylcarba-zole, and all of the sections were counterstained with hematoxylin. In bothstaining procedures, a normal rabbit antiserum was used as negativecontrol.

Sequential protein extraction from synovial tissues

ST biopsies (median wet weight 28.5 mg; range 8–119 mg) were sequen-tially extracted with an Ultra-Turrax homogenizer (T25 basic; IKALabortechnik) in 500 �l of ice-cold 40 mM Tris-HCl-based buffers (pH7.4; three times in each buffer), containing first 150 mM NaCl (TBS ex-tract), then 8 M urea, deionized by incubation with a mixed bed resin (AG501-X8; Bio-Rad), (urea extract), then 8 M deionized urea and 50 mMDTT (urea-DTT extract). All buffers were supplemented with 40 mMEDTA, 0.02% sodium azide, 2 �g/ml aprotinin, 10 mM N-ethylmaleimide,and 1 mM PMSF (all from Sigma-Aldrich). After each extraction, thehomogenate was clarified by centrifugation at 4°C for 7 min at 15,000 �g. The three urea-DTT extracts were chosen for further analysis and pooledbecause, according to our previously published results, they were expectedto be enriched with deiminated fibrin (8). Then concentration and bufferexchange against 50 mM EDTA were performed using disposable ultra-filtration devices with a 3-kDa molecular mass cutoff (Centricon YM-3;Millipore). After concentration so that the total suspension volume equaled2.5 �l/mg ST sample, the protein solution was placed in SDS-PAGE sam-ple buffer.

Immunoblotting

Whenever possible, equal amounts of total proteins from all of the 32urea-DTT ST extracts (as adjusted by visual examination of Coomassieblue-stained gels) were separated by SDS-PAGE on 7.5% polyacrylamidegels and then electrotransferred onto reinforced nitrocellulose membranes(Hybond-C extra; Amersham). Each membrane was successively detected

Table I. Histological evaluation of ST inflammation

Patient CodeaMean LiningThicknessb Vascularityc Infiltrationc

RA 1 1 2.5 12 2 1 33 2 1 2.54 2 1.5 1.55 1 1 16 2 2 37 2 1 1.58 3 1.5 39 1 1 2

10 1 1 011 1 2 212 1 2 113 2 3 1.5

AS 1 2 2 12 2 3 23 1 1.5 24 1 2 1

PsA 1 3 3 1.52 2 2.5 1.53 1 1 14 1 3 2

ReA 1 1 2.5 1USpA 1 1 1 2

2 1 1 13 2 2 1.54 1 2 0.5

SLE 1 2 2 0OA 1 2 2.5 2

2 1 2 13 1 2 24 1 1 0

MM 1 1 1 1.5pd 0.22 0.08 0.08

a RA and control patients were coded according to their diagnosis: AS; PsA; ReA,reactive arthritis; USpA, undifferentiated spondylarthropathy; SLE, systemic lupuserythematosus; OA, osteoarthritis; and MM with knee localization.

b Mean lining thickness was evaluated by counting the number of cell layers in sixrandomly selected regions and semiquantitatively scoring the mean (0:1–2; 1:3–4;2:5–6; 3:�7 cell layers), as previously described (36).

c Vascularity was evaluated by the number of blood vessels. Infiltration of thesublining layer by inflammatory cells was evaluated by the global number of infil-trating cells. Both parameters were semiquantitatively scored from 0 (representing thelowest level) to 3 (representing the highest level), as previously described (36).

d Values of p refer to comparisons between the groups of RA and control patients.

5058 AUTOIMMUNITY TO DEIMINATED FIBRIN

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by several primary probes diluted in 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)containing 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, and 2.5% powdered skimmedmilk (blotting buffer). To make sure that the signals observed were actuallydue to binding of the probing primary Ab used, each time that the mem-brane was probed, the process was preceded by an Ab removal procedurethat included a 5-min wash in 0.2 M glycine-HCl (pH 2.7) and then a30-min incubation at 50°C in blotting buffer containing 14 mg/ml SDS and0.2 M 2-ME. The primary probes used were: AhFibA purified from a poolof RA sera (10 �g/ml), then the antiserum to the �-chain of human fibrin-(ogen) (1:800,000), then a sheep antiserum to the �-chain of human fi-brin(ogen) (1:4,000; Cambio), and, finally, after chemical modification ofcitrullyl residues (37), AMC (0.8 �g/ml). Peroxidase-conjugated secondaryprobes were used for detection of all the primary Abs: protein A (Sigma-Aldrich), goat Abs to rabbit IgG (H � L) (Zymed Laboratories), and rabbitF(ab�)2 to sheep IgG (Southern Biotechnology Associates) for the detectionof human, rabbit, and sheep IgG, respectively. Peroxidase activity wasvisualized using ECL reagents (Amersham), as suggested by the manufac-turer. Negative controls included probing with the secondary probe only.The specificity of the staining obtained with AhFibA was further checkedusing human IgG purified from healthy individuals (Sigma-Aldrich). Fi-brinogen, purified from human plasma, and a urea-DTT extract from arheumatoid ST sample previously demonstrated to contain deiminated fi-brin (8) were used as controls and systematically included in the SDS-PAGE gels for simultaneous immunoblotting.

Fibrinogen deimination

Plasminogen-depleted human fibrinogen (95% pure; Calbiochem) was fur-ther purified, as suggested by manufacturer, by affinity chromatography ona protein G column (HiTrap protein G, 1 ml; Amersham) to eliminateresidual contamination by IgG. Deimination was then performed at 0.86mg of fibrinogen/ml with rabbit skeletal muscle PAD (Sigma-Aldrich; 7U/mg fibrinogen) in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM CaCl2, and 5 mMDTT for 2 h at 37°C.

Autoantibody purification

AhFibA were purified, as previously described, from the IgG fraction of apool of 38 high-titered RA sera (8). Briefly, the IgG were loaded onto a5-ml N-hydroxysuccinimide HiTrap column (Amersham) coupled with14.4 mg of deiminated human fibrinogen. After a 2-h incubation at 4°C, thecolumn was washed with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 MNaCl, and then bound Abs were eluted with 0.2 M glycine-HCl (pH 2.7)and immediately neutralized by addition of 2 M Tris. This purificationprocedure was repeated several times, and the fractions corresponding tothe eluted AhFibA were pooled and concentrated using affinity chroma-tography on protein G.

AhFibA assay

The titer of AhFibA in the serum was evaluated with a recently developedELISA using in vitro deiminated human fibrinogen as immunosorbent (11).Sera were classified as positive for the presence of AhFibA when the titerwas greater than the 98.6% diagnostic specificity threshold titer.

Statistical analyses

Median differences were tested with the Mann-Whitney U test. The p valueadjustment for multiple comparisons was done by the Holm (sequentialBonferroni) correction method (39). Values of p less than or equal to 0.05were considered significant.

ResultsHistopathological examination confirms the existence ofsynovitis in all RA and control patients

Clinical data of the patients are shown in Table II. Knee synovitiswas arthroscopically asserted in all of the patients. All but one(RA13) had an associated synovial fluid effusion. As expected,upon histological examination of the ST (Table I), the individualscores obtained for mean lining thickness, vascularity, and infil-tration by cells of hematological origin clearly indicated that all ofthe synovial membranes were actively inflamed, even though, oncomparison, the groups of RA and control patients tended to showdifferences reflecting disease-related features (36).

Fibrin and deiminated fibrin are biochemically detectable in thesynovial tissue of both RA and control patients

The presence of fibrin and deiminated fibrin in the ST was assessedin all of the 32 patients by immunoblotting analysis of urea-DTTextracts obtained after sequential extraction of the ST biopsies us-ing a TBS, then a urea, and finally a urea-DTT buffer. Indeed, wepreviously described that when applied to rheumatoid ST, this se-quential extraction method enriches the urea-DTT extract in de-iminated fibrin (8). Two antisera specific for the A�- and the B�-chains of human fibrinogen, respectively, probed for the presenceof fibrin, deiminated or not. AMC allowed the detection of all ofthe deiminated proteins. Lastly, AhFibA, affinity purified from apool of rheumatoid sera on in vitro deiminated fibrinogen, assessedthe presence of their own target, deiminated fibrin.

The results are illustrated in Fig. 1, showing the ST analysis of13 representative patients, including 6 RA and 7 control patients.As expected, the reactivities of the antisera to the �- and to the�-chain of human fibrin(ogen) were found to be correlated, a stron-ger reactivity being systematically observed using the antiserum tothe �-chain. A reactivity with the latter antiserum was observed inall of the 32 ST extracts. Therefore, the presence of fibrin wasevidenced in the ST of all the patients, whatever their disease.Moreover, a high degree of interindividual variation in the ratio offibrin to total proteins was noted, with no obvious relationshipswith the disease (data not shown).

The staining intensities obtained with AMC and with AhFibAwere globally related. In all of the extracts, a faint to intense re-activity of AMC and of AhFibA with the �- and the �-chains offibrin was noted, indicating that, for all patients, at least part of theST fibrin was deiminated. The degree of fibrin deimination of theextract varied from patient to patient, high, medium, or low de-grees being observed in both RA and control patients (for example,in Fig. 1, compare staining intensities of the antisera to fibrinchains vs AMC or AhFibA in patients RA 13 and PsA 4, high; inpatients RA 12 and MM 1, medium; and in patients RA 5 and AS2, low degree of deimination).

Therefore, immunoblotting analyses indicate that the presenceof the synovial target of AhFibA is not restricted to the rheumatoidST, but can also be observed in the ST from patients with variousother rheumatological disorders. Moreover, they show that no ob-vious differences in the degree of fibrin deimination exist betweenrheumatoid and control ST.

The assay of serum AhFibA was performed in 9 of the 13 RApatients and 12 of the 19 control patients (Table II). As expected,AhFibA were absent from the serum of control patients, whereas7 of 9 RA patients were AhFibA positive. In those patients, noclear relationships were found between the AhFibA titer and the

Table II. Patients: clinical and serological data

RAn � 13

Control patientsn � 19

Sex ratio (F/M) 9/4 7/12Age, median (range) 64.4 (31.6–77.7) 37.9 (20.8–77.1)Disease duration, median

(range)8 (1–17) 1 (0.2–17)

Swollen joints, median(range)

5.5 (0–31) 2 (1–17)

AhFibAa, no. positive/no.negative

7/2b 0/12b

a AhFibA measured by ELISA, using in vitro deiminated human fibrinogen asimmunosorbent.

b p � 10�3.

5059The Journal of Immunology

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amount of deiminated fibrin assessed by immunoblotting in the STbiopsies (data not shown).

Deiminated proteins and fibrin are histologically colocalized inthe synovial tissue of both RA and control patients

The presence of deiminated fibrin in the synovial membrane wasalso indirectly assessed in 19 of the 32 patients by immunoperox-idase staining of adjacent serial sections of synovial biopsies withthe antiserum to the �-chain of fibrin(ogen) and with AMC (illus-trated in Fig. 2). In 12 patients (corresponding to 6 RA and 6control patients), the anti-fibrin Ab stained interstitial amorphousdeposits of varying abundance located in the lining layer and/or inthe deep synovium. In 2 of these 12 patients (RA 9 and RA 11),AMC did not stain the fibrin deposits, whereas in the other 10patients, fibrin deposits were labeled. The labeling intensity of thefibrin deposits was variable from one patient to another, but also,in each ST sample, within a given fibrinous zone. As illustrated inFig. 2, high, medium, or low degrees of deimination of the fibrindeposits were observed in both RA and control patients.

Therefore, unlike with immunochemical analysis, the less sen-sitive immunohistological methods did not allow detection of de-iminated fibrin in all of the ST samples. Nevertheless, the resultsof both analyses are in perfect agreement to confirm that the pres-ence of deiminated fibrin in the ST is not specifically associated toRA. Moreover, the deiminated fibrin deposits did not appear moreprominent in RA than in other synovitides.

DiscussionUsing an Ab directed to citrullyl residues, produced by immuni-zation of rabbit with L-citrullin coupled to keyhole limpet hemo-cyanin (in this work referred to as anti-L-Cit), we previously ex-plored, by immunohistology, the association between RA and thepresence of deiminated proteins in the ST (40). With this Ab, de-iminated proteins were evidenced in the ST of RA patients, located

in the cytoplasm of rare cells (2–5/biopsy section) of the lining andsublining layers, these labelings being totally absent from the STof patients with other rheumatologic disorders, including spondy-larthropathy and osteoarthritis (40). However, the presence of de-iminated fibrin could not be reliably investigated because anti-L-Cit did not allow reproducible staining of deiminated extracellularfibrin deposits to be obtained. Moreover, anti-L-Cit is unable torecognize deiminated proteins in immunochemical techniques be-cause, by ELISA as well as immunoblotting, it fails to detect manydeiminated proteins such as the deiminated �- and �-chains ofhuman fibrinogen, and deiminated filaggrin purified from humanepidermis (our unpublished results). Therefore, in the presentstudy, AMC, an Ab to citrullyl residues developed by Senshu et al.(37) and known to be reactive with deiminated fibrin both by im-munohistology and immunoblotting (8), was used to assesswhether the presence of deiminated fibrin in the ST was specificfor RA or not. The results clearly demonstrate that the presence ofdeiminated fibrin in the synovial membrane is not specific for RA.Moreover, as already observed (8), AMC decorated the cytoplasmand/or the nucleus of often quite numerous cells that morpholog-ically evoked macrophages and fibroblasts (data not shown). Thiscellular labeling was not confined to RA patients, but was also seenin two cases of ankylosing spondylitis, one case of psoriatic ar-thritis, one case of undifferentiated spondylarthropathy, and onecase of osteoarthritis. In contrast, when the ST samples of thepresent study were probed with anti-L-Cit according to our proto-col (40), the results obtained were very consistent with those of ourprevious study: rare citrulline-positive cells were detected in 7 of13 RA patients and in none of the 19 control patients (data notshown). Therefore, the two Abs to citrullyl residues, AMC andanti-L-Cit, obviously do not recognize the same sets of deiminatedproteins. Anti-L-Cit defines a subset of intracellular deiminatedprotein(s) that is specific for RA. The molecular characterization ofthese proteins is therefore of great interest for RA pathogenesis.

FIGURE 1. Immunoblotting analysis of ST demonstrates the presence of deiminated forms of the �- and �-chains of fibrin in RA as well as controlpatients. After Ponceau red staining, immunodetections of membrane blots of the urea-DTT extracts of the ST samples of RA and control patients weresuccessively performed following the sequence described in Materials and Methods. Anti-�, antiserum to the �-chain of human fibrin(ogen); anti-�,antiserum to the �-chain of human fibrin(ogen); AhFibA, purified autoantibodies to human deiminated fibrin(ogen). Only the zones corresponding to thelocation of the �- and the �-chain of fibrin are presented. Control ST, positive control corresponding to a urea-DTT extract of ST from a RA patient,previously identified as containing deiminated fibrin. Fibrinogen, undeiminated human fibrinogen. Reactivity with the anti-� antiserum indicates thepresence of fibrin in all of the ST biopsies. In all of the samples, reactivity with AMC and AhFibA demonstrates that this fibrin is at least partly deiminated.

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Nevertheless, to date, anti-L-Cit is the only Ab showing such spec-ificity, but it does not work in immunochemical techniques. There-fore, it cannot help the characterization. This exciting future chal-lenge is beyond the scope of the present study.

Because the presence of fibrin deposits is linked to tissue in-flammation, to check the association between RA and deiminatedfibrin, we had to compare the ST of RA patients with other in-flamed ST. The controls were therefore chosen among patientswith non-RA inflammatory rheumatological disorders. Patientswith osteoarthritis and one with knee localization of a multiplemyeloma were also included in our study because even thoughthey are not classified as inflammatory disorders, these diseasescan also lead to intense local synovitis. Accordingly, all of thecontrol ST samples in our study, including those from osteoarthri-tis and multiple myeloma patients, as well as the rheumatoid STsamples, exhibited local synovitis, as indicated by arthroscopy andhistology. Therefore, the presence of deiminated fibrin that weobserved in all the ST is probably a consequence of their inflam-matory state. In agreement with this hypothesis, and with our re-sults, is the fact that the presence of deiminated fibrin in the ST hasrecently been demonstrated in two mouse arthritis models, namelyacute streptococcal cell wall-induced arthritis and chronic destructivecollagen-induced arthritis, whereas the synovial membrane of naivecontrol mice was devoid of fibrin and of deiminated proteins (41).Although it remains to be established, it is also highly conceivable thatdeimination of fibrin may not be restricted to ST inflammation, butalso may be observable during every tissue inflammation in whichfibrin deposition is prominent, such as, for example, glomerulonephri-

tis or acute lung injury. More generally, deimination of fibrin duringinflammation could occur in numerous organs and play a major rolein the physiology of inflammation. Confirmation of this hypothesiswould have a wide impact in human pathology.

As mentioned earlier, PADs are expressed in a wide variety oftissues, but in most of them, the biochemical nature of their sub-strate(s) and hence their function still remain to be unraveled. My-elin basic protein (42), type I and type II cytokeratins (38), filag-grin (43), and trichohyalin (44) are among the few proteins thathave been demonstrated to be in vivo PAD substrates. A commonconsequence of deimination of these proteins is a decrease of theirnet charge that, in vitro, has been shown to modify intermolecularinteractions (45–47). These modifications probably play a role inphysiological processes such as terminal differentiation of epider-mis (48), and skin and brain development (49, 50). Concerningpathophysiological processes, in multiple sclerosis, the associatedincrease in the relative amount of deiminated forms of myelinbasic protein was proposed to be involved in the disease-charac-teristic instability of myelin sheaths (51). Deimination of fibrincould hamper its cleavage by plasmin, arginyl residues being in-cluded in the cleavage sites of this enzyme. The subsequent defectin fibrinolysis could have a role in perpetuating inflammation be-cause fibrin accumulation in the ST has been demonstrated to playa pathogenic role in various animal models of arthritis (52–54). As,in this work, we demonstrate the presence of deiminated fibrin inother rheumatic diseases associated with synovitis, a deimination-related defect in fibrinolysis could constitute a general phenome-non contributing to the maintenance of ST inflammation.

FIGURE 2. Immunohistological analysis shows that deiminated fibrin is present in the ST of RA as well as control patients. Deiminated fibrin wassearched in the ST biopsies by immunoperoxidase staining of adjacent serial sections (panel pairs) with the Ab to the �-chain of human fibrin(ogen) (Fibrin,left panels) and with AMC (Deiminated proteins, right panels). In the synovial membranes of RA (RA 6, RA 13, RA 7) and control patients (PsA 4, AS2, MM 1), the presence of fibrin deposits can be evidenced by staining of interstitial amorphous zones of varying abundance. These zones are stained toa varying extent and intensity by AMC, in both RA and control patients. The degree of staining indicates the degree of deimination of the fibrin deposits,a high (RA 6, PsA 4), medium (RA 13, AS 2), or low (RA 7, MM 1) degree of deimination being observable in both patient groups. Bars � 50 �m.

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When the presence of deiminated fibrin in the ST was investi-gated by immunoblotting, in both RA and control samples, wenoted that the intensities of AMC staining were generally higherfor the �- than for the �-chain of fibrin. This suggests that the�-chain is more accessible to PAD than the �-chain. The stainingintensities of the �-chain obtained with AMC and with AhFibAwere well correlated with each other, whereas a high degree ofdeimination of the �-chain evidenced with AMC did not alwayscorrelate with strong staining by AhFibA. This suggests that whilethe in vivo deimination of the �-chain seems more effective thanthat of the �-chain, this does not necessarily lead to the generationof a higher number of AhFibA epitopes on the �- than on the�-chain. Moreover, the fact that the staining intensities of the�-chain obtained with the antiserum to the �-chain of human fi-brin(ogen) and with AhFibA appeared inversely correlated in allsamples tested is also noteworthy. One possible explanation forthis observation is that while generating citrulline-containingepitopes on the �-chain of fibrin targeted by AhFibA, deiminationat the same time disrupts arginine-containing epitopes targeted by theantiserum to the �-chain of human fibrin(ogen). This hypothesis is inagreement with the decreased intensity that we observe with this an-tiserum when probing in vitro deiminated human fibrinogen in com-parison with an equal amount of its undeiminated form.

Even though the presence of deiminated fibrin is not specific forRA, the autoantibody response to it is tightly associated to thedisease. The reason for this association therefore remains to beelucidated.

In this study, whatever the disease we analyzed, deiminated fi-brin of the ST was recognized by AhFibA. This shows that theepitopes produced in the nonrheumatoid ST are either the same orlargely overlap or are at least cross-reactive with those produced inrheumatoid ST. However, one cannot exclude that one or moreimmunogenic epitopes could be specifically generated during RA.Such epitope(s) could initiate an autoimmune response that wouldtherefore be disease specific. Secondarily, epitope spreading couldlead to the production of Abs directed to epitopes common torheumatoid and nonrheumatoid ST. Generation of such RA-spe-cific epitopes could be due to the activity of one or several RA-specific PAD isoform(s) exhibiting variations in their fine substratespecificity. Interestingly, in a Japanese population, it was recentlyfound that a haplotype of the gene encoding isoform 4 of PAD(PAD4) was associated with an increased susceptibility to RA, andthat individuals homozygous for this haplotype were more likely tobe AFA positive (55). This haplotype was found to be associatedwith the production of a PAD4 mRNA with increased in vitrostability, suggesting that the amount of PAD4 and, consequently,the amount of deiminated proteins and particularly of deiminatedfibrin could be higher in rheumatoid than in nonrheumatoid ST.However, in our study, we could not evidence quantitative differ-ences in the amount of deiminated fibrin between RA and controlpatients. This could be related to differences in the populationsanalyzed because the association between susceptibility to RA andthe described haplotype of the PADI4 gene has not been confirmedin a Caucasian population from United Kingdom (56). Alterna-tively to an increased total amount of PAD enzyme, the describedRA-associated haplotype could rather encode a PAD4 whose finesubstrate specificity leads to the generation of the above mentionedRA-specific immunogenic epitopes on deiminated fibrin. Finally,another possible source of RA-specific immunogenic epitopes cor-responds to the still uncharacterized RA-associated intracellulardeiminated protein(s) defined by the anti-L-Cit Ab. Indeed,some of these proteins seem to correspond to targets of theRA-associated autoantibodies to deiminated proteins because in

some cells, anti-L-Cit and AFA reactivities were histologicallycolocalized (40).

An alternative to the above hypotheses would be that reactivityto deiminated proteins bearing epitopes that mimic epitopes tar-geted in deiminated fibrin is not subsequent to the appearance ofRA-specific epitopes, but genetically determined. The Ab responsecould indeed be dependent on a T cell response restricted by theMHC class II molecules bearing the so-called shared epitope thatcharacterizes the HLA-DR haplotypes associated with an in-creased susceptibility to RA. Supporting this hypothesis is the factthat we found that the titers of AFA are significantly higher inpatients with susceptibility alleles (57) and that an association be-tween the presences of autoantibodies to deiminated proteins andof shared epitope-bearing alleles was also described by othergroups (13, 20, 21). The deiminated proteins eliciting the Ab re-sponse could either be expressed by infectious agents or be en-dogenous. Such an endogenous immunogen could be the RA-as-sociated deiminated protein(s) recognized by the anti-L-Cit Ab ordeiminated vimentin, which moreover could correspond to thesame single Ag. Indeed, this Ag was recently demonstrated to bethe target of the anti-Sa autoantibodies (58), another family ofRA-associated autoantibodies that therefore belongs to the familyof autoantibodies to deiminated proteins and probably overlapswith the other members of the family. Interestingly, although Tlymphocytes specific for deiminated fibrin have not been describedyet, a recent study showed that, in a given vimentin-derived pep-tide, the conversion from arginine to citrulline at the peptide side-chain position interacting with the shared epitope increases theaffinity of the interaction with the MHC molecule (59). Althoughthese results remain to be confirmed with a larger set of peptides,they open a very interesting road toward the understanding of howshared epitope-bearing DRB1 alleles could contribute to the auto-immune response to deiminated self Ags in RA patients.

Be that as it may, in our study, the presence of susceptibilityalleles was investigated in 10 of the 13 RA patients and 8 of the 19

FIGURE 3. Schematic view of the role played by the autoimmune re-sponse to deiminated fibrin in the pathophysiology of RA. In the rheuma-toid ST, after deimination, fibrin becomes the target of the disease-specificAhFibA, locally produced by ST plasmocytes (Pc). This leads to an Ag/Abconflict that, via activation of effector mechanisms probably involvingcomplement and/or Fc receptors, has proinflammatory effects. In turn,these effects lead to plasma extravasation and fibrinogen polymerization,and therefore provoke the formation of new fibrin deposits in the tissue,which become the substrate of one or several locally expressed PAD. Thiscloses a vicious circle that could account for the self-maintenance of rheu-matoid inflammation. In the ST of control patients, even if deiminatedfibrin is present, the absence of AhFibA prevents establishment of thisself-maintenance loop. Fg, fibrinogen.

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control patients (data not shown). The results were consistent withthe largely reported association between RA and these alleles, be-cause 10 of 10 RA patients had a genotype containing at least onesusceptible allele. They also confirmed the association betweenthese alleles and the Ab response to deiminated proteins because,among the 7 of the 10 shared epitope-positive RA patients inwhom the presence of AhFibA was investigated, 6 were AhFibApositive. However, none of the control patients had detectableAhFibA, indicating that even if they possibly play an importantrole to generate the AhFibA response, deiminated fibrin, present inall control patients, and shared epitopes bearing HLA-DR alleles,present in 4 of the 8 analyzed control patients, are not the onlyfactors involved.

Although our results exclude a direct relationship between au-toantigen expression and specific autoimmune response, we cannotexclude that a large overproduction of deiminated fibrin contrib-utes to drive the AhFibA response in RA. Interestingly, some tar-get autoantigens of systemic sclerosis-associated autoantibodieswere found to be selectively overexpressed in the dermal fibro-blasts of diseased patients (60). It has been reported that fibrindeposits are particularly abundant in the rheumatoid synovium vsthe ST from patients with osteoarthritis or joint trauma (61). How-ever, in the present work, we could not detect that the amount offibrin per gram of ST was increased in RA patients vs other rheu-matological disorders. This apparent discrepancy may be related todifferences in the inflamed character of the control ST analyzed,because, in our study, no bias relative to the inflammatory status ofthe synovial membranes was introduced when the RA and controlpatients were compared. Nonetheless, generally, in RA comparedwith other rheumatological disorders, the ST is particularly morehyperplastic, and the number of joints inflamed is higher; there-fore, the global amount of fibrin in the body is higher. Because wedid not find any particular decreases in the ratio of deiminatedfibrin to fibrin in the rheumatoid compared with nonrheumatoidST, that means that the global amount of deiminated fibrin is prob-ably often greater in RA patients. Although, in our study, we couldnot evidence a relationship between the serum AhFibA titer of RApatients and the amount of deiminated fibrin in the ST of oneinflamed joint, this does not exclude that a positive correlation mayexist with the total body amount of deiminated fibrin.

In conclusion, even if to date the specific presence of AhFibA inRA remains unexplained, we think that the role of the autoimmuneresponse to deiminated fibrin in the disease pathophysiology isundoubtedly important. We propose that fibrin deimination in theST is a key element of the disease-characteristic perpetuation ofsynovitis because it feeds an immunological conflict that hasproinflammatory effects that promote the formation of new fibrindeposits in the tissue, which are secondarily deiminated (Fig. 3).The precise biological pathways leading to fibrin deimination inthe human ST are currently the object of investigations in ourlaboratory, in particular, determination of which isoforms of thePAD are expressed in the ST and what their cellular origin is.

AcknowledgmentsWe thank Dr. T. Senshu (Graduate School of Integrated Science, Yoko-hama City University, Yokohama, Japan) for providing us with his veryvaluable AMC. We thank B. Fournie (Rheumatology Department, HopitalPurpan, Toulouse, France), B. Mazieres, and A. Cantagrel (RheumatologyDepartment, Hopital Rangueil, Toulouse, France) for providing patientdata and sera. We also thank M. Mansat and P. Bonnevialle, and Dr. M.Rongieres (Traumatology and Orthopedics Department, Hopital Purpan)for providing samples of human synovial membranes and J.-P. Chavoin(Plastic Surgery Department, Hopital Rangueil) for providing samples ofhuman skin. The skillful technical assistance of M. P. Henry and M. F.Isaıa is gratefully acknowledged.

DisclosuresThe authors have no financial conflict of interest.

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5064 AUTOIMMUNITY TO DEIMINATED FIBRIN

- 132 -

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Résultats expérimentaux

- 133 -

Publication N°2 :

In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune

response is not arthritogenic.

Clinical and Experimental Immunology, 145:502-512, 2006.

Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Al Badine R, Serre G, Saoudi A, Sebbag M.

Le but de cette étude a été d'apporter une preuve expérimentale du caractère pathogène

de l’auto-immunité anti-fibrine citrullinée.

Dans cette étude, nous avons évalué l’immunogénicité et l’arthritogénicité du

fibrinogène citrulliné autologue chez les rat Lewis et Brown Norway qui présentent des

sensibilités différentes aux maladies auto-immunes. Ces rats ont été inoculés soit avec du

fibrinogène de rat citrulliné (C-rFBG), soit avec du fibrinogène de rat non citrulliné (NC-

rFBG). Dans le groupe de rats ayant reçu du NC-rFBG, aucune réponse IgG n’a été

induite. Au contraire, après la première injection de C-rFBG, les animaux ont développé

une réponse immune spécifique du C-rFBG que la seconde injection d’antigène n’a pas

permis d’amplifier. Cependant, cette réponse auto-immune n’était pas associée à

l’induction d’une arthrite puisque, suivis pendant 3 mois après la première sensibilisation

au C-rFBG, les rats sont restés dépourvus de signes cliniques ou histologiques

d’inflammation articulaire.

Pour tenter de démontrer le caractère pathogène de la réponse auto-immune au

C-rFBG, nous avons évalué sa capacité à aggraver une inflammation articulaire, induite

par injection intra-articulaire d’adjuvant incomplet de Freund (IFA). Nous avons observé

que chez le rat Lewis femelle, l’inflammation aiguë transitoire évolue de manière identique

en présence ou en absence d’une réponse immune dirigée contre la fibrine citrullinée. En

outre, chez ces rats, l’injection intra-articulaire d’IFA n’a pas permis d’induire la présence

de fibrine citrullinée dans le tissu synovial.

Notre étude a confirmé que la citrullination du fibrinogène autologue le rendait

immunogène mais que la réponse immune correspondante n’était pas spontanément

arthritogène. Sa capacité à aggraver une arthrite associée à la présence de dépôts de

fibrine citrullinée intra-articulaires reste à étudier.

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Clinical and Experimental Immunology doi:10.1111/j.1365-2249.2006.03168.x

502

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

,

145:

502–512

et al.

Accepted for publication 28 June 2006

Correspondence: Mireille Sebbag, Unité

‘Différenciation Épidermique et Autoimmunité

Rhumatoïde’; UMR 5165 CNRS-Université

Paul Sabatier, Hôpital Purpan, Place du Dr

Baylac, 31059 Toulouse Cedex 9, France.

E-mail: [email protected].

OR IG INAL ART I C L E

In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune response is not arthritogenic

V. Duplan,* C. Foulquier,* C. Clavel,* R. Al Badine,* G. Serre,* A. Saoudi

and M. Sebbag*

*Laboratory of ‘Epidermis Differentiation and

Rheumatoid Autoimmunity’, Unité Mixte de

Recherche 5165, Centre National de la Recherche

Scientifique (CNRS)-Université Paul Sabatier

(Toulouse III University), Institut Fédératif de

Recherche (IFR) 30 (CNRS-Institut National de la

Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-

Toulouse III University-Centre Hospitalier

Universitaire (CHU) de Toulouse), Toulouse,

France, and

Centre de Physiopathologie de

Toulouse Purpan, Unité Mixte de Recherche en

Santé 563, INSERM-Toulouse III University,

IFR30, Toulouse, France

Summary

Conversion of arginyl to citrullyl residues (citrullination) is essential for theformation of the epitopes recognized by rheumatoid arthritis (RA)-associatedautoantibodies to citrullinated proteins (ACPA). ACPA are secreted by plasmacells of the rheumatoid synovial tissue where their major target, citrullinatedfibrin, is abundant. Although numerous arguments suggest that ACPA play animportant role in RA, their pathological relevance remains to be established.In the present study, we assessed the immunogenicity and arthritogenicity ofcomplete Freund’s adjuvant-emulsified autologous citrullinated (C-rFBG) ornon-citrullinated (NC-rFBG) fibrinogen in Lewis (LEW) and Brown–Norwayrats, which exhibit drastic differences in their susceptibility to inducedautoimmune diseases. NC-rFBG induced no antibody response. In contrast, asingle injection of C-rFBG induced an IgG response directed mainly to citrul-linated determinants of rFBG. However, all rat strains remained devoid ofclinical and histological signs of arthritis up to 3 months after C-rFBG inoc-ulation. Next, in LEW rats, we tested whether autoimmunity to C-rFBG couldaggravate acute ankle arthritis triggered by intra-articular injection of incom-plete Freund’s adjuvant (IFA). However, such arthritis evolved identically inthe presence or absence of anti-C-rFBG autoantibodies. However, IFA-injected joints were devoid of citrullinated fibrin deposits. Therefore, citrul-lination allows breakdown of immunological tolerance but the autoimmuneresponse developed is not spontaneously arthritogenic. Whether or not it canaggravate arthritis with citrullinated fibrin deposits remains to be evaluated.

Keywords:

anti-citrullinated protein autoantibodies, citrulline, fibrin, post-translational modification, rheumatoid arthritis

Introduction

Rheumatoid arthritis (RA), essentially characterized bychronic inflammation of synovial joints with frequentextra-articular manifestations, is the most common humanautoimmune disorder. In the serum of

80% of affectedindividuals, IgG autoantibodies to ‘citrullinated’ (deimi-nated) proteins are present and constitute a highly specificserological marker of the disease. These autoantibodies,described initially as two independent autoantibody fami-lies, the so-called ‘anti-keratin antibodies’ and the anti-perinuclear factor, were both shown to recognize epitopesborne by several molecular variants of the epithelial differ-entiation protein filaggrin and thus to constitute a uniquefamily of autoantibodies referred to thereafter as antifilag-

grin autoantibodies (AFA) [1–3]. Secondly, it was demon-strated that protein ‘citrullination’ (deimination), i.e. post-translational conversion of arginyl residues into citrullylresidues mediated by a peptidylarginine deiminase (PAD),was crucial for the formation of the epitopes recognized byAFA [4,5]. In addition we demonstrated that citrullinatedforms of the

α

- and

β

-chains of fibrin correspond to majorantigenic targets of AFA in the rheumatoid synovial tissue[6]. Finally, the recent demonstration that citrullinatedvimentin corresponds to the target of the RA-associatedanti-Sa antibodies [7] showed that anti-Sa antibodies andthe AFA/anti-citrullinated fibrin autoantibodies belong to asingle family of autoantibodies that can henceforth begenerally named ACPA (autoantibodies to citrullinatedproteins).

- 135 -

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Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

,

145:

502–512

503

The existence of the RA-like joint disorder of the K/B

×

NT cell receptor (TCR) transgenic mouse line that dependscritically on the development of a B cell reaction to glucose-6-phosphate isomerase [8,9] suggests that the role played byB cells in human RA needs careful consideration. Moreover,sustained clinical improvement obtained following the use ofan anti-CD20 antibody (rituximab) as a therapy for RA indi-cates an important role for B cells in the pathophysiology ofthe disease [10]. ACPA-producing B cells could thereforeplay a significant role in RA pathophysiology. Indeed, notonly are ACPA largely the most disease-specific of the RA-associated autoantibodies, but also numerous studies haveestablished clearly that a significant positive correlationexists between the titre of these autoantibodies in the serumand clinical, biological and radiological data related to RAactivity and/or severity (for a review see [11] and [12]). Inaddition, several studies have demonstrated that the appear-ance of ACPA in the serum occurs very early in the course ofthe disease, before arthritis becomes clinically perceptible(reviewed in [12]). Secretion and concentration of ACPA inthe rheumatoid synovial membrane [13] and the presencetherein of their specific antigenic target, citrullinated fibrin,constitute a strong additional argument for the involvementof ACPA in the pathophysiology of RA via a disease-specificimmunological conflict occurring precisely in the disease-targeted tissue.

The existence of an arthritis model using intra-articularinjection of fibrin into rabbits immunized previously withhuman (heterologous) fibrin supports the idea that immu-nization against an inflammation product can play a signif-icant role in maintaining a synovitis [14]. However, recentstudies performed in mice to investigate the role of theautoimmune response to citrullinated fibrin in RA patho-physiology were disappointing. In these studies, mice wereinoculated either with a heterologous antigen, humanfibrinogen (hFBG) or with autologous mouse FBG(mFBG), both in either native or citrullinated forms[15,16]. Immunization with hFBG induced an antibodyresponse independently of the state of citrullination of theAg [15]. In contrast, only inoculation of the citrullinatedform of mFBG was associated with production of specificIgG [16]. However, no arthritis signs appeared in the ani-mals that developed an autoimmune response against FBG[15,16].

Mice and rats often exhibit differences in their suscepti-bilities to stimuli designed to trigger autoimmune disorders.For instance, compared to mice, rats are more susceptible toexperimental autoimmune encephalomyelitis [17], experi-mental autoimmune myasthenia gravis [18] or adjuvant-induced arthritis [19]. This prompted us to evaluate theimmunogenic and arthritogenic properties of autologouscitrullinated FBG (rFBG) in the rat. In particular, we usedLewis (LEW) and Brown–Norway (BN) rats, which are pow-erful models of human immunopathological disordersbecause they show an inverse polarization of their immune

responses and susceptibility to experimentally inducedimmunological disorders [20,21].

Materials and methods

Rats

Female LEW and BN rats (8–9 weeks old) were obtainedfrom the Centre d’Élevage R. Janvier (Le Genest St Isle,France) and maintained in our animal house facilityunder specific pathogen-free conditions. All procedures werein accordance with national regulations on animalexperiments.

In vitro

citrullination of rat fibrinogen

Rat FBG (rFBG) (purified from plasma and containing atleast 90% of clottable protein; Sigma, Saint Quentin Fallavier,France) was further purified to eliminate residual contami-nation by IgG using affinity chromatography on a protein-Gcolumn (HiTrap® protein G, 5 ml; Amersham Biosciences,Orsay, France) according to the manufacturer’s protocol.After that purification step, the percentage of IgG contami-nation was estimated as 0·1% or less. Citrullination was thenperformed with rabbit skeletal muscle PAD enzyme (PAD2,7 U/mg rFBG, Sigma) in 0·1 M Tris-HCl (pH 7·4), 0·5 MNaCl, 10 mM CaCl

2

and 5 mM DTT for 2 h at 37

°

C at anrFBG concentration of between 1·8 and 3·8 mg/ml (varyingfrom batch to batch). Citrullinated rFBG is designated as C-rFBG. Control non-citrullinated rat fibrinogen (NC-rFBG)was incubated in citrullination buffer alone. After citrullina-tion, buffer exchange to phosphate-buffered saline (PBS)pH 7·4 containing 0·5 M NaCl was performed in regeneratedcellulose dialysis tubing (Spectra/Por®3, 3500 MWCO; Spec-trum Laboratories, Inc., Interchim, Montluçon, France).Dialysis was pursued until complete reassembly of the sixconstitutive chains of the rFBG molecule (two A

α

-, two B

β

-and two

γ

-chains), monitored by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under non-reducing conditions. Efficient citrullination was checked byimmunoblotting using an antibody able to recognize any cit-rullinated protein (purified rabbit IgG to modified citrullylresidues, a generous gift from Dr T. Senshu, Graduate Schoolof Integrated Science, Yokohama City University, Yokohama,Japan), as described previously [6].

Inoculation of rats with autologous fibrinogen

Rats were injected subcutaneously on the back with 10

µ

g or50

µ

g of C-rFBG or NC-rFBG emulsified in completeFreund’s adjuvant (CFA) containing 1 mg/ml heat-killed

Mycobacterium tuberculosis

H37Ra (Difco Laboratories Inc.,Detroit, MI, USA). A second inoculation was performed4 weeks after the first, either intraperitoneally or intrader-mally with 50

µ

g of the same antigen emulsified in

- 136 -

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V. Duplan

et al.

504

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

,

145:

502–512

incomplete Freund’s adjuvant (IFA) (Difco Laboratories) oralum adjuvant (Sigma).

Induction of ankle joint inflammation and clinical evaluation

Female LEW rats were injected with 50

µ

l IFA into the rightankle joint. PBS (50

µ

l) was injected into the left ankle jointas control. The clinical severity of hind paw inflammationwas monitored using a macroscopic scoring system from 0 to3 according to changes in redness and swelling (0

=

nochanges; 1

=

detectable; 2

=

moderate; 3

=

severe redness andswelling of the entire paw).

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) detection of serum antibodies to C-rFBG, to NC-rFBG and to PAD

Rats inoculated with C-rFBG or NC-rFBG were bled fromthe retro-orbital sinus at regular intervals after the first inoc-ulation and sera were collected individually. For the detec-tion of Ig specific for C-rFBG, NC-rFBG or PAD enzyme inthese sera, microtitre plates (MaxiSorp; NUNC, VWRInternational, Fontenay-sous-Bois, France) were coatedovernight at 4

°

C with 5

µ

g/ml of PBS-diluted C-rFBG orNC-rFBG or rabbit skeletal muscle PAD, respectively. Theplates were then blocked with PBS containing 2% bovineserum albumin (BSA) (Sigma; PBS–BSA) and 100

µ

l/well ofrat serum diluted to 1 : 50 in PBS–BSA containing 2 M NaClwas added. Bound total IgG or IgM were detected using per-oxidase-conjugated in-house-produced polyclonal sheepantibodies to rat IgG (kindly provided by E. Druet, InstitutNational de la Santé et de la Recherche Médicale U28, Tou-louse, France) or polyclonal goat antibodies to rat IgM(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA), respectively. Todetect IgA, plates were incubated with a mouse monoclonalantibody (MoAb) to rat IgA (clone MARA-1) (LO/IMEX;University of Louvain, Brussels, Belgium) then with peroxi-dase-conjugated goat anti-mouse IgG (H

+

L) (Zymed Lab-oratories, San Francisco, CA, USA). Alternatively, boundIgG1, IgG2a or IgG2b were detected using biotinylatedmouse MoAb to rat IgG1 (clone MARG1-2), to rat IgG2a(clone MARG2a-1) or to rat IgG2b (clone MARG2b-3),respectively (LO/IMEX), followed by incubation with per-oxidase-conjugated streptavidin (Amersham, Little Chal-font, Bucks, UK). All incubations were performed for 1 h at4

°

C and followed by three washes in PBS containing 0·1%(v/v) Tween-20 (Sigma). Peroxidase activity was revealed by2 mg/ml orthophenylene diamine dihydrochloride, 0·03%H

2

O

2

in 35 mM trisodium citrate, 40 mM Na

2

HPO

4

at a pHadjusted to 5 with orthophosphoric acid. The reaction wasstopped by 6 N H

2

SO

4

and the OD at 492 nm was measuredwith an automated plate reader (VersAmax; MolecularDevices, Menlo Park, CA, USA).

In competition experiments, the ELISA IgG reactivity toC-rFBG of two representative sera of LEW rats inoculated

with C-rFBG (day 53) was assayed in the presence of PADenzyme. ELISA was performed exactly as mentioned above,except that the sera were tested at a dilution resulting in anOD of

1·0 on C-rFBG (1 : 150). PAD enzyme was added tothe serum dilution 1 h prior to the ELISA testing, at a 0·5, 1,2, 5 or 10

µ

g/ml final concentration. As control, one of thesera incubated with increasing concentrations of PADenzyme was also tested simultaneously by ELISA on PAD.The IgG reactivities obtained in the presence of soluble PADwere expressed as the percentage of those obtained withoutPAD (considered as 100%).

Immunoblotting

C-rFBG and NC-rFBG were separated by SDS-PAGE onover-migrated 12% polyacrylamide gels. Over-migrationwas monitored using pre-stained molecular weight stan-dards (low range, Bio-Rad Laboratories, SA, Marnes LaCoquette, France) and performed until the ovalbuminstandard reached the bottom of the gel. The gels werethen electrotransferred onto reinforced nitrocellulosemembranes (Hybond

C extra, Amersham) and mem-brane strips (

1·36

µ

g antigen/strip) were cut and immu-nodetected by several primary probes diluted in 40 mMTris-HCl buffer (pH 8·0) containing 150 mM NaCl, 0·05%Tween-20 and 2·5% powdered skimmed milk (blottingbuffer). The primary probes included the sera of ratsinoculated with C-rFBG or with NC-rFBG (all diluted to1 : 1000), a pool of ACPA-positive sera or individualACPA-positive sera from human patients with RA (alldiluted to 1 : 1000), a sheep anti-serum directed to theA

α

-chain of hFBG and cross-reactive to the A

α

-chain ofrFBG (1 : 250; Cambio, Cambridge, UK), a rabbit anti-serum directed to the B

β

-chain of hFBG and cross-reactive to the B

β

-chain of rFBG (1 : 100 000; Cambio), asheep anti-serum directed to the

γ

-chain of hFBG andcross-reactive to the

γ

-chain of rFBG (1 : 500; Cambio),an antibody reactive to rabbit PAD2 (1

µ

g/ml, purifiedrabbit Ig raised against peptides derived from thesequence of human PAD2 22 and the purified rabbit IgGto modified citrullyl residues. On the membrane stripsthat were probed with the latter antibodies (0·02

µ

g/ml),citrullyl residues were chemically modified previously, asdescribed elsewhere [6]. Peroxidase-conjugated secondaryprobes were used for the detection of all the primary anti-bodies: sheep polyclonal antibodies to rat IgG, protein-A(Sigma), goat antibodies to rabbit IgG (H

+

L) (Southern-Biotech, Inc., Clinisciences, Montrouge, France) and rab-bit F(ab

)2 fragments to sheep IgG (Southern Biotech.Inc.) for the detection of rat, human, rabbit and sheepIgG, respectively. Peroxidase activity was visualized usingECL

reagents (Amersham), as suggested by the manufac-turer. Negative controls included probing with the second-ary probe only.

- 137 -

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Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

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502–512

505

Histological analysis

Rat hind paws were collected immediately after killing byaorta sectioning under anaesthesia. After removal of the skin,ankles were fixed for 48 h in Bouin’s solution, then decalci-fied in 0·5 M disodium ethylene diamine tetraacetate, pH 7·4and embedded in paraffin. After sectioning (5-

µ

m), thespecimens were stained with haematoxylin and eosin.

Statistical analysis

Results are shown as the mean

±

s.d. and overall differencesbetween medians were evaluated by the Mann–Whitney

U

-test.

Results

Inoculation of LEW and BN rats with autologous citrullinated fibrinogen induces production of specific autoantibodies

To investigate the effect of citrullination on the immuno-genic property of autologous FBG, LEW and BN rats were

inoculated with 50

µ

g of C-rFBG or of NC-rFBG emulsifiedin CFA (at day 0) followed, 32 days later, by a second chal-lenge with 50

µ

g of antigen emulsified in IFA. The same anti-genic preparations were used in both rat strains. The sera ofthese animals were collected at different time-points andanalysed by ELISA for the presence of Ig directed to C-rFBGor to NC-rFBG (Fig. 1). The sera of rats inoculated with NC-rFBG did not recognize NC-rFBG or C-rFBG, even after thesecond inoculation of this antigen. In contrast, following asingle injection of C-rFBG, all rats developed an IgG, IgMand IgA autoimmune response directed mainly to the citrul-linated form of rFBG (Fig. 1a–c). Although the IgG responseto C-rFBG was higher in LEW than in BN rats, the time-course of this response was very similar in both rat strains.Maximal levels of IgG reactive with C-rFBG were obtainedaround day 30, i.e. before the second antigenic challenge.Surprisingly, the second immunization with C-rFBG did notinduce a secondary humoral immune response. Indeed, insera collected after the second inoculation (at days 42, 53 and67), IgG reactivity to C-rFBG was similar to that obtained atday 32, suggesting that the first challenge with antigen failed

Fig. 1.

Citrullination of autologous fibrinogen induces breakdown of tolerance to this autoantigen in Lewis (LEW) and Brown–Norway (BN) rats.

Rats were inoculated subcutaneously with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG) (white bars; LEW: five rats, BN: four rats) or non-C-rFBG (NC-rFBG)

(black bars; LEW: four rats, BN: five rats) in complete Freund’s adjuvant (CFA) (day 0). A second inoculation was performed intraperitoneally with

antigen emulsified in incomplete Freund’s adjuvant (IFA), 32 days after the first injection. The titres of total IgG (a), IgM (b) and IgA (c) reactive to

C-rFGB and NC-rFBG were measured by enzyme-linked immunosorbent assay at different times after the first inoculation as indicated. Results

(LEW rats: left panels, BN rats: right panels) are expressed as the mean OD at 492 nm obtained with the different rat sera diluted to 1 : 50 (

±

s.d.).

3

Reactivity to C-rFBG

LEW

IgG

(a)

OD

(49

2 nm

)

2

1

012 21 32 42 53 67

3

Reactivity to NC-rFBG

2

1

012 21 32 42 53 67

3

Reactivity to C-rFBG

BNO

D (

492

nm)

2

1

012 21 32 42 53 67

3

Reactivity to NC-rFBG

2

1

012 21 32 42 53 67

3

IgM

(b)

OD

(49

2 nm

)

2

1

012 21 32 42 53 67

ND ND ND ND

3

2

1

012 21 32 42 53 67

3

OD

(49

2 nm

)

2

1

012 21 32 42 53 67

3

2

1

012 21 32 42 53 67

3

OD

(49

2 nm

)

2

1

012 21 32 42 53 67

ND ND ND ND

3

2

1

012 21 32 42 53 67

3

OD

(49

2 nm

)

2

1

012 21 32 42 53 67

3

2

1

012 21 32 42 53 67

IgA

(c)

Days after first inoculation

- 138 -

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V. Duplan

et al.

506

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

,

145:

502–512

to induce the generation of memory immune cells. Interest-ingly, the IgM and IgA response followed the same courseand did not rise following the second antigenic challenge.Moreover, in another independently conducted experimentthere was no difference in the mean maximal IgG reactivityto C-rFBG between groups that were re-inoculated or notwith C-rFBG at day 32 (data not shown). In LEW rats severalprotocols of immunization were tested using different dosesof antigen at the first inoculation (10

µ

g or 50

µ

g) and dif-ferent adjuvants (IFA or Alum) or different sites of injection(intraperitoneally or intradermally) at the second inocula-tion. None of these conditions allowed the development of asecondary antibody response after re-inoculation with 50

µ

gof C-rFBG (data not shown).

The IgG reactivity to C-rFBG and to NC-rFBG was alsotested by immunoblotting using sera of LEW rats inoculatedwith C-rFBG or with NC-rFBG obtained from two indepen-dent experiments (Fig. 2). With the sera of rats inoculatedwith NC-rFBG, we did not find antibodies reactive with C-

rFBG or NC-rFBG. In contrast, the sera of rats inoculatedwith C-rFBG, exhibited reactivity with the citrullinatedforms of the A

α

- and of the B

β

-chain of rFBG. Similarly towhat is generally observed with ACPA-positive human RAsera [6], the rat sera tested exhibited no reactivity to the cit-rullinated form of the

γ

-chain. Using these immunoblottingconditions, no reactivity to NC-rFBG was detected. Overall,the results of this immunoblotting analysis are in accordancewith those of the ELISA analyses.

Because the C-rFBG preparation contained the rabbitskeletal muscle PAD enzyme that was used for citrullination(representing

1% of the total protein content), the IgGimmune response to this PAD was also evaluated by ELISA.In the sera of LEW rats inoculated with C-rFBG, IgG reactivewith PAD were clearly detected while, as expected, they wereabsent from the sera of rats inoculated with NC-rFBG(Fig. 3a). IgG reactivity to PAD enzyme was also detectableby immunoblotting (Fig. 2). Interestingly, the IgG responseto PAD increased rapidly after day 32 corresponding to the

Fig. 2.

The serum of Lewis (LEW) rats inocu-

lated with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG)

is strongly reactive to the A

α

- and B

β

-chains of

C-rFGB. LEW rats were inoculated with C-rFGB

or with non-C-rFBG (NC-rFGB). The serum of

these rats, obtained from two independent

experiments at around day 45 after inoculation,

was analysed by immunoblotting on NC-rFBG

(a) and on C-rFBG (b). The rabbit skeletal mus-

cle peptidylarginine deiminase (PAD) enzyme

present in the C-rFBG preparation was detected

using PAD2-specific antibodies (anti-PAD2). An

antibody able to recognize any citrullinated pro-

tein (anti-citrulline) was used to check efficient

citrullination of the three A

α

- B

β

- and

γ

-chains

constitutive of rFBG. These three constitutive

chains (and bands probably corresponding to

their degradation or polymerization products)

were identified using specific anti-sera (anti-A

α

,

anti-B

β

and anti-

γ

) and are shown with filled

diamonds, vertical bars and filled arrowheads,

respectively. Identification of the three A

α

- B

β

-

and

γ

-chains constitutive of C-rFBG was con-

firmed using a pool of anti-citrullinated protein

autoantibody (ACPA)-positive sera from human

rheumatoid arthritis (RA) patients reactive with

both the A

α

- and the B

β

-chain of

in vitro

citrul-

linated human fibrinogen (hFBG), and individ-

ual sera from three ACPA-positive RA patients

characterized previously as being differently

reactive to the A

α

-, B

β

- and

γ

-chains of citrulli-

nated hFBG [6]: a serum reactive only to the A

α

-

chain (A

α

+

B

β

-

γ

- RA serum), a serum reactive

only to B

β

-chain (A

α

-B

β

+

γ

- RA serum) and a

serum reactive to both the A

α

- and the

γ

-chain

(A

α

+

B

β

-

γ +

RA serum). Apparent molecular

masses (kDa) are indicated on the left.

g-chain

Aa-chainBb-chainAa-chaing-chainAa-chain

170

(a)

NC

-rF

BG

116

97

76

66

53

45

g-chain

PAD2

Aa-chain

Bb-chain

g-chain

170

(b)

C-r

FB

G

116

97

76

66

53

45

Ant

i-citr

ullin

e

Ant

i-PA

D2

Ant

i-Aa Serums of rats

inoculatedwith C-rFBG

Serums of ratsinoculated

with NC-rFBGAnt

i-Bb

Aa+

Bb-g-

RA

ser

um

Poo

l of R

A s

erum

s

Aa-

Bb+

g- R

A s

erum

Aa+

Bb-g+

RA

ser

um

Ant

i-g

- 139 -

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Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen

© 2006 British Society for Immunology,

Clinical and Experimental Immunology

, 145: 502–512 507

second inoculation of C-rFBG (Fig. 3a) showing that, in thiscase, the first inoculation led to the development of PAD-specific memory B cells. In order to assess the contributionof the reactivity to PAD in the OD obtained in the ELISA

using C-rFBG as immunosorbent, PAD enzyme was used asa competitor. Whereas the addition of PAD in sera of LEWrats inoculated with C-rFBG was able to strongly inhibit theIgG reactivity against PAD, it virtually did not affect the reac-tivity against C-rFBG (Fig. 3b).

On the whole, the results obtained demonstrate clearlythat inoculation of C-rFBG induces production of IgG anti-bodies directed mainly to citrullinated determinants ofrFBG, but that antigen-specific mechanisms regulate anti-body production.

In LEW and BN rats, autologous citrullinated fibrinogen induces production of different IgG subclasses

In the rat, IgG1 and IgG2a production are associated withtype 2 cytokines while IgG2b depends on type 1 immuneresponses [20,23,24]. Because LEW and BN rats differ mark-edly in the polarization of their autoimmune responses[20,21], we determined the isotype profile of the IgG reactivewith C-rFBG obtained in both strains after inoculation ofthis antigen. As shown in Fig. 4, at day 32 after the first chal-lenge with 50 µg of C-rFBG the titres of IgG1 and IgG2adirected to C-rFBG were similar in both strains, whereas thetitres of Ag-specific IgG2b were higher in LEW rats. Similarprofiles of IgG subclasses were obtained at different timesafter the second inoculation of C-rFBG (days 42, 53 and 67)(data not shown). These results demonstrate that C-rFBGinduces a different polarization of the immune response inLEW and BN rats: in LEW rats, both Th1- and Th2-typeimmune responses were generated, whereas in BN rats aTh2-type immune response was preferentially induced.

The autoimmune response to autologous citrullinated fibrinogen is not spontaneously arthritogenic

LEW (n = 28) and BN (n = 5) rats that had been inoculatedwith C-rFBG following our ‘standard’ immunization proto-col (50 µg of C-rFBG emulsified in CFA followed, 32 daysafter, by a second challenge with 50 µg of antigen emulsifiedin IFA) were examined daily for clinical signs of arthritis(redness and swelling of the paws). All these animals were stillfree of arthritis 3 months after the first sensitization with C-rFGB. Moreover, none of the other different immunization

Fig. 3. The peptidylarginine deiminase (PAD) included in the citrulli-

nated rat fibrinogen (C-rFBG) preparation induces primary and sec-

ondary IgG responses that do not significantly contribute to the OD

obtained by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using C-

rFBG as immunosorbent. Lewis (LEW) rats were inoculated subcutane-

ously with C-rFGB (grey diamonds; five rats) or non-C-rFBG (black

squares; four rats) in complete Freund’s adjuvant (CFA) (day 0). A

second inoculation was performed intraperitoneally with antigen emul-

sified in incomplete Freund’s adjuvant (IFA) 32 days after the first injec-

tion. The titres of IgG reactive to PAD enzyme were measured by ELISA

on days 12, 21, 32, 42, 53 and 67 after the first inoculation (a). Results

are expressed as OD at 492 nm of serum diluted to 1 : 50. The sera of

two LEW rats obtained at day 32 after inoculation of C-rFGB were also

tested in a competition assay using PAD enzyme as competitor (b). The

ELISA plates were coated with C-rFBG (also containing minute amounts

of PAD) (grey diamonds) or PAD enzyme (white triangles, only one

serum tested). Results are expressed as the percentage of the OD

obtained in the absence of competing PAD enzyme (considered as

100%).

3

IgG reactivity to PAD(a)O

D (

492

nm)

2

1

00 10 20 30 40 50

Days after first inoculation

60 70

(b)

0

40

80

120

0 2 4

PAD (mg/ml)

IgG reactivity to C-rFBG or PADin the presence of competing PAD

% B

indi

ng

6 8 10

Fig. 4. In Lewis (LEW) and Brown–Norway

(BN) rats, inoculation of citrullinated rat fibrin-

ogen (C-rFBG) induces production of different

IgG subclasses. LEW (white bars; five rats) and

BN (black bars; five rats) rats were inoculated

subcutaneously with C-rFGB at day 0. The titres

of IgG1 (a), IgG2a (b) and IgG2b (c) reactive to

C-rFGB were measured by enzyme-linked

immunosorbent assay on day 32 after the inocu-

lation. Results are expressed as the mean OD at

492 nm obtained with the different rat sera

diluted to 1 : 50 (± s.d.).

0

0·5OD

492

nm

1

2

(a) C-rFBG-reactiveIgG1

1·5

LEW BN0

0·5

1

2

(b) C-rFBG-reactiveIgG2a

1·5

LEW BN0

0·5

1

2

(c) C-rFBG-reactiveIgG2b

1·5

LEW BN

OD

492

nm

OD

492

nm

- 140 -

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V. Duplan et al.

508 © 2006 British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 145: 502–512

protocols that were tested in LEW rats (see above) inducedclinical signs of joint inflammation within the 2–3 monthsfollowing the first sensitization. We also looked for histolog-ical signs of inflammation by examination of haematoxylinand eosin-stained sections of the hind paw of four LEW andfour BN rats, 3 months after immunization with C-rFBG fol-lowing our standard protocol. This histological approachconfirmed that no signs of inflammation were induced inanimals immunized with C-rFBG. Together, these findingsshow that the autoimmune response to C-rFBG is not spon-taneously arthritogenic both in LEW and in BN rat strains.

The autoimmune response to autologous citrullinated fibrinogen is not able to aggravate acute arthritis

We then tested the capacity of the autoimmune response toC-rFBG to aggravate non-specifically induced joint inflam-mation. A previous study had shown that intra-articular

injection of mineral oils such as squalene (50 µl) or IFA(10 µl) in female DA rats induced moderate joint inflamma-tion by day 6, with oedema of synovial tissues containingmany polymorphs and monocytes/macrophages, followed byinduction of a severe arthritis, reaching a peak on day 21,with marked hyperplasia of the synovial tissue and recruit-ment of pathogenic T cells [25]. We tested the effect of intra-articular injection of IFA in female LEW rats. This rat strainwas chosen because, in comparison with the BN rats, LEWrats exhibited a higher IgG response when challenged with C-rFBG (Fig. 1). IFA (50 µl) was injected into the right anklejoint and, as control, PBS was injected into the left anklejoint. Intra-articular injection of IFA induced very transitoryacute inflammation: the first clinical signs, including rednessand swelling of the injected paw, occurred 1 day after injec-tion, with maximal severity at days 2–5, then progressiverecession and complete disappearance at around day 18(Fig. 5a). Animals were followed-up until 25 days after the

Fig. 5. Intra-articular injection of incomplete Freund’s adjuvant (IFA) in the ankle of Lewis (LEW) rats induces a very transitory acute inflammation.

Naive LEW rats (n = 7) were injected with 50 µl of IFA into the right ankle joint (day 0). As a control, phosphate-buffered saline (PBS) (50 µl) was

injected into the left ankle joint. The right and left hind paws of all animals were examined daily for clinical signs of inflammation. The results are

expressed in (a) as the mean daily clinical score (± s.d.) of the IFA-injected and of the PBS-injected ankles (white and black symbols, respectively) and

correspond to one representative out of two independent experiments. Three days after the intra-articular injections, the left (PBS) and right (IFA)

hind paws of the rats were photographed (b) and analysed histologically after haematoxylin and eosin staining of tissue sections (c, scale bars = 50 µm).

0

1

2

Mea

n cl

inic

al s

core

s 3

4

0 2 4 6 8Days after IFA injection

Time-course of arthritis in IFA-injected paws

10 12 14 16

(b)

(a)

PBS

IFA

(c)

PBS

IFA

- 141 -

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Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen

© 2006 British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 145: 502–512 509

intra-articular injection and no signs of joint inflammationrelapse were observed. The presence of severe inflammation(redness and swelling) at day 3 after IFA injection can be seenclearly in the right ankle photographs presented in Fig. 5b. Atthat time-point, histological analysis after haematoxylin andeosin staining indicated marked hyperplasia of the synovialtissue with thickening of the lining layer and dense infiltra-tion with polynuclear cells, macrophages and lymphocytes(Fig. 5c). In contrast, intra-articular injection of PBS inducedno clinical or histological signs of inflammation (Fig. 5).

Intra-articular injection of IFA was also performed in ratsinoculated previously with C-rFBG when the titre of autoan-tibodies had reached the maximal level (at day 38 after theinoculation). As controls, the intra-articular injection of IFAwas performed on age-matched naive rats or on age-matched rats inoculated previously with NC-rFBG. Thetime-course of inflammation was very similar between naiverats and age-matched rats inoculated previously with CFAonly (data not shown), indicating that previous exposure tothe mineral oil that enters into the composition of both theCFA and IFA emulsions has no effect on the kinetics of theinflammation it induces when injected into the ankle joint.The course of ankle inflammation in rats inoculated with C-rFBG was similar to that observed in control rats (Fig. 6).These data show that the transitory inflammation inducedby intra-articular injection of IFA in female LEW rats followsan identical course in the absence or presence of an immuneresponse to citrullinated fibrin.

Discussion

In the present study, we have shown that FBG can becomeimmunogenic upon citrullination, allowing the develop-ment of an IgG autoimmune response directed essentially tocitrullinated determinants. In comparison with the mousestudies already mentioned, it should be stressed that in therat, much lower amounts of autologous citrullinated FBG

were immunogenic as a single injection of 50 µg of antigeninduced a specific IgG reactivity detectable 12 days afterinoculation. This can be compared with four inoculations of50 µg of citrullinated mFBG in CFA that did not induce anysignificant antibody response in B10.S mice [15] and with50 µg per week during 10 weeks in the presence of adjuvant(CFA or LPS), necessary for efficient immunization of Balb/c mice [16]. Moreover, whereas the majority of the autoan-tibodies cross-reactive with mFBG obtained after immuni-zation of mice with hFBG are IgG1 [26], a Th2-dependentIgG subclass that cannot activate the classical pathway ofcomplement [27,28], in both LEW and BN rats, both com-plement- and FcγR-fixing C-rFBG-reactive IgG were gener-ated, holding the prospect of multiple potentially pathogeniceffector mechanisms. This is similar to what is observedin human RA where ACPA are mainly IgG1 [29], i.e. canboth activate FcγR- and classical complement-dependentpathways.

Another recent study showed that, in rats, citrullination ofan abundant circulating autologous protein, albumin, madeit able to elicit an IgG antibody response upon inoculationwith IFA whereas the native form was not immunogenic[30]. The ability of FBG or albumin to break tolerancedepending on whether it is or is not citrullinated is probablyrelated to differences in the degree of exposure of theimmune system to these two molecular forms. The nativeforms are very abundant (in mammals the blood FBG andalbumin concentration is in the range of g/l and of 101 g/l,respectively) and the very important physiological functionsthey fulfil call for immunological tolerance. On the otherhand, in the case of albumin the conditions necessary forgenerating the citrullinated forms of these proteins are eithertotally unknown (its in vivo occurrence actually remains tobe established), or in the case of fibrin are thought to be asso-ciated with tissue inflammation [31,32]. This suggests amuch lower pressure for tolerance of the citrullinated formsof these autoantigens.

Fig. 6. In Lewis (LEW) rats, pre-immunization with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG) does not aggravate the arthritis induced by intra-articular

injection of incomplete Freund’s adjuvant (IFA). Age-matched naive LEW rats (grey symbols or bars; 12 rats) and LEW rats inoculated with C-rFGB

(white symbols or bars; 14 rats) or with non-C-rFBG (black symbols or bars; 12 rats) were injected with IFA into the ankle joint 38 days after the first

antigen inoculation, and examined daily for clinical signs of inflammation. The results are expressed as the mean daily clinical score of the right hind

paw in each experimental group (a), and as the mean cumulative clinical score ± s.d. (calculated as the sum of the daily clinical scores from day 1

to day 13) in each experimental group (b). Results represent the pooled data of three independent experiments.

0

1

2

3

(a) (b)

Mea

n cl

inic

al s

core

s

Mea

n cu

mul

ativ

ecl

inic

al s

core

s

0 2 4 6 8 10

Days after IFA injection

Time-course of arthritis inIFA-injected paws

Cumulative arthritis scores inIFA-injected paws

12 14 1605

101520253035

Groups

- 142 -

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V. Duplan et al.

510 © 2006 British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 145: 502–512

Even though we were able to readily induce an autoim-mune response to C-rFBG, we could not find a way to elicita secondary immune response to it. This probably arisesfrom the existence of mechanisms able to exert strong neg-ative control on the developing immune response. Theestablishment of such mechanisms could be related to theconcomitant development of a response to NC-rFBG, asindicated by the presence of a low reactivity to this antigen inthe sera of LEW rats inoculated with C-rFBG. It was indeedshown that memory cells able to mount a strong secondaryresponse do not persist in mice, where the immune responseelicited with hFBG is the most strongly cross-reactive withautologous FBG [26]. This was shown to be due to anunknown antigen-specific regulation process, apparently notrelated to exhaustion of autoimmune reactive T cells or tothe presence of antigen-specific regulatory T cells [26]. Inour study, the absence of a secondary response following thesecond antigenic challenge concerned only C-rFBG and notthe PAD present in the antigen preparation. This also pointsto the existence of antigen-specific down-modulation mech-anisms. Alternatively, it could be that a secondary B cellresponse to C-rFBG cannot be generated because of the lackof appropriate cognate T cell help, even though the genera-tion of IgG and IgA reactive to C-rFBG following the firstimmunization is highly suggestive of specific T cell helpavailable at least in the primary response.

Concerning the arthritogenic character of C-rFBG, thestudy we performed in the rat agrees with the mouse studiesin finding that the autoimmune response to native or citrul-linated autologous FBG cannot induce joint inflammationspontaneously. Fibrin deposition in the synovial tissue is sec-ondary to the inflammation. Citrullination of fibrin depositsin the tissue also occurs as a consequence of the synovitis[31,32]. We proposed recently that ACPA play an importantrole in the chronic character of human rheumatoid synovitisarguing that, in the synovial tissue, the immunological con-flict between ACPA and citrullinated fibrin is self-fuelling, asthe inflammation it induces leads to the formation of newfibrin deposits that will become citrullinated secondarily bya locally expressed PAD enzyme [32]. Following this hypoth-esis, one can speculate that the lack of arthritogenicity of theautoimmune response to C-rFBG is related to the absence ofits antigenic target, citrullinated fibrin, in the synovial tissueof the immunized rats. We tested whether the presence of anautoimmune response to citrullinated fibrin would aggra-vate joint inflammation induced by intra-articular injectionof IFA. Injection of 50 µl of IFA into the ankle joints offemale LEW rats, however, induced arthritis that followed anidentical course in the presence or absence of autoantibodiesto C-rFBG. However, immunochemical analysis of proteinextracts of the synovial tissue of IFA-injected ankle jointsobtained at the time of maximal arthritis severity (3 daysafter the intra-articular injection) actually showed the pres-ence of small amounts of fibrin but not of its citrullinatedform (data not shown). This observation is probably related

to the short duration of the arthritis we induced, briefer thanthat obtained by intra-articular injection of 5-times loweramounts of IFA into the ankle joint of female Dark Agouti(DA) rats [25]. Indeed, it was shown that the presence of cit-rullinated proteins in the joints of DA rats with arthritisinduced by autologous collagen type II (CII) is correlatedwith the degree of joint inflammation, appearing only atleast 7 days after the onset of clinical and histological signs ofarthritis and still rising 24 days after and paralleling theincrease in arthritis severity [30]. On the other hand, in ourarthritis model 7 days after onset, the arthritis is alreadymarkedly waning and, 24 days later, it has disappearedcompletely.

Interestingly, in the rat strain LEW.1AV1 it was shown thatthe arthritis induced by autologous citrullinated CII had anearlier onset and a higher incidence than that induced by thenon-citrullinated form of this antigen [30]. Moreover, it wasshown very recently that mice with CIA develop IgG anti-bodies specific for the citrullinated forms of proteins andpeptides (notably the citrullinated form of the β-chain ofhFBG), appearing early after immunization with bovine CII,even before joint swelling is observed [33]. This is in drasticcontrast with previous reports on the absence of such citrul-line-specific antibodies in the same strain of mice with CIAand could be related to subtle differences in the immuniza-tion protocols [31,34]. Moreover and importantly, althoughthe biochemical nature of the autoantigen(s) that these anti-bodies recognize in arthritic mice is still elusive, their arthri-togenic role was demonstrated clearly. First, mice tolerizedwith a citrulline-containing peptide fail to develop theseautoantibodies upon challenge with CII and demonstratereduced severity and incidence in their CIA. Secondly,murine MoAbs reactive with citrullinated hFBG derivedfrom mice with CIA enhance arthritis when co-administeredwith a submaximal dose of a pool of anti-CII antibodies[33]. However, it remains to be evaluated whether the coursetaken by arthritis presenting abundant citrullinated fibrindeposits is influenced by previous immunization with autol-ogous C-FBG. For instance, if DA rats can develop anautoimmune response to C-rFBG, it would be interesting touse this strain to evaluate the influence of this response onthe arthritis induced by intrarticular injection of IFAbecause, as mentioned, in comparison with the LEW ratstrain, DA rats develop an arthritis that lasts longer [25] andis therefore associated more probably with formation of cit-rullinated fibrin deposits. Evaluation of the effect of previoussensitization with C-rFBG on collagen-induced arthritis(CIA) can also be proposed. Indeed, although it has not beendemonstrated formally, it is highly probable that at least partof the extracellular citrullinated proteins present in the jointsof DA rats with arthritis induced with autologous CII corre-spond to citrullinated fibrin [30]. Moreover, the presence ofcitrullinated fibrin-related proteins in the arthritic joints ofmice with CIA or streptococcal cell-wall-induced arthritishas been demonstrated clearly [31].

- 143 -

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Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen

© 2006 British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology, 145: 502–512 511

In conclusion, our study has shown for the first time in therat that an autoimmune response to autologous fibrinogencan be induced by specific immunization with its citrulli-nated form but that this response is neither spontaneouslyarthritogenic nor able to aggravate arthritis that is not asso-ciated with the formation of citrullinated fibrin deposits.However, the pathogenic role of an induced autoimmuneresponse to citrullinated fibrin in animal models with citrul-linated fibrin deposits remains to be established formally.This would strongly support the hypothesis of the role ofACPA in the maintenance of human rheumatoid synovitis.Moreover, such models should prove very useful not only fordissection of the pathophysiological pathways involved butalso for the assessment and validation of new therapeuticapproaches for human RA.

Acknowledgements

This study was supported by grants from the Toulouse IIIUniversity, the CNRS, the INSERM and the ‘Associationpour la Recherche sur la Polyarthrite’. The technical assis-tance of Ms R. Llobera is gratefully acknowledged. We alsothank M. Calize, P. Aregui and A. Boyer (Service de zootech-nie, IFR-30, Toulouse) for taking care of the animal houseand Dr T. Al Saati and Ms F. Capilla (Plateau technique d’his-topathologie expérimentale, IFR-30) for their assistance inhistological analyses.

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Résultats expérimentaux

- 147 -

Publication N°3 :

Peptidylarginine deiminase 2 and 4 but not 1, 3 and 6 are expressed in the rheumatoid

arthritis synovium in close relation with tissue inflammation.

Arthritis and Rheumatism (Sous presse).

Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Al Badine R, Méchin M-C, Vincent C,

Nachat R, Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G.

Le but de ce travail a été d’identifier les isotypes de PAD exprimés dans le tissu synovial

des patients atteints de PR, et responsable de la citrullination de la fibrine, auto-antigène-

cible majeur des ACPA.

L’expression de tous les isotypes de PAD, incluant l’isotype PAD6 récemment décrit,

a été explorée par RT-PCR et immunotransfert, d’une part dans des leucocytes

mononucléés du sang périphérique de donneurs sains et d’autre part, dans le tissu

synovial de 16 patients atteints de PR et de 11 patients contrôles atteints d’autres maladies

rhumatologiques inflammatoires (4), ou d’arthrose (7). Dans le synovium rhumatoïde, les

PAD ont été également localisées par immunohistochimie.

Dans les lymphocytes et les monocytes ainsi que dans les tissus synoviaux

rhumatoïdes, les gènes PADI2, 4 et 6 sont transcrits, mais seules les enzymes PAD2 et

PAD4 sont détectables. La PAD2 est aussi exprimée dans le tissu synovial de tous les

patients témoins alors que l’expression de PAD4 est restreinte au tissu synovial des patients

arthritiques. Chez les patients atteints de PR, les niveaux d’expression de PAD2 et de PAD4

se sont avérés être corrélés à l’intensité de l’inflammation (infiltration cellulaire,

hypervascularisation et hyperplasie de l’intima synoviale). Les analyses histologiques ont

montré la présence des deux enzymes à l'intérieur ou au voisinage proche de dépôts de

fibrine citrullinée. Elles sont également présentes dans des cellules infiltrant l’intima

synovial et, concernant essentiellement la PAD4, dans des synoviocytes de la bordure.

Les PAD2 et PAD4 sont donc les seuls isotypes de PAD exprimés dans le tissu

synovial des patients atteints de PR ou d’autres types d’arthrites. Les cellules inflammatoires

constituent vraisemblablement une source majeure de ces enzymes, la PAD4 étant de

surcroît produite par les synoviocytes hyperplasiques. Ces deux PAD sont probablement

responsables de la genèse des cibles des ACPA dans le synovium rhumatoïde.

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Peptidylarginine deiminase 2 and 4 but not 1, 3 and 6 are expressed in the rheumatoid arthritis synovium in close relation with tissue inflammation

Subtitle:

PAD2 and 4 and not PAD1, 3 and 6 are expressed in the RA synovium

Foulquier Céline1, Sebbag Mireille1, Clavel Cyril1, Chapuy-Regaud Sabine1, Al Badine

Roula1, Méchin Marie-Claire1, Vincent Christian2, Nachat Rachida1, Yamada Michiyuki3,

Takahara Hidenari4, Simon Michel1, Guerrin Marina1, Serre Guy1.

1Laboratory of "Epidermis Differentiation and Rheumatoid Autoimmunity"; Unité Mixte de

Recherche 5165, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Université Paul

Sabatier Toulouse III, Institut Fédératif de Recherche (IFR) 30 (CNRS-Institut National de la

Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)- Université Toulouse III -Centre Hospitalier

Universitaire (CHU) de Toulouse), Toulouse, France.

2Laboratory of Cell Biology and Cytology, Institut Fédératif de Biologie, Hôpital Purpan,

CHU de Toulouse, IFR30, Toulouse, France.

3International Graduate School of Arts and Sciences, Yokohama City University, Yokohama,

Japan.

4Department of Applied Biological Resource Sciences, School of Agriculture, Ibaraki

University, Ibaraki, Japan.

corresponding author : Guy Serre, Unité "Différenciation Épidermique et Auto-immunité

Rhumatoïde"; UMR 5165 CNRS-Université Paul Sabatier, Hôpital Purpan, Place du Dr

Baylac, 31059 Toulouse Cedex 9, France. Phone (33) 5 61 15 84 00; Fax (33) 5 61 49 90 36;

E-mail: [email protected]

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Abstract

Objectives

Autoantibodies to citrullinated proteins (ACPA) are specific for rheumatoid arthritis (RA) and

probably involved in its pathophysiology. Citrullyl residues, posttranslationally generated by

a peptidylarginine deiminase (PAD), are indispensable components of the ACPA-targeted

epitopes. We undertook to identify which PAD isotypes are expressed in the synovial tissue

(ST) of RA patients and involved in the citrullination of fibrin, the major synovial target of

ACPA.

Methods

Expression of all PAD isotypes, including the recently described PAD6, was explored by RT-

PCR and immunoblotting, first in blood-derived mononuclear leukocytes from healthy

donors, then in ST samples from 16 RA patients and 11 control patients with other arthritides

(4) and osteoarthritis (OA, 7). In RA ST samples, PADs were localized by

immunohistochemistry.

Results

In lymphocytic and monocytic cells and, similarly, in RA ST samples, the PADI2, 4 and 6

genes are transcribed, but only PAD2 and PAD4 enzymes are detected. PAD2 is also

expressed in the ST of control patients including OA patients, while PAD4 is preferentially

expressed in the tissue of patients with arthritides. In RA, the expression levels of PAD2 and

PAD4 are correlated with the intensity of inflammation (cell infiltration, hypervascularization

and synovial lining hyperplasia), and both enzymes are demonstrable within or in the vicinity

of citrullinated fibrin deposits.

Conclusion

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PAD2 and PAD4 are the only PAD isotypes expressed in the ST of RA and other arthritides.

Inflammatory cells are a major source but PAD4 also comes from hyperplastic synoviocytes.

Both isotypes are probably involved in the citrullination of fibrin.

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Introduction

Chronic inflammation of synovial joints with frequent extra-articular manifestations is an

essential characteristic of rheumatoid arthritis (RA), the most frequent human autoimmune

disease. Presence of autoantibodies to “citrullinated” (deiminated) proteins (anti-citrullinated

protein antibodies/ACPA) in the serum of patients also constitutes a major disease feature.

The autoantibodies very probably play a significant role in the disease pathophysiology.

Indeed, ACPA are largely the most disease-specific of the RA-associated autoantibodies.

They are detectable in the serum years before the onset of arthritis symptoms and a significant

positive correlation exists between their serum titer and clinical, biological and radiological

data related to RA activity and/or severity (reviewed in 1). In addition, ACPA are produced

by plasma cells of the rheumatoid synovial tissue (ST) and therein not only concentrate (2)

but also probably interact with citrullinated proteins among which citrullinated fibrin

constitutes their major target (3).

Even if not sufficient, citrullyl residues are essential in the formation of the ACPA epitopes

on the target antigens (4-6). They result from the posttranslational transformation of the

positively charged guanidino group of arginyl residues into the uncharged ureido group of

citrullyl residues. A Ca2+-dependent enzyme activity, designated peptidylarginine deiminase

(PAD, protein-arginine deiminase, protein-L-arginine iminohydrolase, EC 3.5.3.15), catalyzes

such conversion. Five PAD isotypes (PAD1, 2, 3, 4, and 6), encoded by five paralogous genes

(PADI1-4 and PADI6, respectively) clustered on chromosome 1p35-36, have been described

in humans (7). Their cellular expression pattern has not yet been extensively explored,

particularly at the protein level. PAD1 has been detected in the epidermis, in hair follicles, in

arrector pili muscles and in sweat glands (8-10). PAD2 has been widely detected, notably in

brain astrocytes (11, 12), sweat glands (9, 13), arrector pili muscles (9), macrophages (14),

and epidermis (8, 15). To date PAD3 expression has only been reported in the upper layers of

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epidermis and in hair follicles (8-10, 16). PAD4, expression has so far only been described in

hematopoietic cells (14, 17-19). It distinguishes from other PAD isotypes by its capacity to

undergo nuclear translocation (20). No data are available concerning expression of PAD6 in

human tissues but the PADI6 mRNA is present mainly in ovary, testis and PBLs (7).

Protein “citrullination” (deimination) leads to alterations in intra- and intermolecular

interactions of the protein targets (21). It is implicated in terminal differentiation of epidermis

(22) and in brain development (23). Nuclear PAD4 could regulate gene expression via

chromatin remodeling (24, 25). Diseases where citrullination has been shown or suggested to

play a role include not only RA but also multiple sclerosis, as well as psoriasis, Alzheimer

disease, primary open-angle glaucoma or obstructive nephropathy (26).

One or several PAD(s) are necessarily responsible for the generation of the ACPA-targeted

epitopes in the rheumatoid ST but therein, the presence of the 5 PAD isotypes, including the

last described PAD6, has not yet been systematically explored. In the present study, we

determined which of the 5 PADs are expressed in the rheumatoid ST both at the mRNA and

protein levels. After assessing their expression in human blood-derived mononuclear

leukocytes, PADs were investigated in the ST of a large series of RA patients, compared to

patients with other arthritides and osteoarthritis. Moreover, both parameters being evaluated

by semi-quantitative methods, correlations could be sought between the levels of PAD

expression and the intensity of ST inflammation appreciated histologically. Finally, to identify

the PAD(s) most likely involved in the generation of citrullinated fibrin,

immunohistochemical analyses of RA ST samples were performed to analyze whether this

major ACPA target is co-located with the ST-expressed PADs.

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Materials and Methods

Patients and serum samples

ST samples were consecutively obtained from 27 patients undergoing surgery of the hand,

wrist, elbow or knee in the Department of Orthopedic and Traumatic Surgery of the Purpan

Hospital of Toulouse. Rheumatologists established the clinical diagnoses according to

international disease classification criteria (27-29). Sixteen patients were diagnosed as having

RA (patients RA1 to RA16, 12 women, 4 men, age range 36-87 years, median 56.5). The

other 11 patients (control patients, 7 women, 4 men, age range 21-80 years, median 56)

included 4 patients with non-RA arthritides ― 2 ankylosing spondylitis (AS1 and AS2), 1

undifferentiated spondylarthropathy (USpA1) and 1 psoriatic arthritis (PsA1) ― and 7

patients with osteoarthritis (OA1 to OA7). The presence or absence of ACPA in

contemporaneous serum samples was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) on in vitro citrullinated human fibrinogen (30). All control patients were ACPA-

negative and 9 of the 16 RA patients were ACPA-positive.

Synovial tissue

Each ST sample was wrapped in a gauze compress soaked in normal saline and kept at 4°C

until dissection into identical sets of fragments representing all its different macroscopic

aspects. Sets destined for protein or RNA extraction were snap-frozen in liquid nitrogen. Sets

destined for histological analyses were fixed overnight in a Bouin’s solution and successively

dehydrated for 24 h in 7.5, 15, and 30% sucrose solutions. All sets were stored at -80°C until

further processing.

Preparation of different blood-derived cell populations

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Different subpopulations of blood-derived cells were enriched from buffy coats of healthy

adult donors (Établissement Français du Sang Pyrénées-Méditerranée, Toulouse, France).

Buffy coats were diluted to ½ in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.6% sodium

citrate and 0.1% bovine serum albumin and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were

isolated by centrifugation over ficoll (Biocoll, 1,077 g/ml, Biochrom AG, Berlin, Germany).

A portion of the PBMC fraction was further fractionated using magnetic beads coated with

anti-CD14 antibodies (CD14 MicroBeads, Miltenyi Biotec, Paris, France) according to the

manufacturer’s instructions. The CD14-negative (CD14-) and the CD14+ mononuclear cells

corresponded to the lymphocyte-enriched fraction and to purified monocytes, respectively. A

portion of the monocytes was allowed to differentiate into macrophages by 7 day-culture in

perfluoroalkoxy polymer culture inserts (VWR international, Fontenay sous Bois, France)

containing a medium designed for macrophages (macrophage-SFM, Invitrogen, Cergy

Pontoise, France) supplemented with 10% fetal calf serum ( Biowest, Nuaillé, France) and

100 ng/ml M-CSF (Peprotech, Levallois-Perret, France). Macrophages were either harvested

directly or after a 24h-activation with 0.5 µg/ml lipopolysaccharide (LPS) (from E. coli,

Sigma-Aldrich Chimie, St Quentin Fallavier, France). All cell samples were washed 3 times

in PBS and stored as pellets at -80°C until further processing.

Analysis of PADI mRNA expression

The RNeasy mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) was used for total RNA preparation from

ST or blood-derived cells, according to the manufacturer’s instructions. For standard RT-PCR

analysis, cDNAs were synthesized using 1 μg of RNA and a reverse transcription kit with

oligo-dT primers and random hexamers (ImProm-II Reverse Transcription System, Promega,

Charbonnières-Les-Bains, France) according to the manufacturer's instructions. PCR reactions

were performed in 15 μl using 0.75 U of Taq DNA polymerase (Qbiogene, MP Biomedicals,

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Illkirch, France), 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM of each dNTP, 5 pmol of each primer and 1μl of

cDNA (equivalent to 50 ng of RNA). The PCR conditions were as follows: 94°C for 3 min

followed by 37 cycles at 94°C for 30 sec, either 58°C (PADI1-4) or 62°C (PADI6) for 30 sec,

and 72°C for 20 sec. PCR amplification of the cDNA of glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (G3PDH) or hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)

genes was performed as control. Positive control reactions also included amplification of

human epidermis cDNA (31) using primers specific for PADI1 and 3, of all-trans retinoic

acid-treated HL-60 cells cDNA (8) using primers specific for PADI2 and 4, and of human

testis cDNA (BD Bioscience, Erembodegem, Belgium) using primers specific for PADI6.

For real-time RT-PCR analysis, total RNA from blood-derived cells was treated with

deoxyribonuclease I (DNase I, Amplification Grade, Invitrogen) before cDNAs were

synthesized as described above. Amplification assays were performed and analyzed with the

7300 Real-Time PCR System and corresponding software (Applied Biosystems, Foster City,

CA). PCR reactions were carried out using the Power SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems) with 250 nM of each primer and cDNA templates corresponding to 20

ng of RNA. Positive control reactions included amplification of human skin cDNA using

primers specific for PADI1 and 3. The fluorescence was quantified as Ct (cycle threshold)

values. Samples were analyzed in triplicate and Ct values exhibiting differences lower than

0.3 cycles were averaged. The relative amount of each PADI gene was normalized to HPRT1

by using the comparative Ct method (ΔCt). Negative control wells (corresponding to PCR

without template) emitted no significant fluorescence after 40 cycles.

PADI amplification primers were designed after checking for the absence of similarity to any

of the other PADI sequence using blast analysis. Positions in the cDNA sequence according to

the indicated Genbank accession number were as follows (when two primer pairs are

mentioned, the first corresponds to standard PCR and the second to real-time PCR): PADI1

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(AB033768), nucleotides (nt) 1644-1663 and 1858-1877 and nt 1768-1788 and 1977-1998;

PADI2 (AB030176), nt 1807-1826 and 1984-2003 and nt 1619-1642 and 1759-1783; PADI3

(AB026831), nt 1754-1773 and 1943-1962 and nt 1601-1625 and 1797-1821; PADI4

(AB017919), nt 1780-1799 and 1926-1945; PADI6 (AY422079), nt 1683-1707 and 1813-

1834.

Protein extraction

ST was homogenized with an Ultra-Turrax homogenizer (T25 basic, IKA Labortechnik,

Staufen, Germany) in an ice-cold lysis solution consisting of a 60 mM Tris-HCl buffer (pH

7.4) containing 150 mM NaCl, 40 mM EDTA, 0.02% sodium azide, 1 mM

phenylmethanesulfonyl fluoride, 10 mM N-ethylmaleimide, 1 mM 4-(2-

aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride, 1.2 µM aprotinin, 25 µM leupeptin, 18 µM pepstatin-A,

15 µM E-64 and 40 µM bestatin (all from Sigma-Aldrich). Pellets of blood-derived cells were

placed in the lysis solution supplemented with 0.5% (v/v) Nonidet-P40 (Sigma-Aldrich) and

sonicated on ice at 8-10 W (3 times for 15 seconds). ST and cell lysates were then centrifuged

for 15 min at 15,000 g and 4°C and the supernatants (low-salt extracts) were collected and

stored at -80°C until analysis.

Anti-PAD antibodies

Already described and validated isotype-specific rabbit anti-peptide antibodies directed

against human PAD1-4 (purified anti-peptide antibodies) were used (8, 31). An antiserum to

human PAD6 was elicited in rabbits by injection of 3 synthetic peptides conjugated to

keyhole-limpet hemocyanin via a natural or added N-terminal cysteine residue. These

peptides were chosen in the most isotype-specific regions of the predicted amino acid

sequence of human PAD6 observed after multi-alignment of all human, mouse and rat PAD

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sequences: peptide A6, (C)IYRNGQVEMSSDKQA (amino acids 130-144), peptide B6,

(C)VEESQDPSIPETVLY (amino acids 280-294) and peptide C6, CLEKLTNIPSDQQPKRS

(amino acids 591-607). Anti-peptide antibody titers were determined by ELISA (CovalAb,

Lyon, France). The antiserum was then affinity-purified on an equimolar mixture of the

reactive peptides (peptides A6 and B6), coupled to an agarose-activated affinity column

(SulfolinkTM kit), essentially as described by the manufacturer (Pierce, Perbio Science,

Brebières, France). The sensitivities of detection of all the anti-PAD antibodies were roughly

equalized by immunoblotting titration against equimolar amounts of each PAD isotype,

corresponding to PAD2 purified from rabbit skeletal muscle (Sigma-Aldrich), recombinant

human PAD1, 3, 4, produced as described (10, 16, 17), and recombinant PAD6 (see below).

Production of recombinant human PAD6

The entire coding sequence of human PADI6 previously cloned into the pCRII-TOPO

plasmid (Invitrogen) (7), was subcloned into the same vector in carboxy-terminal fusion with

a hexahistidine-tag. The plasmid insert was verified by sequencing. Expression of

recombinant PAD6 was induced by isopropyl β-D-thio-galacto-pyranoside (Sigma-Aldrich)

treatment of The E. coli TOP10 F' transformants (Invitrogen). After cell lysis with 0.1 mg/ml

lysosyme (Sigma-Aldrich) in phosphate buffer, PAD6 was purified from the bacterial extract

by chromatography on a HiTrap Chelating/Ni2+ column (GE Healthcare, Orsay, France), as

suggested by the manufacturer. The PAD6-containing fractions were pooled, precipitated in

ice-cold absolute ethanol and then redissolved in SDS-PAGE sample buffer.

Immunoblotting detection of PAD

Equal amounts (~ 50 µg) of total proteins from the ST or cell extracts (as adjusted by

Bradford total protein assay and successive visual examinations of Coomassie blue-stained

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gels) were separated by SDS-PAGE on 7.5% polyacrylamide gels and then electrotransferred

onto reinforced nitrocellulose membranes (Hybond-C extra, GE Healthcare). After blocking

in 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 and 2.5%

powdered skimmed milk (blotting buffer), the membranes were probed overnight at 4°C with

the antibodies to PAD1, 2, 3, 4 and 6 diluted in blotting buffer at 2.7 µg/ml, 0.9 µg/ml, 2.5

µg/ml, 1.1 µg/ml and 5 µg/ml, respectively. Bound rabbit antibodies were detected with a

peroxidase-conjugated goat antiserum to rabbit IgG (H+L) (SouthernBiotech, Birmingham,

Alabama) diluted to 1/10,000 in blotting buffer. Peroxidase activity was visualized using ECL

western blotting reagents (GE Healthcare). Negative controls consisted in probing with the

secondary antibody only. Rabbit skeletal muscle PAD2 and recombinant human PAD1, 3, 4

and 6 were used as positive controls. In addition, protein extracts of human epidermis (8),

HL-60 cells (17), and human adult ovary (Biochain, Hayward, California) were used as

sources of tissular PAD1-3, PAD4 and PAD6, respectively. The intensity of immunodetection

of the various PADs in the ST samples was separately evaluated by summing the scores given

by two readers on a scale ranging from 0 to 3 (0.25 steps).

Histology and immunohistochemistry

Bouin’s-fixed and dehydrated ST samples were embedded in OCT compound (Tissue-Tek II;

Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) and serial 4-µm cryosections were generated. To

evaluate ST inflammation, histological parameters were scored by a pathologist unaware of

the diagnosis and clinical data, as previously described (32), after staining with hematoxylin

and eosin (H&E). Briefly, the mean lining thickness was evaluated by counting the number of

synovial cell layers in six randomly selected regions and semi-quantitatively scoring the mean

(0:1-2; 1:3-4; 2:5-6; 3:≥7 cell layers). Similarly, infiltration of the sublining layer with

inflammatory cells was evaluated by scoring the global number of lymphocytes, plasma cells,

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monocytes-macrophages and polymorphonuclears, and vascularity by scoring the number of

blood vessels. Both infiltration and vascularity were semi-quantitatively scored from 0

(representing the lowest level) to 4 (representing the highest level). In immunohistochemical

analyses, PAD2 and 4 were detected using their corresponding antibody probe at 3 µg/ml,

fibrin was probed with a rabbit antiserum to the β-chain of human fibrin(ogen) (1:4000;

Cambio), CD68 was stained using the PG-M1 mouse monoclonal antibody (1:200,

DakoCytomation, Trappes, France) and citrullinated proteins were probed using rabbit IgG to

modified citrullyl residues (a generous gift of T. Senshu, Yokohama City University,

Yokohama, Japan) used at 1.6 µg/ml after in situ modification of citrullyl residues, as

previously described (3). In simple immunostainings, bound rabbit antibodies were detected

using a peroxidase-labeled polymer conjugated to goat anti-rabbit Ig (EnVision+ Dual Link

System, DakoCytomation) followed by incubation with 3-amino-9-ethylcarbazole and

haematoxylin counterstaining. In double immunostainings, bound anti-PAD antibodies were

first detected, using anti-rabbit Ig conjugated to a peroxidase micropolymer (ImmPRESS kit,

Vector laboratories, CliniSciences, Montrouge, France) followed by incubation with 3,3'-

diaminobenzidine, then sections were probed with PG-M1 which was visualized using

biotinylated goat anti-mouse Ig (DakoCytomation) followed by a mixture of avidin and

biotinylated alkaline phosphatase (both from a Vectastain ABC-AP kit, Vector laboratories)

and incubation with a blue chromogen (Vector blue, Vector laboratories). In all staining

conditions, a normal rabbit antiserum was used as negative control and only specific staining

was taken into account.

Statistical analyses

Data analyses were performed using STATISTICA for Windows (Statsoft, Tulsa, OK). The

Wilcoxon matched pairs test was used to compare PAD2 and PAD4 levels in the different

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patient groups. Differences in the median scores obtained for PAD expression and for the

evaluation of ST inflammation in the different patient groups were tested with the Mann-

Whitney U test. Correlations were sought by computing Spearman rank correlation

coefficients. P values ≤ 0.05 were considered significant.

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Results

Expression of PAD in mononuclear leukocytes

We set to explore the expression of PAD6 in blood-derived mononuclear leukocytes in

comparison with the other PAD isotypes. PBMCs were isolated from the blood of healthy

donors and separated into a purified monocyte fraction and a lymphocyte-enriched fraction.

Macrophages were obtained from monocytes and activated macrophages were generated by

stimulation with LPS. The data presented in Figure 1 are representative of the results obtained

with mononuclear leukocytes from 3 healthy donors. Expression of each PAD was analyzed

at the mRNA level using isotype-specific primers, first by standard RT-PCR (Figure 1A).

PADI1 and PADI3 mRNAs could not be detected in any of the cell types and culture

conditions tested. On the contrary, PADI4 and PADI6 mRNAs were present in the

lymphocyte-enriched and monocyte fractions as well as in the monocyte-derived

macrophages where their levels did not vary significantly upon LPS stimulation. PADI2

mRNA was observed clearly in the monocyte fraction and in resting macrophages and weakly

in LPS-stimulated macrophages and in the lymphocyte-enriched fraction. To further explore

variations in the levels of the different PADI mRNAs between the different mononuclear cell

populations, real-time RT-PCR analysis was performed for the leukocytes of a fourth healthy

donor (Table 1). It confirmed the absence of PADI1 and PADI3 and the presence of PADI2, 4

and 6 transcripts. It confirmed also variations in the relative expression of PADI2 between the

different cell populations, with monocytes exhibiting ten fold higher amounts of transcripts

than LPS-stimulated macrophages or lymphocytes. In addition, elevated Ct values (Ct>32)

strongly suggested very low expression levels of PADI4 in resting or LPS-stimulated

macrophages and of PADI6 in all cell fractions. Expression of PAD was then analyzed at the

protein level using previously produced antibodies specific for PAD1-4. In addition,

antibodies specific for PAD6 were generated and their specificity was verified by

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immunoblotting on a recombinant human PAD6. The apparent molecular-mass of the band

recognized by the anti-PAD6 antibodies (~ 78 kDa) corresponds to the one expected for the

recombinant PAD6 (Figure 1B). Moreover, these antibodies did not cross-react with rabbit

muscle Pad2 or with human recombinant PAD1, 3 and 4 (Figure 1B). Each set of anti-PAD

antibodies was used at a concentration allowing detection of at least ~ 1 femtomole of its

PAD target (Figure 1C). In the different blood-derived cell fractions, PAD expression was

explored by immunoblotting equal amounts of low salt-extracted proteins separated by SDS-

PAGE (Figure 1D). The obtained results were very consistent with the PCR results described

above. Indeed, PAD1 and 3 were not detected in any of the cell fractions, PAD2 was found in

all cell fractions and monocytes exhibited the highest expression levels. PAD4 was detected

in the lymphocyte-enriched and purified monocyte fractions but not in cells where

corresponding mRNA was rare, i.e. in resting or LPS-stimulated macrophages. Similarly,

PAD6 was not detected in any of the cell fractions even though, in simultaneously probed

extracts of human adult ovary, the anti-PAD6 antibodies stained a ~ 78 kDa band (control

extract, Figure 1D).

Expression of PAD in synovial tissues

The presence of the different PAD isotypes was then assessed in the ST of 16 patients with

RA. These were compared with the ST of control patients corresponding to 4 patients with

non-RA arthritides and 7 patients with OA. PAD expression was first examined at the protein

level by immunoblotting analysis of equal amounts of proteins from low-salt extracts of the

ST samples, using the anti-PAD antibodies at their adjusted concentrations (Figure 2A).

PAD1, 3 and 6 were detected neither in the ST of RA patients nor in that of control patients.

By contrast, PAD2 was present in all 16 RA patients, all 4 control patients with other

arthritides and 6 out of the 7 patients with OA. PAD4 was also expressed in both RA and

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control patients. However, it was detected in 13/16 RA patients, all 4 patients with other

arthritides but only 2 out of the 7 patients with OA. The presence of mRNA transcripts

corresponding to the five PAD isotypes was also explored by RT-PCR in a subset of patients

corresponding to 3 RA (RA3, 7 and 15) and 2 controls (AS1 an OA4) (Figure 2B). This

analysis showed the absence of expression of PADI1 and PADI3, and expression of PADI2

and PADI4 in the ST of all RA and control patients. PADI6 transcripts were detected in 4 out

of the 5 ST samples (all but RA15).

Search for correlations between PAD expression and synovial tissue inflammation

The levels of PAD2 and PAD4 were semi-quantitatively estimated by scoring the labeling

intensity of the corresponding bands on immunoblottings (Table 2). No statistically

significant differences were observed between the levels of PAD2 and those of PAD4 either

in RA patients or in patients with RA or non-RA arthritides (patients with arthritides),

although a trend towards higher levels of PAD4 exists. In contrast, in OA patients, the scores

obtained for PAD2 were significantly higher than those for PAD4 (P = 0.028). Accordingly,

whereas the median level of PAD2 expression did not significantly differ between the various

diagnosis groups, that of PAD4 was found to be significantly higher in patients with

arthritides versus patients with OA (P = 0.0055).

The intensity of inflammatory lesions of all ST samples was evaluated histologically on H&E-

stained sections by scoring the mean lining thickness, vascularity and infiltration by cells of

hematological origin (Table 2). This analysis indicated that not all the synovial membranes

from patients with arthritides were actively inflamed and that 1 ST sample from a patient with

OA (OA1) was taken during a highly inflammatory phase. However, globally, as expected,

the ST samples from the group of patients with arthritides tended to have higher inflammation

scores than those of patients with OA, although the differences did not reach statistical

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significance. In figure 2A, the lanes corresponding to ST samples from the 3 groups of

patients (RA, non-RA arthritides and OA) are classified according to decreasing density of

inflammatory infiltration. Interestingly, the labeling intensities of the bands corresponding to

PAD2 and PAD4 tend to decrease in parallel showing a correlation between the expression

levels of PAD2 or PAD4, and ST cell infiltration density. Furthermore, the expressions of

PAD2 and PAD4 were significantly correlated not only to the density of infiltration by

inflammatory cells but also to the vascularity of the deep synovium and the synovial lining

thickness, either when considering all patients or only those with arthritides (including RA) or

only patients with RA (Table 3). Interestingly however, in patients with arthritides PAD2 was

more strongly correlated with the density of ST infiltration than with the synovial lining

thickness (P =0.00023 versus P =0.045, respectively) while the opposite was observed for

PAD4 (P =0.02 versus P = 0.0053, respectively). Remarkably also, in the group of OA

patients, the level of PAD2 expression was only correlated with the density of ST infiltration

(Table 3). Finally, in the group of RA patients, no relationships could be found between the

expression levels of PAD2 or PAD4 and the serum titers of ACPA.

Immunolocalization of PAD2 and PAD4 in the synovial tissue of RA patients

Finally, we sought to specify the location of PAD2 and 4 in the ST of RA patients (Figure 3).

Simple immunoperoxidase stainings were performed on serial sections of ST from a subset of

10 RA patients. Figure 3A illustrates the results obtained by showing STs from 4 RA patients,

in areas where fibrin and citrullinated proteins were detected. Depending on the sample

examined, fibrin was evidenced as compact well defined deposits (patient RA2) or as diffuse

deposits in the deep synovium (patient RA3). In other cases fibrin deposits were found in the

synovial lining layer and appeared as either well defined (patient RA6) or diffuse (patient

RA9). The antibody to citrullinated proteins revealed extensive citrullination of the detected

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fibrin (patients RA2, 3 and 9) or of intracellular proteins in cells located within the fibrin

deposits (patient RA6). PAD2 was observed extracellularly and in the cytoplasm of cells

within the citrullinated fibrin areas (see patient RA2 for an example of both locations). It was

also found in the cytoplasm of palisadic histiocytes encircling amorphous deposits rich in

citrullinated proteins (patient RA3). PAD4 was observed extracellularly in some fibrin-rich

areas (patient RA6) and in the cytoplasm and/or nucleus of cells within (patient RA2) or at the

close vicinity of (patients RA6 and 9) fibrin deposits. More generally, the presence of PAD2

and PAD4 in the ST was observed in 6 and 10 RA patients, respectively. The observation of

zones simultaneously containing PAD2- and PAD4-positive cells was quite uncommon

suggesting the rarity of cells simultaneously expressing both enzymes. The PAD2 staining

was cytoplasmic and generally detected in mononuclear cells scattered in the sublining or

deep synovium and rarely in the synovial lining cells, while the PAD4 staining concerned the

cytoplasm and/or nucleus of more numerous and generally grouped mononuclear cells located

in all tissue areas, and the synovial lining cells (Figure 3B). The morphology of both PAD2-

and PAD4-positive cells frequently evoked that of macrophages and, indeed, double stainings

with the antibodies to PAD2 or 4 and an anti-CD68 antibody showed that most PAD-

expressing cells were CD68 positive and therefore of myelomonocytic origin (Figure 3C).

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Discussion

In the first part of our study, the fact that none of the mononuclear leukocyte populations we

examined expressed the PADI1 and 3 genes fits with the reported absence of the

corresponding mRNA transcripts in PBLs (8, 31). It also fits with a recent study by Vossenaar

et al. reporting absence of mRNAs for PADI1 and 3 in the peripheral-blood derived T cells

(CD3+ PBMCs), B cells (CD19+ PBMCs), monocytes (CD14+ PBMCs) and NK cells

(CD56+ PBMCs) (14) of one blood donor. Both studies are also in agreement concerning the

presence of PADI2 mRNA in lymphocytes, monocytes and monocyte-derived macrophages.

However, at the protein level we found PAD2 in monocytes and macrophages while it was

detected in macrophages but not in monocytes by the other authors (14). This discrepancy

may originate from differences in the methods used to obtain blood monocytes since we

purified monocytes using positive selection of CD14+ PBMC while they isolated monocytes

from PBMC by plastic adherence. Another discrepancy concerns PAD4, which we could not

detect in macrophages while they made an opposite observation. Again, this could originate

from methodological differences: to obtain monocyte-derived macrophages, we used a 7-day

culture of the CD14+ PBMCs in the presence of M-CSF and prevented adherence while, in

the other study, macrophages were obtained by a 7-day culture of adherent PBMCs.

Concerning PAD6, our analysis of its protein expression using specially developed and

validated antibodies is original. The apparent molecular mass of the band that these antibodies

detected in a protein extract of human adult ovary, corresponds to that predicted for human

PAD6. Therefore this protein is probably present at least in ovaries, similarly to its mouse

ortholog, ePAD (33, 34). In addition, we confirm previous reports mentioning detection of

transcripts of the PADI6 gene in PBLs (7, 35) and, furthermore, specify their presence in

several types of mononuclear leukocytes. However, real-time RT-PCR analysis showed that

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the expression level of PADI6 is very low and this probably accounts for the fact that the

corresponding protein could not be detected.

Therefore and on the whole, the results concerning expression of PAD in different

mononuclear leukocytes populations indicate that only PAD2 and PAD4 reach detectable

expression at the protein level in cells of the lymphocyte and monocyte lineages.

The second part of our study constitutes the first systematic exploration of the synovial

expression of the 5 PAD isotypes in a large series of patients with RA, non-RA arthritides or

OA. We clearly demonstrate the absence of PAD1 and 3 in all disease types. Moreover, we

show that PAD2 is consistently expressed in the course of both arthritides and OA while

expression of PAD4 is mainly associated with arthritides. Finally, no PAD6 protein was

found in any of the disease groups.

Concerning PAD2 and 4, our results can be compared to those of other less systematic studies

analyzing their presence in the human rheumatoid ST. The group of Yamamoto mentioned the

presence of PAD4 in the sublining region of the ST of RA patients (36, 37). However, in a

much more detailed confocal microscopy analysis using the same anti-PAD4 antibody, the

presence of PAD4 was detected in all areas of RA ST samples, in cells that were identified as

T and B lymphocytes, macrophages, granulocytes, fibroblasts and endothelial cells (19). This

group also reported immunohistological detection of PAD2 in the lining, sublining and deep

regions of one patient ST sample (36). In the ST of a series including 19 RA patients and 19

control patients with inflammatory and non-inflammatory rheumatisms, De Rycke et al.

detected PAD2 in 59% of RA patients but also in 17% of the control patients (38). This fits

with our observations, even though our immunoblotting detection with optimized antibody

concentrations appears as more sensitive (0.5-1 fmol) since it allowed us to detect the

presence of PAD2 in all RA and almost all control ST samples. Additionally, Pad2 and Pad4

have been explored in the ST of mice with collagen-induced arthritis (CIA) or streptococcal

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cell wall-induced arthritis, with identical results in both models (39). Transcripts for Padi2

were detected in naïve and arthritic mice, while transcripts for Padi4 were only detected in

arthritic mice. Both corresponding Pad2 and Pad4 proteins were absent in the ST of naïve

mice and, in the inflamed ST of arthritic mice, only Pad4 was detected and reported to be

expressed by neutrophils (39). Pad4 has also been evidenced in the inflamed ST of Dark

Agouti rats with CIA but, in this case, mononuclear cells were found to be responsible for its

expression (40).

An important point of our study is that it clearly shows that PAD expression in the ST is not

specific for RA, fitting with our finding that citrullination of fibrin in the ST occurs during a

variety of synovitides (41) and that citrullinated proteins are present in several other inflamed

tissues, such as the muscle, the colon or the lung of patients with polymyositis, inflammatory

bowel disease, or interstitial pneumonia, respectively (42, 43). Similarly, in RA patients, we

could not evidence a relationship between the serum ACPA titer and the level of PAD2 or 4 in

the ST, in line with the absence of correlation between the serum ACPA titer and the amount

of citrullinated fibrin in the ST (41). This emphasizes that, in the ST, PAD expression and

citrullination of target proteins are not specifically associated to RA while ACPA are. We

actually show that PAD expression in the ST is an inflammation-dependent phenomenon. A

close correlation is observed in arthritides and in OA between the level of PAD2 and the

degree of infiltration by inflammatory cells, suggesting a basal expression of this isotype by

these cells in these 2 disease types. As PAD4 is also correlated to the degree of infiltration,

inflammatory cells also constitute a source for this isotype. However, PAD4 is rather confined

to arthritides. Differences in the composition of the infiltrate, but also in the state of

differentiation and/or activation of infiltrating cells, probably influenced by differences in

their cytokine environment may account for PAD4 expression in arthritides but not OA.

Moreover, PAD4 is frequently observed in the lining layer and its expression level is

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particularly correlated with the synovial lining thickness. This suggests that the hyperplastic

cells of the synovial lining constitute another important source of PAD4 in these diseases. It

would be interesting to evaluate whether the proportion of PAD4-positive cells exhibiting

nuclear staining is related to the TNF-α concentration in the ST since it has recently been

shown that this cytokine induces nuclear translocation of Pad4/PAD4 in murine and human

oligodendroglial cell lines (44).

Studies of PAD polymorphisms have shown that a haplotype of PADI4 was associated to RA

in Japanese (37, 45) and Korean populations (46). These results were confirmed in a

Caucasian population from North America (47) but were not reproduced in various Caucasian

European populations (47-51). In the initial study by Suzuki et al., in vitro results indicated

that the presence of this haplotype could lead to a more stable mRNA suggesting that PAD4

expression was increased in RA ST leading to enhanced levels of citrullinated proteins (37).

However, so far the question as to whether the levels of PAD4 expression are related to the

PADI4 haplotype has not been explored. Given the association between PAD4 expression and

the ST inflammation, it would be interesting to evaluate the influence of PADI4 haplotypes in

groups of patients stratified according to their degree of ST inflammation.

Owing to the use of anti-PAD antibodies with equalized sensitivities of detection we could

observe that, in the ST of RA patients, the levels of PAD4 detected by immunoblotting tended

to be higher than those of PAD2. This is corroborated by the observation of higher numbers of

PAD4-positive cells than PAD2-positive cells by immunohistochemical analysis. However,

our results strongly indicate that both PAD2 and 4 are involved in the process of fibrin

citrullination since, even if their simultaneous detection in the same area was quite rare, both

were observed directly or in the close vicinity of fibrin deposits in the ST. This is compatible

with the observation that, in vitro, recombinant forms of both human PAD2 and human PAD4

are able to citrullinate human fibrinogen (36). Moreover, the presence of citrullinated fibrin in

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inflamed samples of ST from OA patients (41) where PAD4 is rarely seen ((19) and the

present study) is necessarily due to a PAD2 activity.

In conclusion, the present study has provided the first extensive exploration of all the existing

PAD enzymes in the RA ST. Even if it remains to be precisely determined which factors

induce their production and how/why they are released and activated to be able to target

extracellular proteins such as fibrin, most probably both PAD2 and PAD4 play a role in the

generation of the synovial ACPA targets. In this respect, inhibition of the activity or of the

expression of PAD2 and/or 4 may constitute a valuable therapeutic strategy for RA.

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Acknowledgments

This study was supported by grants from the Toulouse III University, the CNRS, the

INSERM, and the "Association de Recherche sur la Polyarthrite". We thank Pr. B. Fournié,

Dr. L. Zabraniecki and Dr. O. Lemaire (Rheumatology Department, Hôpital Purpan,

Toulouse), Pr. A. Cantagrel and Dr. A. Constantin (Rheumatology Department, Hôpital

Rangueil, Toulouse), for providing patient data and sera. We also thank Pr. M. Mansat, Dr M.

Rongières, Pr. P. Mansat, and Pr. P. Bonnevialle (Department of Orthopaedic and Traumatic

Surgery, Hôpital Purpan) for providing samples of synovial membranes, Dr. A. Gomez-

Brouchet (Pathology Department, Hôpital Rangueil) for giving access to her diagnostic

pathological analysis of the synovial membranes, Pr. J.-P. Chavoin (Plastic Surgery

Department, Hôpital Rangueil) for providing samples of human skin and Ms. F. Capilla

(Experimental pathology platform of IFR30) for her assistance in histological analyses.The

skillful technical assistance of Ms. R. Llobera, M.-T. Ribouchon, M.-P. Henry, and M.-F.

Isaïa is gratefully acknowledged.

- 172 -

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Table 1. Real-time RT-PCR analysis of PADI gene expression in blood-derived cells.

Ct (relative expressionA) PBMC lymphocyte-rich monocyte macrophage macrophage-LPSPADI1 nd nd nd nd nd PADI2 27 (0.4) 28 (0.1) 24 (1.0) 26 (0.6) 29 (0.1) PADI3 nd nd nd nd nd PADI4 27 (0.4) 28 (0.1) 24 (1.0) >32 (n/a) >32 (n/a) PADI6 >32 (n/a) >32 (n/a) >32 (n/a) >32 (n/a) >32 (n/a )

AIn the different cell fractions, the relative expression of each PADI gene was calculated in

reference to the monocyte fraction using the 2–ΔΔCt formula where ΔCt represents the

difference between the Ct value of the PADI gene and the Ct of the reference HPRT1 gene

and ΔΔCt represents the difference between the ΔCt obtained with the indicated cell fraction

and the ΔCt obtained with the monocyte fraction. nd (not detectable) indicates that no

amplification occurred as no fluorescence was detected after 40 cycles; n/a (not applicable)

indicates that the relative expression was not calculated as only very low amplification

occurred, preventing accurate determination of the Ct (Ct>32).

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Table 2. PAD2 and PAD4 expression, and ST inflammationA

Patient code PAD2 PAD4 Vascularity Infiltration Mean lining thickness

RA 01 4.50 4.75 4 4 1 02 2.50 2.75 3 3 1 03 3.50 5.25 3 2 3 04 3.50 3.50 3 2 2 05 3.00 4.75 3 2 2 06 2.75 4.75 3 2 2 07 2.75 2.00 1 2 1 08 2.25 6.00 4 1 2 09 2.25 2.50 1 1 1 10 1.50 3.75 1 1 0 11 1.50 0.00 1 1 1 12 0.75 4.25 1 1 1 13 0.75 1.75 1 1 1 14 0.75 0.00 2 1 1 15 2.00 0.00 1 0 1

16 1.50 0.50 1 0 0

AS 01 2.25 3.75 2 3 1 02 2.00 1.50 2 0 1 USpA 01 2.50 4.25 1 1 2 PsA 01 0.50 3.25 1 0 2

OA 01 3.25 0.00 4 2 2 02 5.50 2.00 1 1 1 03 2.75 0.00 1 1 1 04 2.25 2.00 1 1 1 05 2.25 0.00 1 0 1 06 1.75 0.00 1 0 1 07 0.00 0.00 1 0 1

AThe levels of PAD expression were evaluated by semi-quantitative scoring of the labeling

intensity of the PAD bands on immunoblottings of ST extracts. ST inflammation was

evaluated by semi-quantitative scoring of the vascularity, infiltration of the sublining layer by

inflammatory cells, and mean synovial lining thickness. For details see the Materials and

Methods section.

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Table 3. Correlations between PAD2 and PAD4 expression, and ST inflammationA

all patients RA patients all arthritides OA patients PAD2 PAD4 PAD2 PAD4 PAD2 PAD4 PAD2 PAD4

Mean lining thickness 0.43 (0.025) 0.47 (0.014) 0.59 (0.015) 0.61 (0.012) 0.45 (0.045) 0.60 (0.0053) ns ns

Vascularity 0.53 (0.0048) 0.47 (0.013) 0.68 (0.0038) 0.70 (0.0023) 0.66 (0.0017) 0.59 (0.0063) ns ns Infiltration 0.67 (0.00015) 0.55 (0.0029) 0.77 (0.00043) 0.54 (0.032) 0.73 (0.00023) 0.51 (0.02) 0.80 (0.032) ns

A Spearman rank correlation coefficients (corresponding P values) are given. Only P values ≤ 0.05 were considered significant; ns: non

significant.

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Figure legends

Figure 1: Standard RT-PCR and immunoblotting analysis of PAD expression in mononuclear

leukocytes. (A) Expression of the different PAD isotypes in peripheral blood mononuclear

cells (PBMC), a CD14- lymphocyte-enriched fraction (lymphocyte), CD14+ purified

monocytes (monocyte), monocyte-derived macrophages (macrophage) and LPS-stimulated

macrophages (macrophage-LPS) was assessed at the mRNA level by RT-PCR. Amplification

of HPRT1 mRNA was used to control the evenness of cDNA inputs. Positive and negative

control reactions included cDNA preparations of tissues or cells expressing the tested PAD

isotype (data not shown, see methods) or PCR without template (- control), respectively. The

size of PCR products is indicated on the right. (B-D). Expression of PAD was also assessed at

the protein level. (B). The specificity of the anti-PAD6 antibodies was checked by

immunoblotting equal amounts of recombinant (r) forms of human PAD1, 3, 4, and 6, and

Pad2 purified (p) from rabbit skeletal muscle. (C) The equalization of the sensitivities of the 5

anti-PAD1-4 and 6 antibodies was checked on the immunoblotting of 13.5 to 0.8 femtomoles

of rPAD1, pPad2, rPAD3, rPAD4 and rPAD6, respectively. (D) Proteins from the low-salt

extracts of the different mononuclear leukocyte fractions were immunodetected with the anti-

PAD antibodies (PAD1-4, 6) used at these adjusted sensitivities in parallel to relevant control

tissue or cell extracts (control extract, see methods). Positions of molecular mass standards

(B) and apparent molecular mass of the different PAD isotypes (C and D) are indicated on the

right.

Figure 2: Immunoblotting and RT-PCR analysis of PAD expression in the ST from patients

with RA and other rheumatisms. (A) For immunoblotting analysis, proteins from low-salt

extracts of the ST samples were separated by SDS-PAGE and electrotransferred onto

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membranes. Total proteins were stained with Ponceau red (Ponceau red) and then probed with

the different indicated anti-PAD antibodies at their adjusted concentrations. Positive controls

(+ control) included rPAD1, 3, 4 or 6 or pPad2 detected by the relevant corresponding anti-

PAD antibodies. The apparent molecular mass of each PAD is indicated on the right. (B) The

presence of mRNA transcripts of the five PADI genes was evaluated by RT-PCR in ST

samples from 3 RA and 2 control patients. Amplification of the mRNA of G3PDH was used

to control the evenness of cDNA inputs. Positive (+) and negative (-) controls were performed

as indicated in Figure 1A. The size of PCR products is indicated on the right.

Figure 3: Immunolocalization of PAD2 and PAD4 in the ST of RA patients. In simple

immunoperoxidase stainings, fibrin, citrullinated proteins, PAD2 and PAD4 were localized on

adjacent sections. PAD2 and PAD4 are shown in areas containing citrullinated fibrin (A) and

in fibrin-free areas (B). (C) In double immunostainings, CD68 (blue) and PAD2 or 4 (brown)

were simultaneously localized. The RA patient code and antibody used are indicated. Boxed

zones correspond to areas for which a higher magnification is shown. Bars = 50 µm (A and B)

or 10 µm (C).

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Figure 1 :

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Figure 2 :

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Figure 3 :

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DISCUSSION DISCUSSION GGÉÉNNÉÉRALERALE

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

INTRODUCTION

DISCUSSION GÉNÉRALE

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Discussion générale

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1. Introduction

Nos travaux nous ont permis d’apporter des précisions concernant l'origine et le

rôle du conflit immunologique associant fibrine citrullinée et ACPA, dans la

physiopathologie de la PR.

D'une part, concernant les enzymes responsables de la genèse des cibles des auto-

anticorps anti-protéines citrullinées, nous avons établi que parmi les cinq isotypes de PAD,

seuls les isotypes 2 et 4 étaient présents au sein du tissu synovial de patients atteints de PR.

En outre, nous avons montré que cette expression des PAD2 et PAD4 n'était pas exclusive

du tissu synovial rhumatoïde, mais observée également au cours d'autres rhumatismes

inflammatoires et corrélée à l'inflammation tissulaire. Alors que la PAD2 était présente

dans le tissu synovial de patients arthrosiques, l'expression de la PAD4 était associée aux

rhumatismes inflammatoires. De plus, par des analyses immunohistologiques, nous avons

précisé que les PAD2 et 4 étaient localisées au voisinage proche ou au sein de dépôts de

fibrine citrullinée, suggérant fortement que ces deux isotypes sont tous deux impliqués dans

la citrullination de la fibrine.

D'autre part, et en cohérence avec ces résultats, nous avions aussi déterminé que la

fibrine citrullinée n'était pas spécifiquement retrouvée dans le tissu synovial rhumatoïde,

mais présente également dans le tissu synovial enflammé de patients atteints d'autres

rhumatismes inflammatoires ou non. La citrullination de la fibrine serait donc une

caractéristique générale des synovites, n'induisant pas nécessairement la production

d'ACPA.

Enfin, nous avons étudié si la fibrine citrullinée autologue était immunogène et

arthritogène chez le rat. Seuls les animaux ayant été inoculés avec du fibrinogène sous

forme citrullinée, et non du fibrinogène sous forme native, ont développé une réponse

anticorps. Cette réponse n'a cependant pas permis ni d'induire spontanément une arthrite,

ni d'aggraver une arthrite aiguë transitoire provoquée par une injection au sein d'une

articulation d'adjuvant incomplet de Freund. Des dépôts de fibrine citrullinée ne s'étant pas

formés au sein des articulations, ce défaut d'arthritogénicité pourrait être dû à l'absence de

mise en place d'un conflit immunologique local.

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Discussion générale

- 190 -

Nos résultats conduisent donc à s'interroger sur les mécanismes d'induction, chez

les patients atteints de PR, d'une réponse auto-immune anti-protéine citrullinée qui est

spécifique, vis-à-vis d'un auto-antigène, la fibrine citrullinée, qui lui, ne l'est pas. En outre,

il reste également à expliquer comment des enzymes localisées intracellulairement vont

être relarguées et activées dans le milieu extracellulaire pour citrulliner des protéines telle

que la fibrine. Enfin, chez l’animal, le caractère arthritogène de l’auto-immunité anti-

fibrine citrullinée mérite encore largement d’être testé.

2. Citrullination et polyarthrite rhumatoïde

2.1. Mécanismes impliqués dans la citrullination au sein du tissu synovial

La recherche immunohistologique des PAD2 et 4 dans le tissu synovial rhumatoïde

a révélé que ces 2 PAD étaient exprimées par des cellules mononucléées infiltrant le tissu

mais également, en ce qui concerne la PAD4, par les synoviocytes hyperplasiques.

La fibrine, cible de ces enzymes, est une protéine extracellulaire. Or, les marquages

des PAD sont cytoplasmiques en ce qui concerne la PAD2, et cytoplasmiques et/ou

nucléaires en ce qui concerne la PAD4. De plus, les PAD ne semblent pas pouvoir être

sécrétées du fait de l'absence dans leur séquence de peptide signal. Enfin, ces enzymes

nécessitent pour être actives des concentrations calciques de l'ordre de 10-5 M, soit une

concentration 100 fois supérieure à la concentration de calcium intracellulaire (environ

10-7 M).

Comment expliquer alors l'activation et le relargage de ces enzymes à l'extérieur de

la cellule ?

L'apoptose est un processus de mort cellulaire programmée qui s'accompagne

d'une augmentation de la concentration calcique intracellulaire telle qu’elle permettrait

d'activer une activité PAD. In vitro, des ionophores calciques comme la ionomycine

facilitent l'influx de calcium du milieu extracellulaire vers le cytosol et induisent l'apoptose

dans de nombreux types cellulaires (Tombal et al. 2002). Ainsi, dans des macrophages

péritonéaux de souris, l'influx calcique provoqué par traitement à la ionomycine induit

l'apoptose de ces cellules et la désimination de vimentine (Asaga et al. 1998). De la

même façon, le traitement à la ionomycine de monocytes humains purifiés ou de

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Discussion générale

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macrophages différenciés ex vivo, active la citrullination de protéines, correspondant

notamment à de la vimentine citrullinée (Vossenaar et al. 2004). L'influx calcique au cours

de l'apoptose de cellules pourrait donc expliquer l'activation de ces enzymes. Leur

libération dans le milieu extérieur pourrait être secondaire à des imperfections dans les

processus d'élimination des cellules apoptotiques.

Les PAD pourraient également être libérées des cellules suite à un phénomène de

nécrose dû à l'inflammation qui induit la présence en abondance de molécules

cytotoxiques telles que les ROS. Ensuite, elles pourraient être activées dans le milieu

extracellulaire où la concentration en calcium, voisine de 10-3 M serait suffisante.

Une autre hypothèse, qui n'a pas à l'heure actuelle encore été vérifiée serait une

sécrétion des PAD2 et 4 dans le milieu extracellulaire par des voies "non-classiques". En

effet, des protéines solubles sécrétées contiennent un peptide signal en N-terminal, qui les

dirige vers une sécrétion "classique" dépendante du réticulum endoplasmique (RE) et de

l'appareil de Golgi. Or, il y a un peu plus de 10 ans, il a été décrit que l'IL-1β et la

galectine-1 pouvaient être exportées des cellules via des mécanismes indépendants du

système RE/Golgi. Depuis, la liste de protéines sécrétées de manière non- conventionnelle

a encore grandi avec par exemple les facteurs de croissance fibroblastiques FGF-1 et -2.

Ces découvertes ont alors suggéré qu'il puisse exister, chez les eucaryotes, des voies

alternatives de sécrétion de protéines. Au moins quatre voies distinctes d'exportation ont

été proposées (cf Figure 29) (pour revue cf (Nickel 2003)).

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Discussion générale

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Figure 29 : Représentation schématique des voies potentielles d'exportation non-classiques pour la sécrétion de protéines. D'après (Nickel 2003).

Pour l'IL-1β, par exemple, l'exportation inpliquerait une importation dans des

vésicules intra-cellulaires, probablement du compartiment endosomal. Les FGF-1 et -2, au

contraire, gagneraient le compartiment extracellulaire par translocation directe à travers la

membrane plasmique, et apparemment en empruntant des systèmes de transport distincts.

La protéine HASPB ("hydrophilic acylated surface protein B) de Leishmania, serait quant à

elle, également transloquée directement à travers la membrane plasmique et nécessiterait

que la protéine soit ancrée à la membrane grâce à une double acylation en N-terminal.

La protéine serait alors localisée sur le feuillet externe de la membrane par un mécanisme

dit de "flip-flop". Enfin, la dernière voie proposée impliquerait la formation d'exosomes,

formés sur la surface externe de la cellule, par un mécanisme encore inconnu. Les

exosomes, de structure labile, libèreraient ensuite leur contenu dans l'espace extra-

cellulaire. Cette dernière voie serait utilisée par les galectines (Nickel 2003). A cet égard il

est intéressant de mentionner que la présence de protéines citrullinées dans des exosomes

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Discussion générale

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purifiés à partir de liquides synoviaux de patients atteints de PR a été rapportée (Skriner et

al. 2006). La citrullination de ces protéines pourrait avoir eu lieu à l’intérieur de ces

exsosomes suite à la présence de PAD dans ces vésicules.

Les analyses immunohistologiques que nous avons réalisées ont très rarement

permis de mettre en évidence la présence de PAD dans le milieu extracellulaire.

Cependant, l'absence de l'enzyme ne signifie pas qu'elle n'a pas été là à un moment

donné, puis dégradée par la suite, avec, pour preuve évidente de leur activité

extracellulaire, les marquages de dépôts de fibrine citrullinée. Le mécanisme exact, par

lequel les PAD 2 et 4 vont être activées et libérées reste encore inconnu mais des pistes de

recherche intéressantes sont donc ouvertes.

2.2. La citrullination : phénomène lié à l'inflammation

Le fait que la présence de fibrine citrullinée ne soit pas spécifique du tissu synovial

rhumatoïde mais plutôt associée à l'inflammation de ce tissu a été également retrouvé

dans une autre étude indépendante (Vossenaar et al. 2004). Au vu de résultats plus

récents, la citrullination apparaît être un phénomène plus général directement lié à

l'inflammation. En effet, des protéines citrullinées ont été mises en évidence dans d'autres

tissus comme des muscles, des amygdales ou encore des intestins enflammés. En

comparaison, la citrullination était par exemple absente des muscles d'individus sains

(Makrygiannakis et al. 2006). En outre, la citrullination a également été décrite dans des

cellules broncho-alveolaires d'individus fumeurs apparemment sains ou donnant des

signes d’inflammation pulmonaire, alors qu'elle était absente des mêmes cellules

d'individus sains non-fumeurs (Klareskog et al. 2006). Enfin, la citrullination de la

fibronectine a été rapportée comme spécifique du tissu synovial rhumatoïde puisqu'elle n'a

pas été retrouvée dans le tissu synovial de patients arthrosiques (Chang et al. 2005). A

noter cependant, que les auteurs n'ont pas évalué le degré d'inflammation des différents

tissus analysés et que les échantillons de tissu synovial de patients arthrosiques n’étaient

peut être pas enflammés comme on peut l'attendre au cours de ce rhumatisme non

inflammatoire. A l’inverse, tous les échantillons de patients atteints d’arthrose présentaient

des signes arthroscopiques et histologiques d’inflammation dans l’étude où nous

rapportons la présence synoviale de fibrine citrullinée au cours de cette pathologie.

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Discussion générale

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Même si cela paraît difficile à réaliser, il serait intéressant d'analyser plus en détail

la relation entre citrullination et inflammation, en recherchant plus précisément des

corrélations entre le degré de citrullination et d'inflammation du tissu comme nous l’avons

fait entre niveau d’expression des PAD et inflammation.

2.3. Conséquence de la citrullination

La citrullination de la fibrine, outre de générer la cible des ACPA, pourrait avoir

pour conséquence d’interférer avec sa fibrinolyse, en entravant son clivage par la

plasmine, des résidus arginyl étant également présent dans certains des sites de clivage

par cette enzyme. En effet, parmi ces sites, certains sont situés directement après des

résidus arginyl citrullinables in vitro par les deux isotypes de PAD 2 et 4 présents dans le

tissu synovial rhumatoïde (Nakayama-Hamada et al. 2005). De plus, un des sites de

clivage est inclus dans un des épitopes immunodominants de la fibrine reconnu par les

ACPA (Sebbag et al. 2006). Ainsi, la citrullination de la fibrine pourrait également

interférer avec la fibrinolyse, indirectement, en limitant l'accès de la plasmine à la fibrine,

suite à la fixation des ACPA sur ces sites ou à leur voisinage immédiat (notamment aussi

parce que certains résidus lysil après lesquels clive la plasmine sont portés par des zones

reconnues par les ACPA du fait de la présence d’un épitope citrulliné adjacent).

Ces "défauts" potentiels de fibrinolyse auraient donc pour effet une accumulation

de fibrine dans le tissu synovial, et pourraient jouer un rôle dans l'entretien de

l'inflammation. En effet, dans plusieurs modèles expérimentaux d'arthrite, il a été montré

que l'accumulation de fibrine dans le tissu synovial favorisait la chronicité et la progression

de la maladie. D'une part, Busso et ses collaborateurs ont évalué le phénotype de souris

déficientes pour l'urokinase (uPA-/-), activateur de la plasmine, et de souris contrôles, dans

un modèle d'arthrite induit par immunisation avec de la BSA méthylée. Chez les souris

uPA-/- l'inflammation était plus persistante par rapport aux souris contrôles, avec une

exacerbation de l'érosion osseuse ainsi qu'une augmentation de l'accumulation de fibrine

dans l'articulation (en raison d'un défaut de fibrinolyse) (Busso et al. 1998). De la même

façon, l'induction d'une arthrite dans des souris déficientes pour l'autre activateur de la

plasmine, le t-PA, s'accompagne d'une inflammation exacerbée. De plus l'injection d'IL-1

dans ces souris provoque le développement une arthrite particulièrement sévère en

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Discussion générale

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parallèle de l'apparition de dépôts de fibrine (Yang et al. 2001). Ainsi un défaut

d'élimination de la fibrine dans l'articulation, pourrait participer à l'auto-entretien de

l'inflammation articulaire.

3. Origine et rôle de l'auto-immunité anti-protéines citrullinées

3.1. Origine de la réponse ACPA

Chez l’homme, la présence de fibrine citrullinée n'est pas spécifique de la PR. Par

conséquent, puisqu’au contraire les ACPA sont eux associés à la maladie, la présence de

dépôts de fibrine citrullinée dans le tissu synovial inflammatoire ne s'accompagne pas

forcément d'une réponse auto-immune spécifique. Dans des modèles animaux d'arthrite

aigüe (arthrite à paroi de streptocoque) ou chronique destructrice (CIA), bien que des

protéines citrullinées, parmi lesquelles la fibrine, aient été détectées, aucune réponse

anticorps dirigée contre ces protéines n'a pu être mise en évidence (par ELISA CCP2)

(Vossenaar et al. 2003). La question sur l'origine de cette réponse ACPA reste donc posée.

Plusieurs groupes ont montré que la présence et/ou le titre des ACPA étaient

associés de manière significative aux allèles HLA-DR de susceptibilité à la PR (Forslin et al.

2000; van Gaalen et al. 2004; Auger et al. 2005). En outre, plusieurs études récentes

rapportent même que l’association entre PR et allèles HLA-DR portant l’épitope partagé ne

serait significative que pour les PR séropositives pour les ACPA, suggérant que ces allèles

prédisposeraient plus au développement de cette réponse immune, qui serait elle

déterminante pour le développement de la maladie, qu’à la maladie elle-même (Berglin

et al. 2004; Huizinga et al. 2005; van der Helm-van Mil et al. 2006). Il a également été

montré dans un modèle de souris transgénique pour la molécule HLA-DRβ1*0401, qu'un

peptide de vimentine interagissant avec l'épitope partagé, lorsqu'il était sous forme

citrulliné était capable de se lier aux molécules HLA-DR avec une affinité supérieure (de 10

à 100 fois) et d'induire l'activation de lymphocytes T CD4 spécifiques (Hill et al. 2003).

Cependant une autre étude plus récente menée en collaboration avec mon laboratoire n'a

pas conforté ces résultats. En effet, les auteurs ont examiné la fixation de peptides dérivés

des séquences des chaînes α et β du fibrinogène à des molécules HLA-DR purifiées

correspondant aux allèles de susceptibilité à la PR et mesuré les réponses prolifératives de

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Discussion générale

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cellules T vis-à-vis de ces peptides sous forme native ou citrullinée, chez des patients

atteints de PR ou chez des individus sains. Plusieurs peptides des chaines α et β se sont

fixés aux molécules HLA-DR, mais la citrullination n'a affecté les peptides de fibrinogène ni

dans leur fixation aux molécules HLA-DR, ni dans leur reconnaissance par des cellules T

spécifiques issues de patients (Auger et al. 2005). Ainsi la citrullination est indispensable à

la formation des épitopes cibles reconnus par les ACPA, mais ne semble pas importante

pour la formation d'épitopes T restreints par les molécules HLA-DR porteuses de l'épitope

partagé.

Bien que la fibrine puisse très vraisemblablement être l'auto-antigène responsable

de l'auto-entretien de la réponse ACPA, l'antigène initial pourrait correspondre à un

antigène exogène, portant des épitopes communs ou structuralement apparentés aux

épitopes citrullinés cibles des ACPA, et qui induirait une réponse réagissant de manière

croisée avec des protéines citrullinées.

Une autre hypothèse serait celle de l’existence d’un défaut de tolérance

périphérique chez les patients atteints de PR, chez qui des défauts fonctionnels de cellules

Treg ont été décrits (Ehrenstein et al. 2004; Valencia et al. 2006). Ceci pourrait

déclencher des réponses immunes par une rupture de tolérance vis-à vis de la fibrine

citrullinée présente de manière chronique dans le synovium enflammé. Au jour

d’aujourd’hui, le manque de données concernant l’existence de lymphocytes T spécifiques

ne permet pas d’avancer beaucoup d’arguments en faveur de cette hypothèse. En outre

cette hypothèse est plus difficilement conciliable que la précédente avec le caractère

précoce de la réponse ACPA, observable avant même l’apparition de signes cliniques,

alors même que la fibrine citrullinée n’est peut-être pas présente au sein des articulations.

Enfin, signalons que, tenant compte de ce " paradoxe ", le groupe de Lars

Klareskog a proposé que la présence de protéines citrullinées produites au cours

d’inflammations non nécessairement articulaires, comme par exemple les protéines

présentes dans les poumons de fumeurs, pourrait, chez des individus génétiquement

prédisposés par la présence d’allèles d’HLA-DR porteurs de l’épitope partagé, être à

l’origine du développement de la réponse ACPA (Klareskog et al. 2006).

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Discussion générale

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3.2. Arthritogénicité

3.2.1. Modèles animaux

Nous avons montré chez le rat que l'injection de fibrinogène citrulliné autologue

était immunogène mais pas spontanément arthritogène. Nous avons proposé que cette

absence d'arthritogénicité soit due à l'absence de dépôts de fibrine citrullinée dans

l'articulation et donc à l’absence de formation de complexes immuns susceptibles d’activer

des mécanismes effecteurs arthritogènes. D'autres études récentes ont éxaminé le rôle de

réponses auto-immunes anti-protéines citrullinées dans l'arthrite.

La première a exploré l'effet de la citrullination sur l'immunogénicité et

l'arthritogénicité d'auto-antigènes chez le rat (Lundberg et al. 2005). Les réponses

immunes vis-à-vis de la sérum albumine autologue citrullinée ou non ont été analysées,

ainsi que le développement d'une arthrite induite par immunisation avec du collagène de

type II (CII) natif ou bien citrulliné. Tout comme dans notre modèle chez le rat utilisant du

fibrinogène, les résultats ont montré que seule l'inoculation d'albumine sous forme

citrullinée permet de rompre la tolérance et d'induire une réponse anticorps, la forme non-

citrullinée étant non immunogène. De plus, l'immunisation de rat avec du CII citrulliné

provoque le développement d'une arthrite, d'apparition plus précoce et d'incidence plus

élevée, qu'après immunisation avec la forme native du CII (Lundberg et al. 2005).

Dans une autre étude récente, Kuhn et ses collaborateurs ont évalué le rôle des

auto-anticorps anti-protéines citrullinées au cours de la CIA provoquée chez des souris

DBA/1J. Ils ont montré que les souris immunisées avec du CII développaient, outre une

réponse anti-CII, une réponse anti-protéines citrullinées d'apparition précoce (avant les

signes cliniques) (Kuhn et al. 2006). Signalons que ces résultats sont totalement

contradictoires avec l’étude de Vossenaar et collaborateurs que j’ai mentionée plus haut,

n'ayant pas mis en évidence de réponse anticorps anti-protéines citrullinées dans les

mêmes souches de souris immunisées également avec du CII (Vossenaar et al. 2003).

Néanmoins, ces anticorps sont capables de reconnaître en immunotransfert la chaîne β

(mais non la chaîne α) du fibrinogène humain citrulliné in vitro, et présentent un potentiel

arthritogène. En effet, des souris rendues tolérantes vis-à-vis d’un peptide citrulliné dérivé

de la filaggrine puis immunisées avec du CII, développent une arthrite d’incidence et de

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Discussion générale

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sévérité réduites par rapport à des souris contrôles rendues tolérantes à une forme non

citrullinée du même peptide. De plus, les auteurs ont produit des formes monoclonales

des anticorps anti-protéines citrullinées. Leur co-administration avec un mélange

d’anticorps monoclonaux anti-CII utilisé à une dose insuffisante pour induire une arthrite,

permet d’obtenir une arthrite similaire à celle observé lors de l’utilisation d’une dose

optimale de ce mélange d’anti-CII arthritogène. Mentionnons enfin que cette étude n’a pu

ni montrer la présence articulaire des cibles antigéniques des anticorps anti-protéines

citrullinées chez les souris atteintes de CIA, ni préciser leur nature biochimique.

Ces études ont apporté des preuves du rôle des réponses anticorps anti-protéines

citrullinées dans des modèles d'arthrite, à la fois dans l'apparition, l'incidence et la sévérité

de la maladie. Toutefois, aucune n'a permis de montrer directement un rôle du conflit

immunologique associant fibrine citrullinée et ACPA dans l'initiation ou l’entretien de la

maladie. Chez l’animal le rôle pathogénique d'une réponse auto-immune vis-à-vis de la

fibrine citrullinée avec des dépôts de fibrine citrullinée reste à établir. Cela permettrait de

conforter notre hypothèse sur le rôle des ACPA dans l'auto-entretien de la synovite

rhumatoïde. De plus, un tel modèle pourrait être utile, à la fois pour disséquer les voies

physiopathologiques impliquées, mais aussi tester et valider de nouvelles approches

thérapeutiques pour la maladie humaine.

3.2.2. Potentiel inflammatoire chez l'homme

Alors qu’une démonstration du rôle arthritogénique des ACPA n’a pu être encore

réalisée in vivo chez l’animal, des travaux réalisés in vitro grâce à un modèle entièrement

humain ont toutefois permis d’établir le potentiel inflammatoire de ces autoanticorps. En

effet, dans une étude réalisée dans mon laboratoire (Clavel et al. 2007), des CI

immobilisés associant du fibrinogène humain citrulliné et des ACPA issus de patients

atteint de PR ont été reconstitués in vitro par immunocapture. Ces complexes sont destinés

à mimer ceux qui se forment dans le tissu synovial rhumatoïde au niveau de dépôts de

fibrine citrullinée. Mis en contact avec des macrophages dérivés de monocytes sanguins

humains, ils induisent la sécrétion de TNF-α. L’activation macrophagique ayant été

évaluée en absence de sérum et donc dans un système dépourvu de fractions du

complément, ce n’est pas par une voie dépendante du complément que la sécrétion de

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Discussion générale

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cytokine pro-inflammtoire a été induite, bien qu’il ne soit pas exclu qu’une telle voie

effectrice puisse aussi être empruntée in vivo par ces CI pour induire une synovite. Par

contre, l’utilisation d’antagonistes des trois récepteurs FcγRI, FcγRII et FcγRIII a permis de

monter que l’induction de la production de TNF-α était essentiellement due à

l’engagement du récepteur activateur FcγRIIA. Outre qu’elle permet d’apporter un

argument majeur en faveur du rôle physiopathologique des ACPA dans la PR, cette étude

ouvre également des perspectives thérapeutiques puisqu’elle suggère que l’inhibition de

voies dépendantes du récepteur FcγRIIA puisse être bénéfique aux patients, alors qu’elle

est actuellement en développement pour d’autres pathologies.

4. PAD et polyarthrite rhumatoïde

4.1. Association génétique PADI / PR

Plusieurs criblages génomiques ont identifié la région 1p36 en tant que locus

d'intérêt pour la susceptibilité à la PR. Au sein de cette région est localisé le locus PADI,

correspondant au groupe de gènes codant pour les 5 isotypes de PAD. Ces gènes PADI

sont des candidats majeurs pour participer au déterminisme génétique de la maladie.

C’est une étude japonaise portant sur 830 patients atteints de PR et 736 individus

contrôles qui a pour la première fois montré une association à la PR de huit SNP situés

dans le gène PADI4. L'association la plus significative était avec le SNP exonique

PADI4_94*T/C. De plus, un haplotype de PADI4 défini par ce SNP ainsi que 4 autres SNP

exoniques (PADI4_89*A/G, PADI4_90*T/C, PADI4_92*G/C, PADI4_94*T/C et

PADI4_104*T/C) s’est avéré être associé à la PR. Cet haplotype dit de susceptibilité

correspondrait à une variation fonctionnelle puisqu’il confèrerait une stabilité accrue aux

transcrits du gène PADI4 et pourrait ainsi favoriser la citrullination et donc la présence

d'ACPA (Suzuki et al. 2003). Cette association a été confirmée dans une étude réplicative

japonaise (Ikari et al. 2005) et dans une population coréenne (Kang et al. 2006) ainsi que

dans des populations caucasienne nord-américaine (Plenge et al. 2005) et allemande

(Hoppe et al. 2006). Cependant aucun lien entre l'haplotype de susceptibilité de PADI4 et

la PR n'a pu être mis en évidence dans plusieurs autres études portant sur des populations

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Discussion générale

- 200 -

caucasiennes notamment au Royaume-Uni (Barton et al. 2004), en France (Caponi et al.

2005), en Espagne (Martinez et al. 2005) et en Suède (Plenge et al. 2005).

Cependant, la recherche d'une association entre le niveau d'expression de la PAD4

et un haplotype du gène PADI4 n'a pas encore été réalisée. Nous avons montré que la

PAD4 était l’un des deux isotypes de PAD responsable de la citrullination de la fibrine au

sein du tissu synovial rhumatoïde et que son expression était corrélée à l'inflammation du

tissu synovial. Il serait donc intéressant d'évaluer l'influence d'haplotypes de PADI4 sur le

niveau d’expression de cette enzyme dans des groupes de patients classés en fonction du

degré d'inflammation du tissu synovial.

En outre, nous avons aussi montré que la PAD2 était impliquée dans la

citrullination au sein du tissu synovial. Bien que dans l’étude initiale de Suzuki et

collaborateurs, l’association à la PR du gène PADI2 ait été exclue (Suzuki et al. 2003) et

qu’aucune autre étude n'ait pour l'instant été publiée, ce gène reste donc un gène

candidat pour participer au déterminisme génétique de la PR.

4.2. Sources de PAD dans l'articulation rhumatoïde.

L'expression de CD68 par les cellules PAD-positives au sein du tissu synovial

rhumatoïde a indiqué leur origine myélomonocytaire. Semblant au moins en partie en

contradiction avec ce résultat, Chang et ses collaborateurs ont récemment analysé

l'expression de PAD4 dans le tissu synovial par microscopie confocale et retrouvé, avec

des marquages parfois un peu douteux, la présence de PAD4 dans toutes les populations

cellulaires testées (granulocytes, lymphocytes B, lymphocytes T, monocytes) (Chang et al.

2005). D'autres analyses rigoureuses pour identifier précisément les cellules exprimant la

PAD4 mais également celles exprimant la PAD2 sont clairement nécessaires. Une analyse

en double (ou triple) marquage, avec des anticorps spécifiques des différents types de

cellules CD68-positives présentes dans le tissu pourrait permettre de déterminer la nature

exacte du ou des type(s) de cellules sources de PAD au sein du tissu synovial.

Plusieurs études ont par ailleurs recherché l'expression des gènes PADI dans

diverses populations de leucocytes sanguins, mais sans systématisme du point de vue de

l’éventail des populations cellulaires, de celui des isotypes de PAD ou du niveau dans

l’expression (ARNm ou protéine) analysés. De plus, les résultats de ces études se sont

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Discussion générale

- 201 -

parfois révélés discordants. Dans l’étude que nous avons nous-mêmes réalisée, nous

avons analysé l'expression des cinq isotypes de PAD, dans différentes populations de

cellules mononucléées isolées à partir du sang de donneurs sains, potentiellement source

de PAD dans le tissu synovial. Nous avons ainsi montré que les PAD 1, 3 et 6 étaient

absentes de toutes les populations cellulaires testées. En outre, nous avons mis en

évidence l'expression de PAD2 et PAD4 dans les fractions cellulaires enrichies en

lymphocytes ainsi que dans les monocytes. Par contre seule la PAD2 était présente dans

des macrophages activés ou non par du LPS, et différenciés in vitro à partir de monocytes

purifiés. Ces résultats sont partiellement discordant avec ceux publiés par Vossenaar et ses

collaborateurs notamment concernant l'expression de PAD2 qu’ils ne retrouvent pas dans

les monocytes, et celle de la PAD4 qu’ils retrouvent dans les macrophages (Vossenaar et

al. 2004). Le fait que nous n'ayons pas mis en évidence de PAD4 dans les macrophages

(activés ou non) est un résultat surprenant, surtout si l'on prend en compte les marquages

immunohistochimiques que nous avons réalisés et qui ont révélé des cellules PAD4-

positives d'allure macrophagique au sein des tissus synoviaux rhumatoïdes. Il est probable

que des stimuli particuliers, autres que le LPS, soient nécessaires pour activer l'expression

de la PAD4 dans les macrophages. Il serait intéressant de regarder si l'effet de cytokines

pro-inflammatoires comme l'IL-1β et le TNF-α, présentes en abondance dans le tissu

synovial rhumatoïde ou l'effet d'une stimulation par CI associant fibrine citrullinée et ACPA

permettrait de stimuler l'expression mais également l'activation des PAD2 et PAD4 dans les

macrophages.

4.3. Modulation de l'activité des PAD

De nombreux facteurs sont capables d'influencer l'activité des PAD, comme par

exemple la présence de calcium ou d'agents réducteurs et particulièrement le dithiothréitol.

Plusieurs inhibiteurs de PAD ont également été décrits, l'un des premiers étant un dérivé du

taxol, le paclitaxel, un agent utilisé en thérapie anti-cancéreuse, qui s’est avéré capable

d'inhiber l'activité de Pad2 bovine purifiée (Pritzker and Moscarello 1998). Récemment,

grâce à la description de la structure cristallographique de la PAD4, de nouveaux

inhibiteurs de la PAD4 ont été découverts : la 2-chloroacetamidine et la

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Discussion générale

- 202 -

fluoroacetamidine. Ces molécules interagissent avec le site catalytique de l'enzyme

agissant en tant qu'inhibiteurs irréversibles (Luo et al. 2006; Luo et al. 2006).

Les PAD, et plus précisément les PAD2 et PAD4, étant responsables de la genèse

des cibles des ACPA, l'inhibition de ces enzymes pourrait constituer une thérapeutique

efficace dans le but d'entraver la formation de CI associant fibrine citrullinée et ACPA, et

donc de limiter ou bloquer l'inflammation chronique observée chez les patients atteints de

PR. Notamment, une demande de brevet portant sur "des méthodes pour traiter la PR en

inhibant les PAD" a été déposée en 2005 par Oscar Gluck et Michael Maricic (N° : US

2205/0159334 A1). Ce brevet concerne des traitements et thérapies comprenant

l'administration de doses thérapeutiques d'un inhibiteur de PAD "acceptable", dans le but

de prévenir le début de la PR et/ou d'en améliorer ses symptômes. Dans les années à

venir, il est donc probable que voient le jour des inhibiteurs de PAD capables d’offrir un

rapport bénéfique/risque intéressant pour les patients.

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ANNEXESANNEXESDISCUSSION GÉNÉRALE

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

DISCUSSION GÉNÉRALE

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

INTRODUCTION

DISCUSSION GÉNÉRALE

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Annexes

- 203 -

Annexe 1 : Revue générale sur les peptidyl-arginine désiminase

Update on peptidylarginine deiminases and deimination in skin physiology and severe

human diseases.

International Journal of Cosmetic Sciences, 29 :147-168, 2007.

Méchin M-C, Sebbag M, Arnaud J, Nachat R, Foulquier C, Adoue V, Coudane F, Duplan

H, Schmitt A-M, Chavanas S, Guerrin M, Serre G and Simon M.

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Review Article

Update on peptidylarginine deiminases and

deimination in skin physiology and severe human

diseases

M.-C. Mechin*, M. Sebbag*, J. Arnaud*, R. Nachat*1, C. Foulquier*, V. Adoue*, F. Coudane*, H. Duplan�,

A.-M. Schmitt�, S. Chavanas*, M. Guerrin*, G. Serre* and M. Simon*

*CNRS-University of Toulouse III, UMR5165, Institut Federatif de Recherche Claude de Preval, IFR30 (INSERM-CNRS-

Universite Paul Sabatier-Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse), Toulouse and �Institut de Recherche Pierre

Fabre, Toulouse, France

Received 22 December 2006, Accepted 9 February 2007

Keywords: differentiation, inflammation, post-translational modification, rheumatoid arthritis, skin barrier

1Present address: Epithelial Cell Biology (Skin), Cambridge Research Institute, Lika Shing Centre, Robinson

Way, Cambridge CB2 ORE, U.K.

Synopsis

Deimination (or citrullination) is a recently des-

cribed post-translational modification, but its conse-

quences are not yet well understood. It is catalysed

by peptidylarginine deiminases (PADs). These

enzymes transform arginyl residues involved in a

peptidyl link into citrullyl residues in a calcium-

dependent manner. Several PAD substrates have

already been identified like filaggrin and keratins K1

and K10 in the epidermis, trichohyalin in hair folli-

cles, but also ubiquitous proteins like histones. PADs

act in a large panel of physiological functions as cel-

lular differentiation or gene regulation. It has been

suggested that deimination plays a role in many

major diseases such as rheumatoid arthritis, mul-

tiple sclerosis, Alzheimer’s disease and psoriasis.

Five human genes (PADIs), encoding five highly

conserved paralogous enzymes (PAD1-4 and 6),

have been characterized. These genes are clustered

in a single locus, at 1p35-36 in man. Only PAD1-3

are expressed in human epidermis. PADs seem to be

controlled at transcriptional, translational and

activity levels and they present particular substrate

specificities. In this review, we shall discuss these

main biochemical, genetic and functional aspects of

PADs together with their pathophysiological impli-

cations.

Resume

La desimination (ou citrullination) est une modifica-

tion post-traductionnelle catalysee par les peptidyl-

arginine desiminases (PADs), decrite depuis peu et

dont les consequences sont encore mal comprises.

Ces enzymes transforment, de facon dependante du

calcium, les residus arginyl engages dans un lien

peptidique en residus citrullyl. Plusieurs substrats

ont ete identifies: la filaggrine et les cytokeratines

K1 et K10 de l’epiderme, la trichohyaline dans le

follicule pileux mais aussi des proteines ubiquistes

comme les histones. Les PADs interviennent dans de

nombreuses fonctions physiologiques telles que la

differenciation cellulaire ou la regulation genique.

La desimination pourrait jouer un role dans plu-

sieurs maladies severes et frequentes comme la poly-

arthrite rhumatoıde, la sclerose en plaque, la

maladie d’Alzheimer ou encore le psoriasis. Cinq

genes humains (PADIs) codant pour 5 enzymes par-

alogues conservees (PAD1-4 et 6) ont ete cara-

cterises. Ils sont regroupes en un seul locus, en

1p35-36 chez l’homme. Seules les PAD1-3 sont ex-

primees dans l’epiderme humain. Les PADs semb-

lent controlees aux niveaux transcriptionnel et

Correspondence: Marie-Claire Mechin, UMR5165, Faculte

de Medecine, 37 allees Jules Guesde, F-31073 Toulouse

cedex, France. Tel.: +33 561145948; fax: +33

561145938; e-mail: [email protected]

International Journal of Cosmetic Science, 2007, 29, 147–168

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 Society of Cosmetic Scientists and the Societe Francaise de Cosmetologie 147

- 205 -

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traductionnel, ainsi qu’au niveau de leur activite.

Elles presentent chacune leurs specificites de subst-

rats. Ces principaux aspects biochimiques, gene-

tiques et fonctionnels des PADs tout comme leurs

implications physiopathologiques seront discutes

dans cette revue.

Introduction to deimination by PADs

Deimination or citrullination, a post-translational

modification

Many post-translational modifications have been

characterized as the biochemistry of proteins was

studied. With new technologies and proteomic

approaches, many others will probably be discov-

ered soon and their implications in cell biology will

become better understood (For a review see

Ref. [1]).

Here, we propose to describe one not well-known

modification of proteins, deimination (or citrullina-

tion). First described in hair follicles and the epider-

mis [2], deimination is the calcium-dependent

conversion of an arginyl residue, in a (poly)-peptide,

into a citrullyl residue by a peptidylarginine deimi-

nase (PAD, EC 3.5.3.15) (Fig. 1). Five PADs are

known in mammals. Each deimination reaction

generates a charge loss potentially leading to modi-

fications in the conformation of the PAD substrate

and subsequently in its interactions.

Identification and properties of PADs

PADs, a new family of enzymes

With a molecular genomic approach, we recently

demonstrated the clustering of the five human

PADI genes at a single locus at 1p35-36 [3]

H2O

H2O

H2O

Ca2+

Ca2+

PAD

NH4

+

PAD4

NH3CH3

+

NH2

NH2

H2N

H2N

+

HN

N H

O

R2

R2

R2

R1

R1

R1

Arginyl-

NHCH3

+

H

N H

O

Mono-methyl-arginyl-

HN

N H

O

O

Citrullyl-

Figure 1 Schematic representation

of the citrullination reactions. Pepti-

dylarginine deiminase (PAD)-medi-

ated citrullination corresponds to

the transformation into a citrullyl

residue, in the presence of calcium,

of either an arginyl residue or of a

mono-methyl-arginyl residue, releas-

ing ammonia or methylamine,

respectively. To note that, so far

only PAD4 has been demonstrated

to act on mono-methyl-arginyl-resi-

dues. R1 and R2 refer to amino-acyl

residues involved in a peptide bond

with the targeted (mono-methyl-)-

arginyl residue.

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168148

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

- 206 -

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(Fig. 2a). The five genes encode distinct PAD iso-

types named PAD1-4 and PAD6 (PAD4 was also

previously designated as PAD5). Actually, the clo-

ning and the characterization of all PADI genes

required more than a decade and the investiga-

tions of many research teams. Briefly, cDNAs

encoding the ‘Pad muscle type’ of rat and mouse

were cloned first, corresponding to the Pad2 iso-

type [4–6]. Next, cDNAs from rodents coding for

the ‘Pad follicle type’, identified as Pad3 isotype,

and the ‘Pad epidermis type’, initially defined as

Pad1 isotype, were isolated [7–9]. Subsequently, a

new isotype called PAD4 was identified from HL-

60 cells (a human myeloid leukaemia cell line)

[10] and the cDNAs of human PAD1-3 were char-

acterized [11–13]. Finally, cDNAs encoding the

last isotype, PAD6, also known as ePad in mouse,

were identified [3, 14, 15]. PAD6 and/or ePad

mRNAs have been detected in ovary, testis, periph-

eral blood leucocytes, oocytes and early cleavage-

stage embryos [3, 14, 15]. The five human PAD

isotypes are highly conserved at the protein level

with 59–71% of homology (Table I). Conservation

has also been demonstrated at the levels of nucleo-

tide sequences and organization of the human and

murine PADI gene loci [3] (Fig. 2b). Conservation

of intergenic non-coding sequences suggests that

they may play a role in a possible co-regulation of

these genes.

Substrates and specificities of PADs

Peptidylarginine deiminase activity has been detec-

ted in all vertebrates and in most organs, tissues

and cells. Several substrates of PADs have been

identified in vivo, in particular structural proteins:

intermediate filament (IF) proteins, such as kera-

tins K1 and K10, vimentin and glial fibrillary aci-

dic protein (GFAP), and IF-associated proteins like

filaggrin and trichohyalin [16–22]. Other sub-

strates are nuclear proteins, histones (H2A, H3

and H4) and nucleophosmin/B23 [23], and also

extra-cellular proteins such as fibrin and fibronec-

tin [24, 25]. These PAD targets are involved in

biological functions as diverse as epidermal differ-

entiation, gene regulation and inflammation/

coagulation. Generally, they are abundant proteins

and present a high percentage of arginine in their

primary sequence. This is the case, for example,

for trichohyalin (22.7%), filaggrin (11%), GFAP

(10.9%) and vimentin (9.2%). It is interesting to

note that the PAD substrates already known are

Telomere

4E1 < << >

62.0

32.8

11.2

27.4

2.5

25.3

Padi 4 Padi 3 Padi 1 Padi 2

46.2

Padi 6

< 15.2

23.9

(b)

Telomere

1p35-36< << >

85.7

40.9

24.0

55.5

3.1

35.1

PADI 4 PADI 3 PADI 1 PADI 2

50.7

PADI 6

< 29.5

8.0(a)

Figure 2 Schematic representation of the human PADI (a) and mouse Padi (b) loci at 1p35-36 and 4E1, respectively.

For each locus, sizes of the genes and of intergenic regions are indicated in kb at the bottom and top, respectively. The

open arrows represent the transcription direction of each gene. Note that PADI2 (or Padi2) transcription takes place in

the opposite direction to the other PADI genes.

Table I Percentage of homology between primary

human peptidylarginine deiminases (PAD) amino-acid

sequences, theoretical isoelectric point (pI) and calculated

molecular mass (kDa) of each human PAD

% homology PAD1 PAD2 PAD3 PAD4 PAD6 pI kDa

PAD1 100 65 68 71 59 6.01 74.6

PAD2 100 67 65 59 5.40 75.3

PAD3 100 68 60 5.25 74.6

PAD4 100 61 6.15 74.0

PAD6 100 4.97 77.7

These data were extracted from the sequences of human PAD1,

2, 3, 4 and 6 corresponding to GenBank accession numbers

AB033768,AB030176,AB026831,AB017919andAY422079, res-

pectively. Percentages of homology were calculated by Blast

analysis and clustalw program, as previously described [13].

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 149

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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often basic proteins (or contain basic domains)

whereas PADs themselves are rather acidic accord-

ing to their theoretical isoelectric point (Table I).

This probably facilitates the interactions between

these enzymes and their substrates.

Deimination by PADs takes place on arginine in

a peptidyl link, in specific amino-acid environ-

ments and under particular structural constraints.

Trichohyalin, mainly helicoidal, is poorly deimi-

nated in vitro by Pad2 whereas filaggrin, less

structured, is fully modified, as demonstrated by

biophysical data [19]. The substrate specificity of

Pad2 is the best known, as a purified Pad2 from

rabbit muscle has been commercially available for

many years. For this isotype, it has been shown by

using peptides that an N-terminal arginine is

poorly deiminated, that proline or glutamic acid

contiguous to the arginine are not favourable

amino-acids, and that the first of two consecutive

arginines are better deiminated [19, 26, 27]. The

specificity of purified recombinant human PAD1-3

towards nine synthetic arginine-derivatives has

been analysed and shown to differ between these

three isotypes [28]. PAD2, for example, is more

active on tosyl-l-Arg-O-Me or benzoyl-l-Arg-O-Et

than PAD1 and 3. After deimination, the migra-

tion of a protein in an sodium dodecyl sulfate-gel

can change dramatically, as observed for trichohy-

alin and filaggrin [19, 28]. Migration of filaggrin

is not the same when it is deiminated by PAD1, 2

or 3, suggesting that different arginines are modi-

fied and thus arguing again for the specificity of

each type of PAD [28]. Similarly, some arginyl res-

idues of the Aa- and Bb-chains of human fibrin-

ogen exhibit different sensitivities to deimination

by recombinant PAD2 or PAD4 [29]. Overall,

these catalytic specificities suggest possible comple-

mentarities of PAD isotypes to deiminate several

arginines of a particular target. Finally, the recom-

binant forms of PAD1-3 have shown, on several

synthetic arginine derivatives, relative activities

similar to those of PAD1-3 purified from diverse

organs [28, 30–33] (Table II). This suggests that

PADs do not require eukaryote-specific post-trans-

lational modification(s) to be active. Nevertheless,

PADs (at least PAD1-3) were found to be capable

of calcium-dependent ‘auto-deimination’ in an in

vitro assay [M-C Mechin, unpubl. data]. The ques-

tions ‘Does auto-deimination happen in vivo?’ and

if so ‘What is its function?’ remain unanswered.

PAD4, nuclear location and crystal structure

PAD4, mainly expressed in haematopoietic cells,

carries a functional nuclear localization signal

(56-PPAKKKST-63, poorly conserved in mouse

Pad4) as demonstrated by transfection of HeLa

cells (a human carcinoma cell line) [34]. In the

nucleus of MCF-7 cells (a human breast carcinoma

cell line) and murine early-stage embryos, PAD4

deiminates arginyl and mono-methyl-arginyl resi-

dues on the N-terminal head of histones H3 and

Table II Comparison of the relative activities on synthetic substrates and on protamin of recombinant peptidylarginine

deiminases (PAD)1, 2 and 3 and the corresponding enzymes purified from various tissues and species

Relative

activity (%)

PAD1 PAD2 PAD3

Rec1 mEp2 bMu3 Rec1 mEp4 rMu5 mEp6 rabMu7 Rec1 mEp8 rMu9

Bz-l-Arg-O-Et 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Bz-l-Arg-O-Me 88.7 71.4 / 46.5 83.0 77.9 68.3 83.9 57.6 26.8 /

Bz-l-Arg-O-NH2 100.2 150 / 50.5 48.7 51.8 48.7 41.4 73.1 88.4 /

Tos-l-Arg-O-Me 3.2 19.6 / 62.9 51.6 / 63.0 65.9 18.2 27.4 /

Ac-l-Arg-O-Me 105.1 66.7 / 33.0 39.5 44.8 44.7 42.5 26.5 32.1 /

Bz-l-Arg 109.6 102 106 18.7 14.2 18.5 18.4 14.9 19.7 11.6 18.0

Ac-l-Arg 113.2 65.0 / 2.4 13.0 / 3.3 2.6 7.2 11.6 /

l-Arg-O-Me 10.3 14.3 / 2.1 2.8 / 2.0 1.8 5.7 15.3 /

l-Arg 15.7 15.0 7.0 4.9 3.7 0.84 4.0 2.6 4.2 8.9 2.4

Protamin 109.5 37.5 / 115.3 59.0 / / / 218.6 141.1 /

(Rec1), Pure human recombinant PAD 1, 2 and 3 were produced as previously described [28]. (mEp2) and (bMu3), PAD1 was purified

from mouse [33] and bovine [31] epidermis, respectively. (mEp4) and (mEp6), PAD2 was purified from mouse epidermis [32 and 33,

respectively]. (rMu5) and (rabMu7), PAD2 was purified from rat [31] and rabbit [30] skeletal muscles, respectively. (mEp8) and (rMu9),

PAD3 was purified from mouse epidermis [33] and rat hair follicles [31], respectively.

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168150

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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H4 [35–37]. Deimination (or ‘demethylimination’)

of mono-methyl-arginyl residues produces a cit-

rullyl-residue and methylamine (Fig. 1). This reac-

tion antagonizes the histone methylation of

arginines normally associated to transcription

induction. These data are of major importance

because they are the first demonstration of a poss-

ible reversibility of the methylation of histones ar-

ginyl residues and of the involvement of

deimination (at least by PAD4) in gene regulation

[38]. In contrast, di-methyl-arginyl residues could

not be deiminated by PAD4. The deimination of

histones H2A, H3 and H4 has also been described

in HL-60 granulocytes where only one or two

methyl-arginyl residues are transformed into cit-

rullyl residues according to mass spectrometry

measurements [39].

PAD4 crystal structure has been resolved at

2.3A and disclosed a head-to-tail homo-dimeric

structure with two immunoglobulin-like sub-

domains in the N-terminal part and five bbab‘propeller-modules’ in the C-terminal half [40, 41].

At least seven amino-acids have been implicated

in the formation of the catalytic PAD4 cleft with a

direct action of Cys-645, Asp-350, His-471 and

Asp-473 in the catalytic mechanism. Five cal-

cium-binding sites, with no EF-hand similarities,

have also been defined. According to multiple

alignments of PAD4 with the other PAD isotypes,

we show that the position of the amino-acids

involved in catalysis and calcium-binding sites are

conserved (Tables III and IV), confirming the close

similarity between PADs. Nevertheless PAD6

appears as the most divergent isotype of the fam-

ily, as previously suggested by phylogenetic

approaches and according to the comparison of

non-synonymous (dN) to synonymous (dS) nucleo-

tide substitution rates (dN/dS) between paralogous

PADI genes [3, 43].

Structural model of PAD1

We produced a 3D model of PAD1 using the

atomic coordinates derived from the analysis of

PAD4 crystal structures [40], as described in detail

in the legend of Fig. 3. This allowed us to precisely

point out, at the structural level, the conservation

and differences between these two isotypes. The

3D modelling of PAD1 showed conformational

changes of several regions after calcium binding

(compare Figs 3a,b), concerning in particular three

loops (indicated by arrowheads). These loops get

closer and seem to cap the active site cleft. As

expected, in the active site, the catalytic residues

of PAD1, deduced from the alignments and con-

served for all PADs (Asp-352, His-472, Asp-474

and Cys-645 corresponding to Asp-350, His-471,

Asp-473 and Cys-645 of PAD4; Table III), are

located in the bottom of the modelled cleft (Fig. 3a),

and shift slightly to get closer after calcium binding

(Fig. 3b). They probably act directly in the

deimination reaction with the peptidyl-arginyl

residue. In contrast, the three other amino-acids of

the PAD1 active site (Arg-374, Arg-376 and

Table III Amino-acids involved in

peptidylarginine deiminases (PAD)4

catalysis cleft are conserved between

PADs

PAD/Pad Asp-350 Arg-372 Arg-374 His-471 Asp-473 Arg-639 Cys-645

1 D R R H D L C

2 D R G H D F C

3 D R G H D L C

4 D R R H D R/Y C

6 D Q/R A/S H D E/N A*

Comparisons were made according to the multiple alignment of primary human and

murine PAD sequences using the multalin program [42]. The human sequences

correspond to GenBank accession numbers given in Table I, the mouse sequences

correspond to GenBank accession numbers NM_011059, NM_008812, NM_011060,

NM_011061 and AB121692 for the mouse Pad 1, 2, 3, 4 and 6, respectively. Amino-acid

numbers are defined on the human PAD4 sequence. If the amino-acids are conserved

between the orthologous sequences, only one letter is indicated at the corresponding

position. When two amino-acids are indicated, the first one is for the human sequence and

the second for the orthologous mouse sequence. Bold letters: identical amino-acids. *: in

the PAD6 sequence two cysteines surround the Ala-676 aligned with the Cys-645 of

PAD4, and in Pad6 one cysteine is situated just before the aligned Ala-665.

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 151

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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Leu-639 corresponding to Arg-372, Arg-374 and

Arg-639 of PAD4), less conserved (Table III), may

play a role in the substrate specificity. They are

clearly located at the entry of the active site cleft

and move widely after calcium binding to become

closer together (compare Figs 3a,b). In that way,

they could constitute a kind of filter for substrates,

some of them being ‘allowed’ to enter whereas

Table IV Amino-acids involved in peptidylarginine deiminases (PAD)4 calcium-binding sites are conserved between

PADs.

Ca2+ sites:

1: PAD/Pad Gln-349 Glu-353 Phe-407 Leu-410 Glu-411

1 Q E F L D

2 Q E F L E

3 Q E F L E

4 Q E F L E

6 Q E I L M

2: PAD/Pad Glu–351 Asp-369 Ser-370 Asn-373

1 E D S N

2 E D S D

3 E D S N

4 E D S N/D

6 E D T A/V

3: PAD/Pad Asn-153 Asp-155 Asp-157 Asp-165 Asp-176 Asp-179

1 N D D D D D

2 N D E/D D D D

3 N D D D D D

4 N D D/E D D D

6 N N/S N/A D E/I N

4: PAD/Pad Asp-155 Asp-157 Asp-179 Asp-388

1 D D D D

2 D E/D D D

3 D D D D

4 D D/E D D/N

6 N/S N/A N G

5: PAD/Pad Asp-165 Asp-168 Glu-170

1 D H/A W/H

2 D D K

3 D D H/Y

4 D D E/K

6 D T/S K/Q

Comparisons were made according to the multiple alignment of primary human and murine PAD sequences, as described in Table III.

Amino-acid numbers are defined on the primary human PAD4 sequence. If the amino-acids are conserved between the orthologous

sequences, only one letter is indicated at the corresponding position. When two amino-acids are indicated, the first one is for the human

sequence and the second for the murine sequence. Bold letters: identical amino-acids. Italic letters: homologous amino-acids.

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168152

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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others would not because of structural constraints

and the charge environment. These 3D models of

PAD1 provide structural clues for the fine specifici-

ty of PADs and highlight their conservation.

PAD6, the isotype involved in embryonic develop-

ment

PAD6 is the latest (and the last) isotype of the

family to be identified and the most divergent. Its

cDNA has been cloned from a human ovary lib-

rary and a human foetal brain library [3, 45]. A

proteomic approach has evidenced Pad6 (or ePad)

expression in murine oocytes, where its action

during remodelling of filamentous cytoskeletal

structures has been suggested [15]. Pad6 has

been detected in the cytoplasm and weakly in the

nucleus of murine blastocytes [15]. This isotype

presents a short lysine-rich motif in its N-terminal

part (132-SDKQAKKK-139, conserved in PAD6),

but its role in the nuclear addressing of Pad6

remains to be tested. The amino-acids of the

catalytic site defined for PAD4 are partially con-

served in the PAD6 sequence (Table III). In

particular, the Cys-645 of PAD4 is not aligned

with any cysteine of PAD6 but with an alanine

surrounded by two cysteines. Nevertheless, a

recombinant form of PAD6 is active, at least on

the soya bean trypsin inhibitor [14]. Further-

more, an anti-ePad antibody has been shown to

inhibit mouse embryonic development before

implantation, with a reduction of the percentage

of blastocyst formation from 90% to 60% [46].

Surprisingly, in this paper, it is proposed that

Pad6 is an extra-cellular protein released from

cortical granules when they undergo exocytosis.

As a signal peptide is predicted for the mouse

Pad6 but not for its human ortholog, this

remains to be demonstrated. Finally, a patent has

been taken out on PAD6 for its putative contra-

ceptive usefulness [14].

Regulation of PADs and deimination:

multilock control points

Calcium

It has long been well documented that the cata-

lysis of deimination by PADs is absolutely depend-

ent on the presence of calcium. As the PAD4

crystal structure is available, this calcium depend-

ence can be better understood at the ‘atomic’ level

[40, 41]. No bivalent cation among eight (mag-

nesium, manganese, cobalt, strontium, barium,

(a) (b)

Figure 3 3D modelling of peptidylarginine deiminase (PAD) 1 according to PAD4 crystal-structures. Schematic ribbon

representations of the 3D structure of PAD1 were derived from the following PAD4 atomic co-ordinates available in the

Protein Data Bank [http://www.wwpdb.org]: Ca2+-free PAD4 (PDB accession code 1WD8) and PAD4 complexed to

Ca2+ and benzoyl-l-arginine amide as a substrate (1WDA) [40]. All the 3D modelling structures were produced by the

Bioinformatic Tool Server @TOME (@utomatic Threading Optimization Modeling & Evaluation) at the CBS Informatic

Team [bioserv.cbs.cnrs.fr] [44]. Furthermore, these models have been refined by energy minimization (3000 iterations)

and validated by Ramachandran plot analyses (data not shown) using MSI Insight II modules Biopolymer, CHARMM

and Viewer on an O2 SGI workstation (a and b). Illustrations of the 3D modelling of Ca2+-free PAD1 (derived from

1WD8) and of Ca2+-bound PAD1 complexed to benzoyl-l-arginine amide (derived from 1WDA), respectively. The immu-

noglobulin-like sub-domains 1 (residues 1–121) and 2 (residues 122–298) are in green and purple, respectively, and

the C-terminal domain is in yellow. The seven amino-acids of the active site are shown by using space-filling representa-

tion. The two arginines (Arg-374 and Arg-376) and the leucine (Leu-639) probably involved in the specificity of PAD1

are in green and purple, respectively. Among the four amino-acids directly involved in the deimination reaction, the

two aspartic acids (Asp-352 and Asp-474) are in black, the histidine (His-473) is in blue and the cysteine (Cys-645) in

red. The two structures are roughly superimposable except for particular regions pointed by arrows in the N-terminal-

and arrowheads in the C-terminal domain, respectively. In (b), the five calcium ions are indicated by asterisks.

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ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 153

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nickel, zinc and copper) was able to replace

calcium in a rabbit muscle Pad2 activity assay.

Some inhibition was even observed with mangan-

ese (80%), nickel (65%) or cobalt (25%) [30].

PAD1–3 need 1- to 2.5-mM calcium to be fully

efficient in vitro on human purified filaggrin, and 4

to 20 mM on benzoyl-l-Arg-O-Et [28]. Even if

amino-acids of the calcium-binding sites are lar-

gely conserved (Table IV), calcium sensitivity of

PAD1–3 differs from one isotype to another and

depends on the nature of substrate (small synthetic

arginine-derivatives vs. structured proteins) [28].

Surprisingly, the calcium concentration used to

determine PAD activity (usually 10 mM) is consid-

erably higher than the intracellular physiological

calcium concentration (around 100 nM) of non-

activated cells. It has been suggested that high cal-

cium concentrations could occur locally in cells or

in extreme situations like apoptosis or necrosis

(For a review see Ref. [47]). This hypothesis

encouraged the research of deiminated proteins

after a calcium-ionophore treatment of cultured

cells. A 70-kDa nuclear protein and vimentin were

detected as targets of PADs in these in vitro models

[48, 49]. More recently, the overexpression of

PAD4 in cultured haematopoietic cell lines has

been shown to induce a cell death programme

involving (i) the increase of p53 and p21, leading

to cell-cycle arrest, (ii) a deregulation of the Bax/

Bcl2 balance, (iii) a large release of cytochrome c

from mitochondria to cytosol and (iv) the activa-

tion of the apoptosome/caspase cascade [50]. Sur-

prisingly, no deiminated protein could be detected

in this model. So, the mechanism of PAD action in

apoptosis should be analysed in detail to be fully

understood.

Calcium also seems to play a role in the regula-

tion of the expression of PADI genes. When nor-

mal human keratinocytes are cultured at low

(0.15 mM) or high (1.2 mM) calcium concentra-

tions, the PADI2 and PADI3 relative mRNA levels

are weakly but significantly increased (two fold) at

the high calcium concentration, as shown by real

time polymerase chain reaction [51, 52]. Sp1 and

Sp3 bind to the minimal promoter of PADI2 as cis-

acting factors. They have been involved in its

basal transcription and the Sp1/Sp3 ratio may

constitute a basal mechanism to control PADI2

transcription. The basal- and calcium-induced

activity of the minimal promoter of PADI3 also

depends on the ratio of Sp1 and Sp3, and involves

the NF-Y transcription factor.

Calcium therefore appears as a major regulator

of PADs as it acts at both the activity and tran-

scriptional levels.

Oestrogens and other hormones

Several in vivo experiments in rodents have shown

an oestrogen-modulation of Pad2 activity in

the pituitary gland and the uterus (during the

oestrous cycle). This was also observed in the

MtT/S rat cell line (derived from pituitary cells)

cultured in vitro [53–59]. PAD activity is low in

the uterus of ovariectomized rats and restored to a

normal level in 4 days after injections of oestra-

diol, but not of testosterone or progesterone [53].

Moreover, when injected simultaneously, prog-

esterone antagonizes the induction by 17-b-oestra-

diol-3-benzoate of PAD activity in the uterus of

ovariectomized mice [57]. In MtT/S cells, insulin

treatment (1 ng mL)1) over 15 h increases PAD

activity and mRNA level [56]. This increase could

also depend on oestrogen as it is not observed in

the presence of steroid-depleted culture medium.

Clearly, oestrogen and other hormones – at least

progesterone and insulin – regulate the activity of

Pad2 and maybe that of the other PAD isotypes.

Other molecules involved in cell differentiation

Both the transcription of genes encoding PAD and

PAD activity have been shown to be modulated by

molecules inducing differentiation of different cell

types. Moreover, each PADI gene seems to be inde-

pendently controlled. In many cultured cells, like

haematopoietic cells or keratinocytes, no deiminat-

ed proteins could be detected without treatments

with vitamin D3, retinoic acid derivatives, or cal-

cium-ionophores (as mentioned above). The active

form of vitamin D3 (Vit D), 1, 25-dihydroxyvita-

min D3, is known to act on the differentiation of

keratinocytes, osteoblasts and chondrocytes, and

to play a major function in the control of calcium

and phosphate metabolism. By microarray analy-

sis, Vit D treatment (10)7 M) of cultured keratino-

cytes has been shown to regulate a complex

differentiation network [60]. The expression of 98

genes, among 12 600 analysed, was modified by

Vit D; 82 were up-regulated and 16, down-regula-

ted. The major components induced in this net-

work involved transcriptional factors (e.g. Klf-4

and Fos), structural proteins (e.g. involucrin), pro-

teases (several kallikreins), protease inhibitors

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168154

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(several B-serpins) and post-translational modifica-

tion enzymes like PAD1-3 [60].

In haematopoietic cells, as HL-60 cells, PAD4

expression and activity are detected only when

they are induced to differentiate in granulocytes

by all-trans-retinoic acid (10)6 M) or in mono-

cytes by Vit D (10)7 M) after 2–5 days of treat-

ment [10]. Treatment of the cells with a phorbol

ester (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) at

10 ng mL)1 fails to induce this expression. Induc-

tion of PAD activity by retinoic acid (0.5 10)6 M)

has also been observed in a newborn rat keratino-

cyte cell line [61].

PAD2 and PAD4 are expressed in cells of both

peripheral blood and synovial fluid of rheumatoid

arthritis patients and their expression seems to be

finely regulated according to the differentiation

state of the cells. PADI2 and PADI4 mRNA were

reported to be expressed in monocytes [CD14-pos-

itive peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)]

but PADI4 mRNA could not be detected in macr-

ophages (obtained by a 7-days culture of adherent

PBMCs) where PADI2 mRNA was observed [62].

Surprisingly, in that study, PAD4 protein has been

immunodetected not only in monocytes, but also

in macrophages. In contrast, PAD2 has been

immunodetected only in macrophages [62].

Although it was not investigated whether mRNA

stability or translation efficiency was affected, a

luciferase gene reporter approach has shown that

the long 3¢ UTR of the PADI2 mRNA (>2 kb)

probably plays a role in the regulation of the pro-

tein production [62]. In the same way, PAD2

expression in optic nerve cells seems to be regula-

ted at the translational level [63]. To date, nothing

has been published about PAD6 regulation.

Altogether, these data show that the regulation

of PADs is highly complex with multilock control

points at transcriptional, translational and activity

levels.

Modulators of PAD activity

Given the importance of calcium for PAD activity,

calcium chelators such as EDTA or EGTA obvi-

ously constitute early recognized PAD inhibitors.

Other inhibitors of PAD were mentioned long ago.

For example, agents that covalently modify cystei-

nyl residues such as monoiodoacetamide and

p-chloromercuribenzoate inhibited a rat epidermal

Pad preparation with a concentration inducing

50% of inhibition (IC50) of �100 lM and �1 lM,

respectively [64]. In line with these observations,

PAD activity has also been described as positively

influenced by the presence of reducing agents,

especially dithiothreitol. In general, PAD activity

reaches a plateau at 2–10 mM of DTT depending

on the isotype considered [30, 33, 64]. Three

inhibitors of PADs have been identified recently,

namely paclitaxel (a taxol derivative), 2-chloroace-

tamidine, and fluoroacetamidine [65–67]. Paclit-

axel carries a long chemical side arm similar to a

frequently used synthetic arginine derivative sub-

strate, the a-N-benzoyl-l-arginine-ethyl-ester. The

direct binding of micellar-tritiated paclitaxel to a

purified bovine Pad2 has been demonstrated with

an IC50 of �5 mM. The small 2-chloroacetamine

has been defined as an irreversible inhibitor of

PAD4 with an IC50 of �3 mM. F-amidine, a com-

pound similar to the PAD synthetic substrate a-N-

benzoyl-l-arginine-amide, appears as the most

potent inhibitor of PAD4 with an IC50 of �20 lM

when pre-incubated with calcium, and an

IC50 > 200 lM without calcium. These molecules

interact with the catalytic site of PADs producing

irreversible inhibitions. Particularly, all the com-

pounds able to covalently modify the SH group of

cysteinyl residues probably inhibit the enzyme via

modification of the highly conserved cysteinyl resi-

due (Cys-645 in PAD4) of the catalytic site, which

has been proposed to initiate the citrullination

reaction by nucleophilic attack of the Cf atom of

peptidyl-arginine [40]. Accordingly, two potential

mechanisms of PAD4 inactivation have been

recently proposed, both directly involving the cata-

lytic Cys-645 residue [68].

PADs in skin physiology

The known substrates of PADs in the epidermis

are cytoskeletal proteins and filaggrin, a crucial

protein for the moisturizing of the stratum cor-

neum

During the nineties, three major substrates of

PADs were identified in mouse, rat, guinea pig or

human epidermis [17, 18, 69, 70]. The presence

of deiminated proteins mainly in the stratum

corneum (SC) already suggested a function for

deimination during terminal differentiation of

keratinocytes. In a urea/2-mercaptoethanol-

soluble-fraction of human epidermis, two deimina-

ted proteins have been identified as keratin 1 (K1)

and keratin 10 (K10) [17, 18, 69, 70]. Later, the

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ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 155

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arginine of the murine sequence GSSGGGRGGSS of

the V2-subdomain in the non-helicoidal tail of K1

was defined as a deimination site [18]. The third

substrate to be identified was filaggrin [17, 69,

70]. Filaggrin is a basic protein found in abun-

dance in the epidermis. It is synthesized by kera-

tinocytes of the granular layer as a large precursor

(400 kDa in man) called profilaggrin, an essential

component of type F keratohyalin granules (KHG).

During the granular keratinocyte to corneocyte

transition, profilaggrin is proteolysed into filaggrin

units (in man, profilaggrin contains 10–12 filag-

grin units). These histidine- and arginine-rich

units associate with the keratin IFs facilitating

their aggregation and the resulting formation of

the intracorneocyte fibrous matrix. After its deimi-

nation in the stratum compactum, each filaggrin

unit is thought to dissociate from the matrix and

to be fully proteolysed to generate free amino-acids

of the Natural Moisturizing Factor (NMF), a com-

plex mixture of osmotic agents essential to main-

tain 10–15% water in the SC [71] (For review see

Refs [72, 73]). The NMF is composed of glycerol,

urea, lactate, ions and free amino-acids (52%), of

which two derivatives have been characterized:

pyrrolidone carboxylic acid and trans-urocanic

acid. Pyrrolidone carboxylic acid derived from glu-

tamine is the most hygroscopic amino-acid, and

trans-urocanic acid derived from histidine contri-

butes to photoprotection by partially absorbing

ultraviolet radiation. The amino-acids of NMF are

nearly all produced from the degradation of filag-

grin, their relative proportion being closely related

to the filaggrin composition [71]. Recently, profi-

laggrin variants, with non-sense mutations (e.g.

R501X, 2282del4) have been defined as very

strong pre-disposing factors for atopic dermatitis

(OMIM # %603165) and causative factors of

ichtyosis vulgaris (OMIM # 146700) [74, 75].

We have demonstrated the capacity of purified

recombinant PADs to deiminate human filaggrin

in vitro with different calcium and pH sensitivities

according to the isotype of the used enzyme [28].

These differences could regulate filaggrin deimina-

tion in vivo as calcium- and pH-gradients are

known to exist in the SC [76, 77].

PAD1–3 location, expression and function in

epidermis differentiation

At the mRNA level, PAD1 has been shown to be

preferentially expressed in human epidermis,

placenta, prostate, spleen, testis and thymus [13].

High levels of PAD1 are immunodetected in the

cytoplasm of living keratinocytes – with an

increasing intensity of staining from the stratum

basale to the stratum granulosum – as well as in

all layers of the SC [13, 28] (Fig. 4a). PAD2, the

most ubiquitous PAD according to RT-PCR analy-

sis, shows a cytoplasmic labelling in all the living

layers of the epidermis with a pericellular staining

of granular keratinocytes [78]. PAD3, also in the

cytosol, has been detected in the granular layer

and the deeper layers of the SC [78, 28] (Fig. 4b).

PAD3 mRNA has been detected from prostate,

small intestine, testis, thymus, lung, kidney, pan-

creas, skin and epidermis [78]. At the mRNA level,

PAD4 and PAD6 have not been detected in

human epidermis. PAD1 and 3 are co-located with

profilaggrin on KHG (Figs 4c and 5) [28]. Until

now, deiminated proteins have not been immuno-

detected in human and mouse epidermal kerato-

hyalin granules, and guinea pig profilaggrin has

been shown to be devoid of citrulline [79]. This

suggests that deimination by PADs is prevented in

the granules, e.g. by a low local concentration of

calcium. Interestingly in this context, profilaggrin

and other components of the KHG contain active

calcium-binding sites of the EF-hand type in their

amino-terminus, the function of which is not

known. One may speculate about a possible chela-

tion of calcium by these molecules that in turn

inactivates the PADs. However, perinuclear gran-

ules of buccal mucosa cells and cytoplasmic gran-

ules of cultured epidermis keratinocytes contain

deiminated proteins immunologically and bio-

chemically related to profilaggrin [80, 81]. These

data show that deimination may occur on KHG

during keratinocyte terminal differentiation

programs related to but different from epidermis

differentiation, in particular when keratinocytes

are kept in a highly humid environment. PAD1

and 3 are also located in the cytoplasmic matrix of

the deeper corneocyte layers (Figs 4c and 5),

where deimination of filaggrin takes place. They

have therefore been proposed to deiminate filag-

grin in vivo [28]. PAD1 isotype is also the best

candidate for keratin deimination because it is the

only isotype which persists up to the top of the SC

where K1 and K10 are probably modified [28, 82]

(Figs 4a and 5). It is not really known whether fil-

aggrin and keratin deiminations are co-ordinated

or separate events in the SC, but the latter seems

to be delayed. Also the role of keratin deimination

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168156

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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is not known. We can only suppose that deimina-

tion of keratins is involved in modifications of the

corneocyte cytoplasmic matrix, as observed at the

ultrastructural level, as both events are concomit-

ant [28].

PADs in cutaneous appendages

We have also analysed PAD1–3 expression and

the presence of deiminated proteins in several

human skin appendages, especially in anagen

hair follicles (i.e. the growth phase of the follicles)

[83]. PAD1 and 2 have been immuno-localized in

arrector pili muscles and in secretory and

myoepithelial cells of sweat glands. PAD1 and 3

have been immunodetected in the hair follicles:

PAD1 in the companion layer between the inner

and outer root sheaths, and in the Huxley layer

and the non-cornified part of the cuticle of the

inner root sheath (IRS); PAD3 in the non-corni-

fied Henle and Huxley layers, and IRS cuticle and

in the medulla. No PADs have been detected in

sebaceous glands. Deiminated proteins have been

only detected in the IRS after cornification

occurs, first in the Henle layer then in the cuticle

and finally in the Huxley layer, and also in the

medulla. Trichohyalin, a known PAD substrate,

and PAD3 are co-located in the medulla. These

(a) (b)

(c)

Figure 4 Immuno-electron microscopy observations of peptidylarginine deiminase (PAD)1 (a) and PAD3 (b–c) in the

human stratum corneum (SC) and on keratohyalin granules (KHG). (a) Arrows indicate the small gold-particle (5-nm

diameter) labelling of PAD1 from the deeper (C1) to the upper (C6) layer of corneocytes in the SC. (b) PAD3 (gold-parti-

cles 5-nm diameter pointed with arrows) and filaggrin (gold-particles 10-nm diameter) labelling does not persist from

the third layer of corneocytes (C3). (c) Zoom on a KHG showing the presence of PAD3 (gold-particles 5-nm diameter

pointed with arrows) and profilaggrin (gold-particles 10-nm diameter). Bar ¼ 200 nm (a and b) and 100 nm (c).

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ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 157

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data and previous analyses [20, 84] strongly sug-

gest that, in the medulla, deimination of the

highly helicoidal trichohyalin by PAD3 could be

responsible for its unfolding and solubilization

from trichohyalin granules allowing its subse-

quent cross-linking by transglutaminases.

Figure 5 Schematic representation of the effects of filaggrin and keratin deimination, and peptidylarginine deiminases

(PAD) localization in the human epidermis. Left panel, PAD1, PAD2 and PAD3 , as shown by their respective number,

are located on an ultrastructural schematic view of the epidermis. Right panel, Filaggrin (Fil) is produced in the upper

granular layer from its precursor profilaggrin, a major constituent of the keratohyalin granules (KHG). Profilaggrin,

firstly phosphorylated (p) is then dephosphorylated and proteolysed in a first step at the level of its peptide linkers. The

N-terminal domain of profilaggrin, carrying two EF-hand calcium-binding sites, translocates to the nucleus, and 10–12

filaggrin units (in man) are released. These basic filaggrin units interact with keratin intermediate filaments (KIF).

PAD1 and 3, located in the stratum granulosum and the lower stratum corneum, have been proposed to deiminate fil-

aggrin at multiple sites (Cit). The deimination alters filaggrin charges, modifies filaggrin/KIF interactions and induces fil-

aggrin dissociation from KIF. Then, in the upper SC deiminated filaggrin can be fully proteolysed to produce free amino-

acids of the NMF. In the upper SC also, keratin K1 and K10 are deiminated by PAD1.

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168158

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PADs and deimination in pathology

Rheumatoid arthritis and autoimmune response to

citrullinated proteins

Rheumatoid arthritis (RA, OMIM # 180300)

affects 0.5–1% of the adult population worldwide.

It is essentially characterized by chronic inflamma-

tion of diarthrodial joints often accompanied by

systemic manifestations. Immune cells infiltrate

the synovial tissue (ST) in which synoviocytes,

and also capillaries and venules, are hyperplastic.

As a whole, they constitute the rheumatoid pan-

nus which erodes subjacent cartilage and bone

leading to irreversible articular destruction and

serious functional disability. Rheumatoid arthritis

aetiology is still unknown but autoimmune

responses are considered as key factors in its

inflammatory process. This autoimmune character

is reflected by the presence of autoantibodies of

diverse specificities in the serum of RA patients.

Among these, autoantibodies to citrullinated pro-

teins (ACPA) are thought to play an important

role in the disease pathophysiology. Indeed, not

only are ACPA by far the most disease-specific of

the RA-associated autoantibodies, but they also

often appear before clinical symptoms and are

linked to the most active and severe forms of RA.

These autoantibodies, initially described as two

independent autoantibody families, the so-called

‘antikeratin antibodies’ and the antiperinuclear

factor, have both been shown to recognize epitopes

borne by several molecular variants of filaggrin

and thus to constitute a unique family of autoanti-

bodies [80, 85, 86]. It was subsequently demon-

strated that protein deimination was indispensable

for antigen recognition by ACPA and several filag-

grin-derived peptides containing citrullyl residues

bearing epitopes recognized by ACPA were identi-

fied [87–89]. Additionally, ACPA were shown to

be secreted and concentrated in the rheumatoid

synovium [90] and, therein, major antigenic tar-

gets were identified that correspond to deiminated

forms of the a- and b-chains of fibrin [24]. Subse-

quently, we characterized the sequential epitopes

recognized on fibrin by ACPA and identified citrul-

linated peptides bearing major linear epitopes [91].

The involvement of ACPA in the pathophysiology

of RA is probably through their disease-specific

immunological conflict with deiminated fibrin,

which occurs precisely in the disease-targeted tis-

sue. We have proposed that this immunological

conflict is involved in the self-maintenance of

rheumatoid inflammation [92]. Indeed, the com-

plement- and/or Fc receptor-mediated pro-inflam-

matory effects of this conflict lead to fibrinogen

extravasation and to the formation of new fibrin

deposits in the ST. These fibrin deposits become

the substrate of one or more locally expressed

PAD(s) and constitute new targets for ACPA,

hereby maintaining the immunological conflict

and subsequent inflammation. Interestingly, the

presence of citrullinated fibronectin has recently

been described in the ST of RA patients [25]. The

reported co-location of citrullinated fibronectin

with citrullinated fibrin deposits suggests that dei-

mination of these two proteins, known to be able

to associate via covalent factor XIII-catalysed e-c-

glutamyl lysine bonds, occurs concomitantly in

the inflamed ST. It would be very interesting to

test whether citrullinated fibronectin also consti-

tutes an antigen target for ACPA, and therefore

could participate in the harmful immunological

conflict involving ACPA.

Only fragmentary information is available con-

cerning the isotypes of PADs expressed in the ST

of RA patients. Two studies report the presence of

PAD4 in the synovial sublining in small series of

samples from RA patients [93, 29]. However, in a

more extensive confocal microscopy analysis, the

same group also reported the presence of PAD4 in

all areas of the ST, colocalizing with cells exhibit-

ing positive staining for T-, B-, macrophage-, gra-

nulocyte-, fibroblast- or endothelial cell-specific

markers [94]. This group also reported the pres-

ence of PAD2 in the lining, sublining and deep

regions of one patient ST sample [29] and similar

observations were made by another group in more

than half of a larger series of 19 ST samples [95].

Additionally, Pad2 and Pad4 proteins have been

explored in animal models of arthritis, showing

the absence of both enzymes in the ST of naıve

mice and the presence of only Pad4 in the

inflamed ST of mice with collagen-induced arthritis

or streptococcal cell wall-induced arthritis [96]. No

data have yet been published concerning the other

PAD isotypes in the human RA patient ST.

Although the expression of PAD1 and 3 appears

to be rather confined to epithelial cells, making

their absence in the healthy or rheumatoid syno-

vium probable, such absence still needs to be

formally assessed because ST inflammation could

lead to induction of their expression. The most

recently described PAD6 also deserves to be

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explored as the presence of its corresponding

mRNA in peripheral blood leukocytes suggests

expression of the protein by the numerous haema-

topoietic cells infiltrating the rheumatoid ST. It

would be interesting to investigate whether PAD

expression in the ST is correlated with the degree

of ST inflammation in both RA and control

patients with inflammatory and non-inflammatory

rheumatism. Such a correlation can indeed be sus-

pected in view of the fact that deimination of fibrin

in the ST is observed during a variety of syno-

vitides [92] and deiminated proteins of still

unknown identity are detectable in several other

inflamed non-synovial tissues such as the muscle

of patients with polymyositis, the colon of patients

with inflammatory bowel disease or the lung of

individuals with interstitial pneumonia [97, 98].

How extra-cellular proteins such as fibrin or fibro-

nectin can become PAD substrates whereas PADs

are intra-cellular enzymes with no secretory signal

peptide also remains to be precisely determined

though apoptosis and/or necrosis of cells of the

inflammatory infiltrate have been proposed as

events leading to the release of PADs in the extra-

cellular milieu.

Given that PADs are involved in the generation

of the antigenic targets of ACPA in the ST and as

systematic genome analyses (linkage studies) in

French and Japanese populations have revealed a

possible RA genetic factor in the region of chromo-

some 1 encompassing the PAD locus [99–104],

PADI genes constitute major RA candidate genes

not only functionally, but also positionally. The

first direct investigation of this hypothesis was

reported in 2003. Single nucleotide polymorphisms

(SNPs) of the genomic region encompassing the

PADI1-4 genes were explored in a case–control

study within the Japanese population, leading to

the discovery of an association between RA and a

PADI4 haplotype [93]. The genetic association was

confirmed in a replicate study from Japan [105],

in a Korean population [106] and in a Caucasian

population from North America [107], but was

not reproduced in Caucasian populations from the

U.K., France or Spain [108–110]. In the initial

study, in vitro results indicated that the presence

of the PADI4 haplotype could lead to a more stable

mRNA and the authors suggested that PAD4

expression was increased in the ST of RA patients

leading to enhanced levels of citrullinated proteins

[93]. Whether a relation exists between the levels

of PAD4 expression in vivo and the presence of the

putative RA-associated PADI4 haplotype remains

to be explored. The association of RA with vari-

ants of the other PADI genes, particularly those

encoding isotypes expressed in the rheumatoid ST,

also deserves further testing.

Multiple sclerosis and other neurodegenerative dis-

eases

Multiple sclerosis (MS, OMIM # 126200) is one of

the most common neurodegenerative diseases, des-

troying the axon-surrounding myelin sheath

formed by oligodendrocytes and Schwann cells,

with a progressive loss of motility sometimes lead-

ing to the patient’s death. Autoantibodies to mye-

lin basic protein (MBP), the major protein of the

axonal sheath, are detected in the cerebrospinal

fluid of MS patients, but they are associated with

various other neurodegenerative diseases and

therefore are not specific for MS (for reviews, see

Refs [111, 112]). MBP undergoes several post-

translational modifications like phosphorylation,

methylation and deimination [113]. The extent of

the latter is increased in the brain of MS patients

and seems to be linked to the severity of the dis-

ease. In a normal situation, 20% of MBP is deimi-

nated. This amount is increased to 45% for the

chronic and even to 90% for the fulminating

(Marburg’s variant) form of MS [114]. The deimi-

nation induces a dramatic conformational change

of MBP, alters many of its properties, and may be

involved in the pathogenesis of MS. This has been

extensively reviewed in a recently published paper

[115], so we simply focus on some examples here.

In vitro, the slightly deiminated forms of MBP (6

Cit/19 Arg, MBP-Cit6) are less degraded than the

highly deiminated MBP (18Cit/19 Arg, MBP-

Cit18) by the metalloproteinase Stromelysin-1

[116] and the aspartic endoprotease cathepsin D

[117, 118], two proteases involved in the genera-

tion of MS lesions. MBP is normally associated

with the lipids of the myelin membrane and pro-

motes actin polymerization. In vitro, these interac-

tions are disrupted after deimination of MBP or

using a mutant of MBP carrying substitutions of

glutamines instead of citrullines to mimic deimina-

tion [119–121]. Interestingly, unlike the control

‘MBP C1 component’, the deiminated ‘MBP C8

component’ [122], dispensed to Lewis rats by s.c.

boost with complete Freund adjuvant, increased

the clinical severity of experimental autoimmune

encephalomyelitis [an animal model of MS induced

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by immunization of susceptible animals with pep-

tides or proteins from the central nervous system

(CNS)] [123]. All these data suggest the involve-

ment of deiminated proteins in the chronicity and

the autoimmunity of the demyelination process

occurring in the human disease. Concerning the

PAD involved in the deimination of MBP, it should

be mentioned that PAD2 is the only one to be

expressed at a high level in the CNS [78, 115].

Therefore, it probably corresponds to the PAD iso-

type involved in the deimination of MBP in physio-

logical conditions. In pathological situations such

as MS, other isotypes may be (additionally?)

involved. Like in RA, PADI genes constitute candi-

date genes in MS as suggestive evidence of linkage

for the 1p36 locus of chromosome 1 was obtained

in MS patients [124, 125]. Up to now, only one

report has been published on the direct evaluation

of the association of PADI genes with susceptibility

to MS. This family-based study revealed no

association between variants of the PADI4 gene

and MS in a French Caucasian population [126].

Interestingly, experimental autoimmune encephal-

omyelitis induction is not impaired in Padi2 knock

out mice even if a dramatic reduction of deiminat-

ed proteins could be observed in the CNS of these

mice in comparison with the wild type animals

[127].

In addition, GFAP is heavily deiminated in unaf-

fected white and grey matter from secondary pro-

gressive MS patients, when compared with age-

matched patients without known neurological dis-

eases [21]. GFAP is a major IF protein of astro-

cytes, the structural and nutritive cells of the

nervous system. Recently, the accumulation of dei-

minated GFAP and vimentin has been evidenced

in hippocampal extracts from patients with Alzhei-

mer’s disease (AD, OMIM # 104300), the most

common form of progressive dementia in the

elderly [22]. GFAP, deiminated proteins and PAD2

have been co-localized in the astrocytes of AD hip-

pocampus. More recently, by a proteomic

approach, PAD2 and protein deimination have

also been implicated in the pathogenesis of human

glaucoma (primary open-angle glaucoma, POAG,

OMIM # 137760). PAD2 and deimination appear

to be more abundant in POAG optic nerves than

in the controls, and MBP has been identified as

the major deiminated protein [63]. The authors

have also observed an induction of deiminated

proteins and PAD2 expression in cultured astro-

cytes subjected to an increased pressure (40 mm

of Hg). Therefore, deimination could play an

important role in the onset and/or progression of

several neurodegenerative human diseases.

Psoriasis and bullous congenital ichthyosiform

erythroderma

Although deiminated proteins are detected in nor-

mal epidermis, surprisingly little is known about

deimination in cutaneous diseases. Psoriasis vul-

garis (OMIM #177900) is a chronic dermatitis

that affects around 2% of the population. It is

characterized by red, scaly skin lesions that are

usually found on the scalp, elbows and knees, and

may be associated with severe arthritis. The aetiol-

ogy of the disease is unknown but hyperprolifera-

tion and abnormal differentiation of keratinocytes,

and infiltration of inflammatory cells into the der-

mis and epidermis are suspected to play a major

role in lesion formation. By immunohistochemical

analysis, a decrease of deiminated proteins, in par-

ticular K1, has been observed in the hyperprolifer-

ative epidermis of psoriasic lesions comparatively

to non-lesional or normal epidermis [82]. In bul-

lous congenital ichthyosiform erythroderma (BCIE,

OMIM # 113800) decreased amount of deiminated

K1 has also been shown [128]. In nearly all

patients with BCIE, skin lesions appear during the

first year of life and �75% of patients already have

lesions at birth. There is notable early mortality

from epidermal erosions and infections. At the

keratinocyte level, a formation of clumps and peri-

nuclear shells because of an abnormal arrange-

ment of keratin tonofibrils mainly involving K1

and K10 has been previously described [129,

130]. Of course, the abnormal deimination of K1

in psoriasis and BCIE could be a consequence of

the disease rather than its origin. Nevertheless, it

is interesting to note that Vit D induces the expres-

sion of PADI1-3 mRNA in cultured keratinocytes

[60], and is currently used as an efficient drug in

psoriasis [131].

Cancers

Immunohistological analysis of cryosections of an

extramammary Paget’s tumour (OMIM #167300)

has shown the expression of a non-epidermal PAD

protein in neoplastic cells [132]. Later, the cDNA

encoding PAD2 was cloned from human cutane-

ous squamous carcinoma cells (HSC-1) and PAD

activity was detected in extracts of HSC-1 cells

ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 161

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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cultivated for 7 or 10 days [12]. Another more

recent immunochemical analysis has revealed an

ectopic expression of PAD4 in epithelial cells of

various adenocarcinomas compared with normal

tissues with a concomitant increase in deiminated

proteins [133]. In these cells, PAD4 has appeared

as co-located with the haematopoietic progenitor

cell marker, CD34, and with keratins K8, K18 and

K19. Therefore, PAD4 could be highly expressed

in cancer cells.

Conclusion

Before 2002, <10 international reports concerning

PADs were published yearly. Since 2003, at least

15 articles involving PADs have been edited each

year and more than 45 just in 2005. This recent

burst must be linked to the demonstration of the

involvement of PADs and deimination in the regu-

lation of gene expression and in human diseases,

especially RA. Since the demonstration of the dif-

fentiation-related differential expression of PAD, in

Keratinocytes, and because of the highly probable

involvement of PAD1 and 3 in the hydration of

the SC through the regulation of NMF production,

a new field of investigation into PAD function is

now emerging. The demonstration that PADs are

clearly necessary for epidermal barrier function

and homeostasis must definitively increase our

interest for these enzymes. The increasing number

of molecular tools generated to analyse this

enzyme family and the post-translational modifica-

tion they catalyse has already been and will cer-

tainly continue to be very helpful not only for

pathophysiological investigations, but also for the

design of useful new diagnostic and/or therapeutic

approaches.

Post-translational modifications like phosphory-

lation, methylation, proteolysis and probably dei-

mination are involved into a dynamic balance of

the finely regulated cell signalling. One major

future goal will be to understand precisely the

regulation of the enzymes, which catalyse these

modifications during cell differentiation. PADs

clearly belong to the group of post-translational

modification enzymes that are worthy of further

study.

Acknowledgements

The authors would like to thank Pr Akemi Ishida-

Yamamoto at the Department of Dermatology,

Asahikawa Medical College, Japan where the

immunomicroscopy analysis was performed by

R. Nachat. This study was supported by grants

from the CNRS, Toulouse III University, INSERM,

the ‘Association de Recherche sur la Polyarthrite’

(ARP), the ‘Societe de Recherche Dermatologique’

(SRD), the European Social Fund (ESF), the Euro-

pean Regional Development Fund (ERDF) and the

Pierre Fabre Research Institute.

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ª 2007 The authors. Journal compilation

ª 2007 International Journal of Cosmetic Science, 29, 147–168 167

Update on peptidylarginine deiminases and deimination M.-C. Mechin et al.

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Annexes

- 227 -

Annexe 2

Communications à Congrès

1. Congrès Régionaux

1. Foulquier C. Peptidyl-arginines désiminases du tissu synovial rhumatoïde. 4° Journée d’Immuno-Rhumatologie du Grand Sud, GEMENOS, juin 2006.

2. Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Al Badine R, Méchin M-C, Vincent C, Nachat R, Michiyuki Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G. Dans le tissu synovial rhumatoïde, seules les peptidyl-arginine désiminases 2 et 4 sont exprimées ; leur expression est corrélée à l’intensité de l’inflammation. 5° Journée d’Immuno-Rhumatologie du Grand Sud, SEILH, juin 2007.

2. Congrès Nationaux

1. Chapuy-Regaud S, Foulquier C, Sebbag M, Méchin M-C, Nachat R, Baeten D, Senshu T, Yamada M, Takahara H, Guerrin M, Simon M, De Keyser F, Serre G. Isoformes de peptidyl-arginine désiminase exprimées dans les membranes synoviales rhumatoïdes. 14ème Journée de l’Association pour la Recherche sur la Polyarthrite, PARIS, octobre 2003.

2. Foulquier C, Chapuy-Regaud S, Nachat R, Méchin M-C, Guerrin M, Simon M, Senshu T, Yamada M, Takahara H, Serre G, Sebbag M. Peptidylarginine deiminase isoforms expressed in the synovial membrane of rheumatoid arthritis patients. Congrès 2005 de la Société Française d’Immunologie et du Club Francophone des Cellules Dendritiques, TOULOUSE, novembre 2005.

3. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Serre G, Saoudi A, Sebbag M. Chez le rat, la citrullination du fibrinogène autologue le rend immunogène mais la réponse auto-immune induite n'est pas spontanément arthritogène. 16ème Journée de l’Association pour la Recherche sur la Polyarthrite, PARIS, novembre 2005.

3. Congrès Internationaux Anglophones

1. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Nachat R, Baeten D, Foulquier C, Simon M, Senshu T, Yamada M, Takahara H, De Keyser F, Serre G. Peptidylarginine deiminase isoforms expressed in the synovial membrane of rheumatoid arthritis patients. 23rd European Workshop for Rheumatology Research, MARSEILLE, February 2003. Arthritis Res 5, Suppl 1:A5, 2003.

2. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Serre G, Saoudi A, Sebbag M. In the rat, citrullination of autologous fibrinogen makes it immunogenic, but the induced autoimmune response is not spontaneously arthritogenic. 26th European Workshop for Rheumatology Research, HERAKLION, February 2006. Ann Rheum Dis 65, Suppl 1, A19, 2006.

3. Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Méchin M-C, Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G. Peptidylarginine deiminase 6 does not contribute to the generation of the synovial targets of the rheumatoid arthritits-specific autoantibodies to citrullinated proteins. 27th European Workshop for Rheumatology Research, FIRENZE, February 2007.

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BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIEDISCUSSION GÉNÉRALE

BIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

DISCUSSION GÉNÉRALE

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

INTRODUCTION

DISCUSSION GÉNÉRALE

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