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Exploration de l’hypersensibilité de type IV : de l’ELISPOT au QUANTIFERON

Lorna GARNIERLaboratoire d’Immunologie – Centre Hospitalier Lyon Sud

DESC d'Allergologie et Immunologie Clinique10/03/2016

Classification de Gells et Coombs

Retardée : 48 à 72 h délai nécessaire à la rencontre de l’Ag avec T spécifiques, leur prolifération et migration des mono/macrophages

Hypersensibilité de type IV : Les Antigènes

Infections bactériennes, parasitaires, mycosiques et viralesDéveloppement intracellulaire

Antigènes protéiquesPoids moléculaires (P.M.) élevédoses faiblesInjection intradermique (ID) ou sous‐cutanée (SC)

Antigènes portés par les allogreffesAntigènes HLA / classe II

Autres substancesCosmétiques, produits d’entretien, industrie, ..Dinitrochlorozène DNCBDinitrofluorobenzène DNFBAdjuvants

Adjuvant complet de Freund

Hypersensibilité de type IVPhysiopathologie

Hypersensibilité de type IVMécanismes effecteurs : exemple du Nickel

Molecular mechanisms of Nickel AllergySaito et al. Int Journal of Molecular Sciences 2016

Phase de sensibilisation

2ème sensibilisation/ persistance de l’antigène : réaction d’hypersensibilité retardée

Hypersensibilité de type IV et Pathologie humaine

1. Défense anti‐infectieuse

2. Dermatite atopique

3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée

4. Rejet de greffe

5. Auto‐immunité


Infections bactériennes, parasitaires, mycosiques et virales :Mycobacterium tuberculosis, lepraeBrucellaToxoplasma gondiiLeishmania majorCandida albicansCMV, herpes

Exemple : exploration de l’immunité anti-tuberculeuse

Contamination par Mycobacterium tuberculosis

9

Infection abortive

Infection primaire5% des cas

Tuberculose latente95% des casPersistance de la bactérie sous forme quiescente

Kaufmann SHE, Nature Review – Immunology 2001


Détection de l’infection tuberculeuse latente

10

Pas de symptômesPas de contagionRéponse immunitaire détectable


Immunité anti‐tuberculeuse : Réponse immunitaire adaptative

11Kaufmann SHE. Immunity, 2010

• Immunité anti‐tuberculeuse protectrice : type Th1

• Antigènes de M. tuberculosis présentés par les cellules dendritiques aux Ly T naïfs

• Différenciation des Ly en Ly Th1 sous l’influence de l’Interleukine 12


Immunité anti‐tuberculeuse : Mémoire immunitaire

12

Cellules mémoires

Les cellules mémoires et effectrices circulent dans le

sang

Kaufmann SHE. Immunity, 2010

Tests d’exploration de l’HSR basés sur la détection/activation des LyT effecteurs/ mémoire


Outils diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente

13

• Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine (hypersensibilité type IV)

• Tests de détection de l’IFN‐g (IGRAs Interferon‐gamma‐release Assays)


Outils diagnostiques de l’Infection tuberculeuse latenteIntradermoréaction (IDR) à la tuberculine

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Limites :• Subjectivité• Sensibilité moyenne• Nécessité de 2 visites• Faible spécificité :

Réaction croisée avec le vaccin BCGMycobactéries non tuberculeuses (NTM)

• Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis

• Lecture à 72h par mesure du diamètre d’induration en mm

• Seuil de positivité


QuantiFERON®‐TB GOLD

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Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)

Incubation du sang total périphérique (anticoagulant héparine) avec les protéines mycobactériennes

Dosage de l’IFN‐g plasmatique par technique ELISA (UI/mL)

BHN 200

Sensibilité : 80‐90%

valeur prédictive négative d’évolution vers la maladie dans les deux ans en pays de faible endémie est autour de 97 ‐ 99 %

incubation à 37ºC pdt 16-24h 2. Centrifugation

ESAT-6CFP-10

Contrôle - Mitogene Contrôle +

4. Lecture spectrophotométrique

3. Plasma +conjugué Incubation 2H.

Test IGRA : QuantiFERON : Interprétation

16

NulTémoin –Tube gris

TB Ag – NulTube patientTube rouge

Mit – NulTémoin +Tube violet

Résultat

IFN gamma (UI/mL)

≤ 3 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF

≤ 3 0,35 – 0,6 ≥ 0.5 DOUTEUX

≤ 3 ≥ 0.6 ≥ 0.5 POSITIF

≤ 3 ≤ 0.5 ININTERPRETABLEAbs ctrl positif

≥ 3 ININTERPRETABLEActivation spontanée

Variabilités inter et intra individuelles importantes : pas d’interprétation quantitative des résultatsZone grise: 0,35 – 0,6 UI/mL‐> résultat à contrôler


Tests IGRA T‐SPOT®TB : Technique ELISPOT

17Lavages et ajout de l’Ac conjugué

Ajout du substrat

PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT

Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l’IFN‐g.

Capture de l’IFN‐g par les anticorps. Incubation.

Chaque spot correspond à unecellule sécrétrice

d’IFN‐ɤ

Apparition des spots en 7 minutes

A partir de Cellules mononuclééesAntigènes spécifiques (testés séparément) : ESAT, CFP‐10


Tests IGRA T‐SPOT®TB : Technique ELISPOT : Interprétation

Témoin négatif Témoin positif Panel A Panel B

Interprétation :nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≥ 8 : POSITIF

nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≤ 4 : NEGATIF

nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX


Tests IGRA : sélection d’antigènes spécifiques de M. tuberculosis

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Antigènes spécifiques• ESAT‐6• CFP‐10• TB 7.7

Codage par les gènes de la région RD1

Absents de la plupart des mycobactéries atypiques

Induisent la sécrétion d’IFN‐ɤ

Antigènes spécifiques de M.

tuberculosis

Antigènes spécifiques du BCG

Antigènes communs

ESAT‐6 : Early Secretory Antigen 6CFP‐10 : Culture Filtrate Protein 10 complex


Tests IGRA : Interprétation clinique et biologique

TEST POSITIF

• fréquence élevée de Ly T (effecteurs/mémoires) spécifiques de M. tuberculosis :

rencontre de M. tuberculosis

• faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France)

• Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt anti‐TNF)

!!Les IGRA ne permettent pas de distinguer l’infection tuberculeuse latente de la tuberculose maladie

Il ne permettent pas non plus de définir l’ancienneté de l’infection, le risque d’évoluer vers une tuberculose maladie, ni le suivi d’une

antibiothérapie anti‐tuberculeuse


Tests IGRA : Recommandations HCSP 2011(Haut Conseil de la Santé Publique)

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Diagnostic de ITL : ↘ le réservoir de patients infectés• Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts (enfants > 5 ans ‐ sujets âgé > 80 ans)• Patients infectés par le VIH (bilan initial)• Dépistage avant mise sous anti‐TNF • Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :

embauche (si IDR > 5 mm)cas contact

• Migrants entre 5 et 15 ans

Diagnostic de tuberculose maladie : Chez l’enfant

Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et uniquement dans l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)

(ITL : Infection tuberculeuse latente)


Exemple 2 : Tests IGRA et CMV

Réponse T est critique dans le contrôle de la réplication du CMV

Evaluation de la réponse immune du patient pour déterminer le risque de réactivation virale.

Application :Suivi post‐transplantation


Evaluation of Cytomegalovirus (CMV)‐Specific T Cell Immune Reconstitution Revealed That Baseline Antiviral Immunity, Prophylaxis, or Preemptive Therapy but not Antithymocyte Globulin Treatment Contribute to CMV‐Specific T Cell Reconstitution in Kidney Transplant Recipients Abate et al. J Infect Dis. (2010)

Elispot (nb de spot /200000 PBMCs)

Exemple 2 : Tests IGRA et CMV


Virémie (nb de copie /mL)

2. Dermite de contact

10% des motifs consultation en dermatologie

Travailleurs de l’industrie, cosmétique, produits d’entretien, médicaments

Haptènes en cause très variés

Diagnostic : Patch tests

Médecine du travail / Médecine médico‐légale

ELISPOT ‐> manque de sensibilité


Différentes formes cliniques Éruptions maculo-papuleusesPustulose exanthématique aiguë généraliséeErythème pigmenté fixe bulleux, Erythème polymorphe majeurDRESS (Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symptoms), Syndrome de Stevens Johnson/Necrolyse epidermique toxique (syndrome de Lyell)

Diagnostic parfois difficile : HS allergique/non allergiqueImputabilité du médicament

Implication des LyT (réponse type Th1)

Présence de LyT spécifiques du médicament

Test de transformation lymphoblastique

Sensibilité : ~60%Spécificité : ~80%

Augmentation de la sensibilité :‐ ajout d’anticorps anti‐CTLA4 et anti‐PDL1‐ déplétion des LyT régulateurs

Non utilisé en pratique courante


ELISPOT

Detection and quantification of drug‐specific T cells in penicillin allergy, Rozieres et al. Allergy 2009

Sensibilité = 91% ‐ spécificité = 95%

Performances analytiques non retrouvées dans étude multicentrique

Erythème maculopapuleux suite à la prise d’Amoxicilline


In vitro drug causality assessment in Stevens‐Johnson syndrome Alternatives for lymphocyte transformation test

15 patients avec syndrome de Steven Johnson ou Toxidermie nécrosante

TTL : positif chez 4/15 patients (Se : 27%)ELISpot Granzyme B : positif chez 5/15 patients (Se : 33%)Test de production d’IFN gamma (type Quantiferon) Se : 55%

Conclusion : combinaison de plusieurs tests :Expression de granulysine par LyT CD4+Granzyme B ELISpotTest de production d’IFN gamma

Se : 80% et Sp : 95%


Porebski et al. , Clinical mechanisms 2013

Hypersensibilité médicamenteuse et présentation antigénique


Pathogenesis and diagnosis of delayed‐type drug hypersensitivity reactions, from bedside to bench and back. Schrijvers et al. Clin Transl Allergy (2015) 5:31

4. HSR et rejet de greffe

Rejet de greffe aiguLe greffon est toujours le siège d’un important infiltrat de cellules mononucléesL’infiltrat est composé en majorité de lymphocytes CD4 +

5. HSR et auto‐immunité

L’HSR serait à la base des mécanismes lésionnels dansLa thyroïditeLe diabète insulino‐dépendantModèle expérimental

Encéphalomyélite allergique expérimentale

Exploration de l’HSR

Intérêt +++ dans le diagnostique de l’infection tuberculeuse latente.

Peu d’application in vitro du fait du manque de sensibilité notamment pour l’exploration des hypersensibilités médicamenteuses

Nombreuses applications potentielles

exploration de l’hypersensibilité de type iv de...

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