dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière...
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Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante : étude par diffusion dynamique de
la lumière
Michaël Suissa
Sous la direction de :M. Eric Freyssingeas
Laboratoire de Physique
etM. Christophe Place
Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie
MODIFICATION DE L’ORGANISATION SPATIALE ET TEMPORELLE DU NOYAU
=MODIFICATION DE L’ETAT CELLULAIRE
Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.
Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.
CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des organismes vivants.
2 types de cellules:
Procaryotes : sans noyau (bactéries,…) Eucaryotes : disposant d’un noyau (hommes, animaux, plantes,…)
Noyau : délimité par la membrane nucléaire
Noyau contient ADN, support information génétique. Découverte récente : grande organisation structurelle et dynamique
Microscopies -> vision globale de la structure,
développer une technique -> approche globale de la dynamique
interne du noyau
Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.
Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.
• Projet : étudier la dynamique du noyau d’une cellule vivante
par : Diffusion Dynamique de la Lumière.
• Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur
l’ensemble des propriétés dynamiques internes
PlanPlan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
Contient ADN sous forme compactée : la chromatine
Molécule d’ADN + protéines (histones, …)
CHROMATINEUnité de base : nucléosome
1) Le noyau
I> Introduction
Territoires chromosomiques
1) Le noyau
Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990)
Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau d’un fibroblaste (Bolzer et al., 2005)
I> Introduction
Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique (Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à l’expression des gènes et à la réplication de l’ADN
Espace interchromosomique•Corps nucléaires •Protéines•Polymérases •ARN•Nucléotides
Territoires chromosomiquesChromatine
I> Introduction
1) Le noyau
Pores nucléaire
Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. (Belmont,
2001)
Dans territoires chromosomiques :•Mouvement de la chromatine à l’intérieur du territoire chromosomique. (Belmont et al., 2001, 2003).
•Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et
condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les
réparations de l’ADN.
Dans espace interchromosomique :• Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à
l’intérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » :
10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004).
• Réactions biochimiques.
I> Introduction
2) Dynamique du noyau
I> Introduction
2) Dynamique du noyauBIOLOGIE PHYSIQUE
Chromatine Polymère
Protéines Particules colloïdales
Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques consommant de l’énergie et produisant de la chaleur (en particulier, synthèse de l’ARN : transcription, et de l’ADN : réplication).
Technique physique adaptée pour analyse dynamique polymères, particules colloïdales :
DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE
Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de l’indice de réfraction n du milieu traversé par la lumière.
i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu.
i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu.
I> Introduction
3) Diffusion dynamique de la lumière
POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions biochimiques.
DDL :
Analyse des variations temporelles de l’intensité de la lumière diffusée par le noyau au cours d’un processus particulier : le
cycle cellulaire
Information globale sur la dynamique du noyau
Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau :
• Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets » fluorescents.
• Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule, contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la longueur d’onde et de la puissance.
• Temps caractéristiques accessibles de 10-5 s à 10 s et, échelle de l’ordre de quelques 500 nm.
I> Introduction
4) DDL par le noyau d’une cellule vivanteDDL
Cycle cellulaire, 4 phases différentes : G1, S, G2 et M.
I> Introduction
4) DDL par le noyau d’une cellule vivantePhénomène fondamental : le cycle cellulaire
Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ?
Assemble le fuseau mitotique, prépare la cellule à la mitose
Termine la division cellulaire
Déclenche l’anaphase et conduit à la cytodiérèse
Déclenche la machinerie de réplication de l’ADN;
Réplique l’ADN
PlanPlan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
II> Montage expérimental et protocolesII> Montage expérimental et protocoles
1) Principe du montage expérimental
Cellules immobiles car adhérentes
2 types de contraintes expérimentales à satisfaire :
• Contrainte « physiologique » : Environnement physiologique des cellules doit permettre développement normal des cellules pendant les expériences (de quelques heures à quelques jours).
• Contraintes « optiques » : a)Viser le noyau d’une cellule b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau d’une cellule (5 m ≤ diamètre noyau ≤ 10 m). c) Faire l’image du volume illuminé par le laser sur un détecteur.
II> Montage expérimental et protocoles
1) Principe du montage expérimental
Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le
pH).
1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ; adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures
2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau » thermostaté.
II> Montage expérimental et protocoles
2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de culture
A t=0, confluence = 1/3Objectif x10
Excellente survie et prolifération des cellules
II> Montage expérimental et protocoles
2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
20 µm
II> Montage expérimental et protocoles
3) Contraintes « optiques »
• Diamètre noyau 6-7 µm focalisation faisceau laser avec objectif microscope.
• Recueillir lumière diffusée selon plusieurs angles :-> Montage à l’horizontal,-> Diffusion de la lumière « vers l’avant ».
Noyau
Laser
II> Montage expérimental et protocoles
3) Contraintes « optiques »Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mWAngle de diffusion variable
Dans la cellule.I(noyau) = 20-200 u. a
I(cyto.) = 5-20 u. a
Dans le milieu.I = 1-2 u. a.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
10-6 10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
g(t)_milieug(t)_noyaug(t)_cytoaplasme
g(t)
t (sec)
II> Montage expérimental et protocoles
4) Validation du montageMesures sur différents systèmes :1) Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à
1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne.
2) Fonctions d’auto-corrélation mesurées pour différentes positions de
focalisation du laser
SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux.
SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et régulier (durée = 15 heures), …Aussi culture simple, « robustes ».
Pour notre étude : cellules neuroblastomes de la lignée SHEP
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Population « normale » de SHEP :
Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour connaître la phase du cycle des cellules à l’instant de la mesure.
• Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU. (HU : Hydroxyurée Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule d’entrer en phase S)• Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU.
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
60 % G0/1
15 % S
25 % G2+M
Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie en flux
MAISCytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur
CO2
Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans CO2
Etude par expériences de
cytométrie en flux
En parallèle
Observations visuelles d’échantillons placés
dans le montage
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par cytométrie en flux
• Un intercalant fluorescent de l’ADN est ajouté à une suspension « cellulaire ».
• Les cellules sont irradiées par un laser qui excite le colorant.
• L’intensité de fluorescence émise par le noyau est mesurée.
La cytométrie en flux permet de déterminer la « quantité » d’ADN présente dans la cellule
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Pic G0/1
Pic G2+MPhase S
Intensité fluorescenceContenu en ADN
Nom
bre
de c
ellu
les
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montageElimination HU
Non éliminé48 heures
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
% de G0/1
% de S
% de G2+M
Temps [heure]
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montageElimination HU
Non éliminé48 heures
Eliminé après10 heures (t0)
80% des cellules entrent en mitose
à t0+17 heures
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10Temps [heure]
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
% de G0/1
% de S
% de G2+M
Temps [heure]
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montageElimination HU
Non éliminé48 heures
Eliminé après15 heures (t0)
80% des cellules entrent en mitose
entre t0+9 et t0+10 heures
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps [heure]
1ère série de mitoses après élimination HU
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
% de G0/1
% de S
% de G2+M
Temps [heure]
HU éliminé après 10 heures HU éliminé après 15 heures
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps [heure]
MesuresS
MesuresG2
MesuresM
MesuresG0/1
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
% de G0/1
% de S
% de G2+M
Temps [heure]
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10Temps [heure]
PlanPlan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
• Signal non stationnaire : •Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes)•Variations brutales d’intensité (toutes les 7-8 s)
•Fluctuations
III> Résultats
Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes
Fonction d’auto-corrélation mesurée à = 21°.
III> Résultats
Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée d’elle même en temps. <I(0)I(t)>
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
t [s]
Fonction d’auto-corrélation mesurée à = 21°.
III> Résultats
2 temps caractéristiques Ajustement par fonction :
(A1.exp(-(t/1)) + A2.exp(-t/2))2 + B.
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
t [s]
2.6
2.65
2.7
2.75
2.8
2.85
2.9
10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1
(<N>)
Premières observations :
• Variations importantes de <N>.
• A2 > A1 ; A1 de 5 à 25 % de l’amplitude du signal
dynamique.
• Pas de corrélation entre <N> et 1, ou 2.
• Pas de corrélation entre A1 et 1, ni entre A2 et 2.
• Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation
indépendants.
• 0,4 ≤ ≤ 1 ; pas de corrélation entre et 1.
III> Résultats
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
0 2 4 6 8 10 120
20
40
60
80
Quantité
1 mesurés sur des cellules majoritairement en S
01020304050607080
4:00:00 6:00:00
1 [ ]ms
temps après relargage
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
0 2 4 6 8 10 12 140
20
40
60
80
Quantité
1 2mesurés sur des cellules majoritairement en G
0
10
20
30
40
50
60
70
80
7:00:00 9:00:00
τ1 [ms]
temps après relargage
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
0 2 4 6 8 10120
20
40
60
80
Quantité01020304050607080
1:00:003:00:005:00:00
1 [ ]ms
temps
1 1mesurés sur des cellules en G
Phase CC(nb mes/nb de noyaux)
Echelle Valeurs [10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)15-70
20; 40; (55)
0
4
8
12
16
20
24
0 20 40 60 80 100 120 140 160
1 [10-3 ]s
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3 140 10-3 160 10-3
1 [ ]s
Phase CC(nb mes/nb de noyaux)
Echelle Valeurs [10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)15-70
20; 40; (55)
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
0
4
8
12
16
20
24
0 20 40 60 80 100 120 140 160
1 [10-3 ]s
Phase CC(nb mes/nb de noyaux)
Echelle Valeurs [10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)15-70
20; 40; (55)
S
(252/44)5-40
20; (15);
(35-40)
0
0,008
0,016
0,024
0,032
0,04
0,048
0,056
0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3
Proba_G1
Proba_S
1 [ ]s
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC(nb mes/nb de noyaux)
Echelle Valeurs [10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)15-70
20; 40; (55)
S
(252/44)5-40
20; (15); (35-40)
G2
(138/18)5-30 10; 25
0
0,008
0,016
0,024
0,032
0,04
0,048
0,056
0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3
Proba_G1
Proba_S
Proba_G2
1 [ ]s
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC(nb mes/nb de noyaux)
Echelle Valeurs [10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)15-70
20; 40; (55)
S
(252/34)5-40
20; (15); (35-40)
G2
(138/18)5-30 10; 25
M
(42/6)5-30 10
0
0,008
0,016
0,024
0,032
0,04
0,048
0,056
0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3
Proba_G1
Proba_S
Proba_G2
Proba_M
1 [ ]s
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
• Dynamique complexe : • Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à différents processus biologiques.• 1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire.
• Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 < 1 => Distribution large de temps caractéristiquesExplication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991).
=> Distribution log-normale des temps de relaxation1 et liés à la moyenne et à l’écart type de la distribution
A l’heure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et un, ou plusieurs, processus biologiques
III> Résultats : temps 1
Phase CCEchelle Valeurs
[s]
Pics
[s]
G0/1 0,2-2 0,5
S 0,2-1,2 0,45
G2 0,5-2 0,75; (1,5-2)
M 0,3-1 0,75 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 1 2 3 4 5 6
Proba G1
Proba S
Proba G2
Proba M
2 [ ]s
III> Résultats : temps 2
Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne de baseNéanmoins : • Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale.• Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins prononcées que pour 1.
Origines possibles de ce temps de relaxation : • Diffusion de complexes ARN-Protéines :
10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004). temps de relaxation, 1/Dq2 (avec q vecteur d’onde ; dépend de l’angle de
diffusion). Ici : q2 ≈ 2,21.1013 m-2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec.
• Mouvement de la chromatine à l’intérieur des territoires chromosomiques (Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde.
III> Résultats : temps 2
PlanPlan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
1) Conclusions DDL
V> Conclusions et perspectives
Mise au point d’un montage expérimental original et protocoles
Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes
Analyse par autocorrélation 2 temps caractéristiques indépendants
Temps rapide : • quelques dizaines de millisecondes, • distribution très différente selon phase du cycle cellulaire,• signature de relaxations s’effectuant par un ensemble de processus hiérarchisés
Temps lent :• de l’ordre de la seconde• distributions changent légèrement au cours du cycle cellulaire• gamme de temps compatible avec résultats sur diffusion de complexes ARN-protéines dans le noyau.
• Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée.
• Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des processus biologiques.Utilisation d’agents pharmacologiques pour bloquer des processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamiqueCoupler les mesures de diffusion avec des mesures de fluorescence Lien entre dynamique et activité biochimique.
• Mesurer la dynamique sur d’autres systèmes : apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à l’intérieur du cytoplasme.
3) Perspectives DDL
V> Conclusions et perspectives
Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent
également en apoptose
V> Conclusions et perspectives
V> Conclusions et perspectives
Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.
Contact ou diffusion ? Séparation des cellules grâce à des motifs carrés
50 µm250 µm
Objectif x10 Objectif x40
V> Conclusions et perspectives
REMERCIEMENTSEquipe E. Goillot : support pour partie bio
M. B. Berge : idée originale
M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal
M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal
Mme M. Barbi : démarrage de l’expérience
Evolution de la distribution des temps caractéristiques 1
en fonction de l’angle de diffusion
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 20 40 60 80 100 120 140
Proba_(16°)
Proba_(23°)
Proba_(27°)
Distribution de probabilité
1 [ ]ms
10
100
10 100
16°23°27°
position pics
1/q2
Evolution de la distribution des temps caractéristiques 2
en fonction de l’angle de diffusion
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7
Proba (16°)
Proba (23°)
Proba (27°)
Distribution de probabilité
2 [ ]s
0.1
1
1 10" " Pic de la distribution de
2
1/q
: 1,7Pente
Evolution de la distribution du coefficient d’étirement au cours du cycle cellulaire
0
1
2
3
4
5
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2
G1
S
G2
M
Densité en probabilité
Evolution de la distribution de <N> au cours du cycle cellulaire
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0 200 400 600 800 1000
Proba G0/1
Proba S
Proba G2
<N>
2.75 109
2.8 109
2.85 109
2.9 109
2.95 109
3 109
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
<I(0)I(t)>
t [s]
Fonction d'autocorrélation de la lumière diffusée par le cytoplasme d'une cellule en phase G1
(Ajustement par cumulants)
Fonction d’autocorrélation de l’intensité de la lumière diffusée par le cytoplasme d’une
cellule en phase G1 (ajustement par cumulants)
1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s