Dynamique intracellulaire des
protéines en temps réel
Mourad FERHAT, Ph.DSpécialiste analyse cellulaire et protéomique
Promega France
La révolution de la protéomique
Comprendre des mécanismes fondamentaux grâce à la
dynamique des protéines
The role of receptor diffusion in the organization of the postsynaptic membrane.
Daniel Choquet & Antoine Triller. Nature Reviews Neuroscience 4, 251-265 (April 2003)
Au programme
Que savons-nous des protéines ? Quelles sont leurs dynamiques ? Quelles méthodes d’étude ?
Que savons-nous des protéines ?
A la source … les acides aminés
Quatre niveaux de structure
Structure primaireSéquence en aa
Structure secondaireFeuillet β
Helice α
Structure quaternaire
Structure tertiaireInteractions hydrophobe
Liaisons ionique
Pont disulfure
Une diversité de localisation et de fonction
Cellules HeLa
2000 µm3
2 X 109 Protéines*
(E.coli : 2,36 X 106)
Récepteurs
< 100 molécules
Enzymes
(Signalisation)
1000 -10000
Protéines
structurales
108 molécules
Christopher E. Sims and Nancy L. Allbritton. Analysis of single mammalian cells on-chip, Lab Chip, 2007, 7, 423 – 440.
Siwiak M, Zielenkiewicz P. Transimulation - protein biosynthesis web service. PloS ONE. 2013 Sep 05 8(9): e73943.
Quelles sont leur dynamique ?
Les protéines possèdent une dynamique interne
Glycogène synthase (GS)
Dynamique à l’échelle de la protéine
Liaisons Hydrogènes
VibrationLiaisons Hydrogènes
- Ruptures
- Réarrangements
- Rotations
Published in: Yao Xu; Martina Havenith; The Journal of Chemical Physics 2015, 143,
Mouvements des
chaines latérales
Mouvements de la
protéine
Changements
conformationnels
Les molécules d’eau participent à cette dynamique
Rotation Rotation
Translation
Mouvement des molécules d’eau
à la surface des protéines
Protéine inactive Protéine active
Approcher la dynamique des
protéines
Méthodes d’étude
Approcher la dynamique des protéines
A l’échelle de la protéine A l’échelle de la cellule
Méthodes d’approches à l’échelle de la protéine
Normal Mode Analysis of Biomolecular Structures: Functional Mechanisms of Membrane Proteins Ivet Bahar,
Timothy R. Lezon, Ahmet Bakan, and Indira H. Shrivastava Chemical Reviews 2010 110 (3), 1463-1497
Real-Time NMR Characterization of Structure and Dynamics in a Transiently Populated Protein Folding
Intermediate. Enrico Rennella et al. †J. Am. Chem. Soc., 2012,
Modélisation/Simulation
Diffraction aux Rayon X
Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Méthodes à l’échelle cellulaire
Gènes rapporteurs
Photoblanchiment (Photobleaching)
Mesure des interactions protéiques
L’approche gènes rapporteurs
Fusion :
Transcriptionnelle : séquence régulatrice (promoteurs, élément de réponse …)
Traductionnelle : expression d’une protéine hybride
Suivi de la translocation
Cellules HeLa : Nluc (luciférase) – GR fusion
Cytoplasme Noyau
Translocation
+ dexamethasone
(15 min)
Engineered luciferase reporter from a deep Sea Shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.
ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1848−1857
Flurophores pour l’imagerie : la GFP
GFP : Green Fluorescent Protein
Protéine de 27 kDa
Issue de la méduse Aequora victoria (1962)
Premier clonage en 1992
Structure : tonneau β (11 feuillets β/1 hélice α)
4variants initialement dérivés
238 aa, 27 kDa
3 nm
4 nm
Chromophore :
Tyrosine/Glycine/Serine
Les protéines fluorescentes les plus courantes
Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues
Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010 Vol. 90 no. 3, 1103-1163
. BFP-H2B - GFP-actin -
RFP-golgi
Fluorescence et dynamique
FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching
+ Tunicamycine
VSVG-GFP
Mobilité
Immobilité
VSVG : Vesicular stomatitis virus G protein.
FRAP : des données quantitatives
Diminution de la constante D (Diffusion) :
Augmentation de la viscosité
Formation d’agrégats ou de complexes
Interaction
Augmentation de la constante D :
Mouvement dirigé
Diminution de la viscosité
Température
Viscosité
FLIP : Fluorescence Loss Induced by Photobleaching
Photobleaching toutes les 40 s
Disparition de la fluorescence au bout de 18 min
Continuité ER
Diminution de fluorescence
Interactions protéiques
Les interactions protéiques
Signalisation cellulaire
Interaction Récepteur ligand
Assemblage de récepteurs
150 000 à 300 000 interactions
Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy
Andrei A. Ivanov et Fadlo R. Khuri.
Trends Pharmacol Sci. 2013 Jul; 34(7): 393–400.
Interactions protéiques : les approches
Transfert d’énergie
. FRET
. BRET
Complémentation fonctionnelle
. Luciférase
. Protéine fluorescente
FRET : Fluorescence Resonnance Energy Transfer
CFP : Cyan Fluorescent Protein
YFP : Yellow Fluorescent Protein
No FRET FRET
Interaction protéique
< 10 nm
Pas d’interaction protéique
> 10 nm
BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer
Substrat : Ex : Coelenterazine
RLuc
PCA : Protein complementation Assay
Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment Complementation Assays in the
Study of G Protein-Coupled Receptor Oligomerization and Signaling
Pierre-Alexandre Vidi and Val J. Watts; Molecular Pharmacology April 2009, 75 (4) 733-739;
Luciférase
Protéine
Fluorescente
BiFc : Bimolecular Fluorescence complementation
GFP 157-158 485/500 Ghosh et al., 2000
YFP, Citrine,
Venus
154-155;
172-173 515/528
Hu et al., 2002; Shyu et
al., 2006
CFP,
Cerulean
154-155;
172-173 452/478
Hu et al., 2002; Shyu et
al., 2006
Venus/Cerul
ean
154-155;
172-173 504/513
Hu and Kerppola,
2003; Shyu et al., 2006
mRFP1-
Q66T
154-155;
168-169 549/570 Jach et al., 2006
mCherry 159-160 587/610 Fan et al., 2008
BiFc : dimérisation de récepteurs
Etude de GPCR : capacité à former des
homo ou hétérodimères
Dimérisation de récepteurs Adénosine
Complémentation YFP
Etude live-cell
BiLc : Bimolecular luminescence complementation
RLuc 110-111 Ch/485 Stefan et al., 2007
GLuc 93-94 Ch/480
Remy and
Michnick, 2006
Interaction Récepteur ligand
Leigh A Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nature Methods 12, 661-3.
Récepteur β2 adrénergique β2AR tagué avec une
nanoLuciférase (Nluc)
Ligand CA200645 (antagoniste) – fluorophore (BODIPY)
DPCPX : Antagoniste non marqué
NLucCA200645
- BODIPY
Etude de voies de signalisation : BRET
Bioluminescent tools for the analysis of G-protein-coupled receptor and arrestin interactions
Mitsuru Hattoria and Takeaki Ozawa*a
RSC Adv., 2015,5, 12655-12663
Suivi des changements conformationnels
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6; 112(1): 148–153..
Closed conformation
Autoinhibition
Open conformation
Conformation active (activité GEF) Rabin 8 (activité GEF) régule Rab8 impliqué
dans le traffic intracellulaire
BRET :
Luciférase : NanoLuc
Fluorophore couplé à un tag : HaloTag
Le passage à la conformation active (Open)
est dépendante de la phosphorylation
Kinase ERK2 active
Constituvely Active (CA)
Kinase ERK2 inactive
Kinase Dead (KD)
Combinaison des approches pour l’étude d’oligomères
Combinaisons
BiLc : Dimère 1
BiFc : Dimère 2
BRET : Tétramère
Suivi en temps réel
Suivi en temps réel : de la molécule à la cellule
FRET sur molécules uniques
Single-molecule FRET
Complémentation luciférase
FRET sur molécule unique : ATPase
ATP synthase :
. Domaine F1 statique
. Domaine F0 membranaire : Rotation
Détection d’une molécule
Accès à une dynamique sur une
très courte échelle de temps (ms)
Détecteur ultrasensibles de
photon
Excitation concentrée sur de petits
volumes
FRET sur molécule unique
Marquages :
. ʏ (rotation) : TMR
. b (statique) : Cy5
Luciférase pour le suivi en temps réel
Luciférase
Luciférase de petite taille 19 kDa
Très brillante > Rluc > Fluc
Utilisable en complémentation réversible :
Clivable en deux fragments : 11aa/156aa
Temps de ½ vie : > 2 h
Application à l’étude d’une voie de signalisation
ATP
Agonist
(ISO)
LgBiTSmBiT
CA R2A R2A
R2A
AMPc
Récepteur β adrénergique
(ADBR2)
Inactive
PKA CA R2A
Active
PKA
Reversible if [cAMP]↓
Biosenseur pour le
suivi de l’AMPcComplémentation luciférase
pour le suivi de la PKA
Antagonist
(PRO)
Activateur Adenylate
Cyclase (FSK)
. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)
. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)
. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)
Ligand domain : Site de laison à l’AMPc
Sensor domain
Domaines N et C Ter de la firefly
luciférase
Biosenseur :La liaison de l’AMPc induit un changement
coformationnel, l’activation de la luciférase
et l’émission d’un signal Luminescent
Suivi dynamique : associations/dissociations PKA
0 2 0 4 0 6 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
0 .1
1
1 0
1 0 0
1 0 0 0
T im e (m in )
Na
no
BiT
(% s
ign
al
de
cre
as
e)
Glo
Se
ns
or c
AM
P 2
2F
(fold
sig
na
l inc
re
as
e)
N a n o B iT
IS O P R O F S K
G lo S e n s o r c A M P 2 2 F
↓[cAMP] ↑[cAMP]↑[cAMP]
NBiT
GS
ATP
Agoniste (ISO)
ou Antagoniste (PRO)
LgBiTSmBiT
CA R2A R2A
R2A
cAMPInactive
PKACA R2A
Active
PKA
Activateur Adenylate
Cyclase (FSK)
NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein
Interactions in Cells. Andrew S. Dixon et al. ACS Chem. Biol., 2016, 11 (2), pp 400–408
Complémentation luciférase
AMPc : Biosenseur
. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)
. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)
. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)
Conclusion
Les apports de l’exploration dynamique des protéines
Pas une mais plusieurs dynamiques :
. Vibration, changement de conformation, translocation,
interactions protéiques …
Les technologies développées permettent aujourd’hui
d’apprécier non plus seulement la fonction d’une
protéine mais sa dynamique propre et au sein de la
cellule et d’un organisme (in vivo)
Luminescent
proteins
Des application concrètes
Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein–protein interaction challenge
Duncan E. Scott, Andrew R. Bayly,Chris Abell & John Skidmore
Nature Reviews Drug Discovery Volume:15,Pages:533–550 (2016)
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