etude par microcalorimétrie des effets de protonation ... · remerciements je tiens tout d’abord...

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences Appliquées

Service de Chimie Organique

Etude par microcalorimétrie des effets de protonation associés aux interactions

enzyme-inhibiteur

Promoteur : Dr. Kristin Bartik

Année académique 2003-2004

Mémoire de fin d’études présenté en vue de l’obtention du grade

d’Ingénieur Civil Chimiste

Wylock Christophe

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le professeur Kristin Bartik de m’avoir accueilli dans

son service, de m’avoir apporté le soutien nécessaire à la réalisation de ce travail et

d’avoir su me pousser quand il le fallait. Merci pour votre patience, votre pédagogie

et votre enthousiasme au travail.

Je tiens aussi à remercier tout spécialement Gilles Bruylants de m’avoir appris les

bases du laboratoire ainsi que de m’avoir fait partager son savoir. Il m’a

accompagné, tel un grand frère dévoué, tout au long de cette passionnante aventure

et a toujours été là pour répondre à mes interrogations.

Egalement un grand merci à Juliana pour ses coups de main au laboratoire ainsi

qu’à Nicole qui permet à la planète P2 de tourner en rond et pour la bonne humeur

qu’elle a su me transmettre.

Je tiens aussi à remercier tous ceux qui ont assisté à mes répétitions et qui m’ont

permis d’avancer vers le bon chemin.

Enfin, merci à tous mes collègues de bureau Gilles, Sophie, Marina et Gaëlle, pour

l’ambiance chaleureuse que j’ai ressenti parmi eux durant toute cette année.

Table des matières

Résumé

Chapitre 1 : Introduction ........................................................................................... 1

1.1) Cadre général ................................................................................................... 1

1.2) Les interactions non-covalentes ....................................................................... 1

1.3) La reconnaissance moléculaire ........................................................................ 3

1.4) Interaction récepteur ligand .............................................................................. 3

1.5) Enzyme et inhibiteur ......................................................................................... 5

1.6) Effet de protonation lors de l’interaction enzyme-inhibiteur réversible .............. 9

1.7) But du travail .................................................................................................. 10

Chapitre 2 : Calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ............................................... 11

2.1) Généralités ..................................................................................................... 11

2.2) Description ..................................................................................................... 12

2.3) Détermination des paramètres thermodynamiques ........................................ 15

Chapitre 3 : Interaction trypsine – benzamidine ................................................... 17

3.1) Présentation ................................................................................................... 17

3.2) Détermination par ITC de la constante d’affinité et de l’enthalpie d’interaction

trypsine-benzamidine ....................................................................................... 19

3.4) Conclusion ..................................................................................................... 21

Chapitre 4 : Interaction chymotrypsine – proflavine ............................................ 22

4.1) Présentation ................................................................................................... 22

4.2) Détermination des constantes d’affinité par spectroscopie UV-Visible ........... 26

a) Principe ...................................................................................................... 26

b) Méthode choisie ......................................................................................... 27

c) Détermination des constantes d’affinité ..................................................... 29

d) Résultats .................................................................................................... 30

e) Discussion ................................................................................................. 32

4.3) Détermination par ITC de l’enthalpie d’interaction .......................................... 37

a) Méthode choisie ......................................................................................... 37

b) Résultats .................................................................................................... 39

c) Discussion .................................................................................................. 39

4.5) Conclusion ..................................................................................................... 47

Chapitre 5 : Conclusion .......................................................................................... 49

Chapitre 6 : Matériaux et méthodes ....................................................................... 52

Chapitre 7 : Bibliographie ....................................................................................... 55

Résumé

Ce travail a été réalisé dans le cadre de l’étude des interactions non-covalentes

entre petites molécules et protéines qui conduisent à la formation d’un complexe

réversible. Nous nous sommes intéressés au cas particulier de l’interaction entre une

molécule chargée et une protéine possédant des résidus pouvant être chargés dans

le site de complexation de la petite molécule. Nous avons étudié l’effet de l’état de

protonation de ces résidus chargés dans le site de complexation de la protéine sur

les grandeurs thermodynamiques caractérisant l’interaction.

Nous avons utilisé deux systèmes modèles de type enzyme-inhibiteur :

trypsine-benzamidine,

chymotrypsine-proflavine.

La trypsine et la chymotrypsine sont deux enzymes possédant au niveau du site de

complexation une histidine. L'état de protonation de cette histidine peut varier dans

une gamme de pH autour du pH physiologique. La benzamidine et la proflavine sont

des petites molécules qui sont protonées dans cette gamme de pH.

L’étude par calorimétrie à titrage isotherme (ITC) du système trypsine-

benzamidine n’a malheureusement pas pu nous donner de résultats exploitables.

Nous avons conclu que les problèmes rencontrés étaient dus à l’autolyse de la

trypsine, malgré toutes les précautions prises pour tenter de l'inhiber.

Le système chymotrypsine-proflavine ne présente pas de problème d'autolyse

mais ces molécules ont tendance à s'agréger. Ce problème est évité en travaillant à

des concentrations faibles. A cause de cette contrainte, nous n’avons pu déterminer

que l’enthalpie d’interaction par ITC, pas la constante d’affinité. Celle-ci a été

déterminée par spectroscopie UV-Visible.

Les résultats indiquent que l’interaction est beaucoup plus favorable avec la

chymotrypsine lorsque le site de complexation est déprotoné. Cela a pour

conséquence que l'équilibre de protonation de ce site est déplacé par l'interaction

avec l'inhibiteur, ce qui conduit à un échange de protons avec le tampon. Le choix du

tampon a une influence sur l'enthalpie d'interaction puisque chaque tampon a sa

propre enthalpie d'ionisation.

En effectuant les mesures dans différents tampons et à différents pH, nous avons

pu déterminer l’effet de l’échange de protons sur les grandeurs thermodynamiques

observées.

Chapitre 1 : Introduction Page 1

Chapitre 1 : Introduction

1.1) Cadre général

Au cours de ce travail, nous allons nous intéresser à l’interaction entre un enzyme

et un inhibiteur réversible. L’interaction enzyme-inhibiteur n’est qu’un cas particulier

d’un phénomène beaucoup plus général : l’ interaction entre un récepteur

moléculaire et un ligand (ou interaction Host-Guest).

Lorsqu’un récepteur moléculaire est mis en présence d’un ligand, des forces

d’interactions non-covalentes entre ces deux entités peuvent conduire à la formation

d’un complexe réversible.

1.2) Les interactions non-covalentes

Les interactions covalentes, fortes et hautement directionnelles, sont responsables

de la connectivité entre atomes d’une molécule. Cependant, des atomes qui ne sont

pas liés de manière covalente peuvent interagir les uns avec les autres. Ces

interactions sont dites interactions non-covalentes. Elles sont fonctions de la distance

entre atomes.

La différence avec les interactions covalentes n’est pas d’ordre qualitatif mais

quantitatif. Différentes classifications des forces non-covalentes sont possibles

suivant les définitions utilisées pour les différentes interactions. On peut trouver ci-

dessous un exemple de classification. Un exemple sera donné à titre illustratif pour

les différentes catégories d’interaction.

- interactions coulombiennes entre charges

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre un ion Na+ et un ion Cl

-, séparé de 5 Å : -278 kJ/mol.

- interactions charges-multipôles permanents

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre un ion Na+ et une molécule d’eau, séparé de 5 Å , la

charge négative du dipôle de l’eau étant orienté vers la charge de l’ion : -21,4 kJ/mol.


- interactions charges-multipôles induits

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre un ion Na+ et le dipôle induit dans molécule de

méthane, le centre du dipôle étant séparé de la charge de 5 Å : -2,9 kJ/mol.

- interactions multipôles-multipôles

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre deux molécules d’eau, séparée de 5 Å , leur dipôle

étant parallèle et aligné : -3,3 kJ/mol.

- interactions multipôles-multipôles induits

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre une molécule d’eau et le dipôle induit dans une

molécule de méthane, séparée de 5 Å : -0,034 kJ/mol.

- forces de dispersion (London)

Ex : potentiel d’interaction dans le vide entre deux molécule de méthane, séparée de 4 Å : -10,9

kJ/mol.

- forces de répulsion (Pauli)

- liens H

Ex : le potentiel d'interaction associé à un lien H entre deux molécule d’eau dans l'eau varie entre

10 et 40 kJ/mol.

On peut également citer les interactions hydrophobes, qui décrivent l'attraction entre

molécules non-polaires dans l'eau [1].

Ex : énergie libre de dimérisation de deux molécules de méthane dans l'eau: ΔG° = -8,5 kJ/mol.

Interactions covalentes et non-covalentes différent principalement par les ordres de

grandeurs des énergies mises en jeu. En effet, l’énergie d’une liaison covalente varie

entre 200 et 800 kJ/mol [1].

Les interactions non-covalentes conduisent à la cohésion d’un système. Elles

peuvent être aussi bien intramoléculaires qu’intermoléculaires :

- Les interactions entre les différents groupements d’une même molécule vont

intervenir dans l’orientation spatiale qu’adopteront ces groupements les uns par

rapport aux autres. Il en résultera la structure tridimensionnelle globale de la

molécule. Les protéines en sont un exemple [2].

- Les interactions entre les différents groupements de différentes molécules peut

conduire à l’assemblage de ces dernières pour former une structure

supramoléculaire. Ex : la double hélice de l’ADN [2].


1.3) La reconnaissance moléculaire

Un récepteur moléculaire est une molécule possédant des groupes fonctionnels

disposés de telle manière qu’elle puisse interagir favorablement avec une autre

molécule appelée ligand. Cette interaction peut conduire à la formation d’un

complexe réversible, car il n'y a pas de liens covalents qui sont formés. Dans

certains cas, la disposition des groupements du récepteur et du ligand est telle que

l’interaction n’est favorable qu’entre un récepteur et un ligand particulier. Si

l’interaction est sélective, on parle de reconnaissance.

Les êtres vivants disposent d’un très grand nombre de récepteurs. On retrouve

ces récepteurs biologiques à de nombreux endroits : membranes cellulaires,

synapses, canaux ioniques... . Ces récepteurs sont extrêmement spécifiques.

1.4) Interaction récepteur ligand

La formation d’un complexe récepteur-ligand réversible est le résultat global d’un

ensemble d’interactions complexes, et la détermination de grandeurs

thermodynamiques associées à l'interaction nous aide à caractériser l’énergétique

des systèmes [3].

Dans le cas particulier d’une interaction 1:1

(L : ligand ; R : récepteur)

L’interaction est caractérisée par la constante d’affinité Ka.

]][[

][

LR

RLKa

La constante d’affinité de l’interaction est reliée à l’énergie libre de Gibbs standard

ΔG° par la relation :

RT

G

a eK

L + R LR


L’énergie libre, la « force motrice » de l’interaction, est la somme de deux

contributions :

STHG

où H et S sont l’enthalpie et l’entropie standard de l’interaction.

Le terme enthalpique est lié à la somme des contributions des formations ou des

ruptures de liens non-covalents et il se manifeste, à pression constante, par une

absorption ou une libération d’énergie sous forme de chaleur.

Le terme entropique, quant à lui, reflète les changement dans l’ordre du système. Il y

a notamment l'entropie de changement de solvatation et le changement de l’entropie

conformationnelle [4].

La connaissance des termes enthalpique et entropique nous apporte une

information plus riche sur l’interaction par rapport à la constante d’affinité seule. En

effet, des processus ayant des ΔG° similaires peuvent avoir des ΔH° et des ΔS° très

différents.

Pour illustrer, prenons l’exemple de l’interaction de l’anhydrase carbonique II

(enzyme catalysant la décomposition de l’acide carbonique en gaz carbonique et en

eau [5]) avec le 4-carboxybenzène-sulfonamide (CBS) et le

5-diméthylamino-1-naphtalène-sulfonamide (DNSA) [6].

CBS DNSA

ΔG° = -35 kJ/mol -37 kJ/mol

Ka(25°C) = 1,4.106 M

-1 3,1.10

6 M

-1

ΔH° = -50 kJ/mol -20 kJ/mol

TΔS° = -15 kJ/mol +17 kJ/mol

C

O OH

S

NH2

O O S

NH2

O O

NH3C CH3

Figure 1.1a Figure 1.1b


On voit que les énergies libres sont proches, et les constantes d’affinité du même

ordre de grandeur. Par contre, les enthalpies sont différentes, quoique favorables

dans les deux cas. D’un point de vue entropique, la première interaction est

favorable tandis que la deuxième est défavorable. Ceci reflète que les forces ayant

conduit à l’interaction sont différentes.

Dans le cas que nous allons étudier, le récepteur est un enzyme.

1.5) Enzyme et inhibiteur

Les enzymes sont des molécules d’une extrême importance sur le plan biologique.

En effet, ce sont des catalyseurs très efficaces. Les réactions qu’ils catalysent sont

de 103 à 106 fois plus rapides que les réactions correspondantes non catalysées

(bon nombre de ces réactions ont des cinétiques très faibles dans les conditions

physiologiques). De plus, les enzymes sont hautement stéréospécifiques. Ils

catalysent généralement une seule réaction avec un seul substrat [2].

Les enzymes sont des protéines, c’est-à-dire des chaînes linéaires d’acides

aminés. Bien que plus de 500 acides aminés naturels soient connus, tous les êtres

vivants, depuis la bactérie jusqu’à l’homme, sont essentiellement constitués de 20

acides aminés [7].

Chaque acide aminé est constitué d’un carbone central, appelé carbone α. Il est

attaché à 4 groupes 2), un groupe acide

e,

NH2

COOH

R

H

Figure 1.2 : Représentation d’un acide aminé L en projection de Fischer.


Les 20 acides aminés naturels, à l’exception de la glycine, sont chiraux et ont une

configuration L. Les chaînes latérales des 20 acides aminés principaux sont reprises

dans le Tableau 1.1 [7].

Les différentes propriétés physico-chimiques des chaînes latérales des acides

aminés sont très importantes pour la conformation et la fonction de la protéine. En

effet, les interactions entre chaînes latérales vont conditionner la structure spatiale et

la dynamique de la protéine, qui vont à leur tour conditionner sa fonction.

L’activité des enzymes dans un organisme est régulée. Cette activité peut-être

diminuée, voire bloquée grâce à des substances appelées inhibiteurs. Un inhibiteur

peut être une petite molécule ou une bien une autre protéine.

Le mécanisme d’inhibition d’un enzyme passe par la formation d’un complexe

enzyme-inhibiteur. L’inhibiteur est un ligand du récepteur enzyme. Le complexe

formé peut être réversible ou irréversible. Nous ne nous intéresserons ici qu’à des

inhibiteurs réversibles.


Tableau 1.1 : Chaînes latérales des acides aminés principaux.

R Nom

Code 3

lettres

Code 1 lettre pKa de la

fonction acide

de R

Glycine Gly G

Groupe alkyle

Alanine Ala A

Valine Val V

Leucine Leu L

Avec fonction hydroxyle

Sérine Ser S

Avec fonction amino

Lysine Lys K 10,5*

QGlutamine Gln

10,1

Asparagine Asn N

Tyrosine Tyr Y

Thréonine Thr T

P

Phe

Proline Pro

I

F

Isoleucine Ile

Phénylalanine

H

CH 3

CH (CH 3)2

CH 2C H (CH 3)

CHCH2CH3

CH3

H2

C

CH2

HN

COOH

H

CH 2O H

CHOH

CH3

H2

C OH

CH2CNH2

O

CH 2CH2CNH 2

O

CH 2(CH 2)3NH 2


* pKa de l’acide conjugué

Tableau 1.1(suite) : Chaînes latérales de acides aminés principaux.

R Nom

Code 3

lettres

Code 1 lettre pKa de la

fonction acide

de R

Avec fonction amino (suite)

Avec fonction mercapto ou sulfure

Cystéine Cys C 8,2

Méthionine Met M

Avec fonction carboxylique

Acide aspartique Asp D 3,7

Acide glutamique Glu E 4,3

6,1*Histidine His H

12,5*

Tryptophane Trp W

Arginine Arg RCH2(CH 2)2NHCNH2

NH

CH2

HN

H2

C

N

NH

CH 2SH

CH 2C H 2SCH 3

CH 2C OOH

CH 2C H 2COOH


1.6) Effet de protonation lors de l’interaction enzyme-inhibiteur

réversible

Si l’enzyme possède un ou plusieurs acides aminés protonables dans le site de

complexation de l’inhibiteur, son état de protonation peut influencer l’interaction et un

effet du pH pourrait être observé. Remarquons que l’inhibiteur aussi peut être

protonable et que son état de protonation peut également influencer l’interaction [8].

Dans le cas où on considère :

- un enzyme possédant, dans le site de complexation, un seul acide aminé

protonable dont l’état de protonation peut varier dans la gamme de pH

physiologique, qui est celle que nous avons étudiée,

- un inhibiteur dont l’état de protonation ne change pas dans cette gamme de pH,

on peut représenter le système de la manière suivante [9] :

][][

][1int,

IE

EIK ;

][][

][2int,

IEH

IEHK

][

][][

EH

HEK f

a ; ][

][][

IEH

HEIK c

a

où E et EH+ représentent l'enzyme sous sa forme non protonée ou protonée

respectivement, et I représente l'inhibiteur. Remarquons que, pour simplifier

l’expression, nous utiliserons le terme enzyme protoné ou déprotoné pour désigner

l'enzyme lorsque l'acide aminé du site de complexation est protoné ou déprotoné,

respectivement.

Kint,1 et Kint,2 sont les constantes d’affinité entre l’inhibiteur et, respectivement, les

formes déprotonée et protonée de l’enzyme.

Ka f et Ka

c sont les constantes d’acidité de l’acide aminé protonable de l’enzyme libre

et complexé.

Kint,2

Kac Ka

f

Kint,1

EH+ + I EH

+I

E + I EI

Schéma 1.1


Remarquons que les constantes sont reliées par la relation suivante :

fa

ca K

K

K

K.

2int,

.

1int,

L’énergie libre étant une fonction d’état, elle est indépendante du chemin emprunté

pour passer d’un état à un autre.

L’inhibiteur I peut à priori interagir avec les deux formes de l'enzyme. Or, ces deux

formes sont différentes. On peut donc s’attendre à ce que Kint,1 et Kint,2 soient

différentes.

1.7) But du travail

Le but de ce travail est d’utiliser la microcalorimétrie à titrage isotherme (ITC) pour

déterminer la contribution d’un effet de protonation sur les grandeurs

thermodynamiques associées à l’interaction entre un enzyme et un inhibiteur

compétitif. Pour cela, deux systèmes modèles seront utilisés :

- trypsine – benzamidine

- chymotrypsine – proflavine.

Il s’agit de deux enzymes possédant un acide aminé protonable dans le site de

complexation de leur inhibiteur.

Les études seront réalisées en solution aqueuse à différents pH, dans différents

tampons et à force ionique tant que possible constante.

Chapitre 2 : Calorimétrie à titrage isotherme (ITC) Page 11

Chapitre 2 : Calorimétrie à titrage isotherme (ITC)

2.1) Généralités

L’ITC est une technique performante qui permet de déterminer, en une seule

expérience, la constante d'affinité et l'enthalpie associée à une interaction.

Elle est aujourd’hui très employée en biologie et en pharmacie pour étudier divers

types d’interactions :

interactions protéines-drogues

interactions protéines-protéines

interactions ADN-protéines

interactions ADN-drogues

……

Les appareils modernes sont aujourd’hui suffisamment sensibles pour détecter des

chaleurs de l’ordre du µJ.

La calorimétrie est la seule méthode permettant la mesure directe de la variation

d’enthalpie ΔH° et de la constante d’affinité Ka, et par là même d’en déduire l’entropie

ΔS°, associée à une interaction [10]. Beaucoup de techniques permettent de

déterminer la constante d'affinité mais l’enthalpie est obtenue indirectement à partir

de la relation de van’t Hoff [11].

lnKT lnKT0HT

0

CpT0 R

1

T

1

T0

Cp

Rln

T

T0

(ΔCp est la différence entre les chaleurs spécifiques des produits et des réactifs ; R

la constante des gaz parfait et T0 une température de référence)


En mesurant Ka à différentes températures et en portant ln (Ka) en fonction de 1/T,

on obtiendrait une courbe dont la pente de la tangente en chaque point est

proportionnelle à ΔH° (Figure 2.1).

Il suffirait donc d’ajuster les paramètres à la courbe obtenue pour pouvoir

connaître l’enthalpie aux différentes températures. Mais ce n’est pas facile car les

mesures de Ka sont souvent entachées de beaucoup d’erreur.

2.2) Description

Un microcalorimètre est constitué de deux cellules identiques enfermées dans une

enceinte adiabatique (Figure 2.2). L’ensemble est maintenu à la température de

l’expérience. Une des cellules est remplie avec le solvant (de l’eau dans notre cas) et

sert de référence. L’autre cellule, la cellule de travail, est remplie avec une solution

contenant le récepteur. Au sein de cette solution plonge l’extrémité d’une seringue,

qui est remplie d’une solution de ligand.

Les concentrations du récepteur et du ligand sont connues.

Lorsqu’on injecte du ligand dans la solution de récepteur, l'interaction entre ces

deux molécules va provoquer un dégagement ou une absorption de chaleur, suivant

que le processus est exo- ou endothermique. La température de la cellule de travail

est alors modifiée par rapport à la cellule de référence.

lnKa

1

T

lnKa

1

T

lnKa

1

TFigure 2.1 : Graphique ln(Ka) en fonction de 1/T.


La base de cette technique est de mesurer la puissance qui doit être ajoutée ou

enlevée pour maintenir la cellule de travail à la même température que la cellule de

référence [10].

Figure 2.2 [10]

: Représentation schématique de l’ITC. L’appareil mesure la puissance

nécessaire pour maintenir une différence de température nulle entre les 2

cellules.

On essaie de choisir les concentrations des deux espèces telles que, au bout

d’une série d’injections, tout le récepteur dans la cellule est saturé. Ainsi, la chaleur

observée pour les dernières injections est uniquement due à l’enthalpie de dilution du

ligand. Un exemple de courbe obtenue est donné à la Figure 2.3 .

La chaleur par injection peut être déterminée par intégration de l’aire sous les pics.

Cette chaleur est portée en graphique en fonction du nombre de l'injection ou du

rapport des concentrations des deux composants. On obtient une courbe appelée

thermogramme (Figure 2.4).

La chaleur de dilution du ligand est déterminée en réalisant un titrage avec une

cellule de travail ne contenant que du solvant. La soustraction de la chaleur mesurée

lors du titrage à celle de dilution donne la chaleur de l’interaction.


Ce thermogramme permet de déterminer les paramètres thermodynamiques de

l’interaction car :

- la valeur du plateau de départ est fonction de ΔH°

- la courbure de la sigmoïde est fonction de Ka.

Figure 2.4 : chaleur dégagée par l’interaction en fonction du nombre de

l’injection lors du titrage de BaCl2 dans l'éther couronne 18-crown-6.

Figure 2.3 : Mesure de la puissance requise en fonction du temps pour maintenir

une différence de température nulle entre les 2 cellules lors du titrage de BaCl2

dans l'éther couronne 18-crown-6.

µW

sec


2.3) Détermination des paramètres thermodynamiques

Soit un récepteur possédant n sites d’interactions identiques avec un ligand.

Le modèle d’interaction est :

où RLn est le complexe formé.

A la ième injection, la chaleur d’interaction qi vaut :

cellinini VRLRLHnq )][]([ 1

ΔH° est l’enthalpie d’interaction,

Vcell est le volume de la cellule,

[RLn]i est la concentration de complexe dans la cellule après la ième injection. Elle

dépend de la constante d’affinité Ka du récepteur pour le ligand, de la stœchiométrie

n et des concentrations totales (c’est-à-dire formes libre et complexée confondues)

de récepteur et de ligand [R]tot,i et [L]tot,i dans la cellule de travail après la ième

injection.

itotitotain LRnKfRL ,.,... ,,,

[R]tot,i et [L]tot,i varient au cours du titrage. A chaque injection, [L]tot,i augmente, tandis

que [R]tot,i diminue suite à l’effet de dilution par l’injection. En effet, le volume de la

cellule étant constant, un volume de solution égal au volume de la solution de ligand

injectée est repoussé hors de la cellule, ce qui diminue la quantité de récepteur

présent dans la cellule.

La variation de [R]tot,i et [L]tot,i est connue et on peut exprimer leur valeur en

fonction des concentrations initiales en récepteur [R]0 et en ligand [L]0 et en fonction

du nombre de l’injection. Pour une série de Ninj injections de volume Vinj , [R]tot,i et

[L]tot,i sont donnés par :

, 0[ ] [ ]

i

cell inj

tot i

cell

V VR R

V

pour i = 1,…, Ninj.

,1 0[ ] [ ]inj

tot

cell

VL L

V et , 0 , 1[ ] [ ] [ ]

inj cell inj

tot i tot i

cell cell

V V VL L L

V V

pour i = 2,…, Ninj

R + nL RLn


Dans le cas particulier d’une interaction 1 :1 (n=1), [RL]i est donné par :

2

, , , , , ,

1 1 1[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 4[ ] [ ]

2i tot i tot i tot i tot i tot i tot i

a a

RL E I E I E IK K

Et la chaleur d’interaction vaut :

1([ ] [ ] )i i i cellq H RL RL V

Ce modèle contient 2 paramètres : Ka et ΔH° . L’ajustement du modèle à la courbe

expérimentale par un algorithme d’optimisation nous permet de déterminer ces

paramètres.

Chapitre 3 : Interaction trypsine – benzamidine Page 17

Chapitre 3 : Interaction trypsine – benzamidine

3.1) Présentation

La trypsine est un enzyme de la famille des sérines protéases. La trypsine que

nous avons utilisée est de la trypsine pancréatique bovine. Elle est constitué d’une

simple chaîne de 223 acides aminés. Sa structure (figure 3.1) a été déterminée par

cristallographie aux rayons X [12].

Son rôle biologique est de catalyser l’hydrolyse des liens peptidiques d’une

protéine. Elle hydrolyse spécifiquement les liens peptidiques dont le résidu juste

avant est une lysine ou une arginine [13],[17]. On peut voir dans le Tableau 1.1 que

lysine et arginine sont des résidus basiques.

La spécificité de la trypsine est due à l’existence d’une poche hydrophobe au

niveau de son site actif (en bleu sur la Figure 3.1). Elle est formée par les résidus

189 à 192, 214 à 216, et 224 à 228 [16]. Cette poche contient un résidu aspartate qui

va interagir favorablement avec ces résidus basiques.

Figure 3.1 : Représentation ruban de la trypsine

(1CE5 [12]

de la Protein Data Bank ). La poche

hydrophobe est représentée en bleu.

Figure 3.2 : Structure de la

benzamidine.


Figure 3.3 [2]

: Représentation schématique de la poche hydrophobe avec le

résidu aspartate 189 de la trypsine.

La benzamidine (Figure 3.2) est une petite molécule qui peut être considérée

comme un analogue structural de l’arginine. Elle est donc un inhibiteur compétitif de

la trypsine [14] car son site de complexation est le site actif de l’enzyme.

La benzamidine est protonée au niveau de l’azote de l’amine pour les pH autour du

pH physiologique. Son pKa vaut 10,5 ± 0,2 [15].

Il a été observé que les paramètres thermodynamiques de l’interaction entre la

trypsine et la benzamidine varient en fonction du pH [14],[17]. Le site de complexation

de la trypsine présente plusieurs acides aminés protonables. Un de ces acides

aminés peut être à l’état protoné ou déprotoné dans la gamme de pH que nous

étudions : l’histidine 57 (Figure 3.4). C’est la raison pour laquelle nous avons décidé

d’étudier ce système, dans une gamme de pH autour du pKa de cette histidine.

Il est important de signaler que la trypsine possède des acides aminés lysine et

arginine (14 lysines et 2 arginines). Elle peut de ce fait catalyser sa propre hydrolyse.

La trypsine est active dans une gamme de pH allant de 6 à 12 avec un maximum

entre 8 et 9 [18]. L’autolyse est donc possible dans la gamme de pH que nous

utilisons. Cette autolyse peut cependant être diminuée par l’ajout de CaCl2 en excès

[14],[17],[19].


Figure 3.4 : Zoom sur le site de complexation de la benzamidine dans la trypsine (1CE5 [12]

de la

Protein Data Bank). Poche hydrophobe en bleu, benzamidine en jaune, histidine 57

en rouge. La benzamidine interagit via liens H avec les résidus glycine 219, sérine

190 et aspartate 189 ( en bleu ball&stick) [17]

.

3.2) Détermination par ITC de la constante d’affinité et de

l’enthalpie d’interaction trypsine-benzamidine

Nous avons fait des expériences à l’ITC dans le but de déterminer la constante

d’affinité et l’enthalpie de l’interaction trypsine-benzamidine.

Malheureusement les expériences n’étaient pas concluantes. Les résultats que

nous avons obtenus n’étaient pas reproductibles.

Il se peut que les problèmes soient dus à l’autolyse de la protéine malgré l’ajout de

CaCl2 en excès dans la solution. Il est en effet probable que la température de travail

de 25°C favorise l’autolyse de la trypsine.

On peut voir aux Figure 3.5 et Figure 3.6 deux courbes d'un titrage trypsine-

benzamidine dans une solution tamponnée par du Tris à pH 8. La première courbe a

été obtenue avec des solutions de trypsine et de benzamidine fraîchement

préparées. La deuxième courbe a été obtenue en réalisant le même titrage une

semaine plus tard avec les mêmes solutions


Sur les deux figures, l’aire des 7 premiers pics décroît à chaque nouvelle injection

de ligand, mais l’aire de ces pics entre les deux figures sont différentes. En effet,

l’aire de ceux de la Figure 3.6 est en moyenne 20% inférieure à ceux de la Figure

3.5, ce qui nous indique que la concentration de trypsine active est plus faible.

µW

sec

Figure 3.5 : Courbe ITC du titrage trypsine-benzamidine réalisé dans du tampon Tris à pH 8 avec

de la trypsine fraichement préparée.

Figure 3.6 : Courbe ITC du titrage trypsine-benzamidine réalisé dans du tampon Tris à pH 8

avec la trypsine préparée une semaine avant.

sec

µW


A partir du 8ème pic, leur aire reste relativement constante, on a atteint la

saturation. L’aire vaut environ 20 µJ sur la Figure 3.6. Par contre, ceux de la Figure

3.5 ont une aire d’environ 100 µJ. L’importante aire de ces pics ne peut pas être

expliquée par la chaleur de dilution de la benzamidine. En effet, nous avons pu

constater à l’ITC que cette chaleur de dilution est négligeable pour les concentrations

que nous avons utilisées. Une explication possible est que les grands pics observés

en fin de titrage à la Figure 3.5 sont dus à une interaction de la benzamidine avec les

fragments primaires d’autolyse. Ceux-ci possèdent probablement une structure

capable d’interagir encore avec la benzamidine. Au fur et à mesure que le temps

passe, l’hydrolyse des fragments peut se poursuivre si ils contiennent des résidus

lysines ou arginines. Les fragments ultimes sont des chaînes d’acides aminés

probablement trop petites pour posséder encore une structure capable d’interagir

avec la benzamidine, ce qui fait qu'il n'y a plus que des petits pics sur la Figure 3.6 .

Cette autolyse est problématique pour les mesures à l’ITC. En effet, l’autolyse fait

que la concentration en trypsine active est plus faible qu’au moment de sa

préparation et cette concentration est inconnue. De plus, il est possible qu’il n’y ait

pas qu’une seule interaction.

Ces deux phénomènes vont fausser les mesures et donc l’estimation de Ka et de

ΔH°.

3.4) Conclusion

Les problèmes rencontrés pour la mesure des constantes d’affinité et des

enthalpies d’interaction nous ont contraint à renoncer à l’étude de ce système. Nous

nous sommes tournés vers le système chymotrypsine-proflavine.

Chapitre 4 : Interaction chymotrypsine - proflavine Page 22

Chapitre 4 : Interaction chymotrypsine – proflavine

Des données sur ce système étaient déjà disponibles au laboratoire. La résolution

des problèmes liés à l’étude de ce système et des mesures avaient déjà été

effectués par Gilles Bruylants. Ce travail est une contribution permettant une

interprétation plus complète du problème.

4.1) Présentation

La chymotrypsine est également un enzyme de la famille des sérines protéases.

La chymotrypsine utilisée est de la chymotrypsine pancréatique bovine. Elle est

constituée de trois chaînes comptant au total 241 acides aminés. Sa structure est

représentée à la Figure 4.1.

La chymotrypsine catalyse spécifiquement l’hydrolyse des liens peptidiques dont

le résidu juste avant possède une chaîne latérale aromatique ou une longue chaîne

hydrophobe [2]. Elle présente donc une spécificité pour les résidus phénylalanine,

NH

+NH

2NH2

Figure 4.2 : Structure de la

proflavine.

Figure 4.1 : Représentation ruban de la chymotrypsine

(6CHA[21]

de la Protein Data Bank). La poche hydrophobe est

représentée en bleu.


tyrosine, tryptophane et leucine. Cette spécificité est due à une poche hydrophobe

au niveau de son site actif qui accepte ces résidus (en bleu sur la Figure 4.1). Cette

poche est formée par les résidus 189 à 192, 214 à 216, et 224 à 228 [16].

Figure 4.3 [2]

: Représentation schématique de la poche hydrophobe de la chymotrypsine.

Remarquons que la chymotrypsine contient ces acides aminés, elle donc

susceptible de s’autolyser. Contrairement à la trypsine, la chymotrypsine s’autolyse

très lentement. Elle ne pose pas de problème pour les mesures.

La proflavine (Figure 4.2) est une petite molécule qui se place dans cette poche

hydrophobe. Il s’agit donc d’un inhibiteur compétitif puisque son site de

complexation est le site actif de l’enzyme [22],[23],[24]. L’azote cyclique de la proflavine à

un pKa 9,65 [25]. La proflavine est donc protonée au niveau de cet azote est pour les

pH que nous utilisons.

Il a été observé par spectroscopie UV-Visible que l’interaction entre chymotrypsine

et proflavine varie en fonction du pH [22],[23]. Or, le site de complexation de la

chymotrypsine présente plusieurs acides aminés protonables. Un de ces acides

aminés peut être protoné ou déprotoné dans la gamme de pH physiologique que

nous étudions : il s’agit de l’histidine 57 (Figure 4.4). Signalons que la constante

d’acidité de l’histidine 57 dans la protéine est différente de celle de l’histidine libre en

solution aqueuse (voir Tableau 1.1 : pKa = 6,1). En effet, elle se trouve dans un

environnement beaucoup moins polaire que l’eau, ce qui a tendance à élever son

pKa. Sa valeur a été déterminée par RMN : pKa = 6,7 [26].


Nous avons décidé d’étudier ce système, dans une gamme de pH allant de 6 à 8.

Les expériences sont réalisées dans différents tampons, à force ionique, tant que

possible, constante.

Figure 4.4 : Zoom sur le site de complexation (6CHA[21]

de la Protein Data Bank). Poche

hydrophobe en bleu, proflavine en jaune, histidine 57 en rouge.

Il est important de remarquer que la chymotrypsine a tendance à s’agréger sous

forme de dimère [27].

avec dimK et dimH

ME

EK 4

2

2

dim 10.5,3][

][ ; )dim/(5,146dim èredemolkJH

La protéine dimérisée n’interagit pas avec la proflavine car les sites de complexation

se recouvrent (Figure 4.5).

Il est aussi connu que la proflavine a tendance à dimériser [27], voire à polymériser,

lorsque sa concentration dépasse les 120 µM.

avec K et H

1714 MK ; )/(7,37 monomèredemolkJH

La proflavine dimérisée, et à fortiori polymérisée, ne peut pas former de complexe

avec la chymotrypsine car l’encombrement stérique l’empêche de rentrer dans la

poche hydrophobe.

E + E E2

n I In


Figure 4.5 : Représentation ruban de chymotrypsine dimérisée (6CHA[21]

de la Protein Data

Bank). Site de complexation en bleu.

L’équilibre de l’interaction chymotrypsine-proflavine est donc combiné aux

équilibres d’agrégation de la proflavine et de la chymotrypsine, ce qui complique

l’analyse. De plus, étant donné que la dilution s’accompagne d’un dégagement de

chaleur suite à la dédimérisation, le dégagement n’est pas le même suivant que

chymotrypsine et proflavine sont diluées ensemble ou séparément, car l’équilibre de

l’interaction déplace les équilibres de dédimérisation.

La mesure des constantes d’affinité étant problématique par ITC, nous avons

préféré les mesurer uniquement par spectroscopie UV-Visible. Pour les mesures

d’enthalpie, nous pouvons travailler avec des concentrations nous permettant de

négliger les chaleurs de dilution et les obtenir par ITC.


4.2) Détermination des constantes d’affinité par spectroscopie UV-

Visible

a) Principe

La constante d’affinité du complexe peut être déterminée par titrage

spectroscopique [22],[23],[24].

La proflavine a un spectre d’absorption en solution aqueuse avec un maximum à

λmax = 444 nm, qui est une longueur d’onde à laquelle la protéine n’absorbe pas.

Lorsque la proflavine se trouve dans le site de complexation de la chymotrypsine,

son spectre subit un shift batochrome, c’est-à-dire vers les plus grandes longueurs

d’onde. Ce changement dans le spectre d’absorption est du à la nature hydrophobe

(non-polaire) du site de complexation [28]. En effet, il a été montré que le spectre

d’absorption de la proflavine subit un déplacement batochrome lorsque la polarité de

son environnement diminue [22].

La valeur du λmax de la proflavine complexée (458 nm) diffère suffisamment de

celle de la proflavine libre pour que la formation de complexe soit facilement

détectable dans le spectre d’une solution chymotrypsine-proflavine. L'intensité est

proportionnelle à la quantité de complexe formé.

La manière la plus précise de déterminer ce déplacement est de mesurer le

spectre différentiel de la solution. Pour cela, on place le mélange chymotrypsine-

proflavine dans la cellule de mesure et une solution de proflavine seule à la même

concentration dans la cellule de référence (l’absorption de la chymotrypsine aux

longueurs d’onde supérieure à 350 nm est suffisamment faible pour ne pas

influencer la mesure de l’absorption à ces longueurs d’onde).

La différence maximale d’absorbance entre proflavine libre et complexée se trouve

à 465 nm. L’absorbance différentielle mesurée à cette longueur d’onde est

proportionnelle à la quantité de complexe formé . Un seul point isosbestique est

observé, indiquant un changement simple entre état libre et complexé.


On réalise un titrage en mesurant le spectre différentiel de différentes solutions à

même concentration en proflavine et différentes concentrations en chymotrypsine

(Figure 4.6).

b) Méthode choisie

Le titrage par absorption différentielle est réalisé avec une concentration en

proflavine de l’ordre de 10 µM. Cette concentration est suffisamment faible pour

qu’on puisse considérer que la proflavine se trouve seulement sous la forme de

monomère.

On titre en faisant varier la rapport molaire chymotrypsine-proflavine de zéro à

environ 15. On prend la valeur de l’absorption différentielle à 465 nm, ce qui nous

donne une courbe de titrage (Figure 4.7).

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

370 390 410 430 450 470 490 510 530 550

(nm)

A

Figure 4.6 : Spectre différentiel d'un mélange chymotrypsine-proflavine par rapport au spectre de

la proflavine dans le tampon Tris à pH 8


Ce choix dans les concentrations est un compromis entre deux objectifs :

- On veut être sûr qu’en fin de titrage toute la proflavine soit complexée, c’est-à-dire

avoir le rapport chymotrypsine-proflavine le plus élevé possible tout en limitant la

dimérisation de la chymotrypsine, ce qui revient à avoir une faible concentration en

proflavine.

- La concentration en proflavine doit être suffisamment élevée pour former assez de

complexe et donner un signal suffisamment intense pour avoir une bonne précision.

Au départ, nous avons une solution de proflavine sans chymotrypsine. On

augmente progressivement la concentration de la chymotrypsine jusqu’à ce qu’elle

se retrouve en excès par rapport à la proflavine. Comme on atteint une concentration

élevée en chymotrypsine (de l’ordre de 200 µM), nous tenons compte de sa

dimérisation dans l’analyse du spectre différentiel.

Figure 4.7 : Courbe de titrage : absorption différentielle à 465 nm d'un mélange

chymotrypsine-proflavine en fonction du rapport des concentrations dans le

tampon Tris à pH8. Valeurs mesurées: points bleus. Courbe d'ajustement en

rouge.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 2 4 6 8 10 12 14

[chymotrypsine] / [proflavine]

A(465

nm)


c) Détermination des constantes d’affinité

La différence d’absorption s’écrit :

ΔA = Δε [EI]

Où Δε est la variation du coefficient d’extinction molaire de la proflavine lorsqu’elle

se place dans le site de complexation. C’est un paramètre à déterminer.

[EI] est la concentration en complexe. Elle dépend de la constante d’affinité.

La spectroscopie différentielle permet de suivre la formation du complexe, mais

sans distinguer les formes protonées et déprotonées.

Soient *][EI la concentration globale en complexe,

][][*][ IEHEIEI

et *][E la concentration globale en chymotrypsine libre.

][][*][ EHEE

La constante d’affinité mesurée est alors une constante observée définie par :

où Etot et Itot sont les concentrations totales en chymotrypsine et en proflavine.

Tenant compte de la dimérisation de la chymotrypsine, les concentrations en

proflavine et chymotrypsine libres dépendent des concentrations totales et de la

concentration en complexe formé :

*][][ EIII tot et 2[ ]* [ ]* 2[ ]totE E EI E

où [E2] est la concentration de la chymotrypsine dimérisée.

On a donc :

2[ ]* [ ]* 2[ ]totEI E E E

En exprimant *][E et [E2] en fonction de Kobs, de Kdim , de Etot et de Itot ; on trouve une

équation dont *][EI est solution :

3 2 2 2

2

dim

1 2[ ]* [ ]* ( 2 ) [ ]* ( 2 ) 0tot

tot tot tot tot tot tot tot

obs obs obs

IEI EI I E EI I E I E I

K K K K

]*)[(]*)[(

*][

][*][

*][

EIIEIE

EI

IE

EIK

tottotobs


On peut déterminer les paramètres Δε et Kobs en ajustant ce modèle aux valeurs de

ΔA observées par une optimisation numérique.

d) Résultats

Les mesures ont été réalisées dans différents tampons aux pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 et

8. Les constantes d'affinité Kobs que nous avons observées sont consignées dans le

Tableau 4.1 .

Ces mesures de Kobs sont les valeurs obtenues par l'ajustement du modèle aux

données expérimentales. L'erreur relative d'ajustement peut être estimée à environ

15 %.

On suppose à priori que la nature des tampons utilisés est telle que le tampon

n'est pas en compétition avec la proflavine pour le site de complexation et que le

tampon n'a pas d'influence sur la conformation adoptée par la chymotrypsine. Dans

ce cas, le choix d'un tampon n'a pas d'influence sur la constante observée, et les

différences entre tampon sont dues aux erreurs de mesures, qui ne sont pas

négligeables.

Tableau 4.1 : Constantes d'affinité observée Kobs en fonction du pH

Tampon pH 6 pH 6.5 pH 7 pH 7.5 pH 8

Tris 24000 24400 20300

Hepes 23000 25100

Mes 7100

Imidazole 12600

Phosphate 14000 25000

BisTris Prop 11200 15000 25400 26000

Moyenne 10767 13800 24000 24900 23800

Kobs (M-1

)


Elles proviennent principalement de l’erreur sur la détermination de la

concentration de la protéine. Le calcul de la constante d’affinité dépend directement

de la concentration en protéine, qui est déterminée en mesurant son absorbance à

280 nm. Or, la précision sur le coefficient d’extinction molaire est de l’ordre de 5%.

De plus, même si l’autolyse n’est pas problématique pour les mesures, elle est

toujours présente. Les résidus d’autolyse absorbant également dans l’UV, on ne peut

pas distinguer la protéine active de la protéine hydrolysée. On estime qu’il peut y

avoir 10 à 15 % de protéine inactive dans la solution, ce qui introduit une erreur

importante sur la détermination de Kobs. Une autre source d’erreur importante sont

les dilutions que nous effectuons pour réaliser le titrage.

Les valeurs moyennes de Kobs ont été portées en graphique (Graphique 4.1).

On constate que la constante d’affinité observée Kobs a tendance à augmenter

lorsque le pH augmente.

Graphique 4.1 : Valeurs moyennes des constantes d'affinité observée Kobs

portée en fonction du pH

5000

1 104

1.5 104

2 104

2.5 104

3 104

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

Kobs

(M-1

)

pH


e) Discussion

Pour expliquer l’effet du pH sur les constantes d’affinité mesurées, comme

mentionné précédemment, on doit tenir compte des différents équilibres possibles :

][][

][1int,

IE

EIK ;

][][

][2int,

IEH

IEHK

][

][][

EH

HEK f

a ; ][

][][

IEH

HEIK c

a

Kint,1 et Kint,2 sont alors les constantes d’affinité de l’interaction entre la proflavine et

la chymotrypsine déprotonée et protonée respectivement, tandis que Ka f et Ka

c sont

les constantes d’acidité de l’histidine 57 dans la chymotrypsine libre et complexée .

La proflavine est chargée positivement aux pH que nous utilisons. Lorsqu’elle se

complexe avec la chymotrypsine, elle se place dans le voisinage de l’histidine 57

(Figure 4.4). L’introduction de cette charge près de l’histidine augmente la polarité de

son environnement : elle est plus facilement déprotonable, c’est-à-dire que Kac est

inférieur à Ka f.

De plus, si l’histidine 57 est protonée, il y aura une répulsion entre la charge de

l’histidine et celle de la proflavine, séparée de 7,5 Å. Cette distance a été mesurée

dans le complexe modélisé dans le cadre du travail de thèse de Gilles Bruylants.

Cela correspond à un potentiel de répulsion charge-charge de +46,3 kJ/mol, en

prenant une permittivité relative r = 4, qui est la valeur généralement utilisée

lorsqu’on veut représenter un milieu protéique. C’est pourquoi on s’attend à ce qu’il

n’y ait pas formation de complexe si l’histidine 57 est protonée. Autrement dit, on

s’attend à ce que Kint,2 soit de plusieurs ordres de grandeurs inférieure à Kint,1.

Kint,2

Kac Ka

f

Kint,1

EH+ + I EH

+I

E + I EI

Schéma 4.1


On peut exprimer Kobs en fonction des constantes d’interaction, d’acidité et du

pH de différentes manières suivant les équilibres que l’on considère.

1) Si on considère les équilibres suivant :

La constante observée est définie par :

→ ][])[]([

][

][])[]([

][

IEHE

IEH

IEHE

EIKobs

→ [ ][ ]

[ ] [ ][ ][ ] 1 [ ][ ] 1

[ ] [ ]

obs

EH IEIK

EH EE I EH I

E EH

→

][1

1][

1

12int,1int,

HK

K

K

HKK

fa

fa

obs

→ fa

fa

pKpH

pKpH

obs

KKK

101

.10 2int,1int, ( pHH 10][ ;

fapKf

aK 10 )

→ fpKapHobs

KKKK

101

1int,2int,1int,

Kint,2

Kaf

Kint,1

EH+ + I EH

+I

E + I EI

Schéma 4.2

][])[]([

][][

][*][

*][

IEHE

IEHEI

IE

EIKobs


En faisant un ajustement de ce modèle aux données expérimentales

(Graphique 4.2), nous obtenons :

Kint,1 = 25953 ± 2496,6 M-1

Kint,2 = 3999,9 ± 9020,1 M-1

pKaf = 6,41 ± 0,51

où les erreurs données pour ces valeurs sont les erreurs d'ajustement.

La valeur de Kint,2 est un ordre de grandeur inférieure à Kint,1, mais on peut

également constater que l'erreur d'ajustement est très importante pour Kint,2 . On peut

supposer que c'est parce que la valeur de Kint,2 est très petite devant celle de Kint,1 et

que Kint,2 est mal estimée à cause des erreurs importantes sur les constantes

observées. Pour le vérifier, on peut essayer de faire un ajustement en supposant que

l'interaction 2 n'a pas lieu.

Graphique 4.2 : Ajustement du modèle du Schéma 4.2 aux valeurs moyennées

de Kobs en fonction du pH. Les barres d'erreur, données à titre

indicatif, correspondent à 2 x écart-type.

4000

8000

1.2 104

1.6 104

2 104

2.4 104

2.8 104

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

Kobs

(M-1

)

pH


2) Si on considère que l’interaction 2 n’ a pas lieu (et que le complexe formé

ne peut pas être protoné), on a le système suivant:

La constante observée est alors définie par :

][])[]([

][

][*][

][

IEHE

EI

IE

EIKobs

→ [ ]

[ ][ ][ ] 1

[ ]

obs

EIK

EHE I

E

→

fa

obs

K

HKK

][1

11int,

→ pHpKaobs fKK

101

11int, ( pHH 10][ ;

fapKf

aK 10 )

L'ajustement (Graphique 4.3) de ce modèle aux données expérimentales nous donne

les valeurs suivantes:

Kint,1 = 25557 ± 1728,3 M-1

pKa f = 6,24 ± 0,15

où les erreurs données pour ces valeurs sont les erreurs d'ajustement.

Kaf

Kint,1

EH+ + I

E + I EI

Schéma 4.3


On retrouve la même valeur pour Kint,1 et pour pKaf , ce qui montre bien que

l’interaction 2 peut être négligée et que la valeur donnée par l'ajustement au modèle

du Schéma 4.2 est due aux erreurs de mesures. Dans la suite, nous négligerons

donc l'interaction 2.

Remarquons que les valeurs obtenues pour pKaf sont cohérentes, car elles sont

proches de la valeur de pKaf trouvée par RMN (pKa

f = 6,7) [26].

Graphique 4.3 : Ajustement du modèle du Schéma 4.3 aux valeurs moyennées

de Kobs en fonction du pH. Les barres d'erreur, données à titre

indicatif, correspondent à 2 x écart-type.

4000

8000

1.2 104

1.6 104

2 104

2.4 104

2.8 104

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

Kobs

(M-1

)

pH


4.3) Détermination par ITC de l’enthalpie d’interaction

Suite au problème de dimérisation de la chymotrypsine et de la proflavine, nous nous

sommes limités à la détermination des enthalpies d’interaction.

a) Méthode choisie

Les mesures calorimétriques sont réalisées avec :

- une concentration en proflavine (dans la seringue) de l’ordre de 100 µM. On peut

ainsi considérer que la proflavine est uniquement sous forme monomère et qu’il n’y

a pas de chaleur de dédimérisation lors de l’injection. De plus, les quantités

injectées étant très faibles, on peut également considérer que la chaleur de dilution

est négligeable.

- une concentration en chymotrypsine dans la cellule de l’ordre de 200 µM, ce qui

nous permet de considérer qu’elle n’est pratiquement pas dimérisée. Ainsi, l’effet de

dilution provoqué par l’injection et la formation de complexe suite à l’interaction ne

modifient pratiquement pas l’équilibre de dimérisation.

Les mesures se font avec un excès d’enzyme dans la cellule : on met très peu de

proflavine dans beaucoup de chymotrypsine. Nous faisons l’hypothèse que

pratiquement toute la proflavine injectée sera complexée. Nous avons testé cette

hypothèse et nous avons estimé qu’environ 90% de la proflavine injectée se

complexe (pour une constante d’affinité de 25000 M-1). Les chaleurs dégagées étant

faibles, l’erreur expérimentale est assez importante. Nous avons fait des simulations

et nous avons constaté que l’erreur commise en supposant que tout est complexé

est masquée par l’erreur expérimentale.


L'intégration de l'aire sous les pics donne le thermogramme suivant (Figure 4.9):

On moyenne alors les chaleurs dégagées et on la rapporte à la quantité de proflavine

introduite lors d’une injection pour déterminer l’enthalpie d’interaction.

µW

sec

Figure 4.8 : Courbe ITC : mesure de l'enthalpie d'interaction chymotrypsine-proflavine réalisée

à pH 7,5 dans du tampon Tris

Figure 4.9 : Thermogramme de la chaleur dégagée par l'interaction chymotrypsine-

proflavine dans du tampon Tris à pH 7,5 en fonction du nombre de l'injection


b) Résultats

Les expériences ont été réalisées pour des pH allant de 6 à 8, dans différents

tampons et à force ionique tant que possible constante.

Les résultats que nous avons obtenus se trouvent dans le Tableau 4.2 .

c) Discussion

On observe que l’enthalpie d’interaction varie en fonction du pH. De plus, pour un

pH donné, on observe qu’elle varie aussi en fonction du tampon utilisé. Le tampon a

une influence sur ΔH°obs.

L’interaction de la chymotrypsine avec la proflavine diminue la concentration en

chymotrypsine déprotonée au niveau de l'histidine 57, ce qui déplace l’équilibre de

protonation de l'histidine 57 de la chymotrypsine. Une partie de la chymotrypsine

protonée va alors se déprotoner. La formation du complexe conduit donc, à un pH

donné, à une libération de protons, et la quantité de protons libérés est

proportionnelle à la quantité de complexe formé.

Les protons libérés seront acceptés par le tampon, puisque son rôle est de

maintenir le pH constant. Or, le tampon possède une certaine enthalpie d’ionisation.

Tableau 4.2 : Enthalpie d'interaction observée en fonction du pH et du tampon

(Intervalle de confiance à 95 %)

Tampon

Tris

Hépès

Mes

Imidazole

Phosphate

BisTrisProp.

H°obs (kJ/mol)

pH 6 pH 6,5 pH 7 pH 7,5 pH 8

-25 ± 5 -29,2 ± 2,3

-5,3 ± 1,2

-22,3 ± 3,4

-2,7 ± 1,5

-18,6 ± 2,2

-29,4 ± 2,2

-13,4 ± 0,9

-23,0 ± 1,2

-7,9 ± 0,6

-23,1 ± 2,0

-23,1 ± 2,0

-19,7 ± 1,3

-18,8 ± 1,3

-19,6 ± 5,5

-22,9 ± 1,3


La chaleur mesurée par le calorimètre contient donc un terme dépendant de

l’interaction et un terme dépendant de l’ionisation du tampon.

On considère donc les équilibres suivant [9] :

Chaque tampon possède une enthalpie d’ionisation ΔH°ion qui lui est propre, c’est

pourquoi les enthalpies mesurées diffèrent avec le tampon. Les valeurs d'enthalpie

d'ionisation sont consignées dans le Tableau 4.3 .

Les valeurs d’enthalpie d’ionisation des différents tampons ont été mesurées par

calorimétrie en injectant de l’HCl à une concentration de 1mM dans une solution de

tampon (dont la concentration est de 50 mM), sauf dans le cas du tampon

phosphate. En effet, il nous a été impossible de déterminer son enthalpie d’ionisation

suite à un comportement particulier de ce tampon.

EH+ + I

E + I EI Tampon + H+ TamponH

+

Schéma 4.4

Tableau 4.3 : Enthalpie d'ionisation mesurées pour les différents tampons, sauf

tampon phosphate.

* valeur provenant de la littérature [29]

.

Tampon H°ion (kJ/mol)

Tris -49,5 ± 1,2

Hépès -18,9 ± 0,8

Mes -12,4 ± 1

Imidazole -31,3 ± 1

Phosphate -3,6*

-44,1 ± 3,8 (1ère

fonction)

-65 ± 2 (2ème

fonction)BisTrisPropane


1. Enthalpie intrinsèque et protons relargués

Si, à un pH donné, on porte en graphique l’enthalpie observée obsH en fonction

de l’enthalpie d’ionisation du tampon ionH , on observe une droite.

Ex : à pH 7 (Graphique 4.4)

L’équation de cette droite est donné par

ionobs HnHH .int [30],[31]

où intH est l'enthalpie intrinsèque à l’interaction et n le nombre de protons

relargués suite à l’interaction. On obtient intH et n par régression linéaire.

On fait la même chose pour les autres pH. Nous obtenons les valeurs de intH et

n à chaque pH : Figure 4.5 à Figure 4.8.

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DH°obs

(kJ/mol)

DH°ion

(kJ/mol)

Phosphate

Hépès

Imidazole

Tris

Graphique 4.4 : Enthalpie d'interaction observée en fonction de

l'enthalpie d'ionisation du tampon à pH 7



l'enthalpie d'ionisation du tampon à pH 6,5

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DH°obs

(kJ/mol)

DH°ion

(kJ/mol)

Mes

Imidazole

BisTrisPropane



-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DH°obs

(kJ/mol)

DH°ion

(kJ/mol)

Mes

ImidazoleBisTrisPropane


-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DH°obs

(kJ/mol)

DH°ion

(kJ/mol)

ImidazoleBisTrisPropane

Tris


l'enthalpie d'ionisation du tampon à pH 7,5

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DH°obs

(kJ/mol)

DH°ion

(kJ/mol)

Imidazole

BisTrisPropane

Tris




Remarquons qu'à pH 6 et 6,5 , nous avons choisi de faire la régression linéaire

avec seulement deux points au lieu de trois. En effet, la mesure que nous avons

obtenue dans le tampon BisTrisPropane est probablement faussée par un effet de

force ionique. La force ionique d’une solution est définie par :

i

ii zcI 2.21

; ci et zi étant respectivement la concentration et la charge de l’ion i.

Or, à pH 6, le BisTrisPropane tamponne par sa deuxième fonction. La charge valant

2 au lieu de 1, cela augmente fortement la force ionique de la solution. La force

ionique a une influence sur les interactions électrostatiques, ce qui peut donc

influencer l’interaction chymotrypsine-proflavine.

Les différentes valeurs de intH et n sont consignées dans le Tableau 4.4 .

2. Enthalpies d’interaction et de déprotonation de l’histidine

Le terme d’enthalpie intrinsèque contient entre-autres un terme lié à la

déprotonation de l’histidine 57 ΔH°His [30]:

Hisninteractio HnHH .int

Si on porte en graphique les intH en fonction de n , on peut considérer qu'ils sont

disposés selon une droite (Graphique 4.9).

pH 6 pH 6,5 pH 7 pH 7,5 pH 8

H° interaction

(kJ/mol)5,8 7,7 -5,8 ± 0,6 -17,2 ± 6,9 -20 ± 9,9

n 0,897 0,839 0,487 ± 0,035 0,096 ± 0,162 0,010 ± 0,235

Tableau 4.4 : Enthalpie intrinsèque intH et nombre de protons relargués n en fonction

du pH. Les erreurs sont les erreurs d'ajustement.


La régression linéaire de l'enthalpie intrinsèque en fonction du nombre de protons

relargués nous donne :

ninteractioH = -20,3 ± 1,1 kJ/mol

HisH = +30,9 ± 1,9 kJ/mol

L'erreur donnée est l'erreur d'ajustement.

Signalons que l'histidine est protonable au niveau de sa fonction imidazole. On

peut remarquer (Tableau 4.3) que l'enthalpie d'ionisation de l'imidazole vaut

-31 kJ/mol, ce qui concorde avec celle de l'histidine.

-30

-20

-10

0

10

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

DH°int

(kJ/mol)

n

pH 8

pH 7,5

pH 7

pH 6.5pH 6

Graphique 4.9 : Enthalpie intrinsèque ΔH°int portées en fonction du nombre de

protons relargués n aux différents pH. Les croix d'erreurs

correspondent aux erreurs d'ajustement linéaire. Elles sont

absentes à pH 6 et 6,5 étant donné que la régression linéaire a

été faite avec deux points.


3. Protons relargués en fonction du pH

Soit Etot la concentration totale de chymotrypsine: totEEHE ][][ .

On a

avec ][

][][

EH

HEKa constante d'acidité de l'histidine 57,

et totEEHE ][][ .

La proportion d'histidine 57 protonée en fonction du pH est donnée par

Puisque toute la chymotrypsine qui se complexe est déprotonée, le nombre de

protons relargués à un pH donné est égal au nombre de protons fixés à ce pH.

On ajuste ce modèle à la courbe expérimentale (Graphique 4.10) :

E + H+ EH+

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

n

pH

Graphique 4.10 : Ajustement du nombre de protons relargués n en fonction

du pH. Les barres d'erreurs correspondent aux erreurs

d'ajustement. Elles sont absentes à pH 6 et 6,5 étant donné

que la régression linéaire a été faite avec deux points.

fapKpHf

atot

HK

EH

EEEH

EH

E

EHn

101

1

][1

1

][

][1

1][][

][][


L’ajustement du modèle nous donne :

pKa f = 6,94 ± 0,10

On peut constater que l’ajustement est assez bon. Remarquons que la valeur de

pKaf que nous obtenons par ITC est cohérente avec celle que nous trouvons par

spectroscopie différentielle.

4.5) Conclusion

Grâce à l’utilisation conjointe de la spectroscopie UV-Visible et de l’ITC, nous

avons pu faire une estimation de la composante indépendante du pH de la constante

d’affinité et de l’enthalpie de l’interaction entre la chymotrypsine et la proflavine:

En ce qui concerne la constante d’affinité, la valeur est de :

Kinteraction ≈ 26000 M-1

et est celle qu’on observerait si toute la chymotrypsine était déprotonée. On peut

constater au Tableau 4.1 que cette valeur est proche de celle observée à pH 8,

c’est-à-dire à un pH supérieur au pKa de l’histidine 57, ce qui correspond à un rapport

20][

][

EH

E(c‘est-à-dire qu’il y a plus de 95 % de chymotrypsine déprotonée).

En ce qui concerne l’enthalpie d'interaction, la composante indépendante du pH

vaut :

interactionH ≈ -20 kJ/mol

E + I EI


Pour avoir une estimation de l'entropie d'interaction, on calcule l'énergie libre de

Gibbs :

lninteraction interactionG RT K ≈ -25 kJ/mol

On trouve pour l'entropie d'interaction :

eractionintST ≈ +5 kJ/mol à 25°C

eractionntiS ≈ +16 J/molK

Remarquons que interactionG est inférieure, en valeur absolue, au potentiel de

répulsion charge-charge qui apparaîtrait si la proflavine (chargée) s’insérait au

voisinage de l’histidine 57 quand elle est protonée, ce potentiel étant estimé à +46,3

kJ/mol (distance entre charges = 7Å, εr = 4). L’interaction avec la forme protonée est

donc très défavorable, et il est tout a fait raisonnable de considérer que cette

interaction n’a pas lieu.

Cette estimation nous montre que l'interaction est favorable tant du point de vue

de l’enthalpie que de l’entropie.

L’ITC nous a permis de déterminer le nombre de protons relargués lors de

l’interaction en fonction du pH. Nous avons pu constater que les valeurs trouvées

correspondaient avec celles attendues, c’est-à-dire au nombre de protons qui

seraient relargués par la déprotonation de toute l’histidine pour un pKa aux alentours

de 6,7. L’ITC nous a permis également d’estimer l'enthalpie de déprotonation de

l'histidine 57 : HisH ≈ +31 kJ/mol. Cette valeur est proche de celle qui accompagne

la déprotonation de l’imidazole en solution aqueuse.

Nous avons également pu constater que la spectroscopie différentielle et l’ITC

nous donnaient à peu près les mêmes estimations pour le pKa de l'histidine 57, et

que l’estimation est en accord avec la valeur déterminée par RMN.

Chapitre 5 : Conclusions Page 49

Chapitre 5 : Conclusion

Les interactions non-covalentes, souvent qualifiées d'interactions faibles en regard

des interactions covalentes, jouent un rôle primordial dans les mécanismes

physiologiques. En effet, ces interactions peuvent conduire à la formation de

complexes réversibles, complexes qu'on retrouve dans de nombreux processus

biologiques. Un de ces processus est l'interaction enzyme-inhibiteur.

Dans le complexe, l'inhibiteur se place à un endroit bien particulier de l'enzyme,

appelé site de complexation, dans lequel peuvent se trouver un ou plusieurs acides

aminés protonables, telle par exemple une histidine. Si leur état de protonation peut

varier dans une gamme de pH située autour du pH physiologique, un effet du pH

pourrait être observé sur l’interaction.

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’effet du pH sur les grandeurs

thermodynamiques associées à l’interaction entre :

- la trypsine et la benzamidine

- la chymotrypsine et la proflavine.

La trypsine et la chymotrypsine sont deux sérines protéases qui possèdent une

histidine dans le site de complexation de l’inhibiteur. Le pKa de l’histidine se situe aux

alentours de 6,7. Les deux inhibiteurs sont chargés positivement pour des pH

inférieur à 9. Le cycle représenté ci-dessous reprend tous les équilibres possibles

entre l’enzyme et l’inhibiteur, où E et EH+ représentent l’enzyme sous sa forme non

protonée ou protonée respectivement et I l’inhibiteur. L’inhibiteur peut à priori

interagir avec les deux formes de l'enzyme, mais il n’y a aucune raison pour que les

constantes d’interaction soient les mêmes.

Kint,2

Kac Ka

f

Kint,1

EH+

+ I EH+I

E + I EI


Avec le système trypsine-benzamidine, nous espérions pouvoir déterminer les

constantes d'affinité et les enthalpies d'interaction par ITC. Malheureusement, les

mesures effectuées n'étaient pas reproductibles. La trypsine est un enzyme qui

possède une certaine activité autolytique (il catalyse sa propre hydrolyse). Cette

activité est importante dans les conditions expérimentales que nous avons utilisées,

malgré les précautions prises : dialyse à 4°C et ajout de CaCl2 en excès. Le CaCl2

est connu pour inhiber l'activité autolytique de plusieurs enzymes, dont la trypsine.

Malgré cela, nous ne sommes pas parvenus à obtenir des résultats exploitables.

Avec le système chymotrypsine-proflavine, il faut tenir compte de la dimérisation

de la chymotrypsine et de la proflavine. La dimérisation peut être évitée à condition

de travailler à faible concentration, ce qui ne permet pas de déterminer les

constantes d’affinité par ITC. Pour les déterminer, nous avons utilisé la spectroscopie

UV-Visible. La proflavine est une molécule particulièrement bien adaptée pour cette

technique car elle absorbe fortement dans une gamme de longueurs d’onde où la

protéine n’absorbe pas et, de plus, son spectre d'absorption subit un déplacement

batochrome lorsqu'elle est complexée avec la chymotrypsine.

La constante d’affinité a été déterminée en suivant la formation du complexe par

spectroscopie différentielle. Nous avons observé que celle-ci augmente avec le pH.

La dépendance de la constante d’affinité avec le pH s’explique par le fait que

la formation d’un complexe entre la chymotrypsine protonée et la proflavine (chargée

positivement) n’est pas favorable thermodynamiquement. Dès lors, on peut

s’attendre à ce que Kint,2 soit négligeable devant Kint,1. L'interaction entre l'enzyme et

l'inhibiteur déplace l’ équilibre de protonation ; les différents équilibres à envisager

sont représentés ci-dessous.

EH+ + I

E + I EI

Kint,1

Kaf


La constante observée par spectroscopie UV-Visible peut alors s’écrire de la manière

suivante :

fpKapHobs KK

101

11int,

Nous avons pu mesurer par ITC l’enthalpie d’interaction entre la chymotrypsine et la

proflavine. Des mesures ont été effectuées dans différents tampons et à différents

pH, à force ionique tant que possible constante. Nos résultats montrent que

l’interaction conduit à une déprotonation de l’histidine du site de complexation et à un

échange de protons avec le tampon. En effet, les enthalpies mesurées à un pH

donné sont dépendantes de la nature du tampon et plus précisément de son

enthalpie d’ionisation. Nous avons pu déterminer, en tenant compte de l’enthalpie

d’ionisation du tampon, la composante de l’enthalpie d’interaction indépendante du

pH, et le nombre de protons relargués lors de l’interaction à chaque pH. Nous avons

pu constater que ce dernier correspond à celui qu’entraînerait la déprotonation

complète de la chymotrypsine participant à l’interaction, avec un pKa de l’histidine

aux alentours de 6,7. Cette méthode nous a également fourni une estimation de

l’enthalpie de déprotonation de l’histidine, qui correspond à celle du tampon

imidazole.

Le fait de décomposer ainsi les grandeurs mesurées améliorent progressivement

notre compréhension du système et des interactions en jeu. Il est important de

rappeler que les partenaires d’une interaction ne sont jamais seuls en solution et que

d’autres équilibres peuvent être liés à la formation du complexe. Il faut garder ceci à

l’esprit lors de l’interprétation des grandeurs mesurées. L’étude par ITC dans

différents tampons et à différents pH nous a permis de rationaliser l’effet d’un de ces

équilibres sur l’interaction, en l’occurrence celui de protonation. A ce titre, il serait

également intéressant de varier la force ionique, pour tenter de déterminer son effet

sur l'interaction.

Chapitre 6 : Matériaux et méthodes Page 52

Chapitre 6 : Matériaux et méthodes

Préparation de la trypsine

La trypsine pancréatique bovine a été achetée chez Fluka et l’hydrochlorure de

benzamidine a été acheté chez Sigma.

La trypsine est dialysée une nuit à 4°C dans une solution de tampon Tris à une

concentration de 50 mM. Le tampon que nous avons utilisé est le tampon Tris. Ce

tampon contient également 10 mM de CaCl2 (ajouté en vue de ralentir l’autolyse de

la trypsine) et 1 mM d’azidure de sodium. Le cut-off des sacs de dialyse est de

12-14 kDa.

Les solutions de benzamidine ont été préparées à partir du dialysat, de manière à

ce qu’elle soient identique à la solution de trypsine.

Les concentrations en trypsine ont été déterminées en mesurant l’absorbance des

solutions à 280 nm en utilisant un coefficient d’extinction molaire de 36300 M-1cm-1

[14]. Celle de la benzamidine est déterminée en mesurant l’absorbance à 228 nm et

en utilisant un coefficient d’extinction molaire de 9400 M-1cm-1 [20].

Préparation de la chymotrypsine

La chymotrypsine pancréatique bovine et la proflavine hémisulphate dihydrate ont

été achetées chez Fluka.

La chymotrypsine est dialysée une nuit à 4°C dans une solution tampon dont la

concentration est de 50 mM. Le tampon de dialyse est changé au moins une fois.

Les tampons que nous avons utilisés sont les tampons Tris, Hépès, Mes, Imidazole,

Phosphate et BisTrisPropane. Ces solutions contiennent également 1 mM d’azidure

de sodium. Le cut-off des sacs de dialyse est de 12-14 kDa en poids moléculaire.


Les solutions de proflavine ont été préparées à partir du dialysat, de manière à ce

qu’elles soient identiques à la solution de chymotrypsine.

Les concentrations en chymotrypsine ont été déterminée en mesurant

l’absorbance de la solution à 280 nm en utilisant un coefficient d’extinction molaire de

50100 M-1cm-1 [24]. Celle de la proflavine est déterminée en mesurant l’absorbance de

la solution à 444 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 35000 M-1cm-1 [24].

Calorimétrie à titrage isotherme

Les expériences ont été réalisées à l’aide d’un microcalorimètre ITC 4200 de

Calorimetry Science Corporation.

Les solutions d’enzyme ont été dégazées 10 min avant d’être injectées dans la

cellule de travail (d’environ 1300 µL), préalablement rincée avec la solution tampon

correspondante.

Les solutions d’inhibiteur ont également été dégazées 10 min avant remplissage

de la seringue. Après l’obtention d’un ligne de base stable, la séquence d’injection

consiste en 24 injections de 10 µL ou 16 injections de 15 µL avec un intervalle entre

injection de 300 s et une agitation de 297 r.p.m. .

Pour le système trypsine-benzamidine :

[trypsine] ~ 200 µM

[benzamidine] ~ 2 mM

Pour le système chymotrypsine-proflavine :

[chymotrypsine] ~ 200 µM

[proflavine] ~ 100 µM


Spectroscopie UV-Visible

L’appareil utilisé est un spectromètre Lambda 40 de Perkin Elmer.

La cellule de travail et la cellule de référence sont remplies avec la même solution

de proflavine ( ~ 10 µM). On réalise un titrage en faisant varier la concentration en

chymotrypsine dans la cellule de travail (0 – 200 µM) tout en gardant constante la

concentration en proflavine et en mesurant la différence d’absorbance par raport à la

cellule de référence.

On enregistre le spectre différentiel de la solution de 220 à 600 nm.

Chapitre 7 : Bibliographie Page 55

Chapitre 7 : Bibliographie

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etude par microcalorimétrie des effets de protonation ... · remerciements je tiens tout d’abord...

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