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TITRAGE DES ANTICORPS ANTI-STREPTOLYSINE O

(ASLO) « par réaction de neutralisation »

Par : S/Abdessemed

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1. PRINCIPE

• On recherche la présence d’anticorps anti-streptolysine (ASLO) dans le sérum du patient suspecté d’infection streptococcique. Dans ce but, on utilise comme antigène la streptolysine protéine produite par les streptocoques b-hémolytiques (groupe A, C ou G) et capable de se fixer au cholestérol membranaire des cellules cibles (hématies, leucocytes…) pour former des pores.

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Dans un 1er temps, on met en présence : oDes quantités connues et croissantes de

SLO réparties dans les cupules d’une barrette

oUn volume constant du sérum à titrer.

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• Pendant l’incubation, si le sérum contient des Ac anti-SLO (ASLO), ils se fixent grâce à leurs paratopes sur les épitopes spécifiques de la streptolysine  et neutralisent son activité : on parle de réaction de neutralisation de l’activité.Si le sérum ne contient pas d’Ac anti-SLO, la streptolysine n’est pas neutralisée.

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• Dans un second temps, pour révéler la réaction, on ajoute des globules rouges de lapin (cibles de la SLO). Après incubation :

• S’il y a hémolyse : la SLO est active, elle n’a donc pas été neutralisée. Le sérum ne contient pas d’ASLO.

• S’il n’y a pas d’hémolyse : la SLO a été neutralisée par les ASLO présents dans le sérum.

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2. ELEMENTS EN PRESENCE

o Sérums à tester

• Ils doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation.

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• Le sérum contrôle positif est testé en même temps que les sérums des patients et à l’ouverture de chaque nouveau coffret. Il permet un contrôle de qualité indispensable pour la validation des résultats des patients :

•Contrôle de la qualité des GR de lapin et réactifs du coffret •Contrôle de la qualité d’exécution des réactions.

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o Réactifs Ils se conservent entre +2°C et +8°C, mais doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation.• Streptolysine O• Réducteur• Sérum de contrôle positif• Tampon phosphate-Nacl PH 6,6• Globules rouges de lapin

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– Matériel nécessaire • Support de barrette• Couvercles de microplaques adaptés aux

supports• Pipettes automatiques et cônes

correspondants• Portoir et tubes à hémolyse à usage unique• Etuve ou bain thermostaté à 37°C.

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3. REALISATION PRATIQUE • Diluer les sérums à tester au 1/100 dans le

mélange tampon-réducteur : 10µL de sérum+ 990 µL de réactif

• Prévoir le nombre de barrettes nécessaires et les placer sur un support

• Pour chaque sérum, répartir 75 µL de dilution dans chacun des 8 puits d’une barrette à partir du repère rouge ASL

• Agiter le support 1 min, par tapotement latéral, pour dissoudre la streptolysine

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• Incuber 15 min à température ambiante (18-25°C)

• Distribuer 75 µL de suspension à 2% de GRL dans chaque puits des différentes barrettes

• Agiter doucement le support pour homogénéiser

• Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis incuber: – Soit 1h15 à 1h30 à température ambiante– Soit 45 min à température ambiante, puis

centrifuger 2 min à 2000 tr/min• Effectuer la lecture

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– Lecture• Sortir chaque barrette du support et

observer latéralement pour noter la présence ou l’absence d’hémolyse dans chacun des puits.

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4. RESULTATS ET INTERPRETATION• Le résultat du patient ne peut être validé

que si le résultat du témoin sérum est correct.– Discussion du témoin sérum (puits N°8)

• Composition : GR de lapin + sérum dilué (absence de SLO)

• Il vérifie la qualité de la suspension de GRL et le comportement du sérum vis-à-vis des GRL, en l’absence de SLO.

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• Résultat correct attendu : absence d’hémolyse.

• Les résultats des autres puits peuvent alors être interprétés.

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• En cas de résultat anormal : il y a hémolyse. Cela peut correspondre à deux éventualités : – L’anomalie ne concerne qu’une ou

quelques barrettes de la série : cela signifie que le sérum correspondant au témoin anormal contient des substances provoquant l’hémolyse des GRL.

– Tous les puits de la barrette présentent une hémolyse et le résultat obtenu pour ce sérum n’est pas validable.

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– L’anomalie concerne toutes les barrettes de la série et tous les puits : cela signifie que les GRL sont hémolysés spontanément, donc non utilisables.

– Les résultats obtenus avec le sérum de contrôle et les sérums des patients ne sont pas validables.

– Il faut recommencer toute la série avec une autre suspension de GR.

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– Détermination du titre des sérums • A partir du repère "ASL" indiqué sur la

barrette, noter le dernier puits de GR entièrement sédimentés donc non hémolysés : il correspond à la plus grande quantité de SLO pouvant être neutralisée par les Ac contenus dans le sérum dilué. Dans ce puits, le nombre d’U.ASLO est ≥ nombre d’U.SLO.

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• Le tableau ci-dessous donne la correspondance entre le numéro du puits (à partir du repère "ASL" indiqué sur la barrette) et le titre du sérum en U.ASLO/mL.

N° du puits 1 2 3 4 5 6 7 8

Titre en U.ASLO/mL ou nature du témoin

100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum

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Exemple de résultat :N° puits 1 2 3 4 5 6 7 8

Titre en U.ASLO/mL

100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum

Lecture Absence d’hémolyse

Absence d’hémolyse

Absence d’hémolyse

Absence d’hémolyse

Absence d’hémolyse

Hémolyse Hémolyse Absence d’hémolyse

Interprétation Neutralisation totale de la SLO SLO non neutralisée Témoin correct

Conclusion Titre du sérum : 600 U.ASLO/mL

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Remarques :• Les titres obtenus pour les sérums d’une

série ne peuvent être validés que si le titre trouvé pour le sérum de contrôle, testé avec cette série, est égal à celui indiqué par le fournisseur.

• Si le titre d’un sérum est supérieur ou égal à 1200 U.ASLO/mL, il faut refaire le titrage de ce sérum à partir d’une dilution 1/1000 et multiplier par 10 la valeur donnée par le tableau.

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Interprétation

En fonction du contexte clinique, en cas de résultat négatif ou douteux à la fois pour les ASD et les ASLO, on peut être amené à vérifier la sérologie sur un second prélèvement environ 15 jours plus tard.

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Merci pour votre attention