Dynamique intracellulaire des

protéines en temps réel

Mourad FERHAT, Ph.DSpécialiste analyse cellulaire et protéomique

Promega France

La révolution de la protéomique

Comprendre des mécanismes fondamentaux grâce à la

dynamique des protéines

The role of receptor diffusion in the organization of the postsynaptic membrane.

Daniel Choquet & Antoine Triller. Nature Reviews Neuroscience 4, 251-265 (April 2003)

Au programme

Que savons-nous des protéines ? Quelles sont leurs dynamiques ? Quelles méthodes d’étude ?

Que savons-nous des protéines ?

A la source … les acides aminés

Quatre niveaux de structure

Structure primaireSéquence en aa

Structure secondaireFeuillet β

Helice α

Structure quaternaire

Structure tertiaireInteractions hydrophobe

Liaisons ionique

Pont disulfure

Une diversité de localisation et de fonction

Cellules HeLa

2000 µm3

2 X 109 Protéines*

(E.coli : 2,36 X 106)

Récepteurs

< 100 molécules

Enzymes

(Signalisation)

1000 -10000

Protéines

structurales

108 molécules

Christopher E. Sims and Nancy L. Allbritton. Analysis of single mammalian cells on-chip, Lab Chip, 2007, 7, 423 – 440.

Siwiak M, Zielenkiewicz P. Transimulation - protein biosynthesis web service. PloS ONE. 2013 Sep 05 8(9): e73943.

Quelles sont leur dynamique ?

Les protéines possèdent une dynamique interne

Glycogène synthase (GS)

Dynamique à l’échelle de la protéine

Liaisons Hydrogènes

VibrationLiaisons Hydrogènes

- Ruptures

- Réarrangements

- Rotations

Published in: Yao Xu; Martina Havenith; The Journal of Chemical Physics 2015, 143,

Mouvements des

chaines latérales

Mouvements de la

protéine

Changements

conformationnels

Les molécules d’eau participent à cette dynamique

Rotation Rotation

Translation

Mouvement des molécules d’eau

à la surface des protéines

Protéine inactive Protéine active

Approcher la dynamique des

protéines

Méthodes d’étude

Approcher la dynamique des protéines

A l’échelle de la protéine A l’échelle de la cellule

Méthodes d’approches à l’échelle de la protéine

Normal Mode Analysis of Biomolecular Structures: Functional Mechanisms of Membrane Proteins Ivet Bahar,

Timothy R. Lezon, Ahmet Bakan, and Indira H. Shrivastava Chemical Reviews 2010 110 (3), 1463-1497

Real-Time NMR Characterization of Structure and Dynamics in a Transiently Populated Protein Folding

Intermediate. Enrico Rennella et al. †J. Am. Chem. Soc., 2012,

Modélisation/Simulation

Diffraction aux Rayon X

Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

Méthodes à l’échelle cellulaire

Gènes rapporteurs

Photoblanchiment (Photobleaching)

Mesure des interactions protéiques

L’approche gènes rapporteurs

Fusion :

Transcriptionnelle : séquence régulatrice (promoteurs, élément de réponse …)

Traductionnelle : expression d’une protéine hybride

Suivi de la translocation

Cellules HeLa : Nluc (luciférase) – GR fusion

Cytoplasme Noyau

Translocation

+ dexamethasone

(15 min)

Engineered luciferase reporter from a deep Sea Shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.

ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1848−1857

Flurophores pour l’imagerie : la GFP

GFP : Green Fluorescent Protein

Protéine de 27 kDa

Issue de la méduse Aequora victoria (1962)

Premier clonage en 1992

Structure : tonneau β (11 feuillets β/1 hélice α)

4variants initialement dérivés

238 aa, 27 kDa

3 nm

4 nm

Chromophore :

Tyrosine/Glycine/Serine

Les protéines fluorescentes les plus courantes

Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues

Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010 Vol. 90 no. 3, 1103-1163

. BFP-H2B - GFP-actin -

RFP-golgi

Fluorescence et dynamique

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching

+ Tunicamycine

VSVG-GFP

Mobilité

Immobilité

VSVG : Vesicular stomatitis virus G protein.

FRAP : des données quantitatives

Diminution de la constante D (Diffusion) :

Augmentation de la viscosité

Formation d’agrégats ou de complexes

Interaction

Augmentation de la constante D :

Mouvement dirigé

Diminution de la viscosité

Température

Viscosité

FLIP : Fluorescence Loss Induced by Photobleaching

Photobleaching toutes les 40 s

Disparition de la fluorescence au bout de 18 min

Continuité ER

Diminution de fluorescence

Interactions protéiques

Les interactions protéiques

Signalisation cellulaire

Interaction Récepteur ligand

Assemblage de récepteurs

150 000 à 300 000 interactions

Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy

Andrei A. Ivanov et Fadlo R. Khuri.

Trends Pharmacol Sci. 2013 Jul; 34(7): 393–400.

Interactions protéiques : les approches

Transfert d’énergie

. FRET

. BRET

Complémentation fonctionnelle

. Luciférase

. Protéine fluorescente

FRET : Fluorescence Resonnance Energy Transfer

CFP : Cyan Fluorescent Protein

YFP : Yellow Fluorescent Protein

No FRET FRET

Interaction protéique

< 10 nm

Pas d’interaction protéique

> 10 nm

BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Substrat : Ex : Coelenterazine

RLuc

PCA : Protein complementation Assay

Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment Complementation Assays in the

Study of G Protein-Coupled Receptor Oligomerization and Signaling

Pierre-Alexandre Vidi and Val J. Watts; Molecular Pharmacology April 2009, 75 (4) 733-739;

Luciférase

Protéine

Fluorescente

BiFc : Bimolecular Fluorescence complementation

GFP 157-158 485/500 Ghosh et al., 2000

YFP, Citrine,

Venus

154-155;

172-173 515/528

Hu et al., 2002; Shyu et

al., 2006

CFP,

Cerulean

154-155;

172-173 452/478

Hu et al., 2002; Shyu et

al., 2006

Venus/Cerul

ean

154-155;

172-173 504/513

Hu and Kerppola,

2003; Shyu et al., 2006

mRFP1-

Q66T

154-155;

168-169 549/570 Jach et al., 2006

mCherry 159-160 587/610 Fan et al., 2008

BiFc : dimérisation de récepteurs

Etude de GPCR : capacité à former des

homo ou hétérodimères

Dimérisation de récepteurs Adénosine

Complémentation YFP

Etude live-cell

BiLc : Bimolecular luminescence complementation

RLuc 110-111 Ch/485 Stefan et al., 2007

GLuc 93-94 Ch/480

Remy and

Michnick, 2006

Interaction Récepteur ligand

Leigh A Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nature Methods 12, 661-3.

Récepteur β2 adrénergique β2AR tagué avec une

nanoLuciférase (Nluc)

Ligand CA200645 (antagoniste) – fluorophore (BODIPY)

DPCPX : Antagoniste non marqué

NLucCA200645

- BODIPY

Etude de voies de signalisation : BRET

Bioluminescent tools for the analysis of G-protein-coupled receptor and arrestin interactions

Mitsuru Hattoria and Takeaki Ozawa*a

RSC Adv., 2015,5, 12655-12663

Suivi des changements conformationnels

Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6; 112(1): 148–153..

Closed conformation

Autoinhibition

Open conformation

Conformation active (activité GEF) Rabin 8 (activité GEF) régule Rab8 impliqué

dans le traffic intracellulaire

BRET :

Luciférase : NanoLuc

Fluorophore couplé à un tag : HaloTag

Le passage à la conformation active (Open)

est dépendante de la phosphorylation

Kinase ERK2 active

Constituvely Active (CA)

Kinase ERK2 inactive

Kinase Dead (KD)

Combinaison des approches pour l’étude d’oligomères

Combinaisons

BiLc : Dimère 1

BiFc : Dimère 2

BRET : Tétramère

Suivi en temps réel

Suivi en temps réel : de la molécule à la cellule

FRET sur molécules uniques

Single-molecule FRET

Complémentation luciférase

FRET sur molécule unique : ATPase

ATP synthase :

. Domaine F1 statique

. Domaine F0 membranaire : Rotation

Détection d’une molécule

Accès à une dynamique sur une

très courte échelle de temps (ms)

Détecteur ultrasensibles de

photon

Excitation concentrée sur de petits

volumes

FRET sur molécule unique

Marquages :

. ʏ (rotation) : TMR

. b (statique) : Cy5

Luciférase pour le suivi en temps réel

Luciférase

Luciférase de petite taille 19 kDa

Très brillante > Rluc > Fluc

Utilisable en complémentation réversible :

Clivable en deux fragments : 11aa/156aa

Temps de ½ vie : > 2 h

Application à l’étude d’une voie de signalisation

ATP

Agonist

(ISO)

LgBiTSmBiT

CA R2A R2A

R2A

AMPc

Récepteur β adrénergique

(ADBR2)

Inactive

PKA CA R2A

Active

PKA

Reversible if [cAMP]↓

Biosenseur pour le

suivi de l’AMPcComplémentation luciférase

pour le suivi de la PKA

Antagonist

(PRO)

Activateur Adenylate

Cyclase (FSK)

. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)

. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)

. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)

Ligand domain : Site de laison à l’AMPc

Sensor domain

Domaines N et C Ter de la firefly

luciférase

Biosenseur :La liaison de l’AMPc induit un changement

coformationnel, l’activation de la luciférase

et l’émission d’un signal Luminescent

Suivi dynamique : associations/dissociations PKA

0 2 0 4 0 6 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

0 .1

1

1 0

1 0 0

1 0 0 0

T im e (m in )

Na

no

BiT

(% s

ign

al

de

cre

as

e)

Glo

Se

ns

or c

AM

P 2

2F

(fold

sig

na

l inc

re

as

e)

N a n o B iT

IS O P R O F S K

G lo S e n s o r c A M P 2 2 F

↓[cAMP] ↑[cAMP]↑[cAMP]

NBiT

GS

ATP

Agoniste (ISO)

ou Antagoniste (PRO)

LgBiTSmBiT

CA R2A R2A

R2A

cAMPInactive

PKACA R2A

Active

PKA

Activateur Adenylate

Cyclase (FSK)

NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein

Interactions in Cells. Andrew S. Dixon et al. ACS Chem. Biol., 2016, 11 (2), pp 400–408

Complémentation luciférase

AMPc : Biosenseur

. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)

. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)

. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)

Conclusion

Les apports de l’exploration dynamique des protéines

Pas une mais plusieurs dynamiques :

. Vibration, changement de conformation, translocation,

interactions protéiques …

Les technologies développées permettent aujourd’hui

d’apprécier non plus seulement la fonction d’une

protéine mais sa dynamique propre et au sein de la

cellule et d’un organisme (in vivo)

Luminescent

proteins

Des application concrètes

Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein–protein interaction challenge

Duncan E. Scott, Andrew R. Bayly,Chris Abell & John Skidmore

Nature Reviews Drug Discovery Volume:15,Pages:533–550 (2016)

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