fonction de la forme du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain :

1

Fonction de la forme du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain :

ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire des anticancéreux

UMR CNRS 8612

Sous la direction du Dr. J.-M. Renoir

Angélique Gougelet

Le 26 janvier 2007

2

Cancer du sein

1er cancer féminin dans les pays occidentaux.

Chaque année en France : (Ligue Nationale contre la Cancer 2000)

• 42 000 nouveaux cas• 12 000 décès

Facteurs de risque :

D’après McPherson et coll. 2000, BMJ, 321: 624-628

0 2 4 6 8 10

alcool

régime

poids

histoire familiale

HRT

contraception

grossesse

ménopause

ménarche

âge

risque relatif

3

Traitements

Chirurgie : technique du ganglion sentinelle.

Radiothérapie : adjuvante ou néo-adjuvante.

Chimiothérapie : adjuvante ou néo-adjuvante :

• protocole CMF : cyclophosphamide (agent alkylant) + méthotrexate et 5-FU (antimétabolites) ;

• protocole FEC : 5-FU + épirubicine (inhibiteur des topoisomérases II) + cyclophosphamide ;

• protocole ET : épirubicine + docétaxel (inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules).

4

Œstrogènes et hormonothérapie

50-60 % de cancers œstrogéno-dépendants ;

hormones stéroïdes impliquées dans le développement et la différenciation

de l’appareil reproducteur et de la glande mammaire ;

liaison à un récepteur nucléaire (ER) :

anti-œstrogènes : Nolvadex (SERM) Faslodex (SERD) ;

œstrone (E1), œstradiol (E2), œstriol (E3) synthétisés à partir des androgènes

par action de l’aromatase ovarienne principalement :

anti-aromatases : Fémara, Arimidex ;

Blocage des voies mitogéniques :

anti-HER2 : Herceptin.

OH

OH

(CH2)9SO(CH2)3CF2CF3

N

O

5

Récepteur aux œstrogènes

Récepteur nucléaire (NR3A)

Facteur de transcription

2 isoformes : • ER clonée en 1985 (Walter et coll. PNAS, 82 : 7889-93).• ER clonée en 1996 (Kuiper et coll. PNAS, 93 : 5925-30; Mosselman et coll. FEBS lett, 392 :49-

53).

DBD

LBD

dimérisation

NLS

A/B C D E FER66 kDa

1 180 263 302 595553

P-box

NLS

AF-1

AF-2

1 149 214 248 530500

ER55 kDa

5 domaines fonctionnels :D’après Ogawa et coll. 1998, BBRC, 243: 122-6

N-term

N-term

C-term

C-term

6

1 149 214 248 530500

ER55 kDa

96 % d’homologie au niveau du DBD ;

96

DBD

ER66 kDa

A/B C D E F

1 180 263 302 595553

53

LBD

53 % d’homologie au niveau du LBD ;

Domaine AF-1 tronqué dans ER.

AF-1

Facteurs de transcription :•Fonction de transactivation constitutive AF-1

•Fonction de transactivation ligand-dépendante AF-2

AF-2

N-term

N-term

C-term

C-term

7

Distribution tissulaire

Tractus génital :ovaire : ER (thèque), ER (granulosa)utérus : ER > ERtesticule : ER, ERprostate : ER

Système cardiovasculaire :cardioprotection, vasodilatation

ER tronqué et ER

Foie : facteurs de coagulation, récepteurs aux lipoprotéines

ER

Cerveau : neuroprotection, humeur

ER et ER

Sein : différenciation finalenormal : 20 % ER+ER+ cancer : 70 % ER++ER+

Tractus gastro-intestinal : ER

Os : maintien de la densité osseuse

ER et ER

Poumons : ER

Tractus urinaire : ER

8

Mécanismes d’action de ER

ER

hsp90 hsp70p23

IP

GGTCAnnnTGACCERE

nucléosomeTATA

Enveloppe nucléaire

membrane plasmique

ER

corégulateurs

ligand

machinerietranscriptionnell

e

POLTF

P

PKA

MAPkinases

P AKTP

ER

hsp90

p23 hsp70

IP

ligand

transcription

9

Rôle protecteur de ER

expression de ER diminuée dans les tissus invasifs ;

tumeurs ER+ mieux différenciées, moins agressives ;

propriétés antiprolifératives :

•inhibition des cyclines (A, D1, E) ;

•induction des inhibiteurs des kinases cycline-dépendantes p21waf1/cip1 et p27kip1 ;

propriétés inhibitrices de la transactivation ER-dépendante.

Compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dansla régulation de la forme du récepteur des

œstrogènes.

Mise au point et développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

10

Lignées cellulaires de cancer du sein

ER

HER

B

HE-5

MC

F-7

MD

A-E

R-

ER

RT-PCR Western blot ER

ER

HER

B

HE-5

MC

F-7

MD

A-E

R-

MCF-7 : modèle de référence ER++ ;

HE-5 : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme de ER (Touitou et coll. JSBMB, 1991, 40 :231-7) ;

HERB : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme de ER (Mueller et coll. JBC, 2003, 278 : 12255-62).

11

IntroductionTransactivation Transactivation œstrogéno-dépendanteœstrogéno-dépendante

ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER

Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90

Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

Plan

12

TATA EREnucléosome

TRAP220SWI/SNF

Ac Ac

Ac

Ac AcSRC1

HAT

HAT

Ac

agoniste

ERER

transcription

CBP/p300

TFTAF

POLTF

Modèle de transactivation de ER

D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 : 775-81

13

TATA EREnucléosome

Ac Ac

Ac Ac Ac

sin3NCoR

SMRT

HDAC HDAC

HDAC2

Antagoniste

mixte

ERER

Modèle de transrépression de ER


14

TFTAF

POLTF

Modèle de transrépression de ER


TATA EREnucléosome

sin3NCoR

SMRT

HDAC HDAC

HDAC2

15

Activation œstrogéno-induite

16 hMCF-7 HE-5 HERB

Imax Cmax Imax Cmax Imax Cmax

Vit(GGTCAcagTGACC) x 3

E2 8 10-

10

6 10-8 5 10-9

gen 9 10-6 5 10-6 6 10-8

tk(GGTCAcagTGACC) x 2

E2 16 10-8 2,5 10-10 4 10-9

gen 16 10-6 3 10-7 2 10-8

C3GGTGGcagTGACC

E2 1,3 Ø 3 10-11 3 10-

11

gen 1,4 Ø 3 10-9 2,5 10-6 La séquence de l’ERE module les niveaux d’induction maximale (Imax).

L’ Imax d’un promoteur est atteinte pour différentes concentrations (Cmax) d’un même ligand.

Les concentrations nécessaires à l’activation maximale d’un promoteur varient avec le ligand.

La transactivation ER-dépendante est influencée par le contexte cellulaire.

•+ importante dans les cellules MCF-7 ;

Les concentrations de ligand nécessaires pour une activation maximale varie avec l’isoforme de ER.

•promoteurs répondeurs :

MCF-7MCF-7 : tk > Vit > C3 0MDAMDA : Vit > tk C3

16

IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendante

ERER répresseur de la transcription ER répresseur de la transcription ER-dépendante-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER



Plan

17

Activité suppressive de ER

0

2

4

6

8

MCF-7 HE-5

indu

ctio

n

Vit

0

6

12

18

MCF-7 HE-5

indu

ctio

n

tk

non transfecté 0,1 µg ER

10 nM E2 ou 1 µM gen

ER la capacité transactivatrice de ER :

au niveau de promoteurs endogènes ou exogènes

quels que soient le type d’ERE et la lignée cellulaire considérés.

0 + E

R

E2

E2 +

ER

gen

gen +

ER

PR

MCF-7

18

Activité suppressive de ER et acétylation

Trichostatine A (TSA) = inhibiteur des histone-déacétylases.

0

40

80

120

1 2

ind

uctio

n

Vit tk

MCF-7

0

4

8

12

1 2

ind

uctio

n

HE-5

Vit tk

ER +10 nM E2 (id.1 µM gen) ER +10 nM E2+TSA 1µM

ER possède des propriétés de dominant négatif régulées par

des processus de déacétylation ou par recrutement d’histone-déacétylases.

19


ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de

ERERApproches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :

Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90


20

477***1 96 161 195 447

ER-AF-1

1 65 99 381351

ER-AF-2

Transfection transitoire de 0,1 µg de ER mutants :

2 gènes rapporteurs Vit et tk.

Cellules MCF-7 et HE-5.

Exposition des cellules à 10 nM E2 ou 1 µM gen 1 µM (TSA)

Importance de l’acétylation.

AF-1/AF-2 de ER et transactivation œstrogéno-induite

N

N

C

C

21

Au niveau de Vit dans les cellules MCF-7

ER

CoR

déAc

AF-2AF-1

+ -ER ER ER-AF-2

synergie

synergie

ERE ERE ERE

ER

ER AF-2AF-1

HDAC

AF-2

CoA

Ac

AF-2

Ac

ER-AF-2

+TSA

0

40

80

120

C E2 1E-8

indu

ctio

n

0

4

8

12

ERER+TSA

ER-AF-2

ER-AF-2+TSA0

10

20

30

40

C E2 1E-8

indu

ctio

n 1/2 ERER+TSA

ER-AF-1

ER-AF-1+TSA

22

0

100

200

300

C E2 1E-8

ind

uct

ion

ERER+TSA

ER-AF-1

ER-AF-1+TSA

synergie

synergie

HDACHDAC

Au niveau de tk dans les cellules MCF-7

HDAC

ER AF-2AF-1 AF-2AF-1 ER

déAc

0

100

200

300

C E2 1E-8

indu

ctio

n

0

14

28

ERER+TSA

ER-AF-2

ER-AF-2+TSA

0

10

20

X 2

Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon le promoteur. 23

ER

EREERE

AF-2

CoA

Ac

AF-2

Ac

ER-AF-2

+TSA + -ER ER ER-AF-2

23

Au niveau de Vit dans les cellules HE-5

ERE ERE ERE

ER

HDAC

ERAF-2AF-1

DéAc

ER AF-2AF-1

ERER +TSA

ER-AF-2

ER-AF-2+TSA

0

4

8

12

C E2 1E-8

Indu

ctio

n

Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon la lignée cellulaire.

24

24

MCF-7

MCF-7 + 0,1 µg ER

MCF-7 + 0,1 µg ER-AF-2

actine

+-TSA 1 µM

Sur le gène endogène PR dans les MCF-7

ER ARNm de PR de 50 %.

L’inhibition des HDAC :

• bloque l’activité suppressive de ER.

PR

• potentialise l’activation induite par ER AF-1.

ER AF-1 + faiblement ARNm PR.

région AF-1 de ER impliquée dans son

activité suppressive sur PR.

synergie de la région AF-2.

25

ER possède des propriétés de dominant négatif liées à sa région AF-1, régulées par :

•acétylation / déacétylation de son domaine AF-1 ou des cofacteurs recrutés ;

•recrutement d’histone-déacétylases ;

Thérapie ciblée sur le maintien de son activité.

25



Approches thérapeutiques à visée anti-Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90


Plan

26

L’ anti-œstrogène de référence : le tamoxifène

50 % des tumeurs œstrogéno-dépendantes diagnostiquées répondent à cet agent.

Activité agoniste à l’origine de cancers secondaires de l’endomètre.

40 % des patientes traitées rechutent par acquisition de résistances associées à :

• Une diminution des concentrations intratumorales en Tam ;• Une altération de l’expression de ER ;• Une altération du niveau d’expression des corégulateurs de ER ;• Une hyperactivation des voies de signalisation œstrogéno-dépendantes.

recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques :

• Anti-œstrogènes purs ;

• Inhibiteurs de la hsp90 ;

• Inhibiteurs des histone-déacétylases.

27


ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2de ER

Approches thérapeutiques à visée anti-Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :œstrogénique : Avantages du RU 58668 Avantages du RU 58668

Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylases

Conclusions et perspectives

Plan

28

Anti-œstrogènes

Anti-œstrogènes mixtes :

• Molécule à activité agoniste ou antagoniste selon les tissus.

• Le tamoxifène référence pour le traitement du cancer du sein.

Anti-œstrogènes purs :

OH

O

N

S

O

OH

RaloxifèneTamoxifène

N

0

OH

OH

(CH2)9SO(CH2)3CF2CF3

ICI 182,780RU 58668

OH

OH

H

H

O

H

CF2CF3

SO2

• Dégradation protéasome-dépendante de ER.

• Indiqués pour le traitement de seconde intention des cancers du sein résistants au Tam.

• Pas de transactivation possible par gêne stérique.

29

MCF-7

HE-5

HERB

E2 1 µM - - + + - - - -

OHT 1 µM - - - - - - + +

RU 1 µM - - - - + + - -

MG132 5 µM

- + - + - + - +

AE et stabilité de ER

100

140

180

220

0 4 8 12 16temps (h)

% p

roté

ine

ER

HERB MCF-7 HE-5

OHT

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16

% p

roté

ine

ER

RU

ER

ER

ER

L’OHT stabilise les 2 formes de ER.

Le RU induit une dégradation protéasomale :

• durable de ER ;• transitoire de ER.

ER

ER

30

AE et transactivation œstrogéno-induite

Vit tk

Pouvoir inhibiteur équivalent des 2 AE dans les MDA-MB-231 :

HERB : 70 % sur Vit 60 % sur tk

HE-5 : 45 % sur Vit 45 % sur tk

0

2

4

6

E2 1E-8 E2+RU 1E-7 E2+OHT 1E-7

0

6

12

18

E2 1E-8 E2+RU 1E-7 E2+OHT 1E-7

ind

uct

ion

MCF-7

0

2

4

6

8

E2 1E-8 E2+RU 1E-7 E2+OHT 1E-7

HE-5 HERB

Effet plus marqué du RU sur les cellules MCF-7 et MELN :

RU : 40 % sur Vit 75 % sur tk 100 % dans les MELN

OHT : sur Vit 55 % sur tk 85 % dans les MELN

RU > OHT sur l’activité et la stabilité de ER.

31

RU et cycle cellulaire

72h Sub-G1 G0/G1

C 2,8 61,2

RU 1 µM 4,2 69,5

ER 1 µg 12 53,6

RU + ER 21,6 65,5

Arrêt du cycle en G0/G1 dans les

cellules MCF-7 ER+ et ER+/ER+.

NT

RU

MCF-7 + ER

MCF-7

Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7.

La présence de ER dans les cellules MCF-7 :

• induit la mort cellulaire ;

l’activité pro-apoptotique du RU.

32

OHT et cycle cellulaire

72h Sub-G1

G0/G1

C 4,7 79,7

OHT 1µM 7,9 83,4

ER 1µg 16,8 68,3

OHT + ER

18,9 72,8

NT

OHT

MCF-7+ERMCF-7

Activité bénéfique du RU sur les cellules MCF-7 ER+/ER+ par

rapport à l’OHT.

Arrêt du cycle en G0/G1 < au RU.

Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7.

Peu d’effet sur les cellules ER+/ER+ contrairement au RU.

33



Approches thérapeutiques à visée anti-Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :œstrogénique : Avantages du RU 58668

Les ligands de la hsp90Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylases

Conclusions et perspectives

Plan

34

La hsp90 : chaperon moléculaire de nombreuses protéines oncogènes

Cochaperons FKBP51/52

Cyp40hsp70p23

hsp40CHIP

KinasesCdk4Cdk6Cdc2AKT

c-Raf-1ErbB2

Récepteurs stéroïdiensRécepteur des œstrogènes

Récepteur de la progestéroneAutres

p53

Cycle cellulaireApoptose

ProliférationCroissance/Développement

CancerAngiogenèse

hsp90

D’après Maloney et Workman. 2002, Expert Opin Biol Ther, 2 : 3-24

35

hsp90 et maturation de ER

ER

poche de poche de liaison auliaison au

ligand ferméeligand fermée

p23

foldosomefoldosome

hsp90 Hophsp40

hsp70

hsp90

ERHop

p23

hsp40

ATP

ADP

poche de poche de liaison auliaison au

ligand ouverteligand ouverte

immunophiline

hétérocomplexe hétérocomplexe maturematurehsp90

ER

p23hsp70

IP

Hop

hsp70

D’après Pratt et Toft. 2003, Exp Biol Med, 228 : 111-33

36

Bloquent les sites de liaison à l’ATP :• en N-terminal : geldanamycine (GA) et radicicol (Rd) ;• en C-terminal : novobiocine (Nv).

Inhibiteurs de la hsp90

1 236

272

629

732

N M C

MEEVD

ATP/clientes

radicicol geldanamycine

novobiocine

ATP/clientes

Ubiquitinylation des protéines clientes immatures par l’E3 ubiquitine-ligase CHIP(C-terminus of hsp70-interacting protein).

Dégradation par le protéasome.

37

Activité antiproliférative des inhibiteurs de la hsp90

% prolifération

à 72h

GA1 µg/mL

Rd1 µg/mL

Nv0,2 mM

MCF-7 40 38 30

MERA 40 30 24

HERB 45 25 55

MDA-ER- 42 20 58

Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les 2 lignées cellulaires ER+ :

Nv Rd GA

Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les MDA ER+ et ER- :

Rd GA Nv

37

avantage en cas d’échappement thérapeutique de cellules ER+ ou ER-.

Pouvoir antiprolifératif influencé par le variant de ER exprimé dans les cellules.

38

0

40

80

120

C GA Rd Nv

pro

liféra

tion (

%)

cycline D1cycline E

cdk2

cdk4

cdk6

cdc2

MCF-7 72 h

Inhibiteurs de la hsp90 et régulateurs du cycle cellulaire

p70S6K

phospho-p70S6K

c-Raf-1

phospho-p42/p44

E2 100 nM

ICI 182,780 10 nM

GA 1 µg/mL

-+-

++-

+++

c-Raf-1 ;

phospho-p70S6K ;

phospho-ERK.

GA > Rd > Nv .

GA : cyclines D1 et E ;

cdk2, 4 et 6 ;

cdc2 ;

3 h

39

RdGA

SG1

Cycline BCdc2

p21

p53

G2 M

RdGA

RdGA

RdGA

RdGA

Ras

Raf

MEK

p110

p85PI3K

AKT

mTOR

ErbB2

P70S6K

ERK

Inhibiteurs de la hsp90 et cycle cellulaire

pRb

E2F

HDAC

Cdk4/6 Cycline D1 Cdk2

Cycline E

E2F

pRb

40

Activité pro-apoptotique des inhibiteurs de la hsp90

0

20

40

60

C GA Rd Nv

% c

ellu

les

sub-

G1

0

20

40

60

C GA Rd Nv

% c

ellu

les

sub-

G1

MCF-7 HERB

0

20

40

60

C GA Rd Nv

% c

ellu

les

sub-

G1

0

20

40

60

C GA Rd Nv

% c

ellu

les

sub-

G1

MDA-ER-

Sub-G172 h

GA1

µg/mL

Rd1

µg/mL

Nv0,2 mM

MCF-7 X 3

MERA X 13 X 3 X 3

HERB X 10 X 3 X 2

MDA- ER-

X 12 X 6 X 3

GA agent le plus puissant.

Peu d’effet sur les cellules MCF-7 :

absence de caspase 3

MERA Activité pro-apoptotique

identique sur les 3 types de MDA.

* *

*

41

Activité et stabilité de ER

Dégradation protéasome-dépendante des 2 formes de ER :

0

1

2

3

4

5

6

7

C

E2

GA

GA

+E

2

Rd

Rd

+E

2

Nv

Nv+

E2

ind

uct

ion

MELN

C E2+GA

E2 GA Rd NvE2+Rd

E2+Nv

0

1

2

3

4

C

E2

GA

GA

+E

2 Rd

Rd+

E2 Nv

Nv+

E2

ind

uct

ion

C E2+GA

E2 GA Rd NvE2+Rd

E2+Nv

HERB

Inhibition de l’activité transcriptionnelle œstrogéno-induite des 2 ER :

**

* **

*

MG132 5 µM

C GA

+-+- +- +-

Rd Nv

ER ER

C GA

+-+- +- +-

Rd Nv16 h

ER protéine cliente de la hsp90

Inhibiteurs de la hsp90 = traitement de choix pour les cancers œstrogéno-dépendants 42

42



Approches thérapeutiques à visée anti-Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90

Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesLes inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

Plan

43

Les histone-déacétylases (HDAC)

18 membres en 4 classes :

+ Sirtuines 1 à 7 : Classe III.

Inhibiteurs d’HDAC = stratégie anticancéreuse prometteuse :

• Classes I et II impliquées dans la prolifération des cellules cancéreuses ;

• HDAC1 et HDAC6 surexprimées dans les cellules de cancer du sein.

HDAC1HDAC2

HDAC3HDAC8

HDAC11HDAC6HDAC10

HDAC4HDAC5

HDAC7

HDAC9

Classe I

Classe IIb

Classe IIa

Classe IV

D’après De Ruijter et coll. 2003, Biochem J, 370 : 737-49

44

Inhibiteurs des HDAC

inhibiteurs cibles essais cliniquescombinaisons

testées

Acides hydroxamique

s

trichostatine A (TSA)

classes I et II5-aza-2’-

déoxycytidine chimiothérapie

SAHA classes I et II

III lymphome cutané T

myélome multiplemaladie de

Hodgkin

chimiothérapie17-AAG

trastuzumab

LAQ824 classes I et II IChimiothérapie

trastuzumab

LBH589 classes I et II I 17-AAG

Acides gras à chaîne courte

acide valproïque

classes I et IIaII

cancers colorectaux

acide butyrique classes I et IIaII

leucémie

5-aza-2’-déoxycytidine 17-

AAG

Peptides cycliques

depsipeptide classe III

lymphome cutané

chimiothérapie 5-aza-2’-

déoxycytidine

apicidine HDAC 1 et 3 STI-571

Benzamides MS-275 HDAC 1, 2 et 3I

lymphomeirradiation

chimiothérapie

45

TSA et cycle cellulaire

NT

TSA

MCF-7+ERMCF-7

72 h Sub-G1

G2/M

C 2,8 19,7

TSA 0,1 µM

40,7 29,8

ER 1 µg 12 17,8

TSA + ER

57,6 22,9 Accumulation des cellules en G2/M.

0

20

40

60

80

100

0 0,1µM

1 µM 0,1µM

1 µM 0,1µM

1 µM 0,1µM

1 µM

pro

liféra

tion (

%)

MCF-7 HE-5 HERB MDA-C

Activité antiproliférative de la TSA :

• = à forte concentration sur les cellules ER+ et ER- ;

* * * *

• > à faible concentration sur les cellules ER+.

** *

*

Forte activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7 et MCF-7 ER+. 45

46

Inhibition des HDAC et transactivation de ER

MCF-7 HE-5 HERB

TSA 1 µM 16 h - + - + - +

Vit

E2 10 nM

7,4 16,8 6 10,4 5,2 16,2

gen 1 µM

9,3 17,9 5,2 14,5 3,7 28,4

tk

E2 10 nM

15,9

96 2,6 8,2 3,8 16,6

gen 1 µM

15,8

113 2,1 9,1 1,7 10,7

Activation de la transcription œstrogéno-induite de ER :

• > au niveau de tk dans les cellules MCF-7 et HE-5 ;

• > dans les cellules MCF-7 par rapport aux HE-5.

Activation plus forte de la transcription ER-dépendante dans les cellules HERB, en présence de génistéine.

X2

X6

X2

X3

X3 X4

X8

X6

46

Activité de la TSA modulée par la lignée cellulaire, l’isoforme de ER et le promoteur ciblé.

47

Inhibition des HDAC et stabilité de ER

Dégradation protéasome-dépendante de ER dans les cellules MCF-7.

TSA ER et ER dans les MDA-MB-231 mais ER dans les MCF-7.

Résultats similaires après suppression de l’expression d’HDAC1 par un ARNi spécifique

L’HDAC1 paraît être un régulateur clé des effets induits par la TSA.

Le niveau d’expression d’HDAC1 varie avec la lignée cellulaire.

- ++ +

MG132 5 µM

- + TSA 1 µM

MCF-7ER

ER

ER

HE-5

HERB

16 h

- +

ARNi HDAC1

HDAC1

MC

F-7

HE-5

HER

B

MD

A-C

47

À l’origine des niveaux d’expression différents de ER en présence de TSA et après suppression de l’HDAC1?

48

- + TSA 1 µM

MCF-7ER

ER

ER

HE-5

HERB

16 h

Association RU/TSA et stabilité de ER

+ +

- +

RU 1 µM - -

L’association RU/TSA :

la stabilisation de ER induite par le RU dans les cellules HERB ;

peu ER dans les cellules HE-5 par rapport au RU seul ;

• potentialise la dégradation de ER induite par le RU dans les cellules MCF-7.

++

+-

Association RU/TSA prometteuse.

49

Association TSA/RU et transactivation de ER

Le RU conserve ses propriétés inhibitrices de la transactivation ER et ER-dépendante en présence de TSA (70 % ).

La TSA augmente l’activité agoniste de l’OHT dans les cellules MCF-7 et MELN.

Le RU inhibe la transcription œstrogéno-induite sans intervention des HDAC.

L’inhibition induite par l’OHT requiert l’intervention de HDAC contrairement au RU.

0

4

8

12

1 2 3 4

indu

ctio

nC E2+

TSAE2+RU

E2+RU+TSA

0

6

12

18

1 2 3 4

indu

ctio

n

C E2+TSA

E2+RU

E2+RU+TSA

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

indu

ctio

n

C E2+TSA

E2+RU

E2+RU+TSA

MCF-7 HE-5 HERB

Vit tk

0

20

40

60

80

100

1 2

E2+OHT

E2+OHT+TSA

49Association RU/TSA avantageuse par rapport à la combinaison

OHT/TSA.

50

72 h Sub-G1

G2/M

C 2,8 19,7

TSA 0,1 µM

40,7 29,8

RU 1 µM 4,2 19,6

TSA + RU 47,6 24,1

Effets combinés de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7

TSA

RU

RU+TSA

C

0

20

40

60

80

100

C RU TSA RU+TSA

prol

iféra

tion

(%)

La TSA conserve ses propriétés antiprolifératives en présence de RU.

MCF-7

La TSA induit toujours une accumulation des MCF-7 en G2/M en présence de RU.

Addition des propriétés pro-apoptotiques de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7.

51

47,6

21,6

57,6

64,5

RU+TSA

RU+TSA+ERRU+ER

Effets combinés de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7 ER+

RU + TSA induit une apoptose + forte que le RU ou la TSA isolément.

0

10

20

30

40

50

60

C RU TSA RU+TSA

pro

lifé

ratio

n (

%)

Pouvoir antiprolifératif de l’association RU/TSA le plus puissant.

RU + TSA plus efficace sur les cellules MCF-7 ER+/ER+ que sur les cellules MCF-7 au niveau de la croissance cellulaire et de l’apoptose.

MCF-7 + ER MCF-7

TSA +ER

52

- - + + - - + +

- - - - + + + +

- + - + - + - +

L’association RU + TSA + ER :

la cycline D1 et ER ;

Expression des régulateurs du cycle cellulaire

RU 1 µM - - + + - - + +

TSA 0,1 µM - - - - + + + +

ER 1 µg - + - + - + - +

p21waf1/cip1

p27kip1

ERcycline D1

cycline E

phospho-Rb

l’induction de la cycline E observée en présence de TSA ;

p21waf1/cip1 et p27kip1 ;

la forme phosphorylée Rb.

53

ER

SG1

pRb

E2F

HDAC

Cdk4/6Cycline D1p21

E2

Cdk2

Cycline E

p130

TSA + RU+ ER

E2F

pRb

p21 ou p27

Association RU/TSA et arrêt du cycle cellulaire

54




Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives

Plan

55

Conclusions (1)

1) ER dominant négatif de ER et potentiel suppresseur de tumeur.

Approche thérapeutique de choix = maintenir / induire son activité.

anti-œstrogènes purs > anti-œstrogènes mixtes.

Alternatives de choix pour le traitement du cancer du sein notamment des tumeurs résistantes aux thérapies classiques.

2) Le RU 58668 (comme l’ICI 182,780) : démontre des propriétés pro-apoptotique et antiproliférative

sur des cellules ER+/ER+ surtout ; affecte essentiellement l’expression de ER.

3) Inhibiteurs de la hsp90 et inhibiteurs des HDAC :

56

Conclusions (2)

Deux stratégies thérapeutiques optimales pouvant être envisagées:

1) Approche non spécifique : un inhibiteur de la hsp90+ un inhibiteur d’HDAC

Ex. : 17-AAG / SAHA ; 17-AAG / LBH589

2) Approche ciblant ER :

un anti-œstrogène pur visant préférentiellement ER+ un ligand activant spécifiquement ER+ un inhibiteur d’HDAC

Affranchissement des risques d’acquisition de résistance à un agent anticancéreux.

Association de ces molécules

57

Perspectives (1)

1) Décryptage complet des mécanismes de régulation de ER :

a) Acétylation directe de ER ou de ses cofacteurs en présence de TSA?

b) Identification des sites précis d’acétylation de ER (région AF-1).

c) Identification des régions de ER impliquées dans son activité suppressive et sa régulation.

d) Identification des corégulateurs/HDAC recrutés par les dimères ER/ER et ER/ER.

2) Identification de nouveaux agents thérapeutiques plus spécifiques :

Mutagenèse dirigée et transfection transitoire des mutants.

Immunoprécipitation.

Immunoprécipitation de la chromatine.

Inhibiteur ou ARNi contre une HDAC diminuant l’activité de ER.

58

Perspectives (2)

3) Ciblage spécifique au niveau de la tumeur :

« drug delivery » = incorporation d’agents cytotoxiques dans des formes galéniques préservant les tissus sains.

Approche particulièrement indiquée pour :• les inhibiteurs à spectre d’action large• les inhibiteurs de protéines ubiquitaires• les molécules administrées à forte dose• les molécules insolubles• les molécules instables comme les ARNi

ciblage amélioré par greffage d’anticorps :

Ex. : immunoliposomes de LAQ824 avec des anticorps anti-HER2 à leur surface.

Inhibiteurs d’HDAC de la hsp90 du protéasome

59

Remerciements

EQUIPE VIII :• Michel Renoir• Céline• Véronique

FINANCEMENT : Ligue Nationale Contre le Cancer

ANALYSES EN FACS : Michel Kornprobst

OUTILS :• J.-C. Faye• K.S. Korach et S.O. Mueller• F. Vignon• D.P. McDonnell

fonction de la forme du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain :

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