© Jonathan Robidoux, 2020

Développement d'une méthode analytique pour l'évaluation des propriétés de déformabilité des

globules rouges

Mémoire

Jonathan Robidoux

Maîtrise en biochimie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Développement d'une méthode analytique pour l'évaluation des propriétés de déformabilité des

globules rouges

Mémoire

Jonathan Robidoux

Sous la direction de :

Steve Charette, directeur de recherche

Danny Brouard, codirecteur de recherche

ii

Résumé

La médecine transfusionnelle est un rouage important du système de santé canadien. Au Québec, la banque

de sang Héma-Québec gère l’ensemble des étapes de la collecte de sang et la livraison des produits sanguins

aux hôpitaux. Depuis quelques années, l’altération de la déformabilité des globules rouges observée durant

leur entreposage dans les banques de sang est revenue à l’avant-plan des discussions en raison de

l’accessibilité grandissante de nouvelles technologies permettant de mieux caractériser cette propriété.

L’objectif de ce projet, réalisé au sein d’Héma-Québec, consistait à développer une approche microfluidique

novatrice permettant la mesure de l’évolution de la déformabilité des globules rouges durant leur entreposage

dans une banque de sang. Le suivi de la déformabilité de six concentrés de globules rouges entreposés à

T = [2-8 °C] durant 42 jours a permis de déterminer que les performances de la méthode microfluidique

surpassent celles d’une méthode comparative également développée dans le cadre de ce projet. Certaines

inconsistances observées lors de l’application de la méthode microfluidique ont subséquemment mené à une

phase d’optimisation. Bien que certains aspects de la méthode doivent encore être améliorés, les résultats de

ce projet laissent présager que la déformabilité pourrait éventuellement servir de marqueur de qualité des

globules rouges au même titre que les marqueurs les plus éloquents actuellement pris en compte à Héma-

Québec.

iii

Abstract

Transfusion medicine is an important part of the Canadian health care system. In Quebec, the Héma-Québec

blood bank manages all stages from blood collection to delivery of blood products to hospitals. In recent years,

the alteration of red blood cells deformability observed during storage in blood banks has returned to the

forefront of discussions because of the increasing accessibility of new technologies to better characterize this

property. This project objective was to develop, within Héma-Québec, a novel microfluidic approach to

measure the evolution of red blood cells deformability during blood bank storage. Monitoring the deformability

of six red blood cells concentrates stored at T = [2-8 °C] for 42 days determined that the performance of the

microfluidic method surpassed that of a comparative method, which was also developed as part of this project.

Some inconsistencies observed during the application of the microfluidic method have subsequently led to an

optimization phase. Although some aspects of the method still need to be improved, the results of this project

suggest that deformability could possibly serve as a quality marker of red blood cells in the same way as the

most eloquent markers do.

iv

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................................... ii

Abstract ............................................................................................................................................................... iii

Table des matières ............................................................................................................................................. iv

Liste des figures .................................................................................................................................................. vi

Liste des tableaux .............................................................................................................................................. vii

Liste des abréviations ....................................................................................................................................... viii

Remerciements ................................................................................................................................................... ix

Avant-propos ....................................................................................................................................................... x

Introduction ......................................................................................................................................................... 1

Chapitre 1 – Bases théoriques et pratiques de la physiologie du globule rouge ................................................. 4

1.1 Physiologie du globule rouge in vivo ................................................................................................. 4

1.1.1 Transport de l’oxygène ...................................................................................................................... 5

1.1.2 Déformabilité du globule rouge ......................................................................................................... 7

1.1.3 L’érythrophagocytose ou la mort régulée des globules rouges ....................................................... 10

1.2 Physiologie du globule rouge in vitro ............................................................................................... 11

1.2.1 Causes des lésions d’entreposage ................................................................................................. 12

1.2.2 Lésions d’entreposage connues...................................................................................................... 14

1.2.3 Impact transfusionnel des lésions d’entreposage ........................................................................... 15

1.3 Méthodes de caractérisation des propriétés de déformabilité des globules rouges ............................... 17

1.3.1 Méthodes d’analyse unicellulaire .................................................................................................... 17

1.3.2 Méthode d’analyse de masse.......................................................................................................... 19

1.3.3 L’analyse unicellulaire à haut rendement ........................................................................................ 19

1.3.4 Méthodes d’analyse microfluidique ................................................................................................. 20

Chapitre 2 – Prévenir la variation instrumentale liée à l’utilisation du dispositif MVA ....................................... 30

2.1 Nature du problème ................................................................................................................................ 30

2.2 Solutions envisageables ......................................................................................................................... 30

2.3 Développement d’un étalon de référence ............................................................................................... 31

2.4 Preuve de concept : Étalon de référence ............................................................................................... 34

Chapitre 3 – Développement d’une méthode comparative de mesure de la déformabilité des globules rouges

.......................................................................................................................................................................... 36

3.1 Adaptation d’une méthode de mesure de la filtrabilité des globules rouges ........................................... 36

v

Chapitre 4 - Development of a Flow Standard to Enable Highly Reproducible Measurements of Deformability

of Stored Red Blood Cells in a Microfluidic Device ........................................................................................... 39

4.1 Résumé .................................................................................................................................................. 39

4.2 Abstract .................................................................................................................................................. 40

4.3 Introduction ............................................................................................................................................. 41

4.4 Material and method ............................................................................................................................... 43

4.4.1 Blood donation and transformation ................................................................................................. 43

4.4.2 The MVA method ............................................................................................................................ 43

4.4.3 Measurement of RBC deformability over storage............................................................................ 45

4.4.4 Measurement of biochemical and hematological parameters ......................................................... 45

4.4.5 Statistical analysis ........................................................................................................................... 46

4.5 Results ................................................................................................................................................... 46

4.5.1 MVA method characterization ......................................................................................................... 46

4.5.2 Deformability analysis – NMF and MMFI ........................................................................................ 47

4.5.3 Biochemical and hematological analysis ......................................................................................... 49

4.6 Discussion .............................................................................................................................................. 50

4.6.1 Velocity measurement to interpret deformability ............................................................................. 50

4.6.2 Storage lesions ............................................................................................................................... 52

Chapitre 5 – Discussion .................................................................................................................................... 54

5.1 Limites de l’étude.................................................................................................................................... 54

5.1.1 Différence entre les culots globulaires de l’étude et ceux transfusés cliniquement. ........................ 54

5.1.2 L’implication de la valeur mesurée .................................................................................................. 55

5.2 Amélioration de l’étalon de référence ..................................................................................................... 56

5.2.1 Limites de l’étalon de référence #1 ................................................................................................. 56

5.2.2 Développement et caractérisation d’un nouvel étalon de référence ................................................ 59

5.2.3 Limites du nouvel étalon de référence ............................................................................................ 64

5.3 Perspectives ........................................................................................................................................... 68

Conclusion ........................................................................................................................................................ 70

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 71

Annexe A .......................................................................................................................................................... 77

vi

Liste des figures

Figure 1 – Schématisation de l’hémoglobine. ............................................................................................... 5

Figure 2 – Courbe de dissociation de l’hémoglobine et de l’oxygène. .......................................................... 6

Figure 3 – Structure du cytosquelette et de la membrane cellulaire d’un GR. .............................................. 8

Figure 4 – Formation de microvésicules. .................................................................................................... 11

Figure 5 – Évolution morphologique d’un GR durant l’entreposage. .......................................................... 15

Figure 6 – Méthodes de mesure unicellulaire de la déformabilité des GR. ................................................. 18

Figure 7 – Principe de la photolithographie. .............................................................................................. 20

Figure 8 – Réseaux de déformation en parachute. ..................................................................................... 21

Figure 9 – Réseau de goulots d’étranglement. ........................................................................................... 24

Figure 10 – Configuration de la puce microfluidique AMVN. ...................................................................... 25

Figure 11 – Représentation de GR en rouleau par adhésion au niveau de leur surface plane. .................... 26

Figure 12 – Influence de l’aggrégabilité et de la déformabilité des GR sur la viscosité d’un échantillon. .... 28

Figure 13 – Relation entre pression et débit relatifs................................................................................... 35

Figure 14 – Hémolyse selon les conditions de microfiltration. ................................................................... 37

Figure 15 – MVA microfluidic network. ...................................................................................................... 42

Figure 16 – MVA signal and analysis. ......................................................................................................... 45

Figure 17 – IS ability to correct for method variability. .............................................................................. 47

Figure 18 – RBCs raw and relative data analysis. ........................................................................................ 48

Figure 19 – Deformability measurements. ................................................................................................. 48

Figure 20 – Effet de l’obstruction partielle du réseau du MVA sur le débit mesuré. ................................... 57

Figure 21 – Effet des agrégats stationnaires sur le débit mesuré. ............................................................... 58

Figure 22 – Comparaison de l’oscillation du débit de l’ER1 et d’un échantillon de GR. ............................... 58

Figure 23 – Effet de la raréfaction des microsphères. ................................................................................. 61

Figure 24 – Correction du signal analytique à l’aide de l’ER2. ..................................................................... 63

Figure 25 – Variations ponctuelles et majeures du signal durant une acquisition. ..................................... 64

Figure 26 – Augmentation du débit lors de l'utilisation de puces n'ayant pas tempéré. ............................. 65

Figure 27 – Obstruction partielle causée par des microsphères de taille non désirées. .............................. 67

Figure 28 – Obstruction significative sur puce MVA. .................................................................................. 68

vii

Liste des tableaux

Tableau 1 - Détermination de la concentration en microsphères et en glycérol nécessaire pour obtenir un

ER dont le débit est représentatif d’un échantillon de GR. ................................................................ 33

Tableau 2 – RCCs quality markers evolution during storage. ...................................................................... 49

Tableau 3 – NMF week-to-week significant differences. ............................................................................ 49

Tableau 4 – NMF related markers .............................................................................................................. 50

Tableau 5 – Caractéristiques et appréciation visuelle des solutions de microsphères testées lors du

développement de l’ER2. ................................................................................................................... 60

viii

Liste des abréviations

2,3-DPG : 2,3-Diphosphoglycérate

AMVN : Artificial microvascular network (Réseau microvasculaire artificiel)

ATP : Adénosine triphosphate

CG : Culot globulaire

DésoxyHb : Désoxyhémoglobine

DI : Indice de déformabilité

EI : Indice d’élongation

ER : Étalon de référence

GR : Globule rouge

Hb : Hémoglobine

Htc : Hématocrite

OxyHb : Oxyhémoglobine

MétHb : Méthémoglobine

MS/V : Ratio de membrane cellulaire sur le volume cellulaire

MVA : Microvascular analyzer (Analyseur microvasculaire)

PBS : Phosphate buffered saline (Tampon phosphate salin)

PDMS : Polydiméthylsiloxane

PE : Phosphatidyléthanolamine

PLM : Microsphère de polystyrène de latex

PS : Phosphatidylsérine

ROS : Complexes réactifs oxygénés

SAGM : Saline-adénine-glucose-mannitol

VCM : Volume cellulaire moyen

ix

Remerciements

Il est coutume de dire que l’important, ce n’est pas la destination, c’est le voyage. La réalisation de ce projet

de maîtrise s’est effectivement avérée être un voyage des plus enrichissant et amusant. Il n’en reste pas

moins qu’on apprécie arriver à destination.

Je tiens tout d’abord à remercier mon codirecteur de recherche, Danny Brouard, pour m’avoir soutenu durant

ce périple, mais également pour m’avoir encouragé à sortir de ma zone de confort dans la réalisation de

tâches diverses et complexes, le tout m’ayant permis de développer de solides compétences. Merci de m’avoir

permis de prendre part à la vie de professionnel de recherche en m’accordant ta confiance dans la gestion de

nos collaborations et en me permettant d’assister notamment au congrès de l’AABB. Vous m’avez encouragé,

Marc Cloutier et toi, à emprunter la voix de la recherche scientifique, et je vous en serai éternellement

reconnaissant.

Je tiens également à remercier tous les membres de l’équipe de recherche opérationnelle qui m’ont offert un

support inconditionnel tout au long de ce processus. Vos compétences dans le domaine de la recherche

scientifique n’ont d’égal que la chaleureuse ambiance régnant au sein de votre équipe. Vous m’avez accueilli

à bras ouverts et j’ai été choyé d'avoir pu passer deux belles années à vos côtés.

Mention honorable également à Steve Charette, directeur de maîtrise, qui aura toujours su se rendre

rapidement disponible malgré les nombreux chapeaux qu’il peut arborer dans une même journée. Ce fut un

réel plaisir d’avoir la chance de te côtoyer.

Et finalement, on ne saurait rester sain d’esprit dans le monde de la recherche sans l’aide d’une muse pour

détourner nos rêves des réflexions scientifiques qui hantent nos nuits. Merci, Gabrielle Nolet, de m’avoir

soutenu émotionnellement, psychologiquement et financièrement durant ces longues années. Tu as porté ta

croix, il est maintenant l’heure pour moi de rapporter le bacon à la maison.

x

Avant-propos

Ce mémoire contient, entre autres, un article scientifique, rédigé en anglais, se trouvant au Chapitre 4. L’article

a été soumis en ligne au journal Transfusion en date du 15 août 2019 (ID : Trans-2019-0652). L’article a été

accepté conditionnellement à l’ajout de modifications suggérées par les réviseurs en date du 7 octobre 2019.

La version retrouvée dans ce mémoire correspond à la version révisée en date du 9 janvier 2020, version qui

sera soumise incessamment. Les numéros des références, de figures et de tableaux ont été adaptés à la

facture de ce mémoire. Je, Jonathan Robidoux, suis premier auteur de cet article. J’ai rédigé l’entièreté de

l’article qui a été par la suite révisé par Audrey Laforce-Lavoie1, Steve J. Charette2, Sergey S. Shevkoplyas3,

Tatsuro Yoshida4 et Danny Brouard1.

1) Héma-Québec, Affaires Médicales et Innovation, Québec (QC), Canada, G1V 5C3

2) Université Laval, Département de Biochimie, Microbiologie et Bioinformatique, Québec (QC),

Canada, G1V 0A6

3) Université de Houston, Département d’Ingénérie Biomédicale, Houston (TX), USA, 77204

4) Hemanext, Lexington (MA), USA, 02421

1

Introduction

Le terme « Banque de sang » (Blood Bank), initialement utilisé par l’américain d’origine hongroise Bernard

Fantus en 1937, est aujourd’hui universellement utilisé pour identifier les entités assurant la gestion des

produits sanguins devant servir à la transfusion sanguine humaine.1 Au Québec, c’est l’organisme à but non

lucratif Héma-Québec qui voit à répondre avec efficience aux besoins de la population québécoise en produits

sanguins de qualité. Pendant la dernière année, ce sont un peu plus de 350 000 dons qui ont été effectués à

travers les divers sites de collecte organisés et administrés par Héma-Québec.2

Il est généralement bien compris qu’un don de sang prélevé en collecte permettra la transfusion de produits

sanguins à une personne dans le besoin. Dans les faits, il existe cependant de nombreuses étapes entre le

don de sang et la transfusion de produits sanguins. Le sang se compose principalement de plasma, de

globules rouges (GR), de plaquettes et de cellules immunitaires. Par des procédés de centrifugation et de

filtration, il est possible d’isoler les composants sanguins en produits sanguins labiles.3 La transfusion de l’un

ou l’autre des produits sanguins labiles permet de répondre aux besoins spécifiques des différents receveurs

tout en diminuant les risques de réactions transfusionnelles indésirables par l’élimination notamment des

cellules immunitaires présentes dans le sang total. La séparation du sang total permet l’entreposage de

chacun des produits sanguins en conditions optimales. Le plasma, dépourvu de cellules, peut être congelé et

conservé pendant une année. Les concentrés de GR, également appelés culots globulaires (CG), demeurent

propres à la transfusion pour une période de 42 jours s’ils sont conservés à une température qui avoisine

T = 4 °C. Les plaquettes, qui ont tendance à s’agréger lorsque soumises à des variations de température, sont

regroupées pour former le concentré plaquettaire qui peut être conservé sept jours, lorsque maintenu à

température ambiante sous agitation continue.

En plus d’assurer la collecte et la distribution de produits sanguins, Héma-Québec a également le mandat de

mener des travaux de recherche scientifique, ce qui en fait un acteur important du système de santé

québécois. À cette fin, la direction de la recherche opérationnelle à la vice-présidence aux affaires médicales

et à l’innovation remplit le rôle d’évaluateur des nouvelles pratiques et des technologies émergentes de la

médecine transfusionnelle dans le but d’améliorer la productivité de l’organisme de même que la qualité et la

sécurité des produits. Par exemple, un nouveau procédé de séparation du sang total en produits sanguins

labiles doit être évalué avant d’être entériné par Héma-Québec puis intégré au niveau des opérations

courantes. L’évaluation vise le suivi de différents marqueurs de qualité durant l’entreposage des produits de

manière à vérifier le respect des critères de qualité définis par Santé Canada. Dans le cas des CG, les

marqueurs sont mesurés à différents moments pendant la période d’entreposage de 42 jours. À terme, il doit

être démontré, entre autres, que le taux d’hémolyse, définit comme étant la fraction de globules rouges (GR)

2

détruits ayant déversé son contenu au niveau du plasma (in vivo) ou du milieu d’entreposage (in vitro), doit

être inférieure à 0,8%, et ce pour 95% des CG analysés.3 Bien qu’ils ne figurent pas parmi les critères de

qualité émit par Santé Canada, d’autres marqueurs de qualité peuvent également être mesurés, toujours dans

le but d’optimiser les méthodes existantes de traitement et de proposer des produits de meilleure qualité.

Aujourd’hui, il n’est pas rare d’observer plusieurs procédés de traitement différents coexister au sein d’une

même banque de sang. Ceux-ci permettent l’obtention de CG de qualité équivalente selon les marqueurs de

caractérisation actuels. Par souci d’amélioration continue de la qualité des produits, le développement d’outils

novateurs pour mieux caractériser la qualité des CG figure parmi les objectifs de recherche de la direction

opérationnelle.

La déformabilité des GR a longtemps été considérée comme une propriété ayant le potentiel d’être révélatrice

de l’état général d’un CG durant l’entreposage. Cependant, les conclusions discordantes d’études sur le sujet

semblent suggérer que les méthodes de mesures actuelles ne sont pas adaptées au suivi des variations de la

déformabilité des GR durant l’entreposage. De récentes avancées dans la fabrication de dispositifs

microfluidiques ouvrent à nouveau le débat sur la possibilité de mesurer et de considérer la déformabilité des

GR comme marqueurs de qualité des CG. Devant pareille opportunité, un projet de recherche ayant comme

principal objectif le développement et la caractérisation d’une méthode microfluidique de mesure de la

déformabilité des GR a été élaboré.

Hypothèse du projet :

Un outil microfluidique adéquat permettra d’interpréter la déformabilité des GR et de déceler des

variations quantifiables de cette propriété durant l’entreposage de ses GR sous les conditions

retrouvées dans une banque de sang.

Objectif principal du projet :

Développer et optimiser une approche microfluidique pour la caractérisation des propriétés de

déformabilité des globules rouges.

Objectifs secondaires du projet :

1. Développer un étalon de référence permettant un étalonnage de l’approche microfluidique.

2. Développer une méthode analytique pour quantifier la déformabilité des globules rouges basée sur

une approche reconnue de la littérature scientifique pour fins de comparaison.

3

3. Comparer le comportement de certains marqueurs de qualité des globules rouges reconnus par

Santé-Canada aux résultats de déformabilité obtenus à partir de l’approche microfluidique.

Dans ce mémoire, les bases théoriques de la physiologie des GR et les méthodes existantes pour la

caractérisation de leurs propriétés de déformabilité sont d’abord exposées. Ensuite, les travaux préliminaires

ayant mené à la réalisation des objectifs secondaires 1 et 2 sont détaillés. Le chapitre 4 traite, au moyen d’un

article scientifique, des performances de l’approche microfluidique et de son rapport aux autres marqueurs de

qualité des GR suivis durant leur entreposage. Finalement, les travaux ayant suivi ceux rapportés dans l’article

scientifique sont présentés avant de conclure avec une discussion portant sur les perspectives d’avenir de la

technologie développée.

4

Chapitre 1 – Bases théoriques et pratiques de la

physiologie du globule rouge

L’étude des GR dans un milieu contrôlé nécessite la compréhension des mécanismes fondamentaux régulant

leur vie et leur survie dans leur milieu naturel. De ce fait, la physiologie du GR in vivo est abordée avec une

attention particulière aux propriétés physiologiques qui lui confèrent ses remarquables propriétés de

déformabilité. Il est ensuite question des changements physiologiques observés pendant la période

d’entreposage des CG dans les banques de sang. Les forces et limitations des méthodes permettant la

mesure de la déformabilité des GR sont discutées avant la présentation de l’approche novatrice développée

dans le cadre du projet.

1.1 Physiologie du globule rouge in vivo

Le système circulatoire sanguin se constitue d’un réseau de vaisseaux sanguins qui permet notamment aux

nutriments, aux déchets métaboliques, aux intervenants du système immunitaire et aux messagers du

système endocrinien de circuler dans le corps humain.4 Il permet également aux GR de circuler et

d’acheminer l’oxygène des poumons vers les tissus, puis au retour, le dioxyde de carbone des tissus vers les

poumons. Un être humain adulte possède approximativement 25 milliards de GR en circulation qui

représentent, en moyenne, entre 40% et 50% du volume sanguin.5-8 Ces GR, également connus sous le nom

d’hématies et d’érythrocytes, ont une durée de vie moyenne de 120 jours, à la suite de laquelle l’accumulation

de nombreuses altérations physiologiques mène à leur élimination. Ce phénomène permet le remplacement

quotidien des GR désuets par des GR fraîchement formés par érythropoïèse. Ceci signifie qu’un individu

moyen présente une population hétérogène de GR âgés entre 1 et 120 jours.

L’érythropoïèse est définie comme étant le processus de différenciation des GR à partir des cellules souches

de la moelle osseuse.9 Au cours de ces étapes de différentiation, les cellules souches contenant tous les

organites généralement retrouvés dans une cellule (noyau, mitochondries, réticulum endoplasmique,

cytosquelette, etc.) se transforment en une cellule privée d'organites à l’exception d’un cytosquelette retrouvé

uniquement sous la surface interne de la membrane cellulaire. Le cytoplasme est principalement constitué

d’hémoglobine (Hb), et dans une moindre mesure, d’une variété de protéines enzymatiques nécessaires au

fonctionnement du GR désormais incapable d’en synthétiser davantage étant dépourvu de noyau. Il est

important de noter que les mitochondries, grandes productrices d’énergies par voie aérobie, sont également

absentes des GR matures. Ceci prévient une utilisation significative de l’oxygène transporté à des fins

métaboliques. Les composantes du GR seront décrites en fonction de leur rôle respectif au niveau du

transport de l’oxygène, de la déformabilité des GR et du processus régulant leur survie et leur dégradation.

5

1.1.1 Transport de l’oxygène

L’oxygène est une molécule réactive qui est grandement utilisée dans le corps humain aux fins de la

respiration aérobie, permettant la formation d’adénosine triphosphate (ATP) par la conversion de l’énergie

obtenue de la dégradation des nutriments absorbés. Cependant, sous certaines conditions, l’oxygène peut

s’associer à d’autres molécules et former des complexes réactifs oxygénés (ROS, reactive oxygen species)

qui peuvent causer d’importants dommages cellulaires.10 Afin d’éviter les dommages oxydatifs, 98% de

l’oxygène présent dans le sang est confiné à l’intérieur des GR alors qu’environ 2% se retrouvent sous forme

dissoute dans le plasma sanguin.11 C’est grâce à leur impressionnante quantité d’Hb cytoplasmique, celle-ci

constituant près de 95% de leur volume cellulaire5, que les GR parviennent à assurer un transport efficace et

contrôlé de l’oxygène. L’Hb est une protéine tétramérique formée généralement de deux sous-unités α et de

deux sous-unités β (Figure 1).12 Des variantes de la sous-unité β peuvent être retrouvées chez l’humain, mais

elles ne seront pas décrites dans le cadre de ce mémoire. Chacune des sous-unités porte un cofacteur hème,

caractérisée par la présence d’un ion de fer généralement sous forme oxydée (Fe2+). Ce sont ces ions ferreux

qui permettent la liaison et la rétention de l’O2. La majorité du CO2 est également transportée en faisant

intervenir l’hème, bien qu’une partie considérable soit également dissoute dans le plasma sanguin.13

Figure 1 – Schématisation de l’hémoglobine. Une molécule d’Hb se compose de deux chaînes α et de deux chaînes β portant chacune un groupement hème. Chaque hème est porteur d’un atome de fer permettant la liaison et le transport de l’oxygène. La capacité du fer à porter une molécule d’O2 dépend de son état ionique, lui qui peut être retrouvé sous forme Fe2+, Fe3+ ou Fe4+ selon l’état du cytoplasme et l’intégrité de la molécule d’Hb. Figure adaptée de https://bodytomy.com/structure-of-hemoglobin.

https://bodytomy.com/structure-of-hemoglobin

6

La grande efficacité d’un GR pour réaliser le transport de l’oxygène réside, en partie, dans la dynamique

particulière d’association et de dissociation de l’O2 et de l’Hb, un processus qui ne consomme pas d’énergie.12

L’Hb est une molécule allostérique, ce qui signifie qu’elle change de conformation lorsqu’elle se lie à

l’oxygène. Lorsque la pression en oxygène du milieu est faible, l’Hb ne porte aucune molécule d’oxygène et se

trouve sous forme désoxyhémoglobine (désoxyHb) en conformation tendue. Cette conformation est maintenue

par des liaisons ioniques, des ponts hydrogènes et des interactions hydrophobes qui sont stabilisés par la

présence de molécules de 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) entre les sous-unités β de l’Hb. Sous une plus

forte pression en oxygène, l’affinité de l’Hb pour l’oxygène supplante les liens maintenant la conformation

tendue, ce qui permet la liaison d’une première molécule d’oxygène. Cette liaison induit un changement

conformationnel de l’Hb qui passe à l’état relâché. Sous cette forme, l’Hb peut se lier à de nouvelles molécules

d’oxygène jusqu’à concurrence de quatre. L’Hb saturée en oxygène est appelée oxyhémoglobine (oxyHb). Ce

phénomène est illustré par la courbe de dissociation sigmoïdale de l’oxygène à la Figure 2.

Figure 2 – Courbe de dissociation de l’hémoglobine et de l’oxygène. A) La forme sigmoïdale de la courbe laisse transparaître; une réticence de l’Hb à lier l’oxygène à des pressions d’O2 faibles (PO2 < 10 mm de Hg), une aisance exponentielle à lier l’oxygène causée par le passage de la conformation tendue à relâchée (PO2 = 10 à 50 mm de Hg), une zone de plateau lorsque la majorité de l’Hb est déjà saturée en oxygène (PO2 > 50-60 mm de Hg). B) Visualisation de l’oxyHb et de la désoxyHb. Figure adaptée de https://www.medicalexamprep.co.uk/

Concrètement, les GR en circulation dans le sang possèdent à la fois des molécules d’oxyHb et de désoxyHb.

Lorsque ceux-ci circulent dans un tissu, comme un tissu musculaire par exemple, la faible pression d’O2

environnante incite les molécules d’oxyHb à relâcher de l’oxygène, mais n’est pas suffisamment élevée pour

permettre aux désoxyHb de changer d’état conformationnel et de capter de nouvelles molécules d’oxygène.

7

Seuls les tissus pulmonaires possèdent une pression environnante en O2 suffisamment élevée pour induire la

fixation de l’oxygène par les désoxyHb. C’est donc la concentration en oxygène de l’environnement du GR qui

influence la fixation et le largage de l’oxygène. Dans un même ordre d’idée, le pH peut également jouer un rôle

au niveau de l’affinité de l’Hb pour l’oxygène. La forte concentration en ions H+ associée à un faible pH incite

l’Hb à adopter une conformation tendue et désoxygénée en favorisant la formation de liaisons ioniques entre

certains de ses acides aminés. Par conséquent, la forte concentration en ions H+ observée au niveau des

tissus hypoxiques favorise le largage d’oxygène en facilitant la transition conformationnelle d’oxyHb à

désoxyHb. La capacité du GR de libérer ou de fixer l’oxygène sans coût énergétique est donc modulée par

l’environnement de l’Hb qui favorisera, par allostérie, la fixation dans un milieu riche en oxygène au pH normal

tel que les poumons, et le largage dans un milieu pauvre en oxygène au faible pH comme un tissu musculaire

au travail.

1.1.2 Déformabilité du globule rouge

Le GR présente une forme discoïdale caractérisée par une épaisseur comprise entre 2,5 et 3 μm et un

diamètre de 7 à 8 µm.14 Afin d’acheminer l’oxygène aux tissus, les GR se doivent de traverser les capillaires

sanguins, qui peuvent présenter un diamètre contraignant pouvant atteindre 3 μm. Les GR parviennent à

circuler par les capillaires grâce à leur grande capacité à se déformer qui résulte d’un amalgame de

propriétés. De manière générale, on distingue ces propriétés en trois grandes catégories, soit le ratio de

membrane de surface par rapport au volume cellulaire (MS/V), l’organisation du cytosquelette et la viscosité

du cytoplasme.

1.1.2.1 Le ratio de membrane de surface par rapport au volume cellulaire

Le volume moyen d’un GR est d’environ 90 fL (1 fL = 10-9 µL) pour une surface membranaire totale d’environ

140 um2.14 S’il était de forme sphérique plutôt que discoïdale, un GR ayant toujours une surface membranaire

de 140 um2 aurait un volume de 155 fL. À cet égard, on pourrait comparer un GR à un ballon de plage

dégonflé, qui s’avère être beaucoup plus déformable et malléable que son homologue bien gonflé. Ce grand

ratio de surface par rapport au volume (MS/V) permet au GR d’adopter sa forme discoïdale typique. Le ratio

MS/V procure aux GR la résilience nécessaire pour répondre aux contraintes physiques rencontrées dans le

système circulatoire. Lorsque soumise à une force orientée dans une seule direction, la membrane discoïdale

du GR adopte une forme plutôt ovale. Par déplacement du surplus de membranes, le GR peut s’allonger pour

atteindre plus du double de sa longueur initiale entraînant une diminution remarquée de sa largeur. Bien qu’un

faible ratio MS/V soit nécessaire pour permettre au GR de se déformer, c’est l’organisation particulière de son

cytosquelette qui lui confère tonus et flexibilité.

8

Figure 3 – Structure du cytosquelette et de la membrane cellulaire d’un GR. A) Le cytosquelette du GR est aussi appelé squelette membranaire puisqu’il recouvre la surface interne de la membrane cellulaire du GR, mais est absent du cytoplasme. L’arrangement particulier de l’α-spectrine, de la ß-spectrine et des autres protéines du cytosquelette lui confère tonus et flexibilité. B) Le cytosquelette supporte la membrane et régule la distribution des protéines membranaires.12 L'interaction horizontale décrit l’arrangement des protéines du cytosquelette entre elles et l'interaction verticale décrit l'arrangement entre protéines du cytosquelette et protéines membranaires. Figure 3.A adaptée de https://www.cell.com/cms/attachment/ce7e45ef-39d4-47df-af4e-c1e9e69d62b7/fx1_lrg.jpg

1.1.2.2 L’organisation du cytosquelette

Le cytosquelette du GR recouvre la surface interne de la membrane cellulaire et est complètement absent du

cytoplasme.15 Le cytosquelette se compose d’α-spectrine et de ß-spectrine qui s’associent en dimères

hélicoïdaux et en tétramères pour ensuite former une succession de segments d’hélices répétées. Ces

tétramères sont liés entre eux par des protéines d’actines, qui forment ensemble une mosaïque flexible

(Figure 3). Les ankyrines sont des protéines intermédiaires permettant la liaison entre les spectrines du

cytosquelette et la protéine transmembranaire bande 3. En plus d’arrimer la membrane au cytosquelette, le

complexe spectrine, ankyrine et bande 3 joue un rôle dans l’organisation latérale de la membrane cellulaire.

Les glycophorines, de forme A, B, C ou D sont également des protéines transmembranaires pouvant servir de

point d’ancrage pour le cytosquelette. C’est à l’aide de la protéine 4.1b et d’un complexe protéique inconnu

que les glycophorines se lient aux actines du cytosquelette. Pour d’autres types de cellules, la présence

d’organites cytoplasmiques requiert le soutien du cytosquelette omniprésent à l’intérieur de la cellule.16 C’est

donc l’absence de cytosquelette en son centre et l’arrangement particulier des hélices de spectrines qui, à

l’image de ressorts, procurent aux GR leur flexibilité tout en soutenant la forme discoïdale observée au repos.

En circulation dans le corps humain, le GR ne dispose que d’un bref instant pour répondre aux contraintes

spatiales de même qu’aux collisions avec les autres cellules en circulation. L’arrangement du cytosquelette et

de la membrane cellulaire peut se déplacer et parvient à rouler autour du contenu cellulaire, un comportement

9

cellulaire défini de l’anglais comme étant du tank treading, ce qui augmente la résilience des GR face aux

contraintes rencontrées dans la circulation sanguine.17

1.1.2.3 La viscosité du cytoplasme

Le ratio MS/V et l’organisation particulière du cytosquelette permettent à la membrane de se mouvoir dans

toutes les directions en réponse aux contraintes externes, ce qui rend la déformabilité du GR vulnérable à la

viscosité de son cytoplasme qui peut offrir une résistance supplémentaire.15 Outre l’eau, l’Hb est le principal

constituant cytoplasmique d’un GR. La concentration de l’Hb se situe normalement entre 27 et 35 g/dL et

n’influence pas de manière considérable la viscosité du cytoplasme. Étant dépourvu de noyau, le GR n’a pas

la capacité de produire de l’Hb au cours de sa vie. Par contre, un dérèglement homéostatique causé par des

défaillances au niveau des pompes ioniques peut entraîner une déshydratation du GR. La quantité totale en

Hb demeure stable, mais la diminution du volume du GR a pour effet d’augmenter sa concentration en Hb.

Lorsqu’elle devient supérieure à 37 g/dL, la viscosité du cytoplasme augmente de manière exponentielle

devenant un facteur important influençant les propriétés de déformabilité du GR.

1.1.2.4 Le rôle indirect des réserves d’énergie

Bien qu’elles ne soient pas directement utilisées dans le processus de déformabilité, les réserves d’énergie du

GR, principalement constituées d’ATP, assurent le maintien de l’organisation membranaire, de l’intégrité du

cytosquelette et du fonctionnement des pompes ioniques.18,19 Une chute abrupte des réserves d’énergie

n’aurait donc pas un impact instantané sur la déformabilité du GR mais affecterait éventuellement chacune

des trois propriétés abordées précédemment. Par conséquent, les réserves d’ATP ont un effet indirect sur la

déformabilité des GR. Puisque les réserves d’énergie des GR évolueront durant leur entreposage, il est

important d’en décrire la source et d’en comprendre les effets.

La glycolyse est le principal processus métabolique actif chez le GR. Ce processus permet la dégradation

anaérobie du glucose et la production d’intermédiaires énergétiques.20 Chaque molécule de glucose permet

au GR de produire deux molécules d’ATP. En plus d’intermédiaires comme le 2,3-DPG, la dégradation du

glucose produit le pyruvate qui peut être réduit en lactate par la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) si

sa concentration cytoplasmique le permet. La concentration en NADH dépend de la présence de la

méthémoglobine (métHb); une forme altérée de l’Hb portant le fer sous forme ferrique (Fe+3) plutôt que

ferreuse (Fe2+). Le NADH permet la réduction préférentielle de la métHb en Hb d’où l’incidence de la

concentration en métHb sur la quantité de NADH disponible pour la réduction du pyruvate en lactate. Ce

concept est d’incidence modérée dans le cas d’un GR in vivo puisque le lactate et le pyruvate sont expulsés

de la cellule pour être métabolisés ailleurs dans le corps humain. Il en est autrement dans le cas de

l’entreposage, où les déchets métaboliques excrétés par les GR subsistent dans le milieu nutritif.

10

1.1.3 L’érythrophagocytose ou la mort régulée des globules rouges

Le concept de mort cellulaire programmée, nommé apoptose, est retrouvé chez un grand nombre de types

cellulaires au niveau des organismes multicellulaires.21 Une cellule endommagée ou en fin de vie utile peut

enclencher un mécanisme d’autodestruction par la synthèse de protéines spécifiques ce qui permet un

renouvellement cellulaire bénéfique à l’organisme. Les GR en circulation ne peuvent pas synthétiser de

nouvelles protéines puisqu’ils sont privés de noyau. Leur élimination fait principalement intervenir des acteurs

externes qui parviennent à reconnaitre les GR les plus altérés via leurs marqueurs de sénescence.22 Au cours

de sa vie de 120 jours, un GR est soumis à de nombreux stress tels que l’acidité élevée et les dommages

oxydatifs. Ces stress affectent l’intégrité et l’organisation du cytosquelette et de la membrane cellulaire du GR.

Il en résulte une désorganisation des points d’ancrage et de la distribution des composants membranaires qui

causent de petits détachements localisés entre la membrane cellulaire et le cytosquelette.23 Ces

détachements membranaires représentés à la Figure 4 résultent en de multiples bourgeonnements, c’est-à-

dire à la formation et au largage de microvésicules (MVs) par le GR. Les MVs sont définies comme étant

formées de membranes cellulaires encapsulant du contenu cytoplasmique. Elles se forment lorsque le

détachement membranaire produit une protubérance suffisamment grande pour permettre à la membrane de

se refermer sur elle-même, se détachant ainsi du reste de la membrane cellulaire. Ce processus permet aux

GR d’éliminer l’Hb dénaturée, les protéines endommagées et les sections de membrane portant un nombre

considérable de marqueurs de sénescence. Cependant, la libération de MVs affecte le ratio MS/V nécessaire

aux GR pour maintenir une bonne déformabilité et induit en partie la transition d’un érythrocyte de forme

discoïdale à sphérique.19 L’altération du cytosquelette s’accentue avec le temps sous l’effet des dommages

oxydatifs alors que le processus de vésiculation perd son efficacité à larguer les segments cellulaires les plus

altérés en raison du manque de surplus membranaire. Cela cause éventuellement l’accumulation de

marqueurs de sénescence exposés à la surface du GR.

L’altération significative du ratio MS/V et de l’intégrité du cytosquelette affecte grandement la déformabilité des

GR, ce qui mène à leur rétention dans les fentes endothéliales (1 µm × 0,5 µm) de la pulpe rouge de la rate.14

Les GR coincés dans la pulpe rouge de la rate sont exposés aux macrophages, c’est-à-dire à des cellules du

système immunitaire dont le rôle principal est la dégradation de cellules ou de structures cellulaires. C’est la

reconnaissance des marqueurs de sénescence, tels que la phosphatidylsérine18 (PS) et la

phosphatidyléthanolamine24 (PE), ainsi que l’absence du marqueur d’inhibition de la phagocytose CD4725 qui

permet aux macrophages de reconnaitre les GR altérés et de déclencher le mécanisme de phagocytose. La

dégradation à l’intérieur des macrophages permet la récupération des hèmes et du fer des GR pour leur

réutilisation lors de l’érythropoïèse.9 Ce processus d’élimination permet de retirer de la circulation les GR qui

ne présente plus la déformabilité nécessaire pour emprunter les capillaires sanguins, endroit de prédilection

11

pour les échanges gazeux.26,27 Le mécanisme d’érythrophagocytose permet donc d’assurer le retrait des GR

dont la fonction principale est altérée tout en recyclant les molécules de fer et d’hème.

Figure 4 – Formation de microvésicules. Toutes perturbations des interactions entre les protéines du cytosquelette et les protéines transmembranaires sont susceptibles de causer la formation de microvésicules par altération directe des liens verticaux ou par regroupement d’éléments membranaires non liés au cytosquelette si l’altération affecte plutôt l’organisation horizontale du cytosquelette. Figure tirée de https://www.frontiersin.org/files/Articles/366081/fphys-09-00703-HTML/image_m/fphys-09-00703-g001.jpg

1.2 Physiologie du globule rouge in vitro

Les banques de sang isolent les GR des autres composants sanguins de manière à favoriser leur préservation

durant l’entreposage et à réduire le risque de réactions immunitaires lors des transfusions. À Héma-Québec,

les pratiques d’entreposage actuelles permettent la conservation d’un CG pendant une période de 42 jours en

conditions réfrigérées (T = 2-8 °C).3 Bien que la transfusion d’un CG en fin d’entreposage soit tout de même

bénéfique pour un receveur, il est reconnu que les GR puissent être de moins bonne qualité en raison des

altérations subies durant cette période. L’ensemble des changements subits et exprimés par les GR sont

regroupés sous l’étiquette de lésions d’entreposage. Certains facteurs causant ses lésions d’entreposage sont

connus, bien que la ramification complexe des mécanismes impliqués rend difficile l’établissement de cause à

12

effet. Pour cette raison, les causes connues et les lésions d’entreposage répertoriées sont présentées

séparément.

1.2.1 Causes des lésions d’entreposage

À première vue, il pourrait sembler logique d’estimer que la population hétérogène composée de GR âgés de

1 à 120 jours continue simplement de vieillir durant l’entreposage. Au bout des 42 jours d’entreposage, cette

population soustraite au processus d'érythrophagocytose serait composée d’individus âgés de 43 à 162 jours,

dont certains seraient fortement altérés. Il faut cependant prendre en considération que la vie d’un GR in vivo

diffère de celle d’un GR entreposé dans le cadre des opérations d’une banque de sang.28 In vivo, les GR

vivent dans le plasma sanguin à température corporelle (T ≈ 37 °C) et sont contraints de circuler sans relâche

dans les vaisseaux sanguins en côtoyant une panoplie d’autres cellules (endothéliales, immunitaires,

sanguines). L’intégrité des GR est fréquemment contrôlée lors de leur passage dans le foie et dans la rate ce

qui mène à l’élimination des GR altérés. Sous forme de CG dans les banques de sang, les GR ne sont pas

soumis aux mêmes stress mécaniques et leur métabolisme est ralenti par les faibles températures

d’entreposage (T = 2-8 °C). Ils sont suspendus dans une solution nutritive et ne sont plus soumis au

processus d’élimination des GR altérés, ce qui bouleverse le concept de durée de vie des GR. Ce nouvel

environnement froid où les GR sont immobiles dans une solution nutritive non renouvelée n’est pas parfait, et

cause sa propre ribambelle d’altérations physiologiques. L’ensemble de ses altérations serait causé par des

dommages oxydatifs et/ou par l’altération des mécanismes métaboliques.

1.2.1.1 Les dommages oxydatifs

L’oxygène est une molécule réactive qui, bien qu’essentielle au fonctionnement du corps humain, peut réagir

de manière incontrôlée avec un grand nombre de molécules.5 Les GR assurent essentiellement un transport

cloisonné de l’oxygène qui ne se retrouve autrement qu’en très faible quantité sous forme de gaz dissout dans

le sang.11 Durant l’entreposage des CG, les GR sont scellés dans une poche de plastique qui n’est pas

totalement étanche à la diffusion des molécules d’oxygène. Le milieu nutritif d’entreposage des GR accumule

l’oxygène à une concentration plus élevée que celle retrouvée dans le plasma sanguin, ce qui affecte la

concentration intracellulaire en oxygène. Comme mentionné précédemment, l’Hb alterne entre la forme

oxygénée et désoxygénée selon la concentration en O2 du milieu. Cependant, lorsque la concentration en

oxygène devient trop importante, l’oxyHb est oxydée pour former ce que l’on appelle la métHb, selon la

réaction suivante :

OxyHb(Fe2+) + O2 = MétHb(Fe3+) + O2-

13

Puisque la metHb ne possède pas la capacité de transporter l’oxygène, sa présence n’est pas souhaitable

in vivo et cette molécule est généralement réduite en oxyHb par la « méthémoglobine réductase ». Durant

l’entreposage, l’activité de cette enzyme est cependant ralentie par la basse température, ce qui favorise

l’accumulation de metHb dans les GR entreposés. De plus, la production de la molécule O2- enclenche une

cascade métabolique de dommages oxydatifs qui mène à la production de molécules oxygénées hautement

réactives (ROS) que sont la « ferryl hemoglobin » (porteuse de Fe4+) et le radical hydroxyle (•OH). Ces

réactions moléculaires s’accélèrent après la deuxième semaine d’entreposage. Le pouvoir oxydatif important

des ROS affecte d’importantes protéines structurales telles que l’ankyrine et la spectrine ainsi qu’un grand

nombre d’enzymes. Certaines des protéines ainsi oxydées auront désormais tendance à se lier au

cytosquelette, troublant son association avec la membrane cellulaire et causant des changements

morphologiques nuisibles à la déformabilité des GR.

1.2.1.2 L’entreposage en milieu froid et acide

La seconde grande cause derrière l’apparition des lésions d’entreposage est le changement d’environnement

des GR.5 Ce nouvel environnement se caractérise notamment par une basse température, un milieu fermé

représenté par la poche d’entreposage et un milieu nutritif plus simple que le plasma sanguin. Durant

l’entreposage réfrigéré, le métabolisme cellulaire des GR est ralenti. Les enzymes de la glycolyse anaérobie

continuent de dégrader lentement le glucose retrouvé dans le milieu nutritif. L'apport énergétique de ce

métabolisme résiduel ne suffit pas pour remplacer la totalité de l’énergie dépensée par la cellule, ce qui mène

à une diminution de la concentration intracellulaire en ATP. La faible température d’entreposage réduit

également l’activité d’autres enzymes importantes. C’est le cas de la méthémoglobine réductase, mais

également celui de la scramblase et de la flippase qui permettent normalement le maintien de l’organisation

des phospholipides membranaires. Ce maintien permet de prévenir le largage de vésicules par détachement

localisé de la membrane et du cytosquelette. Ces deux enzymes, étant ATP-dépendantes, voient leur activité

résiduelle diminuer davantage avec la déplétion des réserves d’ATP observée durant l’entreposage. La pompe

ionique Na-K, le transporteur ionique ATP-dépendant le plus important chez le GR, est inactivée à la

température d’entreposage ce qui perturbe l’équilibre ionique nécessaire au maintien de l’activité des autres

transporteurs ioniques. La chute de la concentration en ATP affecte également la pompe de l’ion calcium

(Ca2+). Le débalancement du gradient électrochimique qui en découle affecte l’organisation du cytosquelette

puisque les ions Ca2+ sont impliqués dans la stabilisation des liens entre actines et spectrines.15 Le

métabolisme résiduel du GR continu de produire des déchets métaboliques tels que le lactate et le pyruvate.

Ces déchets sont normalement excrétés directement dans le sang et sont retirés de la circulation par d’autres

organes du corps humain.20 Durant l’entreposage, ces déchets s’accumulent dans le système fermé de la

poche d’entreposage, causant notamment une diminution du pH. L’acidification de la solution nutritive aura

14

comme conséquence d’entraver graduellement l’activité enzymatique de protéines impliquées dans la

production d’ATP. La solution nutritive la plus utilisée chez Héma-Québec et largement étudiée dans la

littérature scientifique est le saline-adénine-glucose-mannitol (SAGM). Le SAGM se compose d’une solution

saline isotonique, d’une source d’énergie (glucose), d’une purine pour prévenir la désamination néfaste à la

glycolyse et d’une molécule permettant d’amenuiser l’effet de radicaux oxygénés (mannitol). Il diffère du

plasma sanguin par l’absence de facteurs antioxydants tels que l’acide urique.29 Bien que la formule de la

solution nutritive puisse varier, c’est la diminution du pH et la concentration en oxygène qui jouent un rôle

prépondérant sur la qualité des GR durant l’entreposage, ce qui n’est pas facile à prévenir par des

changements au niveau de la solution nutritive. Il est pertinent de mentionner que le remplacement

hebdomadaire de la solution nutritive permet d’amenuiser l’apparition des lésions d’entreposage. Il existe

également des solutions nutritives plus complexes qui permettent de recouvrir certaines caractéristiques ayant

été altérées durant l’entreposage.30 L’utilisation de ces solutions, dans leurs états actuels, ne représente

toutefois pas une avenue opérationnellement viable pour une banque de sang qui doit gérer un volume

important de dons par année.

1.2.2 Lésions d’entreposage connues

Les causes pouvant altérer la qualité d’un CG ont une influence ramifiée et interconnectée.5,18,19,31 Il est de ce

fait difficile d’identifier une cause unique pour une altération particulière. Par exemple, l’inhibition partielle des

enzymes de la glycolyse par le froid et par l’acidification du pH cause une diminution constante des réserves

d’ATP des GR. Cette importante diminution affecte le travail de nombreuses enzymes ATP-dépendantes.

Parmi le lot, les flippases et les scramblases deviennent moins efficaces ce qui accentue l’exposition de la PS,

et l’activité réduite de la méthémoglobine réductase nuit à la prévention des dommages oxydatifs. Les pompes

ATP-dépendantes sont également affectées, ce qui nuit à l’état d’hydratation du GR et à la conservation de

l’équilibre ionique nécessaire au maintien de l’intégrité cytosquelettique. Un autre exemple de pluralité de

conséquences est l’étendue des dégâts oxydatifs causés par la concentration élevée d’oxygène dissous. La

génération de ROS affecte de nombreuses protéines enzymatiques et structurales ainsi que certains

phospholipides. Dans l’ensemble, on considère que les lésions d’entreposage affectent la capacité des GR à

maintenir un niveau optimal d’ATP et de 2,3-DPG. L’altération de l’intégrité cytosquelettique et de

l’organisation membranaire induit des changements morphologiques graduels présentés à la Figure 5, la perte

d’asymétrie membranaire ainsi que le rassemblement de PS et de protéines bande 3.32 Il en découle une perte

d’adhésion de la membrane au cytosquelette ce qui mène au largage de MVs par les GR. Cette perte de

membrane amplifie le phénomène de changement morphologique et affecte le ratio MS/V.18

15

Figure 5 – Évolution morphologique d’un GR durant l’entreposage. Un GR sain présente une forme discoïdale et porte le nom de discocyte. Les altérations physiologiques subies durant l’entreposage mènent généralement à des dissociations ponctuelles entre le cytosquelette et la membrane cellulaires des GR qui entraînent des détachements visibles par microscopie optique. Les GR sont catégorisés en echninocyte I, II et III et sphéro-echinocyte selon l’importance des spicules causés par les détachements membranaires et la morphologie générale du GR. La diminution du ratio MS/V causé par la formation de MVs mène les GR à adopter une forme sphérique. À ce stade, l'absence de surplus membranaire ne permet plus au GR de se déformer efficacement ou de larguer des MVs. Figure tirée de l’article de Sierra et coll.33

La déformabilité des GR semble être altérée par différents aspects de l’entreposage. La souplesse du

cytosquelette est altérée par les dommages oxydatifs et les changements de concentration en Ca2+.19 Le

largage de vésicules induit une perte de membrane qui affecte le ratio MS/V, ce qui induit une transformation

morphologique des GR qui passent d’une forme discoïdale à une forme sphérique peu déformable. La

viscosité intracellulaire des GR ne change pas significativement durant l’entreposage et ne serait pas en

cause dans l’altération de la déformabilité des GR durant l’entreposage. L’ATP n’est pas directement

impliquée dans les processus de déformabilité des GR, mais joue un important rôle dans le maintien de

l’intégrité cellulaire.14 Dans l’ensemble, la capacité de déformabilité des GR ne peut pas être déduite par la

mesure de marqueurs indirects puisque les relations de cause à effet sont multiples et ne sont pas

entièrement connues à ce jour.

1.2.3 Impact transfusionnel des lésions d’entreposage

L’objectif de la transfusion de CG est de restaurer chez un individu l’oxygénation des tissus amenuisée par

une variété de conditions, incluant un saignement dû à une blessure, une chirurgie importante ou une

condition pathologique causant de l’anémie telle que les thalassémies α et β.34,35 Devant l’état des

connaissances concernant les lésions d’entreposages qui accablent la qualité des GR qui composent un CG, il

16

y a lieu de se demander si la transfusion d’un produit entreposé depuis près de six semaines aura le même

effet thérapeutique que la transfusion d’un produit frais.

L’impact transfusionnel de CG présentant certaines lésions d’entreposage n’est pas simple à établir. La

transfusion de CG dans les hôpitaux est nécessaire pour les individus au profil physiologique affecté par la

nature de leur condition, ce qui rend extrêmement difficile l’interprétation des indicateurs de santé mesurés

des suites d’une transfusion. Par exemple, un individu souffrant d’hémorragie se trouve dans une fâcheuse

posture qui pousse déjà son corps à produire une réponse inflammatoire. L’individu en anémie chronique,

quant à lui, est souvent en proie à une élimination de GR plus rapide que la normale ce qui s’accompagne

d’une hausse de facteurs sanguins liés à l’hémolyse. Il s’avère difficile de distinguer la réponse physiologique

liée à la transfusion de GR altérés de la réponse physiologique causée par l’état de l’individu. Néanmoins,

certains chercheurs ont tenté de déterminer l’effet de la transfusion de CG plus vieux par une étude statistique

des cas de mortalité et de survie des suites de transfusions étant survenus dans les hôpitaux. Les résultats de

ces études suggèrent qu’il n’y a pas de corrélation entre des évènements tragiques telles que la mort

d’individu et la transfusion de CG plus âgés.36,37 D’autres études ce sont intéressées à des indicateurs moins

radicaux comme le temps passée en hospitalisation à la suite de la transfusion ce qui s’est soldé par une

absence de corrélation.38 Il n’est pas étonnant de constater que la pratique transfusionnelle développée depuis

des décennies n’ait pas systématiquement d’impacts négatifs majeurs sur la santé des receveurs.

Des études ciblées ont toutefois permis de déceler certains indicateurs suggérant que la transfusion de CG

altérés par l’entreposage pouvait s’avérer moins bénéfique pour le receveur que la transfusion d’un CG frais.

Le principal indicateur utilisé pour caractériser le succès d’une transfusion de CG est le taux de GR transfusés

ayant survécu dans le corps du receveur 24 heures après la transfusion sanguine. Le taux de survie après 24

heures est inversement corrélé avec le temps d’entreposage et peut atteindre des valeurs d’environ 75%

après six semaines d’entreposage.5,39 C’est donc jusqu’à 25% d’un CG transfusé qui sera éliminé par le corps

dans les 24 premières heures suivant la transfusion. L’élimination de ces GR survient principalement par

érythrophagocytose ce qui s’explique par l’exposition accrue de facteurs de sénescence et l’altération de la

déformabilité des GR observés durant l’entreposage.39 Cette élimination rapide de GR peut causer une

surcharge de certains mécanismes de régulations du système circulatoire sanguin.40 Notamment, l’oxyde

nitrique permettant la vasodilatation de vaisseaux sanguins capillaires est accaparé par les microvésicules et

le fer mis en circulation par la transfusion et par l’élimination rapide des GR transfusés.5 De plus, la surcharge

du système d’élimination des GR causée par la transfusion induit le maintien en circulation de GR ayant une

déformabilité altérée.30 La capacité de vasodilatation amoindrie des capillaires et la circulation de GR ayant

une déformabilité altérée peuvent se traduire en un gain limité de la circulation sanguine capillaire à la suite

d’une transfusion et a un gain en Hb total moins important.41 Ces inconvénients peuvent s’accentuer chez les

17

individus devant recevoir plusieurs CG. Notamment, l’élimination accrue de GR peut provoquer une surcharge

du fer dans le sang ce qui peut devenir néfaste pour les organes.42

Les conséquences exactes de la transfusion de CG en fin d’entreposage restent nébuleuses. L’élimination

rapide de GR à la suite d’une transfusion est cependant un fait établi et il est probable que la déformabilité

altérée des GR en soit partiellement responsable. C’est pourquoi le suivi des propriétés de déformabilité des

GR lors de l’évaluation d’un nouveau procédé de séparation du sang total pourrait permettre aux banques de

sang de mieux caractériser les culots globulaires et ultimement d’améliorer la qualité du produit.

1.3 Méthodes de caractérisation des propriétés de déformabilité

des globules rouges

N’étant que survolées dans l’article (Chapitre 4), les différentes méthodes de mesure de la déformabilité des

GR sont ici reprises plus en détail, avec une attention particulière portée aux méthodes impliquant

l’exploitation de concepts microfluidiques. Les méthodes de mesure de la déformabilité des GR sont classées

comme étant des analyses unicellulaires, de masse (bulk analysis) ou unicellulaires à haut rendement. Le

premier cas de figure regroupe des méthodes visant à quantifier la capacité de déformabilité d’un seul GR à la

fois. Cela permet d’étudier la dynamique des membranes en mesurant, par exemple, l’effet d’une altération

chimique du milieu sur la membrane d’un GR. L’analyse de masse permet d’étudier le comportement général

d’un échantillon de sang ou de GR, et fournit une mesure unique par échantillon. L’analyse unicellulaire à haut

rendement regroupe les méthodes permettant d’effectuer une mesure des propriétés de déformabilité de

nombreux GR individuels à l’aide de systèmes automatisés. Elle permet ainsi l’obtention rapide de données

pour un nombre appréciable de GR (typiquement, n > 1000).

1.3.1 Méthodes d’analyse unicellulaire

Ces méthodes demandent beaucoup de temps et d’habiletés techniques en plus d’être difficilement adaptées

pour l’analyse de populations. Elles permettent toutefois de mesurer l’effet d’une modification précise de la

composition membranaire ou cytosquelettique dans le cadre d’étude plus fondamentale portant sur les GR.43

L’aspiration à la micropipette est l’une des premières méthodes ayant été utilisée pour quantifier la

déformabilité des GR (Figure 6A).44 Elle vise à aspirer partiellement ou complètement un GR pour en étudier

la dynamique membranaire. L’aspiration partielle ou complète s’effectue dans des micropipettes de 1 à 5 µm

de diamètre. D’autres applications consistent à mesurer le temps nécessaire pour qu’un GR retrouve sa forme

initiale après avoir été aspiré.

La méthode par pinces optiques combine la microscopie et la photonique. Généralement, deux billes sont

apposées de manière diamétralement opposée à la membrane d’un GR (Figure 6B).44 La première bille est

18

fixée à la lame et au GR alors que la seconde n’est fixée qu’au GR. Le champ magnétique induit par un laser

amovible permet de capturer et de déplacer la seconde bille de manière à étirer le GR. Le GR est étiré jusqu’à

ce qu’il cherche à reprendre sa forme initiale et que la force de traction induite par sa membrane et son

cytosquelette permette à la bille d’échapper au champ magnétique du laser. L’étirement maximal, mesuré par

microscopie optique, correspond à l’étirement du GR au moment où la bille s’échappe du champ magnétique

et permet l’étude comparative de l’étirement des GR.

Figure 6 – Méthodes de mesure unicellulaire de la déformabilité des GR. A) L’aspiration à la micropipette peut consister à mesurer la longueur de la protubérance qui pénètre dans l’embout de la micropipette sous différentes pressions négatives. B) Les pinces optiques permettent d’étirer mécaniquement le GR. L’étirement maximal est mesuré au moment où la tension membranaire force la bille à quitter l’emprise du faisceau optique. C) La microscopie de force atomique permet de mesurer en plusieurs points la force nécessaire pour déformer la membrane du GR. Figure 6.A adaptée de https://www.dovepress.com, 6.B adaptée de https://ars.els-cdn.com/ et 6.C adaptée de https://content.iospress.com/

La microscopie de force atomique est une méthode de mesure quantitative de déformation ciblée d’un

matériel ou d’une cellule telle qu’un GR (Figure 6C).44 Ce dernier est fixé sur une lame de laboratoire et est

sondé en plusieurs points par un système précis de détection composé d’un levier sondant le GR et d’un laser

dont l’angle de déviation est influencé par la réponse du levier à la déformabilité du GR. Cette méthode permet

19

d’obtenir de l’information au niveau unicellulaire, mais également de distinguer différentes parties de la

membrane d’un GR.

1.3.2 Méthode d’analyse de masse

La microfiltration est actuellement la seule véritable méthode d’analyse de masse. Plusieurs adaptations ont

été développées depuis son invention en 1976.45 Généralement, on mesure le temps de filtration d’un volume

précis d’échantillon de GR à un taux d’hématocrite prédéfini à travers un filtre de pores de diamètre inférieur à

celui des GR (3 ou 5 µm), sous une pression faible et constante. Cette mesure permet le calcul de l’indice de

déformabilité qui est défini comme le volume d’échantillon filtré par minute. La sensibilité du système est

grandement limitée par l’obstruction rapide du filtre lorsque la déformabilité des GR est altérée de manière

importante ce qui limite son utilité.46

1.3.3 L’analyse unicellulaire à haut rendement

Un rhéoscope se compose d’un microscope inversé muni d’une chambre rhéologique dans laquelle est

déposé un échantillon sanguin en suspension dans un milieu de viscosité importante.44 La chambre

rhéologique d’un premier modèle est représentée par deux plaques circulaires transparentes tournant en sens

opposés de manière à moduler la force de cisaillement (shear stress) désirée pouvant aller jusqu’à 30 Pa. Les

GR adoptent ainsi une conformation ellipsoïdale influencée par leur déformabilité. Un logiciel permet l’analyse

de l’indice d’élongation (EI) caractérisé par le rapport de la différence entre la longueur (a) et la largeur (b) sur

la somme de la longueur et de la largeur du GR :

EI =(𝑎 − 𝑏)

(𝑎 + 𝑏)

Les données d’EI proviennent de GR individuels et sont compilées en un graphique permettant d’apprécier la

distribution des valeurs. Il est ainsi possible, par exemple, de raisonner sur la valeur moyenne de déformabilité

entre un échantillon de GR en début et en fin d’entreposage. Celle-ci peut être due à une diminution modérée

des propriétés de déformabilité pour l’ensemble des GR ou une forte diminution pour une fraction de ceux-ci.

Ce type d’instrument peut servir d’outil diagnostique pour certaines pathologies sanguines puisque des GR en

forme de faucille (anémie falciforme) ou en forme d’ellipse (elliptocytose congénital) n‘auront pas l’alignement

de GR sains sous l’effet du cisaillement induit. D‘autres types de rhéoscopes utilisent un courant linéaire

appliqué à une chambre rhéologique en forme de corridor. Une mesure de la déformabilité est obtenue à l’aide

de la formule de mesure de l’EI. La principale limitation de ces méthodes est la mesure en deux dimensions

d’un phénomène qui se déroule en trois dimensions.46 La force de cisaillement induite permet donc d’observer

le déplacement de la membrane d’un GR sans toutefois donner d’information sur sa capacité à se déformer en

réponse à des forces externes complexes.

20

1.3.4 Méthodes d’analyse microfluidique

1.3.4.1 Fabrication de dispositifs microfluidiques

Les méthodes microfluidiques requièrent l’utilisation de dispositifs comprenant des canaux dont les

dimensions varient de trois à pas plus de quelques centaines de micromètres. Leur confection implique

l’utilisation de moules précis fabriqués par photolithographie (Figure 7).47 Lors de l'application de ce procédé,

une plaque recouverte d’une ou plusieurs couches de matière photosensible est exposée à une lumière filtrée

par un masque représentant le schéma microfluidique désiré. Le matériel photosensible se solidifie par

exposition à la lumière et la partie n’ayant pas été exposée peut être dissoute afin d’obtenir un moule du

schéma microfluidique aux dimensions voulues de précision micrométrique.

Figure 7 – Principe de la photolithographie. A) La lumière traverse un masque du réseau de microcanaux désirés. Une lentille permet de focaliser la lumière filtrée par le masque afin qu’elle atteigne un substrat placé à une distance déterminée. À l’aide de calculs mathématiques, il est possible d’obtenir une image aux dimensions précises sur le substrat. B) La lumière qui traverse le masque atteint la résine placée sur le substrat. Selon la nature photosensible ou photorésistante de la résine, il est possible d’imprimer le schéma ou l’inverse du schéma sur le substrat et ainsi obtenir un moule aux dimensions micrométriques. Figure 7A adaptée de https://www.quora.com/What-are-the-limitations-of-optical-lithography et Figure 7B adaptée de https://en.wikipedia.org/wiki/Photoresist.

Le polydimétylsiloxane (PDMS) est un composé liquide qui est versé sur le moule porteur du schéma

microfluidique. Les caractéristiques du PDMS, dont sa polymérisation par la chaleur, permettent le respect des

dimensions micrométriques du moule.48 Le dispositif obtenu est transparent et de dimensions stables sur un

vaste domaine de températures (T = -45 à T = 200 °C).49,50 Le composé de PDMS portant le moulage du

réseau de microcanaux est appelé « puce microfluidique ». La puce microfluidique est retirée du moule et

21

apposée sur une lame de microscope préalablement recouverte d’une fine couche de PDMS qui servira de

revêtement favorisant l’adhésion du réseau de microcanaux. En effet, aucun adhésif n’est nécessaire puisque

la fonctionnalisation de la surface de la lame et de la puce par un traitement au plasma d’oxygène permet

d’obtenir deux surfaces fortement polarisées qui adhèrent ensemble.51 La transparence du PDMS permet le

suivi par microscopie du comportement de cellules circulant à travers le réseau de microcanaux. C’est la

simplicité du procédé de fabrication des puces de PDMS qui, entre autres, a mené au développement de

diverses méthodes microfluidiques pour l’analyse des propriétés de déformabilité des GR. Celles rapportées

dans la littérature sont des méthodes d’analyses unicellulaires à haut rendement, et seront décrites plus en

détail pour favoriser la compréhension du caractère unique du dispositif « Microvascular Analyzer » (MVA)

développé dans le cadre de ce projet.

1.3.4.2 Mesure de la déformation en parachute

Deux méthodes similaires développées par Sun Y. et coll.52 et par Cluitmans et coll.53 permettent d’observer la

transition de passage des GR entre deux chambres vastes séparées par un canal de 8 µm de large pour la

première étude et de 7 µm de large pour la seconde (Figure 8).

Figure 8 – Réseaux de déformation en parachute. A) Configuration du réseau microfluidique développé par Sun et coll.52 Bien que le schéma ne soit pas présenté dans son ensemble, il est possible d’apprécier le système permettant la circulation du GR et la mesure des paramètres D et L qui représentent respectivement la largeur et la longueur du GR tel que décrit dans la formule de calcul du DI. Les canaux perpendiculaires au canal de perfusion horizontal induisent un courant incitant l’alignement du GR au centre du canal. B) Configuration du réseau microfluidique développé par Cluitmans et coll.53 La principale différence avec le premier dispositif réside dans l’absence de canaux d’alignement. Les paramètres de mesures B et A correspondent respectivement à la largeur et la longueur tel que décrit dans la formule de calcul du DI.

22

Pour ces deux systèmes, la circulation est induite par un système de pompe mécanique. Pendant son

passage dans le canal, un GR adopte une forme de parachute. Un logiciel mesure la largeur et la longueur du

GR déformé de manière à calculer son indice de déformabilité (deformability index, DI) où :

𝐷𝐼 =Largeur (µm)

Longueur (µm)

Après sa transition dans le canal, le GR se retrouve dans une seconde chambre vaste où il peut reprendre sa

forme initiale. En plus du DI, l’intervalle de temps nécessaire aux GR pour retrouver leur forme à la sortie du

canal est mesuré. Ces méthodes furent utilisées lors du suivi hebdomadaire de CG entreposés pendant huit et

cinq semaines dans les mêmes conditions que celles retrouvées chez Héma-Québec (T = 2-8 °C, dispersé en

solution nutritive SAGM).52,53

Les deux études concluent que les DI mesurées en début et en fin d’entreposage n’indiquent pas de

changement significatif des propriétés de déformabilité des GR. Il est toutefois stipulé dans l’étude de Sun et

coll. que le temps de recouvrement de la forme initiale est affecté par l’entreposage et pose l’hypothèse d’un

lien possible entre cette caractéristique et la diminution des réserves d’ATP des GR qui ne suffiraient plus à

maintenir l’intégrité du cytosquelette. La déformabilité d’un GR est intrinsèquement liée à sa capacité à

répondre à un stress environnemental par un changement de forme rapide. Cette fluidité de forme, qu’elle soit

au moment de la déformation ou au moment du retour à la forme initiale, devrait être considérée comme une

mesure de la déformabilité en soit. La conclusion d’une absence d’altération de la déformabilité des GR sur la

base des DI mesurées sans considérations équivalentes pour le temps de recouvrement manque de support

scientifique. Il aurait peut-être été plus pertinent de considérer le temps nécessaire à l’adoption de la forme

parachute dont il est question dans la méthode, ce qui n’a pas été possible en raison de l’étape d’alignement

du GR au centre du canal susceptible de biaiser une telle mesure. Cet alignement est toutefois nécessaire

puisqu’un GR circulant trop près de la paroi a tendance à se déformer de manière asymétrique invalidant la

mesure de DI. Sun et coll. rapportent qu’un certain nombre de GR ne répondent pas aux manœuvres

d’alignement. Bien que la proportion exacte ne soit pas mentionnée, les figures permettent d’estimer qu’un

peu plus de 20% des GR auraient circulé au niveau du canal avec un mauvais alignement, prévenant la prise

de mesures. Cluitmans et coll. rapportent également avoir exclu de l’analyse les GR circulant aux abords du

canal. Cette omission systématique des GR mal alignés pose évidemment problème pour la technique

analytique. Un CG est composé de GR hétérogènes, signifiant qu’une petite fraction de GR est davantage

altérée que le reste de la population. Il est impossible de statuer sur l’âge ou l’état des GR qui ont été

systématiquement exclus des résultats. Cependant, il ne peut être omis que les GR rejetés puissent partager

certaines caractéristiques communes. Un GR dont la déformabilité est altérée aura tendance à se comporter

23

comme un corps solide longeant les parois ce qui peut avoir des impacts par rapport à leur positionnement au

niveau du canal.54 De ce fait, il est envisageable que les GR ayant été exclus de l’analyse soient ceux dont la

déformabilité ait été plus altérée. Une telle situation nuirait grandement à la puissance analytique de ces

méthodes et pourrait mener à des conclusions erronées concernant l’altération des propriétés de déformabilité

des GR durant l’entreposage. De plus, l’analyse en deux dimensions d’une propriété influençant la forme d’un

GR sur trois dimensions a fait l’objet de critiques lors d’évaluations de méthodes impliquant des procédés

rhéologiques semblables.44

1.3.4.3 Mesure de la vitesse de déplacement : Goulots d’étranglement

La technologie microfluidique utilisée par Han et coll.55 se présente comme un large canal dans lequel se

trouve une succession de goulots d’étranglement (d = 3 µm) distribués uniformément sur la longueur et la

largeur du canal (Figure 9). Le faible taux d’hématocrite (Htc) des échantillons de GR utilisés avec cette

méthode permet d’observer et de mesurer la vitesse de transition de GR soumis à des déformations

successives. Le système de pression utilisé pour induire le déplacement au niveau des canaux n’est toutefois

pas précisé. Cette méthode a été utilisée pour caractériser hebdomadairement la déformabilité de trois CG

durant leur entreposage.56 Les résultats suggèrent une altération significative des propriétés de déformabilité

entre la troisième et quatrième semaine d’entreposage. Comme la méthode de séparation des composants de

sang total et la solution nutritive pour la suspension des CG ne sont pas précisées, il devient difficile de

comparer les résultats de l’étude avec les autres de la littérature. L’une des forces de cette méthode réside

dans la mesure de la vitesse de déplacement qui semble directement influencée par la déformabilité du GR.