doctorat de l'universitÉ de toulouse · 2019. 5. 14. · systèmes naisseur-engraisseur et...
TRANSCRIPT
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSEDélivré par :
Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse INP)Discipline ou spécialité :
Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition
Présentée et soutenue par :M. ELIAS SALEM
le mercredi 24 octobre 2018
Titre :
Unité de recherche :
Ecole doctorale :
Bronchopneumonies infectieuses des jeunes bovins: de la complexité dumicrobiome aux particularités évolutives et cliniques de virus respiratoires
encore méconnus.
Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
Interactions Hôtes - Agents Pathogènes (IHAP)Directeur(s) de Thèse :
M. GILLES MEYERMME MARIETTE DUCATEZ
Rapporteurs :M. ETIENNE THIRY, UNIVERSITE DE LIEGE
Mme CAROLINE LEROUX, INRA LYON
Membre(s) du jury :Mme CAROLINE LEROUX, UNIVERSITE LYON 1, Président
M. GILLES MEYER, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, MembreMme CECILE MALNOU, UNIVERSITE TOULOUSE 3, Membre
Mme GAELLE SIMON, ANSES, MembreMme MARIETTE DUCATEZ, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, Membre
TABLE DES MATIERES Table des matières .......................................................................................... i
Liste des figures ............................................................................................. iv
Liste des tableaux .......................................................................................... iv
Liste des abréviations ..................................................................................... v
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................... 1
Les bronchopneumonies infectieuses chez les bovins : définition et I. importance
2
1. Définition .............................................................................................. 2
2. Importance des BPI ............................................................................. 4
Les agents pathogènes respiratoires bovins ....................................... 8II.
1. Fréquence des agents infectieux ......................................................... 8
2. Pouvoir pathogène des principales bactéries .................................... 13
3. Pouvoir pathogène des principaux virus ............................................ 17
4. Interactions entre agents pathogènes respiratoires ........................... 23
Identification de nouveaux agents pathogènes respiratoires ............. 29III.
1. Notions sur les maladies émergentes chez l’homme ......................... 29
2. Les nouvelles méthodes pour identifier de « nouveaux » agents
pathogènes 33
IV.
de type D
Les « nouveaux » virus respiratoires bovins : cas de l’influenzavirus
38
1. Historique des infections à virus influenza A (IAV) chez les bovins ... 38
2. Découverte d’un nouveau virus influenza de type D chez les bovins 41
3. Propriétés générales des virus Influenza D ....................................... 42
4. Réservoir, spectre d’hôte et pouvoir pathogène ................................ 46
Environnement microbien et pathologie respiratoire .......................... 52V.
1. La notion de microbiote ..................................................................... 52
2. Le microbiote respiratoire de l’homme ............................................... 57
3. Interactions microbiome et agents pathogènes : le pathobiome ........ 64
4. Microbiome et pathobiome respiratoire bovin .................................... 66
DESCRIPTION DES TRAVAUX DE RECHERCHE ..................................... 77
Chapitre I : Identification des virus respiratoires bovins ............................... 78
Introduction et connaissances actuelles ............................................ 78I.
II. Détection des virus respiratoires par approche NGS chez des veaux
affectés par la bronchopneumonie infectieuse ...................................................... 81
1. Matériel et Méthodes ......................................................................... 81
2. Résultats ............................................................................................ 86
III. Caractérisation génétique des coronavirus bovins : évolution et
épidémiologie moléculaire ..................................................................................... 96
Article : « Global transmission, spatial segregation and recombination
determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses » . 97
Chapitre 2 : Identification et caractérisation du bactériote respiratoire bovin
............................................................................................................................... 132
Introduction ...................................................................................... 132I.
II. Article : « Microbial ecology of the upper and lower respiratory tract in
calves: interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia » ................ 136
Chapitre 3 : l’influenzavirus de type D : répartition géographique et pouvoir
pathogène ............................................................................................................... 176
Introduction ...................................................................................... 176I.
II. Article : « Serologic evidence for influenza C and D virus among
ruminants and Camelids, Africa, 1991-2015 » ..................................................... 178
III. Article : « Pathogenesis, host innate immune response and aerosol
transmission of influenza D virus in cattle » ......................................................... 184
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...................................... 229
BIBLIOGRAPHIE ....................................................................................... 243
ANNEXES .................................................................................................. 293
Résultats détaillés du virome respiratoire ........................................ 293I.
LISTE DES FIGURES Figure 1 : Arbre de décision sur l'émergence des maladies et agents
pathogènes. .............................................................................................................. 32
Figure 2 : Représentation schématique d’un virus de type influenza D ....... 43
Figure 3 : Virus influenza D (C/OK) en microscopie électronique ................ 43
Figure 4 : Le génome du virus influenza D .................................................. 44
Figure 5 : Chronologie des études sur les communautés microbiennes ...... 58
Figure 6 : Evolution du nombre d’études sur le microbiome respiratoire ..... 59
Figure 7 : Résistance de colonisation .......................................................... 66
Figure 8 : Représentation du processus de préparation des échantillons pour
le séquençage NGS métagénomique du virome respiratoire. .................................. 85
LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Pouvoir pathogène des différents agents respiratoires bovins
démontré lors d’infections expérimentales. ............................................................... 13
Tableau 2 : Abondances relatives trouvées dans les poumons et les nœuds
lymphatiques (NL) .................................................................................................... 71
Tableau 3 : Résultats de détection des 7 agents pathogènes respiratoires
dans les prélèvements respiratoires avec le LSI vetmax screening kit. .................... 88
Tableau 4 : Détection des principaux virus par NGS .................................. 89
Tableau 5 : Correspondance entre la détection par RT-qPCR et le
séquençage NGS. .................................................................................................... 89
Tableau 6: Résultats détaillés du virome respiratoire ................................ 293
LISTE DES ABREVIATIONS ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
ARN : acide ribonucléique
ARNr : acide ribonucléique ribosomique
ATT : aspiration trans-trachéale
BAAV : bovine associated adenovirus
BAD3 : bovine adenovirus type 3
BAT2 : bovine alveolar type 2 epithelial cells
BAV : bovine astrovirus
BRV : bovine rhinitis virus
BCOV : bovine coronavirus
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
BOHV1: bovine herpesvirus type 1
BoNV : bovine nidovirus
BPI : bronchopneumonie infectieuse
BPI3 : bovine parainfluenza virus type 3
BPV : bovine parvovirus
BRAV : bovine rhinitis virus type A
BRBV : bovine rhinitis virus type B
BRSV : bovine respiratory synctial virus
BVDV : bovine viral diarrhea virus
BWA : burrows-wheeler aligner
CAR : Cilia-associated respiratory bacterium
CFU : colony forming unit
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
cp : cytopathogène
Cq : cycle de quantification
ECP : effet cytopathique
ENP : écouvillon nasal profond
FISH : fluorescence in situ hybridization
GAAS : genome relative abundance and average size
Gb : gigabase
H. s : Histphilus somni
HCoV : human coronavirus
HEF : hemagglutinine ésterase fusion
HRT 18G : human rectal tumor
IAV : influenza A virus
IbpA : immunoglobulin binding protein type A
IBR : infectious bovine rhinotracheatis
IBV : influenza B virus
ICV : influenza C virus
IDV : influenza D virus
IFHI1 : interferon induced with helicase C domain 1
IFNγ : interferon gamma
IGV : integrative genomics viewer
IHA : l’inhibition de l’hémagglutination
IL-10 : interleukine 10
IL-12 : interleukine 12
IL-1β : interleukine 1 beta
IL-4 : interleukine 4
ISG15 : Interferon-stimulated gene 15
LEfSe : Linear Discriminant Analysis using effect size
LBA : lavage broncho-alvéolaire
LDA : laboratoire départemental d’analyse
LPS : lipopolysaccharide
M : protéine de matrice
M. b : Mycoplasma bovis
M. h : Mannheimia haemolytica
ME : microscopie électronique
MERS : middle-east respiratory syndrome
mmp1 et mmp3 : métalloprotéases matricielles
NCBI : national center for biotechnology information
ncp : non cythopathogènes
NGS : nouvelles générations de séquençage
NL : nœud lymphatique
NP : nucléoprotéine
Npro : non functional protein
NS1 : protéine non-structurale
nt : nucléotide
ONT : Oxford nanopore technologies
P. m : pasteurella multocida
PA : protéine acide
pb : paire de bases
PB1 : polymérase basique 1
PB2 : polymérase basique 2
PCR : polymerase chain reaction
pH : potentiel hydrogène
qPCR : quantitative PCR
RSAD2 : Radical S-Adenosyl Methionine Domain Containing 2
RT-qPCR : real-time quantitative PCR
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline
SARS : severe acute respiratory syndrome
SBV : Shmallenberg virus
ST : swine testis
TCID : tissue culture infectious dose
TGS : third generation sequencing
TNFα : tumor necrosis factor alpha
VIP : virus identification pipeline
1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2
Les bronchopneumonies infectieuses chez les I.
bovins : définition et importance
1. Définition
Le terme « bronchopneumonie infectieuse » (BPI) désigne une affection
de l’appareil respiratoire profond des bovins, à caractère contagieux, qui survient
essentiellement chez les jeunes bovins. Ces affections se traduisent cliniquement
par l’apparition brutale de fièvre, d’une baisse de l’état général, d’une perte
d’appétit plus ou moins marquée, d’un jetage séro-muqueux, d’une toux forte et
sèche, de tachypnée et de dyspnée.
Les principales catégories d’animaux touchés sont d’une part les veaux
durant les premiers mois de vie dans les élevages naisseurs, et d’autre part les
jeunes bovins dans les ateliers d’engraissement suite à l’allotissement d’animaux
provenant de différentes exploitations. Les génisses laitières peuvent également
être touchées durant leurs premières années de vie.
L’étiologie des BPI est souvent multifactorielle, elle met en cause des
agents infectieux comme des bactéries, virus ou parasites, et également des
facteurs de risques liés à la conduite d’élevage et à l’environnement.
Des facteurs anatomiques, propres au bovin, le rendent plus sensible aux
affections respiratoires (1). La faible surface des échanges gazeux et l’absence de
ventilation collatérale, entraînent un coût énergétique élevé de leur respiration et
une réserve ventilatoire restreinte. Ces phénomènes sont aggravés chez les races
à viande du fait de leur masse musculaire plus importante.
A ceci s’ajoutent le plus souvent des facteurs de risque propres à chaque
élevage. Souvent, les conditions d’ambiance lors de la mise en stabulation
favorisent le développement des maladies respiratoires. En effet, une densité trop
importante, une mauvaise ventilation, une mauvaise régulation de la température
comme de l’hygrométrie, sont des facteurs prédisposant aux BPI (1). La conduite
d’élevage peut également être un facteur déclenchant ou aggravant : le mélange
des âges, les vêlages groupés, l’alimentation non adaptée, un statut immunitaire
3
défavorable, la circulation du virus immunomodulateur de la BVD (Bovine Viral
Diarrhea), sont des exemples. Dans les systèmes d’engraissement les plus
industrialisés (broutards et veaux de boucherie), les facteurs de stress et le
rassemblement d’animaux de statuts et de provenances différents sont des
éléments favorisants les BPI. Le sevrage, le transport, la transition alimentaire,
ainsi que l’allotissement sont bien souvent en lien avec l’apparition de nombreuses
pathologies dont les BPI (1–3).
A la naissance le veau naît agammaglobulinémique. Son système
immunitaire est encore non totalement fonctionnel. Le complément est
opérationnel à 20% le premier jour après le vêlage, l’activité des neutrophiles et
des cellules NK (natural killer) est totalement fonctionnel entre 2 et 5 mois (4,5).
Les lymphocytes B, quant à eux, sont très réduits à la naissance et augmentent en
fraction pour atteindre les 20% de la composition des lymphocytes totaux à l’âge
de 6 à 8 semaines. Les taux des immunoglobulines IgA, IgG1 et IgG2 n’atteignent
des concentrations protectrices qu’entre 16 à 32 jours d’âge (4,5). Pendant les
premières semaines de vie l’immunité du veau est donc essentiellement apportée
par l’immunité maternelle colostrale. On comprend alors aisément l’importance du
transfert colostral pour assurer une protection des jeunes veaux contre les
infections respiratoires.
Dans un élevage les BPI peuvent évoluer sous différentes formes
épidémiologiques : épizootique, enzootique ou sporadique. Le plus souvent, la
maladie débute dans un cheptel par une phase épizootique avec une morbidité
élevée et une mortalité allant de 5 à 10%. Cette phase peut être consécutive à un
changement de la conduite d’élevage, à des conditions climatiques défavorables,
ou à un rassemblement de bovins d’origines différentes au sein d’une exploitation.
Suite à cette phase, la maladie peut prendre une allure enzootique avec une faible
morbidité et une faible mortalité, d’autant plus que les conditions d’élevage ne sont
pas maîtrisées. L’incidence progresse alors lorsque la densité d’animaux dans un
atelier augmente. Si les conditions environnementales sont peu favorables au
développement d’infections respiratoires (bâtiment et conduite d’élevage
maîtrisées), la maladie, lorsqu’elle survient, peut ne revêtir qu’un caractère
sporadique.
4
2. Importance des BPI
Importance Médicale a.
Les BPI, avec les entérites infectieuses, sont responsables de la grande
majorité des mortalités observées chez le veau. Chez les jeunes bovins à
l’engraissement elles représentent le principal handicap économique dans ces
filières. L’importance médicale est avant tout liée à l’impact possible de la mortalité
(jusqu’à 20% dans certains lots) mais aussi aux signes cliniques (dyspnée,
inappétence, abattement) à l’origine de retards de croissance.
Dans le système naisseur des Pays de la Loire, le taux d’incidence des
BPI a été estimé à 2,5 cas /veaux-jours à risque, soit environ 24 animaux traités
pour 100 veaux (6). Les taux de létalité et de retard de croissance étaient
respectivement de 6% et de 2,7% chez les animaux traités (6). Les BPI sont des
pathologies majeures en engraissement de jeunes bovins. En 2008, dans les
systèmes naisseur-engraisseur et engraisseur spécialisés du Pays de la Loire, le
taux de morbidité pour les troubles respiratoires était de 18,1% sur les jeunes
bovins mis en lot et 22% des lots avaient au moins 4 jeunes bovins atteints (7).
Une autre étude a montré que 2,81% des jeunes bovins saisis à l’abattoir (saisie
partielle ou totale) l’étaient pour motif de BPI (8). Enfin, chez les génisses laitières
de renouvellement, les pathologies respiratoires représenteraient 20 à 30% des
mortalités, le plus souvent vers l’âge de 6 semaines.
L’impact médical est en partie lié au fait que les bovins sont
anatomiquement et physiologiquement mal équipés pour répondre à un processus
pathologique respiratoire. Les bovins ont des poumons de faible volume (environ
12 litres/500 kg) comparé au volume d'un cheval (42 L). Leurs poumons sont en
outre fortement compartimentés et leur surface d'échanges gazeux est faible par
rapport à la masse musculaire de l'animal. Cette compartimentation pulmonaire
prédispose à l’hypoxie voire à l’anoxie périphérique lorsque les conduits aérifères
sont obstrués. Il en résulte dans la région lésée une accumulation et une
multiplication d’éventuels agents infectieux.
5
La trachée des bovins est de faible diamètre (environ 3 cm pour un bovin
de 400 kg) comparé à d’autres espèces du même gabarit. Cela impose une
vitesse de l’air plus élevée qui contribue à l’imprégnation de l’épithélium trachéal
par les éléments contaminants de l’air mais aussi une respiration plus profonde
qui augmente la pénétration de particules.
En ce qui concerne l’appareil respiratoire profond, les bovins possèdent
peu de macrophages dans la lumière alvéolaire. De plus, les lobes crâniaux étant
moins bien irrigués, ils seraient également moins bien oxygénés, ce qui
entraînerait une baisse de l’activité phagocytaire des macrophages alvéolaires et
un ralentissement du pouvoir d’élimination des agents infectieux dans ces zones.
Les bovins présentent donc un certain nombre de particularités
anatomiques qui les rendent particulièrement sensibles aux infections
respiratoires, notamment les jeunes animaux de moins de 6 mois.
Importance Economique b.
Les BPI ont un impact économique considérable. La filière viande bovine
est handicapée par les pertes économiques résultant des mortalités, des baisses
de performance des animaux atteints, du coût des traitements et de la non-valeur
économique de certains animaux. Une pathologie respiratoire durant la période
néonatale entraîne un poids au sevrage inférieur de 16.5 kg comparé aux animaux
sains (9). En France, les BPI sont la principale cause de mortalité des veaux après
le premier mois de vie dans les élevages de bovins allaitants (10).
Dans les ateliers d’engraissement, les BPI constituent une préoccupation
majeure pour l’état de santé et la performance économique globale du troupeau.
En effet, le taux de létalité sur des animaux atteints de BPI peut aller jusqu’à 9,5%
(11). Cette mortalité due aux BPI représente jusqu’à 60% de la mortalité en atelier
d’engraissement. L’une des conséquences de la maladie est la diminution du gain
moyen quotidien associé à une diminution du poids de carcasse et à un
allongement de la durée de l’engraissement, ce qui entraîne des pertes
économiques. Pour exemple dans les ateliers d’engraissement des Pays de Loire,
6
le coût des BPI varie entre 8 et 83 euros/animal selon les taux de mortalité et de
morbidité (12).
En élevage laitier, l’impact négatif des BPI sur la croissance des génisses
conduit à des baisses de performance de reproduction, des baisses de production
laitière en première lactation et à une diminution de la longévité des animaux (13).
Impact Sanitaire c.
Les BPI ont une importance sanitaire car le traitement de ces affections
fait appel à l’utilisation d’antibiotiques de façon plus ou moins systématique. En
effet, lorsque des jeunes bovins sont atteints de troubles respiratoires, un
antibiotique est le plus souvent utilisé pour lutter contre l’infection bactérienne ou
pour la prévenir lors d’infections virales. De plus, en fonction de la gravité et du
nombre d’animaux touchés, c’est souvent l’ensemble d’un lot qui est mis sous
traitement et pas seulement les animaux qui présentent des signes cliniques.
Cette pratique, appelée métaphylaxie, a pour objectif de traiter les malades et de
prévenir la maladie chez les animaux encore non affectés, surtout quand la
détection est difficile. Autrefois les antibiotiques pouvaient aussi être utilisés à titre
préventif lors des périodes à risque telles que les rassemblements de jeunes
bovins. Ce genre de pratiques, susceptible de favoriser l’émergence
d’antibiorésistance (14,15), est aujourd’hui interdit.
Outre l’utilisation importante d’antibiotiques, le problème se posait aussi
jusqu’il y a deux ans en terme de qualité, notamment de familles d’antibiotiques
utilisés. Jusqu’en 2015 étaient en effet principalement utilisés des macrolides, des
fluoroquinolones de 3e génération et des céphalosporines de 3e génération. Les
deux dernières familles appartiennent à des familles d’antibiotiques dits
« critiques », antibiotiques à utiliser préférentiellement chez l’homme. Ces
molécules de dernière génération montrent une grande efficacité pour lutter contre
les surinfections bactériennes, mais leur utilisation est depuis peu très
règlementée en médecine vétérinaire pour limiter l’apparition de résistances. Elles
ne sont maintenant autorisées qu’en seconde intention lorsque la bactérie
responsable de BPI a été clairement identifiée et qu’elle présente des résistances
aux autres antibiotiques. Selon l’Agence nationale de sécurité du médicament et
7
des produits de santé (ANSM), la définition des antibiotiques critiques repose sur
la notion de pression de sélection et sur l’intérêt en dernier recours (16). Donc les
antibiotiques « critiques » sont catégorisé soit 1- comme étant particulièrement
générateurs de résistances : les associations amoxicilline-acide clavulanique, les
céphalosporines, les fluoroquinolones, et la témocilline, soit 2- étant de dernier
recours (la daptomycine, les glycopeptides, la linézolide, la tédizolide, la colistine
injectable, les pénèmes, les phénicolés, la tigécycline, et la fosfomycine
injectable). Ce contexte de réduction de l’utilisation des antibiotiques (plan
Ecoantibio) et les législations récentes qui s’y réfèrent, ont incité les décideurs à
développer des projets de recherche et des modalités nouvelles de gestion autour
des agents infectieux responsables de BPI. L’objectif est d’une part de développer
des mesures préventives (vaccination, augmentation de la robustesse des
animaux, aménagement des bâtiments, changement des pratiques d’élevage…) et
d’autre part de choisir le meilleur protocole thérapeutique en cas de maladie (choix
de la molécule, de la dose, de la voie d’inoculation…).
8
Les agents pathogènes respiratoires bovins II.
Même si les BPI font intervenir des facteurs liés à l’élevage et l’hôte, il
n’en reste pas moins que se sont les agents infectieux qui sont responsables du
déclenchement et de la sévérité de la maladie. Là encore la situation est complexe
car seulement dans un tiers des cas environ la maladie est due à un seul agent
(bactérie, virus ou parasite) alors que dans 2/3 des cas, il s’agit d’une association
virus/bactérie ou virus/virus, voir même bactérie/bactérie. De plus les techniques
récentes d’identification de virus et bactéries permettent de découvrir de nouveaux
agents potentiels. Dans ce paragraphe nous aborderons les principaux
pathogènes connus puis nous traiterons des connaissances actuelles sur les co-
infections lors de BPI et nous terminerons par les données actuelles sur les
nouveaux agents infectieux potentiellement impliqués dans les BPI.
1. Fréquence des agents infectieux
Les principaux agents pathogènes impliqués dans BPI sont décrits dans le
tableau 1. Leurs implications reposent sur les données d’études épidémiologiques
et de reproduction expérimentale de la maladie.
Quatre bactéries sont plus communément impliquées dans les BPI, il
s’agit de Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni et
Mycoplasma bovis (Tableau 2). Les trois premières appartiennent à la famille des
Pasteurellaceae. La prévalence de M. haemolytica et P. multocida en France est
importante. La relation causale avec les BPI est plus complexe à établir car ces
bactéries sont présentes dans le nasopharynx des jeunes bovins sains. La
présence de M. haemolytica est probablement importante dans le système
« jeunes bovins en lot » (17). En France, en 2011, un suivi régulier de 112 jeunes
bovins charolais provenant de 43 fermes a permis d’étudier l’impact de M.
haemolytica lors des épisodes de bronchopneumonie pendant la première phase
d’engraissement. Au total, 75 jeunes bovins présentaient au moins une aspiration
transtrachéale (ATT) positive pour M. haemolytica durant toute période d’étude.
Quasiment tous les épisodes de pneumonie étaient associés à la présence de la
9
pasteurelle (14/16) avec toutefois une prévalence individuelle très variable (0-
89%) (18).
Les pasteurelloses sont également importantes chez les animaux non
sevrés. Une étude réalisée sur 133 veaux provenant de plusieurs départements
français met en évidence une prévalence de 28% pour M. haemolytica contre une
prévalence de plus de 60% pour P. multocida (19). Si P. multocida est la plus
fréquemment détectée, elle l’est en grande majorité en association avec d’autres
pathogènes (74% des prélèvements possédant plusieurs agents pathogènes). En
Europe ces deux bactéries sont ubiquistes. Dans une étude finlandaise, 34% des
veaux laitiers mis en lot entre 5 jours et 1 mois d’âge, et affichant des signes
cliniques respiratoires, étaient positifs à P. multocida sur des lavages trachéaux.
La bactérie a été isolée dans environ 70 % des lots présentant un à plusieurs
animaux malades (20). Son rôle dans les BPI reste discuté car elle n’est
significativement associée à des signes cliniques que lorsque le prélèvement est
poly-infecté.
En Ecosse, 17% des veaux (n= 616 veaux) possèdent M. haemolytica
dans les cavités nasales avec une prévalence nettement plus élevée dans les
cheptels laitiers, 26%, contre 9% dans les cheptels allaitants (21). Dans une étude
danoise réalisée chez des veaux laitiers de moins de 4 mois pendant un épisode
de BPI, P. multocida, H. somni et M. haemolytica ont été trouvées respectivement
chez 48%, 20% et 23% des veaux sains alors que quasiment tous les veaux
malades présentaient une culture ou une PCR positive pour deux agents
pathogènes ou plus (97% avec 2 espèces bactériennes ou plus ; 3% avec une
seule espèce bactérienne), avec une fréquence d’isolement de 82%, 41% et 29 %
respectivement pour P. multocida, H. somni et M. haemolytica (22). Lorsqu’on
s’intéresse au système « veaux de boucherie », l’étude réalisée par Pardon en
2010 recense 24 épisodes de pneumonie (240 veaux) avec des prévalences
quasi-similaires pour les deux types de pasteurelles : 21,3% pour M. haemolytica
et 22,1% pour P. multocida (23). L’ensemble de ces études suggère que la
présence de P. multocida et M. haemolytica semble être un facteur de risque
supplémentaire de BPI puisqu’elles sont fréquemment isolées lors d’épisodes
cliniques, que ce soit seules ou en association (19,20,22).
10
En ce qui concerne H. somni, sa prévalence a surtout été étudiée en
Amérique du Nord. En Ontario, Gagea (2006) a mis en évidence H. somni dans 16
% (14/86) des poumons de bovins présentant des lésions pulmonaires (86/99),
avec une association avec P. multocida et/ou M. haemolytica dans plus de 50%
des cas (24). En Europe H. somni a été détectée au Danemark par culture ou
PCR sur ATT chez 20% des animaux sains et 41% des animaux malades (22) et
en Finlande chez 0,5% des veaux (396 veaux laitiers) dans 5% des cheptels (20).
En France, Tessier révèle une prévalence apparente globale de 30% par analyse
PCR (133 veaux non sevrés). Entre 2006 et 2010, le laboratoire départemental
d’analyse de Haute-Saône (LDA 71) a réalisé une large enquête et estime la
prévalence d’H. somni dans les pathologies respiratoires (tous prélèvements
confondus) à environ 2,5% par méthode classique de bactériologie et à 18% par
PCR (25).
Pour les mycoplasmes, le réseau d’épidémio-surveillance (VIGIMYC) a
montré que M. bovis est le mycoplasme le plus fréquemment isolé avec plus de
55% des isolats mycoplasmiques reçus (541/902) sur des prélèvements le plus
souvent respiratoires (83%) (26). Une autre enquête sérologique réalisée à
l’échelle nationale sur 824 cheptels choisis au hasard (32 197 animaux de plus
d’un an) met en évidence pour M. bovis une prévalence cheptel de 28 à 30 % et
une prévalence individuelle de 2 à 13% (27). Ces résultats sont conformes à ceux
obtenus en Angleterre entre 1990 et 2000 avec une séroprévalence de 22%. M.
bovis est fréquemment associé à d’autres mycoplasmes ou à d’autres agents
bactériens lors d’épisodes de BPI : il est isolé dans 57% des poumons positifs
pour P. multocida ou M. haemolytica contre 10% des poumons positifs au virus
respiratoire syncytial bovin BRSV (pour Bovine Respiratory Syncytial virus) (28) ; il
est associé à d’autres bactéries dans 81% des lavages broncho-alvéolaires (LBA)
positifs à M. bovis (29). Enfin, les pneumonies à M. bovis se rencontrent
majoritairement dans les élevages en lots (jeunes bovins et veaux de boucherie),
où les animaux proviennent de cheptels différents. Des études montrent
l’importance de ce mycoplasme lors de mise en lots de veaux non sevrés puisqu’il
est le pathogène le plus fréquemment isolé avec plus de 70% des échantillons
positifs (23,29).
11
Quant aux virus, les plus connus sont l’herpès virus bovin de type 1
(BoHV-1 pour Bovine Herpesvirus 1), le virus respiratoire syncytial bovin (BRSV),
le virus parainfluenza 3 bovin (BPI3 pour Bovine Parainfluenza Virus type 3) mais
depuis quelques années d’autres virus ont été incriminés tels que le coronavirus
bovin (BCoV pour Bovine Coronavirus) et les adénovirus bovins (BAV pour Bovine
Adenovirus). Globalement, les infections à virus respiratoires sont fréquentes chez
les jeunes bovins, au moins pour le BRSV et le BPI3, comme en témoigne la forte
séroprévalence des troupeaux en Europe. En 2010, la prévalence des infections à
BRSV en Suède dans le cheptel bovin viande variait, selon la densité des animaux
et les régions, entre 8 et 70%. La prévalence du BCoV était plus faible mais variait
parallèlement à celle du BRSV (30). En élevage laitier, sur 59 élevages testés en
Italie, au moins une vache séropositive au BRSV était présente dans tous les
élevages (31). Dans 25% des élevages, tous les individus testés étaient
séropositifs. En Norvège, la prévalence chez les veaux de plus de 5 mois dans les
élevages laitiers a été estimée en 2009 à 50.2%, 39.3% et 31.2%, pour les virus
BPI3, BCoV et BRSV, respectivement (32). En France toujours, les infections à
BRSV et BPI3 sont considérées comme fréquentes, les séroprévalences étant
estimées entre 60 et 70% avant 3 ans. En France la prévalence nationale
moyenne d’ateliers infectés par la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR pour
Infectious Bovine Rhinotracheitis) avoisine les 10-11% selon les années avec une
prévalence plus importante en atelier allaitant qu’en atelier laitier. Toutefois des
variations importantes existent entre les départements, la prévalence des ateliers
infectés variant de 0,06 % à 85,2 %.
Les données de prévalence des virus lors d’affections respiratoires
cliniques diffèrent selon les études, qui soulignent l’impact des techniques
analytiques sur les résultats et une probable diversité attribuable, a minima, aux
facteurs géographiques. Le BRSV est l’agent viral le plus fréquemment isolé à
partir du poumon de veaux morts de troubles respiratoires. En élevage laitier, le
BRSV serait associé aux troubles respiratoires dans 60 % à 70% des élevages au
Danemark, aux Etats-Unis, en Suède et aux Pays Bas. En élevage allaitant ou en
production de viande, le BRSV semble responsable de 16 à 71 % des troubles
respiratoires selon les études. Plus le nombre de cheptels impliqués est élevé,
12
plus le risque relatif est important. En France, une étude menée à la fin des
années 1990 a permis d’identifier une cause infectieuse dans 65,4% des cas de
BPI chez des veaux (33). Un virus était présent, seul ou en association avec une
bactérie dans 52,4 % des cas et parmi les virus, l’infection par le BRSV était
dominante. En élevage de veaux de boucherie en lots, une enquête a été réalisée
dans l’Est de la France en 2007 qui suggère que parmi les virus, l’infection par le
PI3 était prédominante sans que les auteurs précisent le statut clinique des veaux
infectés. La majorité des veaux testés avait reçu une injection de Rispoval RS
BVD® lors de la mise en lots (environ 8 à 13 jours avant le prélèvement).
L’interprétation de ces résultats doit aussi tenir compte des limites
liées aux prélèvements et aux techniques analytiques. Dans les études
précédemment citées les techniques de détection utilisées étaient différentes
selon l’agent infectieux recherché, avec chacune des caractéristiques propres de
sensibilité et spécificité. Pour limiter, à défaut d’éliminer, les variabilités liées aux
méthodes analytiques, des techniques d’amplification génique en temps réel
(qPCR) ont été récemment mises au point, qui permettent de détecter rapidement
le BRSV, le BPI3, le BCoV et les bactéries M. bovis, M. haemolytica, P. multocida
et H. somni. Cette détection peut être couplée à la recherche du BVDV ou du
BoHV-1, là aussi par PCR. Cet outil a été utilisé pour analyser 602 prélèvements
respiratoires obtenus sur trois années consécutives par le LDA 71 dans le cadre
du diagnostic vétérinaire (34). Les prélèvements respiratoires étaient un
écouvillonnage nasal (EN), une ATT ou un prélèvement de poumon,
principalement d’élevages naisseurs. Globalement les résultats montrent que dans
80% des cas il a été possible d’identifier un des sept agents respiratoires
recherchés. Par comparaison avec des techniques conventionnelles, la technique
PCR améliore la sensibilité de détection notamment des bactéries respiratoires, et
plus particulièrement de P. multocida. Les fréquences de détection étaient
respectivement de 22, 18, 7, 20, 51, 22 et 9% pour le BRSV, BCoV, BPI3, M.
haemolytica, P. multocida, H. somni et M. bovis. La prévalence du BCoV en
France sur des animaux cliniquement atteints est importante, de l’ordre de 20%.
Par ailleurs les co-infections sont apparues très fréquentes dans plus de 40% des
cas sans qu’il ne ressorte d’association préférentielle. Cette fréquence de co-
13
infections a aussi été observée dans une étude irlandaise où un virus était identifié
dans 35% des troubles respiratoires et où 40% des veaux infectés avaient plus de
2 virus présents (35). Cette étude a aussi montré une grande fréquence de
détection du BCoV, y compris dans les prélèvements de l’appareil respiratoire
profond, et une fréquence relativement importante de H. somni, bactérie
probablement sous-détectée auparavant dans la mesure où son isolement
nécessite des conditions particulières de culture. L’ensemble des données de
prévalence doit être interprété en tenant compte des limites liées aux modes
opératoires (absence de critères stricts d’inclusion, systèmes d’élevage
spécifiques, nombre d’échantillons...).
Tableau 1 : Pouvoir pathogène des différents agents respiratoires bovins démontré lors d’infections expérimentales.
2. Pouvoir pathogène des principales bactéries
Les principales bactéries impliquées dans les BPI bovines appartiennent à
deux principaux groupes : les mycoplasmes (Mycoplasma bovis), associés le plus
14
souvent à des BPI de forme chronique, et les pasteurelles (Manheimia
haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni) plutôt à l’origine
d’affections aiguës. Plus rarement, on peut isoler les genres Salmonella et
Coxiella, voire l’espèce Trueperella pyogenes.
Les Mycoplasmes a.
Les mycoplasmes appartiennent à la classe des Molliculites. Cette
dernière comprend la famille des Mycoplasmataceae, se divisant elle-même en 4
genres : Mycoplasma, Ureaplasma, Eperythrozoon et Haemobartonella. Le genre
Mycoplasma comporte environ 100 espèces dont 40 isolées chez les ruminants.
Les espèces pathogènes majeures chez les bovins sont : M. mycoides subsp.
mycoides responsable de la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), et
Mycoplasma bovis, agent de BPI.
Les pneumonies à M. bovis se rencontrent majoritairement dans les
élevages en lots (jeunes bovins et veaux de boucherie), où les animaux
proviennent de cheptels différents. Des études montrent l’importance de ce
mycoplasme lors de mise en lot de veaux non sevrés puisqu’il est le pathogène le
plus fréquemment isolé avec plus de 70% des échantillons positifs (23,29). La
présence de M. bovis semble cependant corrélée à l’apparition de pneumonies
puisque la bactérie est isolée uniquement dans des poumons d’animaux
présentant des signes cliniques respiratoires chroniques et aigus (0% des
animaux sains, 35,5% des animaux à pneumonie chronique et 50% des animaux
à pneumonie aiguë) (28).
La contamination d’un élevage se fait souvent par l’introduction de
porteurs sains ou malades. La transmission horizontale se fait par contact direct
entre animaux via les aérosols, mais aussi via la contamination de l’alimentation et
de l’eau de boisson par les sécrétions nasales d’animaux porteurs. Les animaux
convalescents peuvent excréter pendant une longue période et les porteurs
chroniques sont généralement responsables de la persistance de M. bovis au sein
d'un troupeau. Un stress (conditions climatiques, ventilation insuffisante,
surpopulation, allotissement) permet à la maladie de resurgir. En occasionnant
des lésions inflammatoires chroniques, M. bovis fragilise le terrain pulmonaire, le
15
prédisposant ainsi à l’infection par d’autres agents pathogènes. Si les
mycoplasmes sont généralement peu résistants dans le milieu extérieur, M. bovis
peut persister plusieurs semaines sur du matériel humide ou dans l’eau, et jusqu'à
230 jours dans le fumier (36). L'environnement constitue donc la seconde source
importante d'infection.
Mycoplasma bovis possède un double statut initiateur/ubiquiste puisqu’il
est responsable à lui tout seul de lésions cellulaires importantes et d’une
persistance de l’infection pendant plusieurs semaines. M. bovis possède 13 gènes
codant pour des protéines de surface variables impliquées dans la variabilité
antigénique, lui permettant d’échapper à la réponse immunitaire (37).
Plus rarement Mycoplasma dispar et Mycoplasma bovirhinis ont été cités
pour leur rôle dans les BPI sans qu’il n’existe actuellement de preuves de leur
pouvoir pathogène (38–40).
Les Pasteurelles b.
Les pasteurelles font partie de la flore commensale des muqueuses des
vertébrés supérieurs et tout particulièrement des mammifères et des oiseaux
domestiques. Chez les bovins, elles sont commensales dans le nasopharynx et le
portage asymptomatique concerne plus de 30 % des sujets adultes. Il résulte d'un
équilibre entre la réceptivité de l'animal hôte et la virulence des pasteurelles (41).
Les pasteurelles prennent ainsi une grande importance dans le cadre de
surinfections bactériennes consécutives à des infections respiratoires amorcées
par des virus (BoHV1, BRSV, BVD) ou par des mycoplasmes.
Les trois principales pasteurelles pathogènes chez les bovins sont
Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida et Histophilus somni.
M. haemolytica est la pasteurelle réputée la plus pathogène chez les
bovins. Elle agit en tant que pathogène unique, notamment lors d’une diminution
des défenses de l’hôte ou secondairement à une infection virale ou
mycoplasmique (17). L’expression du pouvoir pathogène de M. haemolytica est
conditionnée par une première multiplication locale dans le nasopharynx,
concomitante à une altération des mécanismes de défense de l’appareil
16
respiratoire. La bactérie adhère alors à l’épithélium grâce à des facteurs
d’attachement (pili, capsule), et ce d’autant plus facilement qu’un agent pathogène
primaire a lésé préalablement la muqueuse. La contamination de l’appareil
respiratoire profond se fait via l’inhalation d’exsudats virulents stagnants dans les
régions postérieures des cavités nasales où la concentration en bactéries est très
élevée en début de maladie (17). Une infection virale, classiquement par le virus
BPI3 ou BoHV-1 facilite la colonisation en altérant la clairance muco-ciliaire des
poumons et donc en altérant l’évacuation des bactéries envahissantes (17,42).
Mannheimia haemolytica possède de nombreux facteurs de virulence : une
adhésine, un polysaccharide capsulaire, un fimbriae, une sialoglycoprotéase, un
lipopolysaccharide (LPS), une neuraminidase, une lipoprotéine OMPs, et une
leucotoxine (Lkt). Les cinq premiers facteurs assurent l’adhésion à la cellule cible
et la colonisation cellulaire. La neuraminidase participe au disfonctionnement de
l’appareil muco-ciliaire et la sialoglycoprotéine clive les anticorps IgG1 bovins
produits lors de la réponse humorale. Le LPS possède une action pro-coagulante
et pro-inflammatoire entrainant un afflux de cellules inflammatoires ainsi que des
lésions vasculaires (17). La leucotoxine Lkt est un facteur de virulence majeur de
la bactérie. Cette protéine secrétée induit l’apoptose des neutrophiles et la
libération consécutive de facteurs pro-inflammatoires et toxiques participant à la
genèse des lésions typiques de bronchopneumonie alvéolaire (43).
Pasteurella multocida est, elle, la pasteurelle la plus fréquemment isolée
ces dernières années en France à partir de prélèvements respiratoires. Il existe
cinq sérogroupes parmi lesquels le sérogroupe A3 est le plus fréquemment isolé
sur les bovins atteints de BPI (44,45). Plusieurs études tendent à montrer que P.
multocida est une bactérie opportuniste des cavités respiratoires superficielles des
bovins (46) dont la pathogénicité semble limitée (45). A contrario, d’autres études
mettent en évidence une corrélation entre la présence de la bactérie et la
présence de signes cliniques respiratoires (47) et une augmentation accrue des
protéines inflammatoires (48). Elle possède globalement des facteurs de virulence
identiques à M. haemolytica sauf la leucotoxine.
Enfin, H. somni a été identifiée pour la première fois chez les bovins en
1956. Pendant longtemps, sa seule manifestation clinique semblait être la
17
méningo-encéphalite thromboembolique mais H. somni provoque également
d’autres affections, notamment respiratoires. Cette bactérie est responsable de
plusieurs affections chez les bovins et les ovins : bronchopneumonie, infertilité,
avortement, septicémie, myocardite, arthrite, méningoencéphalite (49). Six
variants sont décrits à ce jour mais seules les souches 1, 2 et 3 sont isolées chez
le bovin (50). H. somni provoque une pneumonie voire une pleurésie fibrineuse
dans sa forme respiratoire. De plus, il semble que de nombreux facteurs de
virulence soient exprimés uniquement chez des souches isolées sur des poumons
présentant des lésions (51).
3. Pouvoir pathogène des principaux virus
Comme cité précédemment, les principaux virus respiratoires impliqués
dans les BPI sont le BRSV (pour bovine respiratory syncytial virus), le BoHV-1
(pour bovine herpes virus 1), le coronavirus bovin BCoV (pour bovine
coronavirus), le BPI3 (pour bovine parainfluenza virus 3), l’adénovirus bovin de
type 3 (BAD3 pour bovine adenovirus type 3), et le BVDV (pour bovine viral
diarrhea virus). L’importance relative de ces différents virus repose sur leur
prévalence et leur pouvoir pathogène principalement étudié lors d’infections
expérimentales (Tableau 1).
Le virus respiratoire syncytial bovin a.
Les enquêtes viro-épidémiologiques dans différents systèmes d’élevage
bovin indiquent qu’actuellement le BRSV est l’agent pathogène responsable, seul
ou en association, d’une grande partie des BPI (52). Il a été isolé pour la première
fois en 1967 chez un bovin atteint de troubles respiratoires (53) et appartient à la
famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Pneumovirinae, et genre
Pneumovirus. C’est un virus enveloppé à ARN simple brin de polarité négative
contenant 10 gènes viraux qui codent pour 11 protéines dont 2 protéines de
surface qui sont des déterminants antigéniques du virus (52). La glycoprotéine de
fusion F permet la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire de la
cellule cible, mais aussi la fusion des cellules infectées avec d’autres cellules non
infectées, à l’origine de la formation de syncytia. Elle est la cible majeure des
18
anticorps neutralisants et est aussi impliquée dans l’induction de la réponse
cellulaire spécifique. La glycoprotéine G permet, elle, l’attachement du virus à la
cellule cible.
Le virus colonise l’épithélium des bronchioles puis les cellules des
alvéoles pulmonaires (pneumocytes de type II) où il exerce son effet pathogène,
conduisant à une bronchiolite obstructive fonctionnelle puis restrictive. Son pouvoir
pathogène s’exerce à la fois par un effet cytopathique direct mais aussi par
l’initiation d’une réponse immunitaire pathologique, notamment lors de forme
clinique sévère. La nature de la réponse innée inflammatoire influencerait la
nature de la réponse immunitaire spécifique des lymphocytes auxiliaires vers une
voie dite de type Th1 ou Th2. La réponse Th1 est associée à la production
d’anticorps neutralisants et l’induction d’une réponse cellulaire cytotoxique qui
assure l’élimination du virus et la protection. La réponse de type Th2 serait
associée à la libération de médiateurs pro-inflammatoires et au recrutement de
polynucléaires neutrophiles et éosinophiles à l’origine d’une broncho-constriction
sévère.
Sur le terrain, dans la majorité des cas le BRSV infecte un grand nombre
de veaux (morbidité de 20 à 50%) et est responsable de signes cliniques
respiratoires modérés avec une faible létalité (0,5 à 1%). Toutefois le BRSV peut
aussi induire à lui tout seul des bronchopneumonies sévères avec un taux de
mortalité non négligeable pouvant aller jusqu’à 20-30% (54).
Le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine b.
L’herpès virus bovin de type 1 (BoHV-1 pour bovine herpesvirus type 1)
ou virus de l’IBR (Infectious Bovine Rhinotracheitis) appartient à la famille des
Herpesviridae, sous famille des Alphaherpesvirinae. Il s’agit d’un virus de 150 à
200 nm de diamètre à ADN double brin d’environ 150 kbases. Le BoHV-1 a un
tropisme pour les cellules épithéliales, les cellules mononucléées sanguines et les
neurones (55). Il existe des différences nettes de pouvoir pathogène selon les
souches virales. La latence virale et les périodes dites de réactivation-réexcrétion
représentent la clé de voûte de l’épidémiologie de l’IBR (55). Le pouvoir
pathogène du BoHV-1 est démontré depuis longtemps sur des bases
19
épidémiologiques et expérimentales. La rhinotrachéite infectieuse bovine est la
forme respiratoire de l’infection par le BoHV-1. Suivant sa voie d’entrée dans
l’organisme et le sous-type viral, le virus est également responsable d’encéphalite,
de conjonctivite, d’avortement, d’une forme systémique mortelle en période
néonatale et d’une forme génitale : la vulvo-vaginite pustuleuse infectieuse. Dans
sa forme respiratoire le BoHV-1 n’est pas directement responsable de BPI, son
tropisme étant limité au rhinopharynx et à la trachée. Par contre son rôle en tant
qu’agent initiateur des BPI est étudié depuis longtemps, notamment dans le cadre
de co-infections expérimentales avec Mannheimia haemolytica (55). De ces
études, il ressort que le BoHV-1 favoriserait l’apparition de BPI par 3 actions, une
cytolyse directe des cellules épithéliales respiratoires, la production de cytokines
pro-inflammatoires et un effet suppresseur sur la réponse immune cellulaire.
Sur le terrain, la maladie atteint des animaux de tout âge mais les
jeunes bovins sont les plus sensibles et la plupart des infections respiratoires sont
asymptomatiques. Sinon la maladie se traduit par une rhinotrachéite (jetage séro-
muqueux, hyperthermie, toux, épiphora), voire des troubles fonctionnels (râles,
cornage) pour les souches pathogènes.
Le virus parainfluenza de type 3 (BPI3) c.
Le virus Parainfluenza de type 3 bovin (BPI3 pour bovine parainfluenza
virus type 3) appartient à la famille des Paramyxoviridae, et au genre Respirovirus.
Il s’agit d’un gros virus (150 à 300 nm) enveloppé à symétrie hélicoïdale dont le
génome est constitué d’une molécule d’ARN simple brin linéaire de polarité
négative. Principalement étudié dans les années 1990, le BPI3 fait actuellement
l’objet de recherches peu nombreuses et essentiellement focalisées depuis 2000
sur la variabilité génétique et la possibilité de contamination croisée entre les
différents virus parainfluenza. Le BPI3 est capable d’infecter un grand nombre de
types cellulaires de l’appareil respiratoire car il reconnait comme premier récepteur
l’acide sialique des cellules (56). Il induit une hyperplasie et une nécrose de la
muqueuse, une perte des cellules ciliées et finalement une pneumonie
interstitielle. Notamment, le BPi3, contrairement au BRSV, se multiplie dans les
macrophages du poumon. Il en résulte une altération des fonctions
20
macrophagiques (baisse de la phagocytose, de la cytotoxicité des cellules
infectées, secrétions de prostaglandines proinflammatoires…). Par ailleurs, et
contrairement au BRSV, l’infection par le BPI3 entraîne chez le veau une perte de
la ciliature des cellules ciliées trachéales, la présence d’inclusions cytoplasmiques
et la desquamation et destruction des cellules épithéliales respiratoires. L’effet
cytopathique observé, et potentiellement l’altération de la réponse immunitaire,
expliquerait ainsi le rôle du BPi3 comme agent initiateur des BPI. Malgré ces
observations, le pouvoir pathogène direct du virus n’est pas encore clairement
établi. La plupart des infections expérimentales n’induisent pas à peu de signes
cliniques et sur le terrain le virus est souvent détecté en présence d’autres
pathogènes. Comme pour la plupart des autres virus respiratoires infectant les
bovins, le virus BPI3 est fragile et ne se transmet que par contact direct « de mufle
à mufle », ou bien via l’inhalation d’aérosols et de gouttelettes émises par un bovin
infecté qui tousse ou éternue.
Le coronavirus bovin (BCoV) d.
Le BCoV (pour bovine coronavirus) appartient à la famille des
Coronaviridae, elle-même subdivisée en quatre genres (Alphacoronavirus,
Betacoronavirus, Gammacoronavirus et Deltacoronavirus) (57). Il fait partie du
genre Betacoronavirus auquel appartient aussi le virus du Syndrome Respiratoire
Aigu Sévère qui a sévi en Asie au printemps 2003 (SRAS-CoV), le coronavirus du
syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) ainsi que le coronavirus
respiratoire humain (HCoV OC43) (58). Il s’agit d’un virus sphérique enveloppé et
pourvu de spicules, d’un diamètre de 120 à 160 nm, très fragile, sensible à la
chaleur, aux détergents et aux solvants. Il est doté d’un ARN simple brin positif. A
sa surface figurent deux protéines responsables de l’attachement du virus à la
cellule hôte : l’hémagglutinine estérase (HE) et la protéine de la spicule (S), Leurs
actions combinées permettent l’adhésion aux cellules cibles et l’entrée du virion
dans le cytoplasme. De plus, les protéines HE et S provoquent une production
d’anticorps neutralisants protecteurs (59). Toutes les souches de BCoV sont
actuellement regroupées dans le même sérotype.
21
Le BCoV a un tropisme respiratoire et digestif. Il est bien connu en tant
qu’agent de diarrhée chez les veaux mais son rôle dans les affections
respiratoires est resté longtemps mal défini. Bien que détecté en 1986 dans deux
cas de pneumonies à coronavirus chez les bovins, il a fallu attendre 2003
(pandémie de SRAS en Asie) pour que survienne un regain d’intérêt pour le
coronavirus à tropisme respiratoire tant dans l’espèce humaine que chez les
bovins. Dans les élevages, il pourrait jouer un rôle dans l’apparition de
bronchopneumonie chez les jeunes animaux et chez les bovins engraissés en lot.
Le BCoV peut ainsi être retrouvé tant dans les voies respiratoires inférieures que
supérieures. Les veaux, les jeunes adultes ou les adultes infectés de manière
subclinique ou clinique constituent le réservoir du virus. La reproduction
expérimentale de la maladie est difficile mais permet d’induire un jetage nasal et
de la toux, signe d’une infection du tractus respiratoire supérieur. Son implication
en pathologie respiratoire repose alors principalement sur des études cas-témoins
réalisées dans des feedlots nord-américains suggérant une association entre
portage nasal de BCoV et BPI, une association entre présence de BCoV et lésions
respiratoires à l’abattage, et une association inverse avec la présence d’anticorps
neutralisant le BCoV et l’apparition de BPI (60–63). Les données en Europe sont
moins nombreuses mais montrent aussi une corrélation avec la pathologie
respiratoire (64–69).
Sur le terrain, Les affections à BCoV du jeune veau peuvent être
cliniquement bénignes (toux, rhinite) ou se compliquer de pneumonie notamment
lors de stress ou de surinfections bactériennes. Dans ce dernier cas le virus agirait
comme agent initiateur. Lors de formes sévères les lésions traduisent une
bronchopneumonie interstitielle (24,60,62,70–73).
L’Adénovirus bovin de type 3 e.
Les adénovirus responsables de troubles respiratoires chez les bovins
appartiennent à la famille des Adenoviridae, et au genre Mastadenovirus.
L’Adénovirus bovin de type 3 (BAD3) a été isolé pour la première fois en 1965
chez une vache saine. Ce sont des virus nus qui mesurent 70 à 110 nm de
diamètre, à ADN double brin et à géométrie icosaédrique. Ils sont très stables
22
dans le milieu extérieur (74). L’implication de ce virus dans la maladie respiratoire
chez les bovins est très peu connue, quelques études évoquent sa détection dans
les prélèvements respiratoires ou la détection des anticorps anti-BAD3
(20,23,48,74,75). L’infection semble causer des troubles pulmonaires et gastro-
intestinaux mais il est aussi fréquent d’isoler le virus chez des animaux sains, la
majorité des infections étant subcliniques. Récemment Ng et al (2015) ont montré
que le BAD3 est significativement associé avec la BPI (P<0.0001) (76).
Le Virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) f.
Le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV pour bovine viral diarrhea
virus) est un agent infectieux majeur des bovins qui appartient à la famille des
Flaviviridae, et au genre Pestivirus. Il s’agit d’un petit virus enveloppé dont le
matériel génétique se compose d’un ARN simple brin de polarité positive. Comme
la plupart des virus à ARN, il fait preuve d’une grande variabilité génétique. Le
virus BVD peut se présenter sous deux biotypes appelés cytopathogène (cp) qui
induit une lyse en cultures cellulaires et non cytopathogène (ncp). Il semblerait
que le biotype cytopathogène dérive du biotype non cytopathogène par mutation,
chez les bovins infectés permanents immunotolérants (IPI) (77). Seules les
souches ncp sont isolées à partir de poumons et ce sont les biotypes ncp qui
circulent principalement sur le terrain (78). Les troubles respiratoires sont
consécutifs à une infection transitoire avec une souche ncp. Toutefois les essais
d’inoculation ayant pour but de produire une affection respiratoire due au seul
virus BVD n’ont abouti qu’à des lésions mineures (78). Il semblerait que le virus
BVD soit peu pneumopathogène par lui-même, même si une réplication dans la
muqueuse respiratoire est possible (79) Son pouvoir pathogène dans les BPI
s’expliquerait principalement par son effet immunosuppresseur. L’effet
potentialisateur peut s’expliquer par l’action du virus sur les cellules lymphoïdes :
altération fonctionnelle des granulocytes neutrophiles, des lymphocytes B et T, et
quelquefois des thrombocytes ce qui induit une neutropénie et une lymphopénie,
une trombocytopénie persistant 10 à 15 jours après l’infection. La durée et
l’intensité de l’immunodépression dépendent de la souche virale.
L’immunodépression induite par le BVDV (80) peut ainsi faciliter l’infection du
23
poumon par d’autres virus et par des bactéries (78,81–90). L’implication du BVDV
dans les affections respiratoires bovines est donc complexe. Même s’il semble
jouer un rôle plutôt indirect, il existe suffisamment de preuves pour le considérer
comme un agent du complexe des affections respiratoires bovines.
4. Interactions entre agents pathogènes respiratoires
Les infections d’un même individu malade par plusieurs agents
pathogènes impliqués dans le processus morbide ont été bien décrites chez
l’homme dès les épidémies d’influenza de type A au XIXe et XXe siècle où les
personnes atteintes décédaient de complications bactériennes respiratoires à
staphylocoques, haemophilus et/ou streptocoques. Ces notions de co-infections
sont très étudiées en Santé Humaine pour comprendre les processus morbides et
trouver des moyens communs de prévention et de lutte. En pathologie respiratoire
bovine, même si les recherches sur les co-infections respiratoires datent des
années 1950 (91), il n’existe finalement que peu d’études dans ce domaine, qui
reposent soit sur des données épidémiologiques visant à associer plusieurs
pathogènes à un processus morbide soit sur des reproductions expérimentales.
Pour ces dernières, l’objectif est de comparer la pathogénicité d’une co-infection à
deux agents pathogènes le plus souvent par rapport à des mono-infections avec
les mêmes agents étudiés. Cela contraste avec les études de prévalence qui
suggèrent toutes une association fréquente entre pathogènes lors de BPI. Ainsi
Tessier révèle que 74% de ses prélèvements sont poly-infectés alors que
seulement 19,5% des prélèvements permettent d’isoler un seul agent (19). Dix-
neuf pour cent des veaux sont poly-infectés dans l’étude de Valarcher (1). En
Suède, une étude menée par Hagglund révèle que 35% des veaux sont infectés
par une combinaison de 2 virus, 26% par une combinaison de 3 virus et 6% par
une combinaison de 4 virus (92). Les combinaisons d’agents sont multiples et
différentes selon les études et selon les types de prélèvements écouvillons nasaux
profonds (ENP), ATT ou LBA. Dans l’étude de Valarcher, l’association la plus
souvent rencontrée est BRSV/BCoV (1). Dans une autre étude française les
couples de pathogènes les plus fréquents sont P. multocida/H.somni (28%), P.
multocida/BRSV (19,6%), P. multocida/M. haemolytica (19,6%), H. somni/BRSV
24
(4,3%), et BRSV/BPi3 (4,3%) (25). En l’état et en l’absence de données
exhaustives, il ne se dégage pas d’associations privilégiées entre certains agents
pathogènes.
Interactions entre bactéries respiratoires a.
Les études sur les relations synergétiques et antagonistes entre bactéries
dans les pneumonies sont diverses. Chez l’homme ces interactions sont décrites
entre les bactéries commensales qui colonisent le tractus respiratoires et celles
considérées comme pathogènes ou entre bactéries pathogènes (93,94). Les
associations positives existent quand un micro-organisme favorise la présence et
la survie d’un autre par des mécanismes de mutualisme, de commensalisme ou
de symbiose ou par des moyens qui aident à échapper au système immunitaire de
l’hôte. Les associations négatives sont dues aux interactions d’amensalisme
(antagonisme) ou de prédation entre les espèces bactériennes en compétition
dans le même habitat ou quand le système immunitaire favorise indirectement la
présence d’une espèce. Ces mécanismes comprennent entre autres la production
par certaines bactéries tolérantes du peroxyde d’hydrogène (H2O2) toxique pour
les espèces compétitrices (95), les réactions biochimiques qui mènent à la
destruction des protéines de surfaces nécessaires pour l’adhésion à l’épithélium
des bactéries compétitrices (96), et la modulation du système immunitaire pour
entraîner la clairance des espèces en compétition (97).
Les co-infections bactéries-bactéries sont très peu étudiées en pathologie
respiratoire bovine. Corbeil et al. (1985) ont suggéré que la flore respiratoire
résidente pouvait améliorer ou inhiber la croissance de M. haemolytica, P.
multocida, et H. somni in vitro (98). La plupart des isolats de la flore respiratoire
étaient bénéfiques à la croissance des pasteurelles, notamment les genres
Micrococcus, Corynebacterium et Staphylococcus. A l’inverse tous les isolats du
genre Bacillus, sauf un, ont montré un pouvoir inhibiteur sur les pasteurelles. En
termes de diversité, il y avait 4 fois plus d’isolats améliorateurs de croissance que
des bacilles inhibiteurs.
La bactérie Bibersteinia trehalosi précédemment connue comme
Pasteurella haemolytica biovar T est considérée comme un agent pathogène
25
respiratoire chez les petits ruminants. En plus de B. trehalosi, M. haemolytica et P.
multocida sont impliqués dans les BPI chez les mouflons canadiens.
Curieusement, B. trehalosi et P. multocida sont souvent détectés simultanément
dans les prélèvements de poumons des mouflons atteints, une association qui
n’implique pas M. haemolytica. L’hypothèse que B. trehalosi et P. multocida
peuvent inhiber la croissance de M. haemolytica a été vérifiée in vitro dans deux
études. Dans la première étude, la charge en CFU (colony forming unit) de M.
haemolytica était entre 6 et 9 log10 fois inférieure lors de co-culture avec B.
trehalosi par rapport à la monoculture en l’absence de B. trehalosi (99). La
deuxième étude (100) a montré, par des méthodes similaires, l’effet inhibiteur de
P. multocida sur la croissance de M. haemolytica. Cultivées individuellement, les
deux souches P. multocida et M. haemolytica ont montré des caractéristiques de
croissance similaires, ce qui n’est pas le cas lorsque les deux pasteurelles sont
misent en culture ensembles. Quantitativement, à 24h après mise en co-culture, la
charge de M. haemolytica était inférieure de 4 ordres de grandeur comparée à
celle de la monoculture. Dans les deux études, l’inhibition n’était pas observée
quand les cultures du couple en question étaient séparées par une membrane de
8 µm empêchant le contact direct entre les deux cultures, ce qui suggère un
mécanisme dépendant du contact et non pas par sécrétion de composés
antimicrobiens. Les auteurs suggèrent que ce phénomène d’inhibition entre les
pasteurelles est à l’origine des observations dans les données de diagnostic du
terrain durant les épisodes de BPI chez les mouflons canadiens.
Une étude récente (101) a utilisé les résultats de Corbeil et al sur le
potentiel des Bacilles respiratoires à inhiber la croissance et la colonisation des
bactéries pathogènes comme les pasteurelles. Dans cette étude in vitro, les
souches suivantes : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis
ainsi que Streptococcus thermophilus et Paenibacillus polymyxa ont été évaluées
pour leur effet inhibiteur contre le serotype 1 de M. haemolytica, notamment sa
capacité d’adhésion sur les cellules épithéliales bronchiques bovines (BBE). Les
souches P. polymyxa, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus planterum,
Lactobacillus casei et Lactobacillus acidophilus ont réussi à inhiber la croissance
26
de M. haemolytica sur le milieu de culture. Le mécanisme proposé serait la
sécrétion de substances antimicrobiennes, car l’effet peut être reproduit en
utilisant le surnageant de culture des souches à effet inhibiteur. Par la suite, les
deux souches P. polymyxa et L. acidophilus ont montré le meilleur potentiel pour
réduire la colonisation des cellules bronchiques bovines par M. haemolytica A1.
Les souches bactériennes appartenant au genre Lactobacillus font partie du
microbiote respiratoire normal des bovins (102) et une perturbation de leur
abondance pourrait être à la base d’une dominance des bactéries pathogènes.
Dans une application similaire en médecine humaine, la bactérie Streptococcus
salivarius a montré un grand potentiel dans la protection contre la colonisation par
des bactéries pathogènes dans les cavités respiratoires superficielles (103,104).
Interactions entre virus et bactéries b.
Les interactions virus-bactéries dans la pathogenèse des infections
respiratoires chez l’homme font principalement intervenir deux mécanismes, la
destruction de l’épithélium respiratoire par un virus qui expose la membrane
basale aux infections bactériennes secondaires et le dysfonctionnement du
système immunitaire favorisant ainsi la prolifération bactérienne (94). Tout atteinte
de l’épithélium respiratoire, par exemple lors d’infection à BoHV-1, va entrainer
une facilitation de la translocation bactérienne ce qui mène à une migration des
bactéries résidentes dans les voies respiratoires superficielles vers les voies
respiratoires profondes. Ce mécanisme est commun lors d’infection à pasteurelles
(M. haemolytica, P. multocida et H. somni) qui peuvent être des germes
commensaux du tractus respiratoire supérieur. Ces bactéries sont bien souvent
isolées dans des prélèvements nasopharyngés de bovins ne présentant aucune
pathologie respiratoire apparente. Par contre leur présence dans les poumons est
un critère d’imputabilité pour les BPI.
Le mécanisme le plus souvent cité pour expliquer les co-infections virus-
bactéries est la capacité des virus respiratoires à modifier/inhiber la réponse
immunitaire, et notamment la réponse lymphocytaire, favorisant ainsi la
prolifération bactérienne. Les principaux mécanismes connus sont le blocage de
l’expression de certain récepteurs CMH (BoHV1) (55) , une diminution de la
27
phagocytose (BPI3) (56), et quelquefois un emballement sévère de la réponse
immunitaire (BRSV) lymphocytaire vers une voie Th2, délétère pour l’animal (105).
L’exemple le plus cité dans la littérature est le virus BVD, connu comme
cofacteur potentialisateur des maladies respiratoires lorsqu’il est associé à une
pasteurelle ou un autre virus respiratoire. Le risque de BPI est ainsi
significativement augmenté lorsque le lot est exposé au BVDV (12,106), et les
traitements sont significativement plus longs (107). Le passage du virus de la BVD
par les poumons aurait un impact sur les macrophages alvéolaires en diminuant
leurs capacités de phagocytose et en diminuant la sécrétion des cytokines et
chimiokines produites, notamment le TNFa et l’IL-1 (87). De même le BVDV
diminuerait les capacités microbicides et de cytotoxicité dépendantes des
anticorps associées aux neutrophiles (108). Par ailleurs, après infection par le
BVDV on observe une lymphopénie et une thrombocytopénie transitoires (3 à 6
jours) sévères selon les souches. Toutes les classes de lymphocytes sont
impactées (B, T, γd) et l’expression des molécules de CMHII est perturbée (109).
Une étude a montré que lors de co-infections par le BVDV et M. haemolytica, les
signes cliniques étaient plus sévères dans le groupe co-infecté. Les auteurs ont
détecté dans le groupe co-infecté des concentrations élevées de protéines de la
phase aiguë de l’inflammation (acute phase proteins APP) et une durée prolongée
de l’infection virale. Par ailleurs la souche de M. haemolytica utilisée était
faiblement pathogène (effet sur le groupe mono-infecté) suggérant la nécessité
d’une co-infection par le BVDV pour induire une infection respiratoire sévère (90).
Deux études ont aussi souligné l’importance du BVDV lors de co-infection avec M.
bovis (86,110).
L’ordre de passage des pathogènes pourrait jouer un rôle. Pour exemple
chez les bovins, la durée de l’infection était plus longue et les signes cliniques et
les lésions pulmonaires plus sévères lors d’une infection par le BRSV suivie par
une infection par H. somni, comparé à des infections uniques (111). Dans ce cas
les IgE produites par l’infection virale seraient responsable d’une augmentation de
la perméabilité vasculaire, des œdèmes et de l’inflammation observés (111). Ce
synergisme entre le BRSV et H. somni a aussi été démontré in vitro, une pré-
infection de cellules alvéolaires bovines par le BRSV induit une augmentation
28
significative de leur rétraction et est suivi par une augmentation de l’invasion par
voie paracellulaire par H.somni. Cette rétraction cellulaire s’expliquerait par une
production cellulaire accrue des métalloprotéases matricielles mmp1 et mmp3 qui
vont dégrader plusieurs protéines de la matrice pulmonaire (112). Toutefois, dans
une étude récente, la même équipe a suggéré une relation antagoniste entre H.
somni et le BRSV lors d’infection primitive par la bactérie (113). Le pré-traitement
des cellules BAT2 avec du surnageant de culture de H. somni a significativement
réduit la réplication du BRSV lors de l’infection ultérieure. Par analyse microarray,
ils ont montré que le surnageant de culture de H. somni sur les cellules BAT2
induit une surexpression de la transcription de différents gènes de protéines
antivirales (IFIH1, ISG15, MX1, et RSAD2 en tant que viperin). Notamment la
surexpression de la viperin serait due à l’endotoxine LPS. Par contre dans cette
étude l’expression de l’antigène lbpA, responsable de la rétraction cellulaire et de
la perméabilité des cellules alvéolaire, n’a pas été modifiée.
Interactions entre virus respiratoires c.
Les interactions entre virus sont moins bien connues en pathologie
respiratoire bovine. Dans une étude expérimentale, les profils des cytokines IL-1β,
TNFα, IFNγ, IL-12, IL-4 et IL-10 obtenus après co-infections par le BVDV et le
BoHV1 ont été évalués et comparés à ceux produits lors d’une infection à BoHV-1
unique (114). Les veaux pré-infectés par le BVDV ont montré une augmentation
de sécrétion de TNFα et une diminution de sécrétion de IL-10 après l’infection par
le BoHV-1 entraînant une aggravation des signes cliniques et une exagération de
la réponse inflammatoire comparée au groupe infecté par le BoHV-1 seul (114).
L’effet coopératif du BVDV avec un autre virus serait lié à sa capacité à limiter la
réponse innée et notamment la réponse en interférons de type I (INF-I). La
protéine non-structurale virale Npro du BVDV réduit la production d’INF-I en
agissant notamment sur la suppression du facteur de régulation IRF-3 (interferon
regulatory factor 3) (85,115). Ainsi la réplication du BRSV in vitro était
significativement supérieure en présence d’un virus BVD-2 sauvage par
comparaison avec le même virus mais muté dans le gène Npro (protéine non
fonctionnelle (BVDV2-E) (115). Les résultats de cette étude confirment les
29
premières observations de Brodersen et Kelling (1998) qui ont montré qu’une co-
infection par le BVDV et le BRSV aggrave les signes respiratoires et les lésions
pulmonaires. L’excrétion du BRSV dans le nasopharynx et les poumons était
également plus longue lorsque le BVDV était présent (88).
Identification de nouveaux agents pathogènes III.
respiratoires
Un autre domaine d’actualité en recherche sur les maladies
respiratoires est l’identification d’agents pathogènes nouveaux permettant
d’expliquer l’émergence de maladies, de nouvelles associations entre pathogènes,
voir l’absence de résultats positifs lors de diagnostic étiologique d’une affection
respiratoire.
1. Notions sur les maladies émergentes chez l’homme
Les maladies infectieuses ont continuellement accompagné l’homme et
les évènements d’émergence et de réémergence des maladies virulentes comme
par exemple la peste bubonique au XIVe siècle et l’introduction des maladies
inconnues dans le nouveau monde durant le XVIe siècle ont sans doute marqué
l’histoire de l’humanité. Les premières publications apparues avec l’expression
« maladie émergente » datent des années 1950 et depuis, la définition de maladie
émergente ainsi que les critères d’attribution de ce terme ont constamment varié.
En médecine humaine, Rosenthal et al. (2015) proposent des critères
pour lesquels les maladies et les agents pathogènes sont considérés comme
émergents. Ces critères distinguent la maladie émergente, l’agent pathogène
émergent et le nouvel agent potentiellement pathogène (116). Une maladie est
dite émergente si elle répond à l’un des critères suivants : 1- une augmentation
nette de son incidence, 2- une exacerbation de la mortalité et de la morbidité, 3-
une expansion géographique. Un agent pathogène est dit émergent dans les cas
suivants : 4- un changement évolutif récent, 5- un changement de tropisme avec
une première détection chez l’homme, 6- un changement significatif dans sa
pathogenèse et sa manifestation clinique, 7- une première identification.
30
L’appellation « nouvel agent pathogène » est en fait discutable vu qu’il faut pouvoir
distinguer entre un agent nouvellement émergent et un agent déjà existant mais
nouvellement identifié. Pour répondre à cette question, la détermination de l’âge
des micro-organismes est possible à partir de leurs séquences en faisant des
alignements avec des souches homologues et par la suite en calculant le temps
de divergence des ancêtres communs déterminés à partir d’une analyse
phylogénique (117,118). Le terme nouvel agent potentiellement pathogène est lui
réservé aux agents émergents qui n’ont pas encore montré une pathogénicité
chez l’homme. La figure 1 montre l’arbre décisionnel pour distinguer une maladie
émergente, un agent pathogène émergent, un agent potentiellement pathogène et
une maladie ou agent pathogène en cours d’éradication.
Chez l’homme, les agents infectieux sont responsables d’environ 25% de
la mortalité (119,120). Parmi ceux-ci ce sont les virus émergents qui ont été
majoritairement responsables des épidémies durant les deux dernières décennies,
dont la grande majorité possède un pouvoir pathogène respiratoire (121). Citons
les coronavirus SARS-CoV , responsable du syndrome respiratoire aigu sévère, le
MERS-CoV (122), le HCoV-NL63 (123), le métapneumovirus humain (124),
l’hantavirus Sin Nombre (125), l’influenza H1N1 responsable de la pandémie de
2009 (126), le virus Ebola (127), et récemment le virus Zika (128). Les maladies
émergentes d’origine bactérienne sont également significatives en termes
d’impact sur la santé publique. Comme les virus émergents, les maladies
émergentes bactériennes sont majoritairement zoonotiques et étroitement
associées aux changements sociodémographiques et environnementaux.
Cependant, les émergences s’expliquent d’avantage par une perturbation de la
biodiversité très complexe des communautés bactériennes qui nous entourent que
par l’apparition de nouvelles bactéries non décrites auparavant (129). En
comparant aux virus, les génomes bactériens sont beaucoup plus stables et donc
moins sensibles aux évènements évolutifs de nature aléatoire comme les
mutations spontanées. Les évènements d’émergence les plus fréquents chez les
bactéries sont l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques (130) comme
le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) (131) ou l’apparition de
nouveaux sérovars très virulents appartenant à des familles bactériennes très
31
abondantes comme le cas de la souche O104:H4 de Escherichia coli qui a
émergée en Allemagne en 2011 (132). Des bactéries pathogènes autrefois
inconnues ont été récemment identifiées, comme l’espèce entéropathogène Vibrio
fluvialis (133), et l’espèce vectorisée par les tiques Neoehrlichia mikurensis (134).
De nombreuses études montrent que la fréquence d’émergence des
maladies infectieuses a significativement augmenté ces derniers décennies
(120,135,136) et cette croissance est due au changement du dynamisme hôte-
pathogène (116,129,135,137). Ces évènements d’émergence, majoritairement de
nature zoonotique (129,135,137,138), sont non-aléatoires, et fortement corrélés
aux facteurs socio-économiques, environnementaux et écologiques, surtout à
l’exploitation intensive des terres, et aux activités agricoles et agro-alimentaires
(135,137). Les études récentes sur les maladies infectieuses émergentes
cherchent ainsi à comprendre comment les interactions entre le climat,
l’environnement et les facteurs anthropologiques peuvent déclencher des
épidémies. Elles combinent leur résultats avec les études plus classiques sur les
modalités de transmission des agents pathogènes, l’existence de réservoirs, le
spectre d’hôte et la pathogenèse (120,139,140).
32
Figure 1 : Arbre de décision sur l'émergence des maladies et agents pathogènes, d'après (116).
33
2. Les nouvelles méthodes pour identifier de « nouveaux » agents pathogènes
Un autre facteur expliquant l’augmentation des notifications d’émergence
est l’arrivée d’outils plus performants pour les identifier, en particulier ceux de
séquençage à haut débit et d’analyse bio-informatique. Ces nouveaux outils
permettent une recherche sans a priori afin de récolter un maximum d’information
dans les prélèvements. L’avantage est donc de pouvoir identifier le maximum
d’agents, y compris ceux pour lesquels il n’existait aucune hypothèse de départ.
La commercialisation des séquenceurs à haut débit a commencé au début des
années 2000, permettant un séquençage parallèle et profond de plusieurs millions
de molécules d’ADN de taille différentes en un temps réduit comparé au
séquenceur Sanger de première génération (débit de 96 séquences par réaction
ou « run »). La première plateforme NGS a été le 454 de Life science (acheté par
Roche en 2007 et arrêté en 2013) qui utilisait la chimie de pyroséquençage.
Actuellement, les plateformes NGS de deuxième génération les plus connues
sont : Illumina (Miseq, Hiseq et Novaseq) et Ion Torrent de Life Technologies
(PGM et Ion Proton). Ces plateformes possèdent des séquenceurs de plusieurs
formats, y compris maintenant des séquenceurs de « paillasse » (benchtop
sequencer). Bien que ces plateformes possèdent des méthodologies similaires,
leurs performances ainsi que leur débit, taille des lectures produites et coûts sont
différents (141). Actuellement, les technologies de deuxième génération sont les
plus utilisées dans les projets de metagénomique et d’écologie microbienne (142).
Les plateformes dites de troisième génération (third generation sequencing TGS)
(141) comme Pacific biosciences (PacBio SMRT), Oxford Nanopore (MinION,
GridION, PromethION, SmidgION) utilisent, elles, des technologies de « molécule
unique » (single-molecule sequencing). Les caractéristiques de ces outils sont la
génération des lectures de très grandes tailles en temps réel sans la nécessité
d’amplifier préalablement le matériel génétique. Cela permet de générer
rapidement des génomes complets « Whole genome sequencing » (141–143).
La metagénomique shotgun est définie par un séquençage haut débit de
la totalité du matériel génétique dans un échantillon (144). Cette approche est
irremplaçable pour l’identification des micro-organismes n’ayant pas des gènes
34
ubiquitaires comme les virus et les phages et pour l’annotation fonctionnelle des
génomes microbiens. Quand la metagénomique est appliquée avec comme
objectif l’identification d’un virome dans des échantillons bruts et non pas à partir
de cultures de virus purs, une étape d’enrichissement du matériel génétique viral
est nécessaire. En fait, la proportion d’acides nucléiques viraux par rapport à ceux
de l’hôte ou des autres micro-organismes est infime, limitant ainsi la quantité de
données propres au virome (145). Pour atténuer cette contrainte, différentes
approches sont utilisées pour concentrer ou purifier les ADN ou ARN viraux (146–
150). Une amplification non-spécifique par PCR (122,151) ou des stratégies
«multiple displacement » (152,153) sont souvent utilisées afin de générer une
charge d’ADNc ou d’ADN viraux suffisante pour le séquençage haut débit. Selon
les objectifs, les produits du séquençage sont traités suivant deux voies : un
assemblage de novo ou un alignement et une affiliation par rapport à des
génomes de références contenus dans les des bases de données (Binning).
L’assemblage de novo consiste à assembler les séquences générées (« reads »
ou lectures) afin de construire des génomes entiers ou partiels (contigs) sans avoir
recours à des génomes de référence. Par contre, les stratégies utilisées durant le
binning consistent à affilier chaque séquence générée à un groupe taxonomique
en la comparant à une base de données afin de déterminer sa composition
taxonomique. La séquence peut aussi être alignée contre un génome de référence
(mapping) pour reconstruire des génomes partiels ou complets (144,145,154,155).
Un des avantages de la metagénomique est de récolter un maximum
d’informations dans les échantillons par une approche non ciblée dite sans a
priori. La puissance des séquenceurs de dernière génération a permis d’explorer
les populations microbiennes surtout virales d’un grand nombre d’organismes et
d’échantillons de l’environnement d’une manière exhaustive et large. L’autre
avantage est la profondeur de séquençage permettant une détection des
génomes minoritaires et d’identifier les quasi-espèces virales (156). Tant dans le
monde vétérinaire qu’en médecine humaine, sur des patients sains ou des
patients présentant des signes cliniques, les analyses metagénomiques
permettent de répondre à des questions très variées. Les deux principales limites
de ces méthodes sont d’une part la faisabilité et la difficulté technique à générer et
35
interpréter des millions de séquences et d’autre part l’imputabilité des agents
identifiés par rapport à la maladie découverte. Les virus par exemple sont les
entités biologiques les plus abondantes sur la planète (157), mais parmi tous les
virus présents, une fraction seulement est reconnue comme étant pathogène.
La conception des virus obligatoirement pathogènes a en effet changé
avec l’identification des virus commensaux comme les phages et les anellovirus
chez l’homme (158,159). La causalité d’un virus dans l’étiologie d’une maladie
n’est pas systématique même si le virus en question a été détecté dans une lésion
ou un prélèvement d’un organisme atteint d’une maladie (160), d’où la nécessité
d’établir des postulats comme celui de Koch et Rivers dans le but de définir la
causalité d’un micro-organisme (161). De plus si ces dernières techniques
permettent d’identifier le génome d’agents infectieux, l’isolement de ce dernier
n’est pas toujours réalisable et le postulat de Koch pas toujours reproduit.
Différentes analyses peuvent être réalisées in silico pour caractériser un nouveau
virus identifié comme par exemple les analyses génomiques (phylogénie et
évolution, marqueurs de virulence) ou des analyses in vitro comme l’étude du
tropisme cellulaire, l’identification des récepteurs et la transcriptomique. De même,
le rôle d’un nouvel agent potentiellement pathogène dans une maladie devrait être
évalué en se basant sur les données épidémiologiques et expérimentales comme
la séroprévalence et la prévalence de l’agent dans différentes populations, la
charge de l’agent chez les malades par rapport aux individus sains, le tropisme
dans l’organisme, la durée d’excrétion de l’agent pathogène, le profil de la réponse
immunitaire et les facteurs de risque associés (160,162).
Globalement, le séquençage de masse a permis d’identifier un grand
nombre d’agents pathogènes viraux émergents et ré-émergents chez l’homme ces
dernières années, comme par exemple le virus Ebola associé à l’apparition des
fièvres hémorragiques de 2007 en Ouganda (163), le nouveau phlebovirus
nommé Heartland virus (HRTV) aux Etats Unis en 2009 (164), un nouveau genre
viral nommé cosavirus appartenant à la famille des picornaviridae associé à une
pandémie de paralysie chez des enfants au Pakistan (165), un nouveau rhinovirus
(166), un nouveau bocavirus (167), un nouvel arenavirus en 2008 responsable du
36
décès de patients transplantés (168), ainsi que le MERS-Coronavirus responsable
de maladie respiratoire aiguë (122) et de nombreux arbovirus (169).
L’identification de nouveaux agents pathogènes via des techniques de
séquençage de nouvelle génération (NGS) est aussi de plus en plus utilisée chez
les animaux avec des applications en Santé Humaine (zoonose) mais aussi en
médecine vétérinaire. Pour exemple les chauves-souris ont fait l’objet de
nombreuses études (170–174) particulièrement depuis que les chiroptères ont été
identifiés comme hôtes réservoirs de plusieurs virus pathogènes responsables
d’épidémies (virus Ebola, virus Marburg, coronavirus SRAS et MERS, différents
lyssavirus dont le virus de la rage, virus Hendra et Nipah) (175) ainsi que de
différentes bactéries zoonotiques et pathogènes (176,177). Pour les pathologies
animales sensu stricto, le NGS est utilisé dans deux cas de figures, la recherche
d’un agent pathogène inconnu mais principalement responsable d’une épizootie
ou d’une émergence et la recherche exhaustive d’agents agissant en commun
dans des pathologies multifactorielles pour lesquelles on fait l’hypothèse que tout
n’est pas connu.
L’exemple le plus criant est l’identification en 2011 d’un bunyavirus, le
virus Schmallenberg portant le nom de la ville dans laquelle la maladie a été
détectée. Au cours de l’été 2011, de nombreux cas de diarrhées fébriles
associées à une perte d’appétit et une chute importante de la production de lait
étaient rapportés chez des bovins adultes en Allemagne (Rhénanie du Nord et
Westphalie), avec parfois des signes cliniques évocateurs de la Fièvre Catarrhale
Ovine, laissant craindre une résurgence de ce virus. Dans un premier temps la
recherche de nombreux agents pathogènes dans des prélèvements provenant de
bovins malades s’est révélée négative par des techniques classiques et même
l’utilisation d’approches innovantes comme la bio-puce Epizone Biochip (> 2 000
amorces de virus). Ce n’est qu’avec une approche NGS à partir d’échantillons de
sang de bovins malades que l’Institut Friedrich-Loëffler (FLI) a identifié en
novembre 2011 des séquences nucléotidiques appartenant à un nouveau virus qui
fut nommé Schmallenberg virus (SBV). L’analyse de la séquence du génome viral
indiquait des similarités avec les virus Akabane, Aino et Shamonda, qui
appartiennent au genre Orthobunyavirus au sein de la famille des Bunyaviridae.
37
L’implication du SBV dans les signes cliniques observés fut ensuite confirmée par
détection par RT-qPCR du SBV dans les échantillons des bovins malades et
quelques temps plus tard par une infection expérimentale sur des bovins âgés de
9 mois. Au cours du mois de décembre 2011, les Pays-Bas signalent pour la 1ère
fois une action tératogène du SBV chez des ovins, dont les caractéristiques
s’assimilent aux effets observés avec les virus Akabane et Aino.
38
Les « nouveaux » virus respiratoires bovins : IV.
cas de l’influenzavirus de type D
Depuis quelques années de nouveaux projets de recherche ont vu le jour
dont les objectifs sont de mieux caractériser les pathogènes respiratoires chez les
ruminants et notamment d’identifier de nouveaux agents, principalement des virus.
Trois explications majeures peuvent être avancées. La première est que
finalement, avec des techniques très sensibles comme les PCR, il existe encore
un pourcentage non négligeable de résultats négatifs (5% à 20% selon les études)
même quand on cible l’ensemble des pathogènes respiratoires connus et que l’on
se place dans les conditions optimales d’échantillonnage. La deuxième est que, si
on connait le pouvoir pathogène individuel d’un agent, il reste encore beaucoup de
questions sur les co-infections virales et leur importance. La troisième est, comme
nous l’avons dit, liée au développement récent d’outils très performants de
détection et de recherche de pathogènes. Deux approches peuvent être ainsi
définies, une approche ciblée qui repose sur une hypothèse préalable et donc sur
les connaissances existantes (données préliminaires, pathologie comparée…) et
« l’intuition » scientifique, et une approche qui repose sur une recherche
exhaustive de tous les virus et/ou bactéries présents et ensuite une analyse des
résultats obtenus.
En l’état plusieurs études reposant sur une approche exhaustive ont été
réalisées récemment, qui seront présentées dans la partie expérimentale de ce
manuscrit (76,178–180). De même un nouveau virus, le virus Influenza D (IDV),
fait partie des virus récemment détecté grâce aux méthodes NGS.
1. Historique des infections à virus influenza A (IAV) chez les bovins
La détection de virus influenza chez les bovins n’a été que très rarement
décrite. Le virus influenza de type A a été isolé pour la première fois chez des
bovins en 1962 en Hongrie (181). Par la suite, le virus aurait été isolé sur des
bovins en Russie dans les années 1970, durant des épisodes de maladies
respiratoires sur des bovins, coïncidant avec l’épidémie humaine de grippe à
39
H3N2 (182,183). En 1973, la souche A H3N2 calf/Duschabe/55/71 a été isolée
grâce à une mise en culture sur œufs embryonnés de prélèvements issus d’un
veau présentant des signes cliniques respiratoires (183). En 1998, Brown et al.
(184) décrivent une séroconversion au virus influenza A chez des vaches laitières
présentant des troubles respiratoires et des chutes de production laitière au
Royaume uni. Les tests utilisés étaient l’inhibition de l’hémagglutination (IHA) et
l’immunodiffusion. Les titres les plus élevés en anticorps étaient obtenus pour
deux souches humaines d’influenza A : A/England/333/80(H1N1) et
A/England/427/88(H3N2).
En 1984, dans une revue sur la microbiologie et l’épidémiologie de
l’infection par l’influenza chez ruminants, Lopez et al. (185) indiquent que des
résultats sérologiques (test de fixation du complément) positifs ont été obtenus
aux USA contre les souches A2/Japan/305/57, Sw/15, Sw/Shope/58,
A/Equi/Prague/57, et B/Johannesburg/59. Au moyen de l’IHA, des résultats
positifs ont été trouvés contre les souches A/PR/8/34, A/equi/Prague,
A/Equi2/Lexington, Sw/15, Sw/Shope/58, et B/Johannesburg/59 aux USA, et
contre les souches A/PR/8/34, A/FM/1/47, B/Bonn, and B/Roma/1/59 en Italie et
contre différentes souches de virus Influenza A en Roumanie, en ex URSS, au
Népal, en Inde, et en Hongrie. Plusieurs souches ont alors pu être isolées.
En 2002 en Irlande, Graham et al. (186) analysent par IHA 84 paires
d’échantillons (des phases aiguë et convalescente) de sérums issus de 17
élevages laitiers présentant des épidémies de maladies respiratoires, diarrhéique
et de chute de production. Une séroconversion au virus A/England/333/80/H1N1
est ainsi mise en évidence chez 56,5% des animaux testés et la séroconversion
au virus A/England/427/88/H3N2 est démontrée dans 58,8% des cas. Ces
résultats suggèrent que le virus influenza A est capable d’infecter les bovins.
Toutefois l’importance de l’infection et son rôle épidémiologique ne sont pas
clairement connus. Ainsi une étude a été menée en 2007 au Royaume Uni par
Crawshaw et al. (187) pour savoir si l’infection par les virus influenza A humains
(A/England/333/80(H1N1) et A/England/427/88(H3N2)) pouvait être à l’origine
d’une chute de production laitière chez les bovins. Deux troupeaux de 350 et 320
vaches ont été sélectionnés sur la base de l’apparition récente, soudaine et
40
transitoire (une à deux semaines) d’une chute de production lactée avec
hyperthermie modérée, avec une incidence de 10 à 20% dans un troupeau et
sans étiologie identifiée. Des sérologies couplées (à 21 jours d’intervalle) ont été
réalisées sur les animaux présentant des chutes de production laitière de plus de
30% et sur 25 animaux témoins. Les tests sérologiques classiques ELISA étaient
tous négatifs (absence de séroconversion) vis-à-vis des principaux pathogènes
respiratoires (BRSV, BVDV, BoHV-1, BPI3, adénovirus, H. somni, M. bovis,
Chlamidia psittaci, Coxiella sp, M. haemolytica, P. multocida, Treponemes spp.).
Chez les vaches présentant une chute de lait, les résultats ont montré une
séroconversion significative vis-à-vis des virus influenza A H1N1 et H3N2 (60% et
65% de séroconversion respectivement). Une corrélation significative a également
été mise en évidence entre la séroconversion et une hyperthermie d’une part, et
entre la séroconversion et la présence de bruits respiratoires surajoutés
(craquements et sifflements) d’autre part. Cette étude suggère que le virus
influenza A pourrait entraîner des troubles cliniques comme une chute de la
production laitière ou des signes cliniques respiratoires peu marqués chez les
bovins. Dans cette étude, la présence directe du virus n’a pas été recherchée.
Une étude d’infection expérimentale par vois intranasale sur quatre veaux
inoculés par la souche influenza A hautement pathogène
A/cat/Germany/R606/2006(H5N1) s’est révélée incapable d’induire de la
symptomatologie, même si les veaux ont excrété le virus pendant 3 jours et ont
séroconverti (188). Enfin une étude expérimentale (189) a montré que les virus
influenza A humains (A/England/42/72, A/Michigan/1/72), le virus influenza A
porcin (A/sw/IL/75(H1N1)) et le virus influenza A isolé chez un veau
(A/calf/Duschanbe/55/71(H3N2)) étaient capables d’infecter des veaux, de se
multiplier dans les muqueuses nasales (isolement viral pendant sept jours) et pour
les souches isolées chez le veau et le porc, d’induire des signes
cliniques respiratoires ainsi que des lésions pulmonaires modérées.
Compte tenu du faible nombre d’expériences réalisées, des études
supplémentaires apparaissent nécessaires pour déterminer le rôle pathogène des
virus influenza A chez les bovins et pour définir l’importance réelle des infections
dans les conditions naturelles. L’adaptation du tropisme des virus influenza, en
41
particulier humains, aux bovins est probablement limitée, en raison du faible
nombre de cas déclarés chez les bovins, pourtant en contact étroit avec les
humains.
2. Découverte d’un nouveau virus influenza de type D chez les bovins
En Avril 2011, un virus est isolé aux U.S.A (190) à partir d’écouvillons
nasaux réalisés sur des porcs âgés de 15 semaines présentant des signes
cliniques grippaux. L’étude en microscopie électronique a montré des images
caractéristiques d’un orthomyxovirus : virus sphérique enveloppé de 100nm de
diamètre présentant des spicules, avec au niveau des cellules infectées des
bourgeons filamenteux naissants à partir de la membrane plasmique. Bien que les
RT-PCR soient négatives pour les virus influenza A (IAV), B (IBV) et C (ICV), et
que l’activité neuraminidase soit négligeable, la présence d’une activité O-
acétylesterase suggérait que le virus en cause était apparenté au genre influenza
C.
Par la suite l’analyse du génome viral à l’aide d’outils de NGS a révélé 7
segments d’ARN contenant 1000 à 2000 paires de bases, et des régions non
codantes en 3’ et 5’ similaires à celles trouvées chez l’ICV humain. De même,
cette analyse a montré que le virus identifié était phylogénétiquement plus proche
du type ICV (50% d’acide aminés identiques) que des types IAV et IBV. Le virus a
donc été nommé provisoirement C/swine/Oklahoma/1334/2011 (C/OK).
Par la suite, différentes études ont montré que ce virus était suffisamment
éloigné des ICV pour être classé dans un nouveau type : le virus influenza de type
D (IDV) (191). Notamment, afin d’étudier les relations antigéniques entre les virus
C/OK et influenza de type C humain, un typage sérologique par immunodiffusion
sur gel d’agar (AGID) a été effectué. Cette méthode permet d’identifier les
différences antigéniques des protéines NP et M1 et permet ainsi de classer les
virus influenza en trois genres (A, B, C). Des anticorps polyclonaux spécifiques du
virus C/OK ont réagi de façon significative avec le virus C/OK et un autre virus
bovin D/660 mais n’ont pas réagi avec des ICV humains (C/JHB et C/TAYLOR).
De même des anticorps polyclonaux spécifiques du virus humain C/TAYLOR n’ont
42
pas reconnu le virus C/OK ni le virus bovin D/660 mais ont réagi avec les souches
humaines C/JHB et C/TAYLOR. Ces absences de réactions antigéniques croisées
ont constitué une première preuve pour affirmer que le virus découvert appartenait
à un nouveau genre d’influenzavirus. Par la suite une expérience a montré
l’absence de réassortiment in vitro entre C/OK et des ICV humains sur cellules ST
(swine testicle) lors de co-infections (191). Par contre et plus récemment, un
réassortiment forcé a été réussi à l’aide d’un système de génétique inverse (192).
Enfin des études phylogénétiques ont montré que les divergences entre les virus
C/OK et les ICV humains étaient similaires à celles que l’on trouve entre les IAV et
les IBV.
Au vu de tous ces arguments, il a été admis par la suite que ce virus C/OK
représente un nouveau genre d’influenzavirus nommé influenza D. Dans la suite
du manuscrit, le virus C/OK sera nommé D/OK.
3. Propriétés générales des virus Influenza D
Propriétés structurales a.
L’IDV fait partie de la famille des Orthomyxoviridae. C’est un virus
enveloppé, doté d’un ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les virions
sont sphériques (Figure 2), d’un diamètre de 80 à 120 nm. En microscopie
électronique ils apparaissent comme une sphère recouverte de spicules
correspondant aux glycoprotéines de surface : l’hémagglutinine estérase fusion
(HEF). L’enveloppe lipidique est dérivée de la membrane plasmique. Sous cette
enveloppe se trouvent des protéines matricielles et au centre, une structure
moléculaire hélicoïdale associant l’ARN à des complexes de nucléoprotéines et à
des polymérases.
43
Figure 2 : Représentation schématique d’un virus de type influenza D (193)
Figure 3 : Virus influenza D (C/OK) en microscopie électronique l’hémagglutinine de l'enveloppe forme un halo caractéristique autour des particules virales en coloration négative (190).
Dans le cas des virus de type C et de type D, une unique glycoprotéine de
surface est présente et assure à la fois le rôle de l’hémagglutinine et de la
neuraminidase des IAV ou IBV. Cette glycoprotéine, appelé HEF, présente donc
44
trois fonctions : hémagglutination, activité d’estérase et de fusion. Elle est
composée de deux sous-unités HEF1 et HEF2. La protéine HEF se lie au
récepteur 9-0-acetyl-N-acetylneuraminic présent en surface des cellules cibles
(194,195).
Génome viral et évolution virale b.
Le génome viral est lui composé d’un ARN simple brin de polarité négative
réparti en 7 segments (Figure 4), chaque segment d’ARN code pour une ou
plusieurs protéines virales (190). Les segments d’ARN sont entourés par la
nucléoprotéine (NP) pour former des nucléocapsides de symétrie hélicoïdale.
Figure 4 : Le génome du virus influenza D (193)
Le gène de la protéine PB1 (polymérase basique 1) est le mieux conservé
chez tous les virus influenza (196) et sa séquence nucléotidique est souvent
utilisée pour évaluer les relations phylogénétiques entre différents virus influenza.
Il existe plus de 69% d’identité entre les gènes PB1 de IDV et IDC alors que cette
dernière est environ de 39% avec IAV et IBV. A titre de comparaison, les gènes de
PB1 d’IAV et IBV présentent 61% d’identité, et les gènes PB1 des différents sous
types d’IAV sont extrêmement conservés avec plus de 90% d’identité. De même,
concernant les protéines PB2 et P3, les identités entre IDV et ICV sont
respectivement de 53% et 50% (190). Concernant la protéine HEF, le pourcentage
d’identité entre IDV et ICV est de 53%. Ce pourcentage est similaire au
pourcentage d’identité des différentes hémagglutinines des sous-types d’IAV
(49%) (190). Le pourcentage d’identité entre les NP du virus D/OK et celles d’ICV
45
est inférieur à 41%. De même, concernant les protéines de matrice, cette identité
n’est que de 38% (190).
Les extrémités terminales 3’ et 5’ des segments d’ARN sont des régions
non codantes habituellement très bien conservées. Ces régions non codantes
jouent un rôle clé dans la réplication du génome et dans l’assemblage. De même,
le phénomène de réassortiment entre deux virus n’est possible que si les régions
non codantes de ces deux virus sont similaires (197). En ce qui concerne le virus
D/OK, les régions situées en 3’ et 5’ sont identiques à celle du virus influenza C
humain à l’exception d’un nucléotide.
Les virus influenza évoluent grâce à 2 mécanismes : les mutations
ponctuelles («drift») et les réassortiments génétiques («shift»). Les mutations
ponctuelles sont dues au faible taux de fidélité de l’ARN polymérase virale, avec
un taux d’erreur de 10-4 substitutions/nucléotide/cycle pour l’influenza A, ce qui est
assez important comparé au 10-9 substitutions/nucléotide/cycle de l’ADN
polymérase. Ces erreurs aboutissent à des mutations ponctuelles au niveau des
bases nucléotidiques des gènes viraux, et par conséquent à des modifications au
niveau des protéines pour lesquels ils codent. Les conséquences peuvent être des
pertes de fonction des protéines virales ou bien l’apport d’avantages sélectifs.
C’est le phénomène de dérive génétique ou glissement antigénique. Ce dernier
résulte également de la pression de sélection exercée par les anticorps
neutralisants sur des sites antigéniques (198). Une étude d’évolution moléculaire
sur 5 segments (PB1, PB2, P3, NP et M) du virus D/OK suggère que l’IDV a
divergé d’un ancêtre commun aux ICV humains actuels, cet évènement datant d’il
y a 300 à 1200 ans (117).
Les réassortiments sont dus à la segmentation du génome des virus
influenza. Si une cellule est infectée simultanément par deux virions de sous-types
différents, les segments peuvent se mélanger lors de l’assemblage de nouveaux
virions. On obtient alors un nouveau virus dit « réassortant ». Une expérience de
réassortiment in vitro a été effectuée avec des ICV humains, le virus D/OK et des
virus D/bovin (190). Des cellules ST (swine testicle) ont été co-infectées avec
différentes combinaisons des virus humains C/Taylor/1947, C/Johannesburg/66, le
virus porcin D/OK et le virus bovin D/660. Des virus réassortants issus des deux
46
ICV humains ont été identifiés, ainsi que des virus réassortants issus du virus
D/OK porcin et du virus D/bovin. La co-infection des cultures cellulaires avec de
l’ICV humain et du virus D/OK porcin ou du virus D/bovin n’a en revanche pas
permis de créer de virus réassortant viable. Cette incapacité de réassortiment
naturel suggère que le groupe IDV est génétiquement éloigné de l’ICV humain et
représente un nouveau genre d’influenzavirus dans la famille des
Orthomyxoviridae. Par contre, un réassortiment forcé a été réussi à l’aide d’un
système de génétique inverse (192) ; les différents gènes de D/OK ont pu
remplacer les gènes correspondants appartenant à un virus ICV humain, et des
virus réassortants viables ont été produits (192).
4. Réservoir, spectre d’hôte et pouvoir pathogène
Lors de la première détection de l’IDV chez le porc (Figure 3), des études
se sont concentrées chez le porc et l’homme pour déterminer le spectre d’hôte et
le réservoir viral. L’analyse de plusieurs cohortes a montré une séroprévalence
limitée chez l’homme (1,3%) et le porc (9,5%), suggérant un rôle limité de ces
deux espèces (190). Afin de vérifier la spécificité de la méthode sérologique
employée, le virus influenza C humain C/Taylor/1233/47 a également été
recherché chez les porcs. Des titres en anticorps allant de 10 à 20 ont alors été
détectés chez 2,8% des sérums testés.
Chez le porc
Malgré une séroprévalence modérée, des études montrent que l’IDV
circule chez le porc. En Italie en 2016, un écouvillon respiratoire sur 150
prélèvements testés est apparu positif à l’IDV (RT-qPCR) chez un porc malade
(199). En 2017 et dans la même région italienne (plaine du Pô), 2,3% (n=845) des
prélèvements respiratoires de porc malades prélevés entre les années 2015 et
2016 ont été positifs en RT-qPCR dont des prélèvements de poumons (200). Les
sérologies réalisées en 2015 indiquaient un pourcentage de séropositivité de
11,7% alors qu’il était de 0,6% en 2009, suggérant une probable augmentation de
la circulation d’IDV dans cette région.
47
En Chine, des taux de détection de 36,8% dans les écouvillons nasaux et
de 28,9% dans les poumons des porcs atteint de maladie respiratoire ont été
trouvés par RT-qPCR (201).
Dans une étude récente aux USA une séroprévalence globale de 19,1% a
été trouvée chez les cochons sauvages (202). Dans cette même étude, 12 porcs
sauvages capturés ont été inoculés par voie intranasale avec la souche D/46N, le
virus a été détecté dans les sécrétions respiratoires jusqu’à 7 jours après
inoculation avec des titres viraux maximaux de 2,37 log10 TCID50/ml. Les 7 porcs
excréteurs de l’IDV ont séroconverti entre 5 et 8 jours post-inoculation. Le virus a
été détecté dans les prélèvements respiratoires avec des titres maximaux dans la
partie distale de la trachée (5,34 log10 TCID50/ml). Parmi les animaux de cette
étude, 8 porcs ont été mis en contact direct avec les porcs infectés. La
transmission par contact direct a été observée avec la détection d’IDV chez 3
animaux contacts. Finalement aucun signe clinique n’a pu être observé chez les
porcs infectés.
En bilan, ces données montrent que l’IDV circule chez les populations de
porcs domestiques et sauvages avec une distribution mondiale. Leur capacité à
produire des troubles cliniques sur ces espèces semble être faible. En revanche,
le risque d’adaptation chez cette espèce ou de réassortiment avec les autres
genres de la famille des Orthomyxoviridae adaptés aux suidés reste probable.
Chez l’homme
L’IDV a la capacité d’infecter et de se transmettre par contact direct entre
furets, un modèle de choix pour l’étude des virus influenza humains (190). Cela
suggère que ce virus pourrait être transmissible à l’homme. De même, le tropisme
cellulaire large et les bonnes capacités de réplication de l’IDV à 37°C sont des
arguments supplémentaires concernant le potentiel zoonotique de l’IDV. Plusieurs
enquêtes pour rechercher l’IDV chez l’homme ont donc été conduites avec des
résultats très variés.
Une étude a été conduite en Floride en 2016 (203) pour évaluer la
présence de l’IDV chez des personnes en contact avec le bétail. Un sondage
sérologique a été réalisé chez 35 personnes qui travaillent au contact du bétail,
48
ainsi que chez 11 individus non exposés. Une séroprévalence de 91% a été
détectée parmi les personnes travaillant au contact des bovins. Au sein des
individus non exposés, une prévalence de 18% a été mise en évidence. Les
résultats générés par cette étude pourraient être controversés ; les sérums
humains analysés n’ont pas été pré-adsorbés avant avec des antigènes de l’ICV
afin d’éviter une possible réaction croisée, sachant que la présence ou l’absence
de réaction croisée entre les anticorps contre ces deux virus chez l’homme n’a pas
été préalablement démontré. L’absence de cette étape pourrait constituer un biais
méthodologique qui explique possiblement ce haut taux de positivité. Dans ses
travaux de thèse, L. Eckard (192) a détecté une séropositivité de 1% contre IDV
chez une cohorte d’individus en contact avec des bovins séropositifs. Une
déplétion préalable des anticorps anti-ICV de ces échantillons a mené à une
élimination complète des titres positifs anti-IDV, ce qui suggère une éventuelle
réaction croisée entre les anticorps contre les deux virus.
Dans une autre étude, Smith et al. ont cherché IDV dans des
prélèvements respiratoires humains ; 3300 échantillons écossais de 2006-2008
ont été analysés par PCR (204). Aucun échantillon n’a été trouvé positif pour IDV.
Le potentiel zoonotique a lui été investigué dans les travaux de L. Eckard.
La capacité d’IDV à se répliquer dans les cellules normales bronchoépithéliales
humaines différenciées (NHBE), qui représentent des cellules du système
respiratoire superficiel humain, a été montrée. Si on considère l’infectivité d’IDV
chez le furet et la possibilité de réassortiment forcé avec l’ICV, on peut estimer
que le risque zoonotique d’IDV est possible et doit être étudié plus en profondeur.
Chez les bovins
Le rôle des bovins comme réservoir principal du virus a très vite été
suspecté. Début 2013 une première étude a été réalisée sur 45 écouvillons
nasaux de bovins atteints de BPI dans 6 états des USA pour recherche d’IDV par
RT-qPCR (gène cible, PB1) suivie, pour les échantillons positifs, d’une mise en
culture et d’un isolement viral sur la lignée cellulaire HRT-18G (human rectal
tumor). Huit échantillons se sont révélés positifs (18%) à l’IDV avec des charges
virales importantes (Ct compris entre 12 et 15). Par la suite, deux virus
(D/bovine/Minnesota/628/2013 et D/bovine/Minnesota/729/2013) ont été choisis
49
au hasard et séquencés pour les comparer au virus D/OK. Tous les segments des
virus isolés à partir de bovin étaient identiques à plus de 96% au virus D/OK.
Depuis, l’IDV a été identifié par des méthodes de détection directe (RT-
qPCR) ou indirecte (sérologie), dans de nombreux pays (Mexique, Italie, Irlande,
Luxembourg, Japon) sur plusieurs continents chez des bovins atteints ou non de
signes cliniques respiratoires (199,202,205–212). Pour exemple, un sondage
sérologique a été conduit en 2016 pour évaluer la présence de l’IDV au Japon
(210) ; 1267 échantillons de sérums bovins collectés sur des animaux sains entre
2010 et 2016 dans différentes exploitations agricoles du pays ont été analysés. La
méthode utilisée pour détecter les anticorps anti-IDV était l’IHA. Des sérums
positifs ont été trouvés pour toutes les années de collecte et pour toutes les
régions du pays. Les taux de séropositivité variaient entre 13,5% et 50% selon les
régions. La séropositivité totale des échantillons testés était de l’ordre de 30%.
Cette étude montre l’ubiquité de l’IDV au Japon depuis plusieurs années. La
détection d’IDV en Asie avait en fait commencé plus tôt avec l’identification du
virus en Chine en 2014 avec 3 positifs sur 453 prélèvements respiratoires testés
(205). Dans l’étude chinoise de Zhai et al. (201), l’IDV a été détecté dans la
province de Guangdong avec des taux de détection compris entre 7,3 et 16,3%.
Les échantillons consistaient en des prélèvements respiratoires et des sérums, la
détection du génome de l’IDV dans les composants du sang des bovins n’ayant
pas été précédemment décrit.
C’est aux USA que les études sur les bovins sont les plus nombreuses.
En 2015, une étude a montré un taux de positivité de l’IDV de 4,8% (n=208) et a
surtout mis en évidence l’existence de deux rameaux phylogénétiques
représentés par les souches D/swine/Oklahoma/1334/2011 (D/OK) et
D/bovine/Oklahoma/660/2013 (D/660) (206). Un troisième groupe phylogénétique
distinct s’est ensuite présenté avec l’identification des souches japonaises (213).
La même année, Ferguson et al. ont montré que les deux souches D/OK et D/660
co-circulaient dans les élevages bovins atteints de BPI dans le Mississippi (207).
Aux USA il semble que l’IDV circule depuis 2003, comme l’indiquent des résultats
de séropositivité sur des cohortes de bovins dans le Nebraska (214).
50
En Europe, la détection de l’IDV a rapidement suivi son identification aux
USA. L’équipe virologie (IHVV) de l’UMR 1225 à Toulouse a travaillé sur un total
de 134 échantillons respiratoires (poumons, écouvillons nasaux et liquides
d’aspiration trans-trachéale) de bovins atteints de BPI aimablement fournis par le
laboratoire départemental de Saône et Loire (LDA71) et sur 140 échantillons (70
écouvillons nasaux et 70 lavages broncho-alvéolaires) obtenus par l’équipe en
2013 et 2014 sur des veaux atteints de BPI et provenant de 23 fermes du Sud-
Ouest (Ducatez et al., 2015 et données non publiées). Respectivement deux
écouvillons nasaux profonds (ENP, 2,8% des échantillons, provenance unité) et
six prélèvements (4,5% des échantillons, provenance LDA71), se sont avérés
positifs par RT-qPCR. Des co-infections ont été observées avec le BRSV, le
BoHV-1, P. multocida, M. haemolytica et H. somni dans 4 prélèvements du LDA71
et les 2 prélèvements de l’UMR. Pour 2 prélèvements (5831 et 5920, collectés en
2014 par le LDA71), seul l’IDV a été détecté. Le virus présent dans l’échantillon
présentant la charge virale la plus élevée a alors été séquencé et nommé
D/bovine/France/2986/2012. L’analyse phylogénétique de ses segments a montré
que D/2986 forme un groupe distinct qui se rapproche du groupe D/bovine/OK.
Les études de surveillance européennes se sont enchaînées depuis. En Italie en
2016, Chiapponi et al. (199) ont décrit la détection et la caractérisation génétique
de trois isolats d’IDV dont deux détectés dans des ENP de bovins atteint de BPI.
Les trois prélèvements dataient des années 2014 et 2015 pour les ENP bovins et
de 2011 pour l’ENP porcin. Les génomes analysés étaient très proches
génétiquement et appartiennent au groupe D/swine/OK. En Irlande, 320
échantillons respiratoires de bovins atteints par la BPI entre 2014 et 2016 ont été
analysés (211), l’IDV a été identifié dans 18 ENP. Le séquençage partiel et
l’analyse phylogénétique ont montré que les virus détectés appartiennent au
groupe D/swine/OK également. Enfin des études de sérologie menées en France
indiquent une prévalence variant de 38 à 70% selon les régions testées (données
non publiées).
L’ensemble de ces résultats suggère que les bovins sont l’hôte principal
de l’IDV. S’est automatiquement posée la question du pouvoir pathogène de l’IDV
dans cette espèce. Très rapidement après sa découverte deux études de
51
metagénomique sur des prélèvements respiratoires de bovins atteints de BPI aux
USA et au Mexique ont montré une corrélation positive significative entre la
détection du virus et la maladie respiratoire (76,180). Par la suite deux infections
expérimentales ont été réalisées qui ont montré un pouvoir pathogène respiratoire
principalement limité à l’appareil respiratoire supérieur (215,216). Ces études
seront détaillées dans la partie expérimentale et leurs résultats discutés.
Autres espèces
En 2015, des échantillons de sérums ont été prélevés sur 648 petits
ruminants (ovins et caprins) issus de 141 exploitations et dans 25 élevages
avicoles (poulets et dindes) situés dans différentes régions des Etats-Unis et du
Canada (217). Par IHA et séroneutralisation, des anticorps anti-IDV ont été
détectés chez 5,2% des ovins testés (13.2% des exploitations ovines) et chez
8,8% des caprins testés (13,5% des exploitations caprines). Concernant les
élevages avicoles, il n’a pas été détecté d’anticorps anti-IDV. Plus récemment le
génome de l’IDV a été détecté par RT-qPCR dans 27 échantillons de sérums de
chèvres (33,8%) et plus curieusement dans 12,5% des échantillons rectaux (201).
En revanche, aucun écouvillon nasal n’était positif dans cette étude. Ces résultats
montrent que l’IDV circule aussi chez les petits ruminants. Le pouvoir pathogène
de l’IDV chez ces espèces n’est en revanche pas documenté à ce jour.
52
Environnement microbien et pathologie V.
respiratoire
Si la notion d’agents infectieux respiratoires agissant sur un terrain
prédisposé par des facteurs d’élevage et environnementaux est un concept bien
établi en pathologie respiratoire, l’impact de l’environnement microbien a
longtemps été ignoré, une des raisons étant la croyance que l’appareil respiratoire
profond était stérile. Les données issues notamment de la biologie moléculaire ont
radicalement changé ce concept ces dernières années.
1. La notion de microbiote
Introduction et définit ions a.
L’avancement des techniques de biologie moléculaire centrées sur l’étude
du matériel génétique a montré que les humains et les animaux sont les créatures
minoritaires dans un énorme écosystème très complexe de microbes. Le corps
humain loge 10 fois plus de cellules bactériennes que de cellules du soi et 100 fois
plus de matériel génétique que son propre génome (218). Il est ainsi difficile
d’imaginer que ce « deuxième » génome que nous hébergeons sur nos surfaces
épithéliales est sans importance. Ces complexes poly-microbiens qui colonisent la
majorité des surfaces sur terre, dont nos tissus, sont généralement symbiotiques
et avantageux pour l’organisme hôte qui les héberge (219).
La description de ces communautés microbiennes complexes et de leur
environnement a fait l’objet de nombreuses définitions quelquefois contradictoires.
Les termes les plus utilisés dans ce domaine sont les suivants :
- Le microbiote représente l’ensemble des communautés microbiennes
présentes dans un environnement bien défini. Ces communautés
microbiennes en question regroupent l’ensemble des bactéries (on parle de
« bactériote » (220)), virus (on parle de « virome »), phages, archées, et
micromycètes (220,221). Bien que le terme semble apparaître vers le début
des années 50 (222), le terme microbiote est devenu commun vers les années
60 dans le lexique des laboratoires, à l’époque où les modèles animaux
53
gnotobiontes sont devenus populaires (223). Le terme de microflore a aussi
été utilisé pour décrire ces communautés mais dans la mesure où le mot
« flore » est plus spécifique des plantes, le terme microbiote apparait plus
adéquat pour désigner les microorganismes (224).
- Le microbiome est l’ensemble des communautés microbiennes en plus de
leurs gènes et de l’environnement qui les entoure (221,223,225,226). En
d’autres termes, un microbiome désigne un microbiote en prenant compte des
données géniques ou génomiques et des interactions avec son habitat. Selon
le dictionnaire Merriam-Webster (227), le terme microbiome est apparu pour la
première fois en 1952 dans une étude sur les protozoaires comme indicateurs
de la pollution de l’eau (222) mais son utilisation dans la littérature ne sera
répandue que dans les années 2000.
- Le metagénome est la collection des données géniques ou génomiques des
membres d’un microbiote issue d’un séquençage haut débit (225,226). En
d’autres termes c’est un dossier informatique contenant la totalité des
informations issues d’un séquenceur à haut débit. Dans certaines références,
les auteurs distinguent le terme metagénome du terme metataxonome, le
premier désignant les données issues d’un séquençage haut débit non ciblé
(shotgun sequencing) et le deuxième désignant les données issues d’un
séquençage haut débit ciblé (par exemple le gène 16s rRNA) (225,226). Un
metataxonome représente un métagénome contenant la collection des
données d’un gène unique et pouvant être utilisé pour construire un arbre
phylogénique.
Historique des études des communautés microbiennes b.
Les microorganismes associés au corps humain ont été étudiés depuis
plusieurs siècles dans les conditions de santé ou de maladie. La première étude
du microbiome humain a probablement commencé avec le scientifique
néerlandais Antonie Van Leeuwenhoek qui sera le premier à décrire la présence
des « animalcules » dans le grattage de la « substance granuleuse » accumulée
entre ses dents et observée sous microscope (228). Ainsi, en 1693, il sera le
premier à visualiser les bactéries nichées dans la plaque dentaire.
54
Ensuite, les microorganismes faisant partie d’une communauté
microbienne ont été identifiés in situ par les méthodes de coloration comme par
exemple la coloration de Gram (229). Ces méthodes, bien efficaces pour discerner
de façon vague les familles microbiennes, manquaient de précision quant à la
distinction taxonomique des espèces. De ce fait, la microbiologie est devenue
quasiment dépendante de la culture ; il était nécessaire de cultiver un
microorganisme au laboratoire afin de l’étudier. Différentes méthodes seront ainsi
développées pour la détection et la discrimination des espèces microbiennes :
l’utilisation des milieux de culture sélectifs, la discrimination selon la morphologie
des colonies bactériennes, et les capacités métaboliques de production ou de
consommation.
L’utilisation systématique des techniques de culture bactérienne a
probablement privilégié l’étude des espèces dites cultivables. Pourtant la grande
majorité (>99%) des espèces bactériennes n’est pas facilement cultivable (230).
Le terme « numération erronée en plaque » (plate count anomaly) a été utilisé
pour la première fois par Rasumov en 1932 (231) qui nota à partir d’échantillons
divers une différence de plusieurs ordres de grandeur entre d’une part les
bactéries identifiées par énumération microscopique et par culture en plaque.
Longtemps les moyens pour étudier les espèces bactériennes non cultivables sont
restés limités jusqu’au développement de méthodes indépendantes de la culture
qui se basent sur l’étude moléculaire de l’ADN (232). Ainsi le développement de
techniques analytiques à haut débit et la perception que les microorganismes sont
en majorité non cultivables par les méthodes classiques et qu’ils sont
responsables de la majorité des cycles environnementaux et des maladies
humaines et animales a changé notre conception des microorganismes et de la
façon de les aborder.
Les techniques moléculaires analysent le matériel génétique bactérien
extrait directement de l’échantillon et non pas d’une culture pure. Elles prennent
en compte la diversité taxonomique présente et permettent de décrire les
fonctions de chacun des membres de la communauté bactérienne (génomique
fonctionnelle). En résumé ces méthodes permettent d’avoir une vision plus réelle
55
et diversifiée des communautés microbiennes dans les différentes niches
biologiques étudiées.
Les premières tentatives d’étude de diversité d’une communauté
microbienne non cultivée étaient celles de David Stahl en 1984 et 1985 (233,234).
Dans leurs études, les ARN 5S ribosomiques des échantillons de l’environnement
étaient extraits, séparés par électrophorèse, séquencés, et leur phylogénie
analysée. Par la suite, Olsen et al proposa l’utilisation des molécules d’ARN
ribosomique (ARNr) plus grandes dans les études de l’écologie microbienne
comme les ARNr 16S (235). Cette application qui ressemble de loin aux
approches actuelles, a été utilisée pour la première fois en 1990 (236) et 1991
(237) pour caractériser des échantillons de plancton marin de l’océan Atlantique.
La méthodologie utilisée dans ces 2 études a consisté à extraire et fragmenter
l’ADN total et à le cloner dans un bactériophage. Les clones contenant les inserts
du gène d’ARNr 16S étaient ensuite sélectionnés, amplifiés en PCR avant d’être
séquencés. Les méthodes utilisées (PCR, clonage, synthèse d’amorces et de
sondes d’hybridation,…) ont été considérées à l’époque comme une évolution très
avantageuse dans la découverte des nouvelles espèces microbiennes (236–238).
L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) a été parmi les premiers outils
dits « culture-indépendants » utilisés dans les études de diversité microbienne in
situ. Cette méthode se base sur l’hybridation ciblée des acides nucléiques sans
extraction préalable (239).
Ces premiers outils ciblaient des gènes bactériens spécifiques ou des
fonctions biochimiques et reposaient sur le clonage et le séquençage individuel
des clones (236,237,240–242). Elles ont été capables de décrire la diversité
microbienne dans des échantillons de l’environnement et du contenu intestinal
particulièrement. Toutefois l’information fournie restait limitée.
Approches actuelles des analyses de la diversité c.
microbienne
Trois approches différentes de séquençage à haut débit peuvent être
utilisées dans les études de microbiome en fonction des objectifs : le séquençage
56
ciblé des amplicons, la metagénomique, et la metatranscriptomique. Le
séquençage ciblé des amplicons consiste à amplifier d’une façon spécifique un
fragment ou la totalité d’un gène et à le séquencer, les gènes en question sont
souvent très conservés comme le gène ADN ribosomique 16S et peuvent servir
pour déterminer la composition et la diversité microbienne d’un environnement. La
metagénomique consiste à séquencer tous les ADN présents dans un échantillon
dans le but d’identifier tous les gènes présents, cette méthode est utilisée dans la
recherche fonctionnelle (par exemple sur les gènes de virulence ou les voies
métaboliques) d’un microbiome ou dans le cas où les micro-organismes d’intérêt
ne possèdent pas de gène conservé (comme les virus et les phages) (155). La
metatranscriptomique ou « RNA-seq » consiste à séquencer l’ensemble des ARN
(le transcriptome) présents dans l’échantillon ; l’analyse des résultats générés vise
à identifier les transcrits présents et l’expression des gènes dans l’environnement
étudié. En d’autres termes, le choix de l’approche peut se baser sur les questions
suivantes : séquençage ciblé des amplicons ou « Qui est là ? », la
metagénomique ou « qu’est-ce qu’ils peuvent faire ? », et la metatranscriptomique
ou « qu’est-ce qu’ils font ? » (243).
Toutes ces approches reposent sur le séquençage à haut débit, le choix
repose essentiellement sur les objectifs fixés et les questions posées. Par ailleurs
la préparation des échantillons, les analyses bio-informatique et l’interprétation
des données différentes selon les méthodes choisies.
Le séquençage du gène ADN ribosomique 16S est parmi les premières
méthodes utilisées dans les études des communautés bactériennes (224). Il
fournit une description quantitative (224) des espèces bactériennes présentes
dans des échantillons de nature diverses permettant ainsi l’identification et les
analyses de diversité des communautés complexes. Le gène ADNr 16S code pour
l’ARN ribosomique (ARNr) 16S qui constitue la petite sous-unité des ribosomes
des procaryotes. Il est constitué d’une alternance de régions conservées et
variables, ce sont ces dernières qui permettent la discrimination entre les
différentes espèces bactériennes (244). Le séquençage à haut débit d’une ou
plusieurs régions variables du gène ADNr 16S est généralement précédé par une
amplification de cette séquence cible à l’aide d’une réaction de PCR. Ce sont les
57
amplicons produits qui sont alors utilisés pour la préparation des librairies de
séquençage (224). L’analyse bio-informatique des lectures générées par le
séquençage ADNr 16S passe par plusieurs étapes durant lesquelles les
séquences similaires sont groupées pour former des unités taxonomiques
(operational taxonomic units, OTU) et affiliées en les comparant à des bases de
données (par exemple : RDP, silva128 16S, greengenes). Les OTU identifiées
ainsi que le dénombrement de ces taxons pour chaque échantillon sont classées
dans une table d’abondance qui sera utilisée ultérieurement pour les analyses de
biodiversité.
2. Le microbiote respiratoire de l’homme
Historique a.
Longtemps les poumons ont été considérés comme un organe stérile chez
l’homme en bonne santé (245). Cette croyance et le fait que les méthodes
d’investigation de l’appareil pulmonaire étaient considérées comme invasives et à
risque expliquent en partie que cet organe n’était pas dans la liste des tissus du
projet « Human microbiome project » (HMP) (Figure 5). Le HMP lancé en 2008 est
l’étude de la diversité microbienne la plus importante en terme de budget (150
millions de dollars ) et de débit de donnés générées (246). Il avait comme objectifs
à partir de prélèvements réalisés sur 250 volontaires qualifiés comme « sains »,
de caractériser le microbiome lié aux différents sites du corps humain en utilisant
les outils biologiques à haut débit, de déterminer les associations entre les
perturbations du microbiome et l’état de santé ou de maladie et finalement de
fournir des ressources et des approches techniques standardisés afin de les
diffuser dans la communauté scientifique (247)
58
Figure 5 : Chronologie des études sur les communautés microbiennes. Les cercles représentent les projets basés sur le séquençage profond du gène 16s ou metagénomique (shotgun) trouvés sur NCBI jusqu’à Mai 2012. La
59
grandeur de chaque cercle reflète la quantité de séquences générées par le bio projet. D’après (230)
La première étude décrivant un microbiome respiratoire bas (248) chez
l’homme a été fortement critiquée et sa méthodologie remise en question. Depuis
d’autres études sont venues confirmer la présence d’un microbiome respiratoire
bas, la notion d’un microbiome « normal » colonisant l’arbre respiratoire de
l’homme et sa relation avec certaines maladies respiratoires étant maintenant
acceptée. En outre, les études se basant sur les séquences du gène ribosomique
16S révèlent une sorte de consensus sur les phylums bactériens présents dans
l’appareil pulmonaire sain, que sont les phylums Firmicutes, Bacteriodetes,
Proteobacteria, Fusobacteria, et Actinobacteria (249–251).
Le nombre d’études portant sur le microbiome respiratoire chez l’homme
est en augmentation remarquable depuis quelques années, ces études se basant
entièrement sur les outils de séquençage à haut débit. Le résultat d’une recherche
simple sur Pubmed comprenant les termes suivants : « respiratory » OR « lungs »
AND « microbiome » OR « microbiota » est suffisant pour illustrer cette croissance
annuelle (Figure 6). Ces études traitent majoritairement des maladies respiratoires
à caractère inflammatoire aigu et/ou chronique, et génétique chez l’homme
comme par exemple la bronchopneumopathie chronique obstructive (252–254),
l’asthme (248,255), l’allergie (256) et la mucoviscidose (257–259).
Figure 6 : Evolution du nombre d’études sur le microbiome respiratoire
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
18
46
18
85
18
92
18
98
19
05
19
12
19
18
19
24
19
30
19
36
19
42
19
48
19
54
19
60
19
66
19
72
19
78
19
84
19
90
19
96
20
02
20
08
20
14
année
nombre d'études
60
Ecologie du microbiome respiratoire en homéostasie et b.
dysbiose : description chez l’homme
Le système respiratoire se constitue majoritairement d’un réseau
d’épithéliums en contact direct avec l’environnement extérieur. Chez l’homme et
les mammifères, la complexité anatomique et histologique de l’arbre respiratoire
est à l’origine d’une écologie microbienne diversifiée créant ainsi différentes
niches microbiennes reparties sur les différents niveaux du tractus respiratoire.
Ces différences sont majoritairement dues à des variations de l’humidité, de
l’oxygénation, de l’acidité du tractus luminal aérien et de la nature des cellules
épithéliales (260). Dans les minutes qui suivent la naissance on peut détecter des
communautés bactériennes présentes dans la cavité orale et dans le
nasopharynx, indiquant d’abord une colonisation précoce de l’arbre respiratoire
superficiel puis de l’arbre respiratoire profond (261,262).
Plusieurs hypothèses ont été proposées (254,263) pour expliquer la
formation des microbiotes dans leurs habitats, la plus souvent admise est celle de
l’écologie de la communauté décrite par Mark Vellend (260). Dans ce modèle,
l’écosystème formé par le microbiote n’est pas soumis juste à la pression de
sélection de son environnement mais aussi à une combinaison d’évènements
sélectifs et aléatoires (264) que sont la dispersion, la sélection, la spéciation, et la
dérive écologique. Le phénomène de dispersion, qui représente le mouvement
des microorganismes dans les habitats, est responsable de la première
colonisation du système respiratoire superficiel dans les instants après la
naissance (265). L’exposition d’un être naïf à l’environnement extérieur va induire
une colonisation non différenciée sur la totalité de son organisme, d’où la nature
aléatoire de ce phénomène. La sélection, par contre, repose sur les capacités
adaptatives et évolutives de différentes populations microbiennes. La sélection
influence la prolifération et les taux de réplication de certaines espèces
bactériennes et est à l’origine de la mise en forme de la structure du microbiome
en termes d’abondance et de composition. La pression qu’exerce l’environnement,
ainsi que les conditions physico-chimiques sont à l’origine de la structure des
différents microbiomes dans chaque partie de l’arbre respiratoire. La spéciation
représente-elle un isolement génétique dans un habitat spécifique dans lequel des
61
espèces s’adaptent et s’individualisent grâce à des évènements de mutations et
de recombinaison ? Similaire à la spéciation, la dérive écologique est par contre
liée au hasard. Ces évènements écologiques semblent gérer les interactions
entres les bactéries aboutissant à une écologie très dynamique des microbiomes
respiratoires (260).
Un microbiome colonisant un habitat biologique constitue une entité
génomique et écologique très dynamique, et souvent dépassant en nombre de
microorganismes et de gènes celles de l’organisme hôte (247,266). La
composition des microbiomes colonisant une niche biologique d’une même
espèce hôte est variable avec l’âge (267), la population, l’environnement, les
conditions de vie (268), l’exposition à des substances pharmaceutiques ou
chimiques (269), et diverses autres conditions (270).
La perturbation du microbiote, aussi appelée dysbiose correspond à un
état dans lequel le microbiote subit des changement en terme de composition et
de diversité suite à un évènement perturbateur et aboutissant à une maladie
(256) : d’où le rôle fondamental des microbiomes dans la physiologie des
organismes hôtes qui les hébergent et leur considération dans les approches de
diagnostic et thérapeutique actuelles. Les interactions qui ont lieu entre l’hôte et
les communautés microbiennes qui colonisent les muqueuses sont fondamentales
pour le développement et la régulation du système immunitaire inné et acquis ; la
nature de l’exposition du microbiote intestinal nouvellement installé chez les
nouveau-nés est démontrée cruciale pour le développement et la modulation d’un
système immunitaire sain, ce microbiote contenant l’ensemble des premiers
antigènes se présentant à l’organisme (251,256,263,271–275). Il est aussi
important pour la maintenance de l’homéostasie métabolique, pour exemple la
surproduction des acides gras volatils suite à une perturbation du microbiote
intestinale et à l’obésité (276,277) et des fonctions neurologiques, comme par
exemple la capacité de certains micro-organismes du microbiote intestinal
d’influencer le comportement de l’hôte par la production des composés
neuromédiateurs analogues à ceux produits dans le système nerveux central
(278). L’augmentation du risque de l’athérosclérose chez la souris ferait aussi
62
suite à la production exagérée par certaines bactéries intestinales de
triméthylamine-N-oxide (279).
Pour le système respiratoire, les données sont bien moins nombreuses.
Cette différence est due principalement à la difficulté d’échantillonner les cavités
respiratoires basses, au manque de modèles, et à la faible charge bactérienne
dans le tractus respiratoire aboutissant à un ratio positif en faveur des cellules de
l’hôte (280,281). Le système respiratoire est considéré comme pauvre en
ressources nutritionnelles nécessaires pour une prolifération microbienne
abondante comparé au système gastro-intestinal.
Microbiome et pathologie respiratoire c.
Si on considère que le microbiome interagit avec l’homéostasie de l’hôte,
toute perturbation majeure de ce microbiome pourrait avoir des conséquences sur
l’état de santé. De nombreux facteurs régulent la prolifération bactérienne dans les
cavités respiratoires tels que la pression en oxygène dans le tissu, la nature de
l’irrigation sanguine du tissu, le pH de l’épithélium, la température locale, et la
nature des cellules inflammatoires présentes (251).
A chaque inspiration des microorganismes vont se trouver en contact avec
la muqueuse respiratoire des cavités nasales (282). En plus de l’extension directe,
la micro-aspiration est un phénomène normal permettant la migration des
microorganismes du système digestif superficiel vers le système respiratoire
superficiel. L’élimination des particules et des microbes colonisant est assurée
dans un premier temps par le tapis « muco-ciliaire » présent au niveau des
bronches, par la toux, ainsi que par la phagocytose par les cellules immunitaires
résidantes dans la muqueuse (251,260,283,284). Ainsi, ces trois facteurs
contrôlent le dynamisme du microbiote de l’arbre respiratoire et maintiennent un
état d’équilibre à l’état normal. Toute altération de la composition ou de la charge
du microbiome respiratoire peut être attribuée à un dysfonctionnement d’un ou
plusieurs de ces facteurs (282).
Dickson et al (263) a proposé différents modèles pour expliquer la
pathogenèse respiratoire et le changement que subit l’écosystème pulmonaire
63
durant une pneumonie. Le premier modèle, adapté des données de l’écologie des
espèces terrestres, considère les cavités respiratoires superficielles et profondes
comme deux entités séparées. Ce modèle se base sur la migration et le taux
d’extinction des espèces. La migration est dépendante de la différence de
richesse ; les microorganismes tendent à coloniser les tissus ayant une richesse
en micro-organismes inferieure. Le taux d’extinction dépend lui des capacités
d’élimination des microorganismes par l’appareil respiratoire (toux, activité muco-
ciliaire, immunité innée et acquise).
Le deuxième modèle écologique adopte la notion du gradient
environnemental qui représente la variation des facteurs physico-chimiques le
long du tractus respiratoire (température, pression d’oxygène, circulation
sanguine, salinité, pH…). L’abondance et la diversité ainsi que le mouvement des
espèces qui colonisent le système respiratoire sont directement liés à ce gradient.
Le troisième modèle considère l’écosystème microbien dans les poumons
comme un système complexe adaptif. Dans ce modèle, tous les facteurs déjà
cités sont pris en compte : les facteurs environnementaux, les facteurs de
virulence, les conditions physico-chimiques, le système immunitaire, les structures
anatomiques et physiologiques ainsi que les interactions des bactéries entre elles
et avec les virus, tous ces facteurs interagissent ensemble d’une façon complexe.
Par définition, un système complexe adaptif est non linéaire et très dynamique, il
possède des capacités à changer rapidement et à s’adapter à de nouvelles
conditions. Dans ce modèle l’écosystème respiratoire sain est considéré en état
d’homéostasie, et la pneumonie, donc la maladie, est un phénomène foudroyant
dans lequel le microbiote a une diversité microbienne basse (richesse en espèces)
et une biomasse (charge microbienne) abondante ainsi qu’une réaction
inflammatoire agressive.
Ces modèles montrent la nécessité d’étudier la relation microbiome-
maladie dans une perspective écologique et non pas microbiologique classique
(285).
64
3. Interactions microbiome et agents pathogènes : le pathobiome
Si on considère que l’appareil respiratoire profond héberge une
communauté microbienne résidente, quelles peuvent être les relations entre cette
communauté et des agents pathogènes respiratoires connus ?
Autrefois le postulat de Koch « un microbe, une maladie » se résumait
comme suit : le microorganisme est présent dans tous les cas de la maladie, il doit
être absent dans tous les autre cas, et finalement, le microorganisme doit pouvoir
déclencher la maladie après avoir été isolé et cultivé dans un milieu pur (161). Ce
dogme datant de 1890 a été fragilisé depuis que l’on considère le caractère
multifactoriel et multimicrobien des maladies respiratoires (286). Les limitations au
postulat de Koch ont en effet rapidement émergé avec la découverte du portage
sain pour plusieurs agents pathogènes (exemple Vibrio cholera) ou avec
l’identification de virus répondant rarement au postulat (287). Mais c’est durant la
dernière décennie et avec le développement d’outils de séquençage que les
postulats de Koch ont été soit remis en question soit adaptés en intégrant les
données moléculaires obtenues sur des communautés microbiennes entières.
Grace aux données générées par les approches de biologie moléculaire
récentes, est apparu la définition d’un « microbiote infectieux complexe » ou
« pathobiome » pour désigner les interactions entre un microbiome et des agents
pathogènes durant une maladie au sein d’un organe ou d’un tissu donné (288).
Une telle approche semble être en discordance avec les modèles traditionnels
d’infection surtout des organes et tissus stériles comme le sepsis ou la méningite
où l’agent étiologique est unique et l’évolution préalablement connue. Comme déjà
démontré dans plusieurs études, le microbiome normal peu se transformer en
microbiome virulent sous certaines conditions (288) et inversement, un
microbiome normal peut héberger des microorganismes connus comme étant
pathogènes sans qu’il n’y ait nécessairement de maladie (260).
Etudier un pathobiome repose alors sur la compréhension des interactions
de tous les membres du microbiote avec l’environnement qui les entourent. Ce
travail complexe demande (i) une bonne connaissance des différents
microorganismes qui constituent cette communauté et surtout de ses agents
65
connus comme étant pathogènes, (ii) des preuves qui lient les membres de cette
communauté à la pathogenèse, (iii) une connaissance sur le rôle de la
communauté microbienne ainsi que sur la persistance, transmission et évolution
des agents pathogènes présents, et (iv) une connaissance sur les facteurs
biotiques et abiotiques qui peuvent modifier la composition du microbiome et
amener à une pathogenèse (288).
Au final les interactions peuvent être de nature agoniste ou antagoniste au
sein des écosystèmes microbiens. Une étude sur la pathogenèse du poliovirus
dans un modèle souris a montré que les souris ayant un microbiote intestinal
déplété étaient moins susceptibles à l’infection par le virus (289). A l’inverse des
effets antagonistes ont été mis en évidence, comme par exemple la présence de
certaines entérobactéries dans l’intestin des moustiques (vecteurs de la malaria)
qui rendait le microbiote intestinal du moustique résistant à la colonisation par le
parasite Plasmodium falciparum, agent responsable de la malaria chez les
humains (290). Ce phénomène de protection des organismes commensaux contre
des agents pathogènes est désigné « résistance de colonisation » (Figure 7). Ces
microorganismes commensaux protègent leur hôte en inhibant directement l’agent
pathogène ou en renforçant le système immunitaire (291). Ce même phénomène
a été validé dans une étude dans laquelle des intestins de souris pré-colonisés par
Clostridium scindens, une bactérie commensale, ont montré une amélioration des
signes cliniques suite à une infection par Clostridium difficile, une bactérie très
pathogène responsable d’une entérite aigue (292). Dans une autre étude, une
souche particulière d’E. coli (O21:H+) dans l’intestin de souris s’est montrée
protectrice (absence de cachexie) dans un modèle d’infection du tractus gastro-
intestinal. Dans cette même étude, le transfert du microbiote résistant des souris
protégées à des souris sensibles a permis de les protéger (293). Le mécanisme
envisagé de protection par le microbiome et particulièrement E. coli O21:H+ ferait
intervenir une stimulation du système immunitaire inné.
66
Figure 7 : Résistance de colonisation. (A) selon le postulat de Koch, un agent pathogène peut déclencher une maladie. (B) Cette théorie est remise en question quand un autre microorganisme peut induire une protection contre l'agent pathogène. (C) Dans d’autres cas, un microbiote peut avoir un effet protecteur encore plus important. D’après (291)
4. Microbiome et pathobiome respiratoire bovin
Les études sur le bactériote respiratoire des jeunes bovins sont récentes
et en plein essor. La volonté d’explorer ces communautés bactériennes très
complexes et inconnues et la facilité qu’offrent les outils de séquençages à haut
débit expliquent ce progrès très rapide. Dans cette partie, nous désignons par
« bactériote » la communauté bactérienne analysée puisque dans l’ensemble des
études, les autres composantes du microbiote (virus, champignons et archées)
n’ont pas été abordées. La grande majorité des études publiées concerne les
élevages de type feedlot aux USA et au Canada où les BPI apparaissent quelques
jours après la mise en lot de centaines de veau provenant de nombreux élevages.
67
Un premier objectif était d’étudier de manière dynamique la biodiversité du
microbiote respiratoire nasopharyngien des veaux à l’allotissement puis 40 ou 60
jours après, aux dates correspondant à l’apparition des BPI. Ces travaux ont
principalement été menés à l’Université de Calgary où l’équipe de Holman a
montré dans une première étude (294), qu’au jour de l’allotissement, la grande
majorité des séquences obtenues par NGS appartenaient au phylum
Proteobacteria (93% des séquences générées), le phylum Firmicutes étant le seul
autre à contenir plus d’1% des séquences totales. Par contre au jour 60 après
allotissement, de nouveaux phylums avec plus d’1% d’abondance relative
apparaissaient, tels que les phylums Actinobacteria, Tenericutes, et Bacteroidetes.
En étudiant les genres bactériens, les plus abondants à l’allotissement
étaient Pseudomonas, Shewanella, Acinetobacter, et Carnobacterium alors qu’au
jour 60, les genres Staphylococcus, Mycoplasma, Mannheimia, et Moraxella
prédominaient. Dans une 2e étude les même auteurs ont identifié le bactériote
nasopharyngé selon la même cinétique mais en comparant deux groupes de 5
veaux traités ou non aux antibiotiques pour cause de BPI (102). Ils ont utilisé une
puce à ADN (du genre Phylochip), capable d’identifier 8741 taxons bactériens
différents par hybridation spécifique de 297 851 sondes ciblées sur le gène 16S
ribosomique. Plus de 75% des OTU identifiées appartenaient aux phylums
Proteobacteria et Firmicutes sans différence entre veaux malades et sains. La
famille Acidobacteriaceae, qui regroupe des bactéries de l’environnement, était le
taxon omniprésent dans tous les échantillons. Les veaux cliniquement sains
présentaient des abondances relatives supérieures aux veaux malades pour les
familles bactériennes Micrococcaceae, Lactobcillaceae et Bacillaceae à l’entrée
au feedlot et Micrococcaceae et Lachnospiraceae 60 jours plus tard. Concernant
les pasteurelles responsables de BPI, aucune différence n’a été observée entre
les deux groupes au jour de l’entrée en feedlot. Par contre, tous les veaux atteints
à l’entrée possédaient au moins un taxon appartenant à M. haemolytica ou à P.
multocida, ces taxons n’étaient plus détectables au jour 60. La détection des
Mycoplasmes n’était pas abordée dans cette étude. Indépendamment des
groupes, c’est le phylum Actinobacteria qui a subi une diminution forte de
l’abondance relative au cours du temps. De même les familles
Enterobacteriaceae, Oxalobacteraceae, et Pasteurellaceae ont vu leur abondance
68
baisser au cours du temps à l’inverse des familles Micrococcaceae et
Pseudomonadaceae. Les auteurs considèrent ainsi que le microbiote subit des
modifications entre l’allotissement et la période d’apparition des BPI, sans pouvoir
établir de lien direct entre modification du microbiote et pathologie respiratoire.
Une étude similaire a alors été menée, mais en utilisant cette fois le séquençage
NGS de Illumina Miseq, dans le but de caractériser l’évolution du bactériote
nasopharyngien chez 30 veaux entre les jours 0 et 40 après l’entrée dans le
feedlot (295). Les animaux inclus étaient préalablement vaccinés contre les
pathogènes suivants, BoHV-1, BVDV1-2, BPi3, BRSV, Clostridium chauvoei, C.
haemolyticum, C. novyi Type B, C. perfringens Types B, C et D, C. septicum et C.
tetani. De même les veaux atteints de BPI étaient traités aux antibiotiques
(florfenicol). Les phylums les plus abondants dans tous les prélèvements étaient
les Tenericutes (53.2% dont 99.8% Mycoplasma pp), Proteobacteria (34.7%),
Firmicutes (4.2%), Bacteroidetes (3.7%), et Actinobacteria (3.4%). Des différences
majeures ont été observées dans la composition des classes de bactérie par
rapport à leurs précédents résultats, notamment pour les espèces Mycoplasma
dispar et Mycoplasma bovirhinis qui étaient les plus abondantes. Entre l’entrée et
40 jours plus tard, 92 OTU ont subi un changement d’abondance relative
(augmentation ou diminution) chez les veaux. Une augmentation a été observée
pour les genres Acinetobacter, Aerococcus, Amycolatosis, Anaerofilum, et
Bifidobacterium et une diminution pour Aneurinibacillus, Bavillus, Brevibacillus,
Enterococcus, et Pasteurella. Le bactériote a ainsi subi un changement de
composition mais sans corrélation avec les signes cliniques ; parmi les 30 veaux,
seuls 3 veaux ont en effet développé des signes de BPI.
Le 2e groupe d’études porte sur la composition du bactériote respiratoire
en fonction de la nature et du lieu de prélèvement. Seules quelques études
récentes se sont intéressées au bactériote respiratoire profond (296–299). La
première a exploré la composition et la structure des bactériotes respiratoires
superficiels et profonds de 8 veaux charolais cliniquement sains, âgés de 6 à 8
mois (298). Les veaux n’avaient pas reçu de traitement antibiotique mais avaient
été vaccinés contre le BoHV-1, le BVDV, le BPi3 et le BRSV. Dans un premier
temps les biodiversités alpha (intra échantillon) et beta (inter échantillon) des
69
taxons bactériens ont été comparées entre les deux types de prélèvements.
Aucune différence n’a été trouvée pour la diversité alpha, par contre une
distinction significative de la diversité beta a été observée, suggérant une disparité
écologique importante entre les deux niveaux de l’appareil respiratoire. Les
auteurs se sont ensuite intéressés aux différents taxons composant le bactériote.
Ils ont montré une prédominance dans les ENP des phylums Actinobacteria
(43,9% versus 4,9% dans les LBA), Tenericutes (12,1% versus 8,8% dans les
LBA). En revanche dans les LBA on trouvait préférentiellement les phylums
Proteobacteria (33,3% versus 15,9% dans les EN), Bacteroidetes (18,2% versus
8,8% dans les EN), et Fusobacteria (3,4% versus 0,1% dans les EN). Une
différence significative en terme d’abondance relative entre les EN et les LBA a
été notée pour les phylums Proteobacteria et Actinobacteria. En affinant la
taxonomie au genre, les genres bactériens Rathayibacter, Flavisolibacter,
Micrococcus, Agrococcus, et Cellulomonas sont apparus significativement plus
abondants dans les cavités nasales alors que Bibersteinia, Streptococcus et
Bacteroides étaient plus abondants dans les poumons. Aucune différence
significative n’a été mise en évidence pour les genres bactériens associés aux BPI
tels que Mycoplasma, Mannheimia, et Pasteurella. A l’aide d’une analyse de
régression linéaire multiple les auteurs ont ensuite montré une association
spécifique entre certains taxons des deux cavités, Mycoplasma, Sneathia,
Moraxella, Mannheimia, Succinivibrio, Ruminococcus et Flavisolibacter. De plus
certains taxons du nasopharynx étaient prédictifs de la présence d’autres taxons
dans les LBA. Ainsi la présence de Streptococcus dans les EN était fortement
prédictive de la présence de Moraxella et Mycoplasma dans les LBA. De même, la
présence de Bacteroides, Promicromonospora et Mycoplasma dans les EN étaient
fortement associés à Mannheimia, Bibersteinia et Mycoplasma dans les LBA. La
même équipe s’est ensuite intéressée dans une 2e étude à ce qui se passe chez
les veaux malades (M. Zeineldin et al 2017). Soixante-six veaux ont été
sélectionnés en début d’allotissement, dont 22 veaux ont présenté une BPI
diagnostiquée. Dix veaux ont été inclus comme contrôles négatifs et prélevés au
même moment, à l’entrée en feedlot et un mois après. Ainsi, 4 groupes de
bovins ont été inclus : BPI-E (malades juste après entrée), BPI-D (diagnostiqués
un mois après l’arrivée), sains-E (sains après l’entrée), et sains-D (sains contrôles
70
au même moment que les BPI-D). Au niveau des phylums, des différences
significatives (test Wilcoxon/ Kruskal-Wallis) ont été observées entre les 4 groupes
de veaux pour Proteobacteria, Actinobacteria, et Fusobacteria. Les phylums
Proteobacteria étaient plus fréquemment identifiés chez les veaux malades et les
phylums Actinobacteria et Fusobacteria chez les veaux sains. Au niveau genre,
les différences statistiques ont été détectées pour Acinetobacter, Rathayibacter,
Corynebacterium, Solibacillus, et Turicibacter. Par analyse à l’aide de l’algorithme
LEfSe, les OTU spécifiques du groupe veaux sains étaient Rathayibacter,
Cellulomonadaceae et Bacteroidales alors que ceux du groupe malade BPI-D
étaient Arcanobacterium, Actinomycetaceae, Microbacterium, Lysinibacillus,
Solibacillus, Bacillus, Comamonas, Burkholderiales, Neisseriales, Acinetobacter,
Moraxellaceae, Pseudomonadales, Stenotrophomonadaceae,
Xanthomonadaceae et Xanthomonadales. In fine, aucune différence significative
en terme de biodiversité (richesse en espèces) n’a été trouvée entre les groupes.
En 2017 Johnston et al. a étudié le bactériote des poumons et des nœuds
lymphatiques respiratoires prélevés sur des échantillons provenant d’animaux
atteints de BPI. Au total 38 échantillons de lobe crâniaux pulmonaires et 32
nœuds lymphatiques médiastinaux provenant de 32 veaux de boucherie et 6
veaux laitiers atteins de BPI ont été testés. Vingt prélèvements de poumons et 20
prélèvements de nœuds lymphatiques provenant de veaux sains ont servi de
contrôles négatifs. Si la biodiversité des taxons bactériens n’a pas été abordée,
les auteurs se sont focalisés sur plusieurs variables telles que le type de tissu
(lobe crânial du poumon ou nœud lymphatique médiastinal), le type de production
(bœuf de boucherie ou veau laitier), l’état de santé du veau (présence de signes
respiratoires et lésions pulmonaires, absence de signes respiratoires mais
présence de lésions pulmonaires, absence de signes respiratoires et présence de
lésions pulmonaires). Des tests statistiques ont été utilisés pour révéler les
différences qui existent en termes de détection et d’abondances taxonomiques,
dans les différents types de prélèvements entre les deux types de productions en
question. Le tableau 2 résume les principaux résultats d’abondances
taxonomiques :
71
Tableau 2 : Abondances relatives des familles bactériennes trouvées dans les poumons et les nœuds lymphatiques (NL) de veaux cliniquement sains ou atteints de BPI, ayant ou pas des lésions pulmonaires, dans les productions laitières ou de boucherie, d'après (299).
72
Les taxons suivants : Leptotrichiaceae, Fusobacterium, Pasteurella,
Trueperella, Helcococcus, et Ureaplasma étaient abondants dans les poumons et
nœuds lymphatiques des veaux de boucherie et laitiers atteints de BPI. Par
contre, les taxons : Leptotrichiaceae, Fusobacterium, Mycoplasma, Trueperella et
Bacteroidetes étaient plus abondants dans les poumons des veaux laitiers atteints
de BPI comparés aux poumons des veaux sains et sans lésions.
Dans leurs études de comparaison des bactériotes superficiels et
profonds des veaux atteints de la BPI, Nicola et al. (296) et Timsit et al. (297) ont,
eux, utilisé la méthode de l’aspiration trans-trachéale (ATT) comme méthode
d’échantillonnage du tractus respiratoire profond. Bien que l’ATT soit une
technique aseptique et peu invasive, elle permet de récupérer le lavage drainant la
trachée et les grosses bronches mais pas le tissu pulmonaire profond (bronchioles
et alvéoles). Ainsi Timsit et al. (2018) ont récemment analysé la composition et la
diversité du bactériote respiratoire nasopharyngien et trachéal chez 60 veaux
atteints de la BPI et 60 veaux cliniquement sains des mêmes feedlots. Ils ont
montré que la richesse microbienne chez les veaux atteint de BPI était inférieure à
celle de leurs camarades cliniquement sains que ce soit dans les EN ou dans les
ATT. Parmi tous les phylums détectés, les plus abondants étaient les Tenericutes
(47,4%), Proteobacteria (26,0%) et Firmicutes (20.7%). Les genres bactériens les
plus abondants étaient Mycoplasma (46,8%), Lactococcus (18,02%), et
Histophilus (10,1%). Plus précisément, les taxons ont été regroupés dans des
metacommunautés (élément où la contribution était la plus élevée selon la
méthode de Dirichlet). La métacommunauté 1, comprenant les pathogènes
classiques des BPI comme M. bovis, M. haemolytica et P. multocida, était
fortement représentée chez les veaux atteints de BPI. La métacommunauté 2,
constituée de H. somni, Moraxella et des variants de L. lactis, était également
présente chez des veaux sains et atteints de BPI, majoritairement dans un feedlot
testé. La métacommunauté 3, constituée de M. dispar, L. lactis et L. casei, était
majoritairement présente dans les trachées des veaux sains et la
métacommunauté 4 (Corynebacterium, Jeotgalicoccus, Psychrobacter et
73
Planomicrobium) uniquement présente dans le nasopharynx des veaux
indépendamment de l’état de santé.
La comparaison veaux atteints de BPI et veaux sains a aussi été
investigué par Gaeta et al. (300) en utilisant cette fois une approche de
métagénomique (WGS) ciblée sur l’ensemble des gènes. Six jeunes génisses
atteintes de BPI ont été prélevées par ENP en deux jours différents (14 et 28 jours
d’âge) après l’apparition des signes cliniques. Dix veaux sains choisis
aléatoirement ont aussi été prélevés les mêmes jours pour finalement aboutir à 4
groupes finaux : BPI-J14, BPI-J28, sains-J14 et sains-J28. Les phylums
Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, et Tenericutes ont
regroupé 80-96% des séquences dans tous les groupes. Seul le phylum
Bacteroidetes était différent entre les 4 groupes en termes d’abondance.
Concernant les pathogènes respiratoires connus, il n’a pas été observé de
différences significatives statistiques entre les groupes pour Mannheimia,
Pasteurella et Mycoplasma. Curieusement, Mannheimia haemolytica a été détecté
chez 78% des veaux de l’étude et a été l’espèce la plus abondante au jour 28
dans les groupes BPI et sains. En considérant les biotypes, l’abondance relative
de M. haemolytica A1 était significativement augmentée chez les veaux des
groupes BPI-J14 et 28 par rapport aux veaux sains du J14. Une augmentation des
autres biotypes de M. haemolytica a été observée mais sans différence
significative. Quant à Mycoplasma bovis, cette espèce était présente chez 16.7%
des veaux des deux groupes BPI, chez 40% des veaux sains le jour 28 et était
absente chez les veaux sains au J14. Cela infirme le portage sain de M. bovis à
l’opposé des autres bactéries comme les pasteurelles. Enfin l’utilisation de la
métagénomique, par rapport au séquençage 16S, a permis aux auteurs d’explorer
la fonctionnalité des gènes. Ils ont notamment remarqué une abondance des
gènes de résistance aux cobalt-zinc-cadmium chez un groupe de veaux, une
observation très intéressante dans l’étude de l’évolution des métagénomes
respiratoires après l’allotissement et le dynamisme de l’apparition des gènes de
résistances aux antibiotiques dans ce type d’élevage.
En bilan, ces études ont permis de faire ressortir un consensus pour le
bactériote considéré « normal » (animaux sains) si on étudie les phylums
74
bactériens. Dans les cavités nasopharyngiennes des veaux non malades, les
taxons les plus abondants sont les Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes,
Actinobacteria, et Bacteroidetes. Dans le tractus profond pulmonaire il s’agit alors
de Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, et des Firmicutes. Par contre
établir un consensus aux niveaux taxonomiques plus en aval (familles, genres, ou
espèces) apparait difficile vu les résultats divergents observés. La même
observation peut être faite si on cherche un consensus de bactériote dysbiotique
ou « malade » prédominant lors de BPI. Enfin parmi toutes les études existantes,
aucune n’a pris en considération les effets des co-infections virales sur la structure
microbienne. Johnston et al. (2017) a été le seul à montrer des résultats
d’examens virologiques et bactériens mais sans aucune relation d’association
avec la structure des microbiotes. Par ailleurs, la majorité des veaux de ces
études ont été vaccinés contre les pathogènes respiratoires et traités aux
antibiotiques avant le prélèvement. Même si cela reflète la réalité du terrain, ces
éléments doivent être pris en compte comme potentiellement interférant avec les
structures des microbiotes et leurs dynamismes durant la maladie.
75
OBJECTIFS
Depuis 40 ans, les concepts ont progressivement évolué quant aux
causes et aux mécanismes physiopathologiques des BPI. Si autrefois on ne
considérait que l’agent pathogène, très vite sont apparues des notions de
sensibilité de l’hôte et de facteurs de risque qui modulent la sévérité des affections
respiratoires. Les BPI ont ainsi été définies comme des « affections inflammatoires
de l’appareil respiratoire profond, d’allure contagieuse et d’étiologie plurifactorielle
incluant des agents infectieux relayés par des facteurs liés à la conduite d’élevage
et à l’environnement ». Les notions d’agent infectieux elles-mêmes ont aussi
progressé, notamment avec l’avènement des techniques de biologie moléculaire
puis les techniques dites à haut débit ou « omiques ». Nous sommes ainsi passés
des monoinfections à agents pathogènes majeurs (BRSV ou M. haemolytica) aux
co-infections virus-bactéries (virus dits initiateurs et bactéries de surinfection) puis
plus récemment à la notion d’ensembles d’agents infectieux plus ou moins
pathogènes agissant sur un terrain plus ou moins prédisposé. La notion de terrain
a elle-même évolué avec l’identification d’un microbiote respiratoire de l’appareil
superficiel mais aussi profond.
Ces notions soulèvent plusieurs questions scientifiques. Si les techniques
modernes permettent de détecter un grand nombre de virus présents dans
l’appareil respiratoire, quels sont-ils et quel est leur rôle réel dans la genèse et
l’impact des BPI ? Par ailleurs l’identification du microbiote respiratoire pose aussi
la question de son impact possible sur les BPI, ou vice-versa.
Il est probable que le nombre de virus respiratoires impliqués dans les BPI
augmente à l’avenir, comme cela a été le cas avec l’apparition des
metapneumovirus et bocavirus en Santé Humaine. L’équipe IHVV a ainsi
récemment identifié (208) un nouveau virus influenza D en France,
potentiellement impliqué dans les BPI.
76
Dans ce travail nous sommes partis de prélèvements de l’appareil
respiratoire superficiel et profond réalisés en système naisseur chez des veaux
récemment atteints de BPI non vaccinés et non traités aux antibiotiques. Nos
objectifs étaient les suivants :
- D’une part caractériser le virome respiratoire et potentiellement identifier de
nouvelles cibles virales ;
- D’autre part caractériser le microbiote respiratoire et décrire les interactions
possibles avec les pathogènes connus.
Ces deux objectifs descriptifs vont permettre une mise à jour des agents
pathogènes respiratoires circulants dans les élevages bovins en France, le dernier
état des lieux datant des années 1990. Ils vont également permettre d’affiner nos
connaissances sur les co-infections et d’émettre des hypothèses sur les
combinaisons d’agents pathogènes plus ou moins fréquentes, qui suggèreront des
synergies ou des antagonismes.
Enfin dans la mesure où nous avions déjà identifié un nouveau virus
respiratoire, nous avons souhaité mieux comprendre sa prévalence et son pouvoir
pathogène chez les bovins : étudier IDV en tant que seul agent étiologique
potentiellement pathogène dans le modèle veau.
77
DESCRIPTION DES TRAVAUX
DE RECHERCHE
78
CHAPITRE I : IDENTIFICATION DES VIRUS
RESPIRATOIRES BOVINS
Introduction et connaissances actuelles I.
Les données concernant le virome respiratoire bovin sont récentes. Une
première étude a permis d’identifier en 2013 un nouveau virus à partir de
prélèvements respiratoires post-mortem lors d’une épizootie sévère de BPI
apparue dans un feedlot du sud-Ouest des Etats-Unis (178). La technique NGS a
été utilisée en raison d’une absence de détection d’agents pathogènes via les
techniques classiques d’isolement. Sur 6 prélèvements (poumon, trachée et nœud
lymphatique trachéo-bronchique) provenant de 4 bovins, 3 se sont avérés contenir
des séquences d’un nouveau nidovirus bovin (BoNV) appartenant à un nouveau
genre de Torovirinae, une sous-famille de Coronaviridae. Une étude sérologique
sur 127 sérums de bovins américains présentant des signes cliniques respiratoires
a montré une prévalence de 9% pour le BoNV. L’imputabilité clinique de ce virus
n’a cependant pas été démontrée. D’autres virus ont en effet été détectés par
cette technique, tels que le BCoV (1 prélèvement sur 6) et un herpèsvirus bovin (2
prélèvements sur 6). Par ailleurs aucun prélèvement de veaux sains du même
feedlot n’a été réalisé à titre comparatif.
Une deuxième étude a recherché de manière exhaustive
(métagénomique) des séquences virales à partir d’écouvillonnages nasaux
profonds réalisés chez des veaux laitiers américains âgés d’un à deux mois et
présentant des signes cliniques respiratoires (76). Cinquante veaux malades ont
ainsi été prélevés. Par ailleurs, pour chaque veau malade, un veau physiquement
proche mais ne présentant pas de signes cliniques a aussi été prélevé. L’analyse
métagénomique a été réalisée sur les veaux malades par mélange de 5 veaux,
soit 10 mélanges au total. L’analyse a permis d’obtenir 23,7 millions de séquences
dont 11,5 millions ont été exploités, après élimination des séquences du génome
bovin, des séquences de bactéries, des séquences doublons et des séquences
illisibles. Dans 32% des échantillons il n’a pas été possible d’identifier de
79
séquences virales. Différentes raisons peuvent être avancées, qu’elles soient
d’ordre méthodologique (élimination/dégradation des ARN lors de leurs
traitements, absence de séquence homologue dans les banques, niveau de
présence en dessous du seuil de détection, échantillonnage trop tardif,...) ou
d’ordre biologique (présence de virus respiratoires mais uniquement dans
l’appareil respiratoire profond, infections uniquement bactériennes). Dans les
autres échantillons et par comparaison avec les banques génomiques (243 virus
connus), les séquences obtenues présentaient, par ordre de fréquence
décroissant, des homologies avec le rhinovirus bovin de type A (BRAV pour
Bovine Rhinitis A Virus), l’adenovirus bovin de type 3 (BAD3 pour Bovine
Adenovirus type 3), l’adénovirus-associé (BAAV pour Bovine Adeno-Associated
Virus, dependoparvovirus B), le rhinovirus bovin de type B (BRBV pour Bovine
Rhinitis B virus), l’astrovirus-BSRI1 (BAV-BSRI1 pour Bovine Astrovirus- BSRI1),
le virus influenza D bovin (IDV pour Influenza D Virus), les picobirnaviruses, le
parvovirus bovin de type 2 et l’herpès virus bovin de type 6. Par ailleurs un
nombre élevé de co-infections était observé avec au moins 2 virus dans 38% des
échantillons provenant de veaux maladies contre 8% pour les veaux contrôles.
Toutefois il est impossible de savoir dans cette étude si les co-infections avaient
un rôle majeur dans l’apparition des signes cliniques respiratoires. Pour associer
la détection de ces virus avec un quelconque pouvoir pathogène (présence de
signes cliniques respiratoires), des tests PCR, spécifiques des principaux virus
identifiés, ont été élaborés et utilisés parallèlement sur les 50 veaux malades et
les 50 veaux apparemment sains (76). Une association statistique entre maladie
et présence du virus a pu être observée pour le BAD3, le BRAV et l’IDV. Le BAD3
est un adénovirus très prévalent dans les feedlots américains (50% de
séroconversion) dans lesquels il a été associé à un syndrome fébrile sans perte
de poids (74). Son inoculation par voie intratrachéale à des veaux de 4 mois et
privés de colostrum a en effet provoqué un syndrome fébrile (301). Le BRAV est
quant à lui, le plus souvent considéré comme non pathogène ou de pathogénicité
mineure, bien qu’il n’existe aucune donnée expérimentale permettant de le
confirmer ou de l’infirmer. Pour l’IDV ces résultats confirment la prévalence non
négligeable (14%) de ce virus uniquement chez les veaux malades. Dans 85%
des situations l’IDV était détecté en présence du BAD3 et du BPV2 (180).
80
L’approche métagénomique en NGS a aussi permis d’obtenir des
génomes complets de virus. En 2015 un écouvillonnage nasal a été testé par NGS
(179). Les séquences issues de cet échantillon (4 millions dont 3,6 millions
appartenant à l’hôte) ont révélé la présence des séquences appartenant à BCoV,
BAD4, BRAV2 (rhinite bovine A de type 2) et BRBV (rhinite bovine B). Un génome
quasi-complet a été directement obtenu pour le BCoV, assemblé à partir de 15500
lectures. Les auteurs se sont ensuite intéressés au BRV (BRAV et BRBV), ils ont
élaboré une RT-PCR qui cible les BRVA 1, BRVA 2 et BRBV. Sur 204 écouvillons
nasaux de veaux souffrant de BPI, 13 échantillons se sont révélés positifs pour les
BRV. Neuf de ces écouvillons étaient aussi infectés avec au moins un autre virus
respiratoire connu (BRSV, BPi3, BCoV…) et 4 étaient aussi positifs pour le virus
de la rhinite bovine. Par analyse NGS sur 6 échantillons BRV positifs, quatre
étaient co-infectés par deux BRV différents (BRAV1, BRAV2, et BRBV), un était
infecté uniquement par le BRV1 et le dernier contenait des séquences des 3 BRV.
La présence de virus pathogènes dans la grande majorité des échantillons BRV
positifs questionne sur le pouvoir pathogène de ces derniers. Le rôle des différents
virus de la rhinite bovine reste en effet discuté, avec généralement des résultats
qui suggèrent une pathogénicité respiratoire très faible (302,303). En contrepartie,
la méthode métagénomique utilisée s’est avérée très puissante pour générer des
génomes complets ou quasi-complets des deux espèces de BRAV et BRBV.
Notons aussi que cette méthode a permis de détecter les génomes de BCoV et du
BRSV non détectés par la PCR.
En 2016 Mitra et al. (180) ont analysé le virome respiratoire superficiel
dans 93 écouvillons nasaux provenant de 93 jeunes bovins dont la moitié environ
étaient atteints de BPI. Ces animaux étaient regroupés dans des feedlots dans le
Kansas aux USA et au Mexique. Dans chaque feedlot atteint de BPI, cinq animaux
malades et cinq autres cliniquement sains étaient prélevés. Les différentes
réactions de séquençage ont engendré 40,5 millions de séquences (reads) pour la
totalité des animaux malades et 36,9 millions pour les animaux cliniquement sains.
Après un travail d’assemblage et de comparaison des séquences, un total de 21
virus a été obtenu. Pour chaque virus détecté, une caractérisation génomique et
phylogénétique a été faite ainsi qu’une analyse statistique qui visait à établir une
81
corrélation entre l’état clinique et la présence du génome viral. Les virus identifiés
étaient des virus respiratoires pathogènes classiques (BRSV, BCoV, BoHV-1,
BPI3, BVDV1 et BVDV2, BAD3) ainsi que des virus moins étudiés tels que
l’adénovirus-associé (BAAV), les virus BRAV, BRBV, IDV, le parvovirus bovin de
type 3 (BPV3) et les entérovirus E et F bovin (EEV et EFV). Les auteurs pensent
avoir identifié un nouveau virus qu’ils ont nommé bocaparvovirus des ongulés de
type 6 (UBPV6). Le nidovirus bovin récemment caractérisé aux USA par une
équipe qui collaboratrice avec Mitra et al. a aussi été détecté.
Les auteurs (76,180) se sont ensuite intéressés aux associations
statistiques entre détection d’un virus et présence ou non de signes cliniques
respiratoires. L’association la plus importante a été obtenue pour IDV avec un
odd-ratio (OR) de 2,94 mais un intervalle de confiance très large (95% CI = 0,71-
12,13) et une probabilité non significative (p= 0,134).
Dans ce travail, nous avons cherché à identifier le virome respiratoire
présent dans les élevages français de veaux atteints de BPI.
Détection des virus respiratoires par approche II.
NGS chez des veaux affectés par la bronchopneumonie infectieuse
1. Matériel et Méthodes
Schéma expérimental et prélèvements a.
Les prélèvements respiratoires ont été obtenus dans des fermes
d’élevages naisseurs du sud-Ouest de la France. Les animaux à prélever étaient
des veaux âgés de 2 semaines à 4 mois et présentant des signes cliniques de
bronchopneumonie. Une vingtaine de cabinets vétérinaires de 7 départements ont
été contactés au cours de l’automne 2013 pour nous prévenir en cas d’apparition
de BPI dans leurs élevages, les départements concernés étaient la Haute-
82
Garonne, le Gers, l’Ariège, les Hautes-Pyrénées, le Tarn, le Tarn-et-Garonne et
l’Aveyron. Les critères d’inclusion pour les cas sélectionnés étaient les suivants :
Veaux âgés de 0 à 4 mois, présentant des signes cliniques d’atteinte de
l’appareil respiratoire profond (broncho-pneumonie sur un lot ou plusieurs
animaux) : hyperthermie > 39.5° – 40°C avec de la toux, une tachypnée et une
dyspnée (modification des mouvements respiratoires, bruits respiratoires
renforcés et si possible surajoutés (type râle) à l’auscultation).
Évolution aiguë (depuis 3 à 4 jours maximum) avec un nombre minimal
de 3 veaux atteints.
Les critères d’exclusion étaient les suivants :
Ancienneté des signes cliniques (les troubles respiratoires étaient
présents depuis plus de 5 jours). De même, au sein d’un élevage, n’étaient
prélevés que les animaux malades depuis moins de 3-4 jours ou en phase
d’hyperthermie, les autres étant exclus.
Présence de traitements antibiotiques préalables et/ou vaccination
préalable contre les virus respiratoires.
En bilan 93 veaux atteints de BPI de 23 élevages ont été prélevés, soit
entre 3 et 5 veaux par élevage. Deux types de prélèvements ont été réalisés pour
chaque veau : un écouvillonnage nasal profond (ENP, appareil respiratoire
superficiel) et un lavage bronchoalvéolaire (LBA, appareil respiratoire profond).
L’ENP a été effectué au moyen d’un écouvillon stérile de 20 cm avec
embout en coton et manche en plastique pour éviter qu’il se casse en cas de
mouvements de l’animal. Pour des veaux âgés de moins de 4 mois, la contention
physique de l’animal suffisait à la réalisation des ENP. L’écouvillon était introduit
dans la narine de l’animal le plus loin possible vers le méat dorsal puis
vigoureusement frotté contre la muqueuse nasale jusqu’à la rosée sanguine par
un mouvement de va-et-vient pendant une dizaine de secondes. Il était ensuite
élué dans un mL de soluté salé physiologique puis conservé au froid positif durant
le transport avant d’être congelé à -80°C, dans l’attente d’être analysé.
83
Les LBA ont été réalisés sous anesthésie générale par endoscopie
(gastroscope pour petits veaux et colonoscope pour veaux de taille moyenne et
jeunes bovins). Brièvement les veaux en hyperthermie et ne présentant pas de
troubles respiratoires trop sévères étaient anesthésiés au moyen d’un mélange
ketamine-diazepam (4 ml d’Imalgène 1000 (100 mg/ml) et 2 ml de Valium Roche
(5 mg/mL)). Cette technique permet une anesthésie rapide, elle protège le veau,
les opérateurs et le matériel. Par ailleurs, ce protocole permet une anesthésie de
courte durée, ce qui est préférable pour des veaux présentant des troubles
respiratoires, mais aussi une bonne myorelaxation (diazépam) qui facilite la mise
en place de l’endoscope (passage du larynx et progression jusqu’aux bronches).
L’endoscope est introduit par voie buccale en étant préalablement protégé par la
mise en place d’un tube de plastique rigide dans la bouche de l’animal pour avoir
un accès direct au larynx sans risque de contamination par la flore buccale. Une
fois l’endoscope bloqué dans une bronche intermédiaire du lobe crânial droit, 100
mL de liquide physiologique stérile étaient injectés puis ré-aspirés, à l’aide d’une
seringue d’au moins 50 ml. La quantité de liquide récupérée variait entre 35 et 70
mL. Le prélèvement était ensuite placé dans un tube stérile puis conservé au froid
positif durant le transport avant d’être traité au laboratoire. Entre chaque
prélèvement, l’endoscope était nettoyé à l’aide d’une solution physiologique. Entre
chaque élevage, une désinfection complète à base d’ammoniums quaternaires
(Amnios) était réalisée, selon les normes et le protocole du fabricant.
Traitement des échantillons b.
Pour les EN, 250 µL de solution d’ENP a été mélangée à 750 µL de Trizol
LS (réactif permettant d’isoler l’ARN). Le reste de la solution a été aliquoté dans
deux tubes eppendorf. Le tout a été conservé à -80°C. Les échantillons issus de
LBA, une fois arrivés au laboratoire, ont tout d’abord été filtrés sur gaze, pour
éliminer les gros débris fibrino-cellulaires. Le liquide de LBA a ensuite été divisé
en deux parties. Une première partie du liquide, de 20 à 25 mL, a été centrifugé
pendant 20 minutes à 1200-1500 tours/minute. Cette centrifugation permet
d’obtenir deux phases : le surnageant et le culot cellulaire. Le surnageant a été
récolté et aliquoté dans deux tubes eppendorf de 2 mL et dans des tubes de 5 mL.
84
Quant au culot cellulaire, il a été repris dans 1.5 mL d’une solution tampon PBS
(Phosphate Buffered Saline) puis stocké dans deux tubes eppendorf à -80°C.
L’autre partie du liquide filtré a été traitée directement sans être centrifugée. Deux
tubes contenant 250 µL de ce liquide et 750 µL de Trizol LS ont été conservés à -
80°C ainsi que deux tubes contenant 140 µL de ce liquide associé à 140 µL de
tampon de lyse du kit d’extraction d’ARN (RNeasy, Qiagen®). Le reste a été
directement conservé à -80°C.
Détection des pathogènes respiratoires majeurs par RT-c.
qPCR
Les prélèvements d’un même élevage ont été mélangés avant l’analyse.
Pour chaque mélange, une recherche des virus BRSV, BCoV, BPI3 et des
bactéries M. haemolytica, P. multocida, H. somni et M. bovis a été réalisée en
utilisant un kit commercial RT-qPCR One step, basé sur la méthodologie Taqman
(LSI Vetmax screening Pack- Ruminant Respiratory Pathogens – Life
technologies).
Caractérisation du virome respiratoire superficiel et d.
profond des veaux par séquençage métagénomique avec la méthode Illumina
Pour le séquençage à haut débit, 300µL de chaque prélèvement d’ENP et
3 mL de LBA ont été filtré à travers un filtre de 0,45µm à l’aide d’une seringue
stérile. Ensuite le filtrat contenant les particules virales a été concentrées par
ultracentrifugation (100000 g, 2h, 4°C). Les culots obtenus après
l’ultracentrifugation des ENP et LBA ont subi un traitement nucléase (Exonuclease
I (20U, Thermo Fischer, USA), Benzonase (25U, Merck chemical, Germany),
Turbo DNAse (2U, Thermo Fisher Scientific, USA), RNase I (10U, Thermo
Fischer, USA)). Le traitement des échantillons aux nucléases sert à éliminer les
acides nucléiques libres donc non encapsidés, une étape qui va favoriser
l’enrichissement en acides nucléiques viraux.
85
Après une incubation d’une heure à 37°C, les acides nucléiques ont été
extraits à l’aide du kit Qiamp minElute virus spin kit de Qiagen et amplifiés par
transcriptase inverse et PCR aléatoire. Brièvement, des amorces aléatoires
(octomères) portant une étiquette ont été utilisées pour la rétrotranscription et la
PCR. Les étiquettes utilisées étaient les suivantes : Tag-D
CGTAGATAAGCGGTCGGCTC et Tag-E CATCACATAGGCGTCCGCTG. Les
étiquettes servent à l’identification de chaque échantillon après l’étape de
séquençage. Une étape de Klenow est nécessaire pour la création d’un ADN
double brin à partir d’une molécule d’ADN simple brin. Les librairies ont été créées
en suivant les indications du kit Illumina TrueSeq pour le séquençage sur la
plateforme Illumina. Cette méthodologie d’amplification aléatoire est connue sous
le nom de SISPA (sequence-independant, single-primer amplification) (Figure 8).
Figure 8 : Représentation du processus de préparation des échantillons pour le séquençage NGS métagénomique du virome respiratoire.
Séquençage et analyse bio-informatique e.
86
Deux séries de séquençage ont été réalisées : le séquenceur Illumina
Miseq pour un premier run puis le séquenceur Illumina Hiseq pour une deuxième
série (3 runs). Le changement méthodologique a été opéré car le nombre de
séquences virales obtenues lors du premier run (Miseq) était faible (4,5 millions de
séquences/run, équivalent à 260 000 séquences par échantillon). Les mêmes
séries ont donc été analysées par la technique Illumina Hiseq. La différence
majeure entre les deux séquenceurs Illumina se résume par le débit de données
générées (15 Gb (millions de paires de bases) pour le Miseq contre 650 Gb pour
le Hiseq). Parmi les résultats générés par le run Miseq, des génomes complets et
partiels de BCoV ont été obtenus, ces données ont été exploitées dans le but de
caractériser ces virus. Les informations concernant la caractérisation de BCoV
seront détaillées dans la section « Caractérisation génétique des coronavirus
bovins – Evolution et épidémiologie moléculaire » de ce manuscrit et dans l’article
soumis « Global transmission, spatial segregation and recombination determine
the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses ».
Le circuit bio-informatique utilisé a été le VIP (304). Ce circuit
nouvellement créé pour l’identification et la découverte des virus a été installé sur
la plateforme bio-informatique Galaxy du centre INRA Occitanie. Le pipeline VIP
se caractérise par les étapes suivantes : 1. Contrôle qualité des séquences ; 2.
Suppression des séquences hôtes éventuelles (appartenant à Bos Taurus) ; 3.
Assemblage des lectures en contigs ; 4. Alignement nucléotidique contre des
bases de données virales spécifiques (ViPR/IRD), ou contre les bases de données
virales du NCBI ; 5. Assemblage de novo : reconstruction du génome des virus
détectés.
2. Résultats
Caractérisation du virome respiratoire bovin a.
Dans un premier temps les agents pathogènes bovins connus ont été
identifiés par RT-qPCR dans les prélèvements et ils sont décrits dans le tableau 3.
87
En bilan 23 exploitations ont été testées sur trois séries de séquençage.
Les mélanges d’ENP et de LBA provenant des mêmes animaux ont été
séquencés par une approche métagénomique à l’aide de la technologie Illumina
Hiseq. Les 3 run de Hiseq ont permis de générer respectivement 140, 93 et 219
millions de séquences totales.
Des séquences correspondant potentiellement à de nombreuses familles
virales ont été identifiées. Les résultats générés par le logiciel VIP appartenant à
chaque échantillon sont présentés sous forme d’un tableau de synthèse (tableau
4), les données complètes présentées en Annexe détaillent, pour chaque famille
de virus détecté, l’espèce virale la plus proche à la séquence assemblée, le genre
viral, le pourcentage de couverture de l’ensemble des séquences assemblées par
rapport à la séquence de référence, le nombre de reads (séquences issues du
séquenceur et de l’analyse bio-informatique), la moyenne de profondeur (nombre
moyen de hits (détections) par base du génome de référence).
88
Tableau 3 : Résultats de détection des 7 agents pathogènes respiratoires dans les prélèvements respiratoires avec le LSI vetmax screening kit. BRSV : virus respiratoire syncytial bovin, BPI-3 : virus parainfluenza-3 bovin, BCOV : coronavirus bovin, p. m ; Pasteurella multocida, m. h ; Mannheimia haemolytica, m.b ; Mycoplasma bovis, h. s ; Histophilus somni, LBA : lavage bronchoalvéolaire, EN ; écouvillon nasal, et p : présent.
Dans ce travail nous avons fixé un seuil de 10 reads pour considérer que
le résultat (le virus identifié) est crédible (ou acceptable). Par ailleurs, même si les
séquences d’origine bovine étaient éliminées par le pipe-line VIP, un travail
supplémentaire a consisté à re-analyser les séquences attribuées aux virus ADN
et aux rétrovirus, pour éliminer les reads affiliés correspondant à des gènes
cellulaires (similarité de séquences avec certains gènes de virus à ADN, gènes de
rétrovirus intégrés). En bilan, les principaux virus détectés par ordre décroissant
de fréquence sont le BCoV, le BRSV, le BPI3, L’astrovirus bovin (BAV), les virus
de la rhinite bovine BRAV et BRBV, le parvovirus bovin de type 2 (BPV2) et
l’entérovirus bovin (EVB) (Tableau 4).
89
Tableau 4 : Détection des principaux virus par NGS ; nombre d’élevages positifs et nombre de prélèvements positifs dans l’appareil respiratoire superficiel (ENP) et profond (LBA).
Pour 4 prélèvements (un ENP et 3 LBA) venant de 4 élevages, il n’a été
possible de détecter qu’un seul virus, le BCoV pour 3 échantillons (1 ENP, 2 LBA)
et le BRSV pour le 4e LBA. A chaque prélèvement d’ENP ou LBA avec un seul
virus identifié, son équivalent contrôle en LBA ou ENP contenait plusieurs familles
virales. Ainsi il n’a pas été possible d’identifier deux prélèvements d’un même
élevage ne contenant qu’un seul virus BCoV ou BRSV.
Des génomes complets et partiels ont été reconstruits pour les 8 virus
détectés en alignant les métagénomes contre des génomes de référence.
Parmi les séquences générées, une grande proportion est apparentée à
des virus des plantes, d’insectes et à des bactériophages. Ces séquences de
bactériophages pourraient avoir un intérêt dans l’étude du bactériote respiratoire
et les interactions au sein du microbiote et pourront faire l’objet d’une analyse
spécifique ultérieurement.
Pour les virus pathogènes connus un tableau de correspondance a été
établi entre la détection par RT-qPCR et le séquençage NGS (tableau 5).
Tableau 5 : Correspondance entre la détection par RT-qPCR et le séquençage NGS des virus BRSV, BPI-3, et BCOV. N : détection uniquement
90
par séquençage NGS, P : détection uniquement par RT-qPCR, et NP : détection par les deux méthodes.
Discussion b.
Dans cette étude nous avons fait le choix de travailler sur la présence
des virus par mélange de veaux considérant l’élevage comme une unité ici, qui
reflète la pression infectieuse locale et les différentes conditions individuelles
possibles. Théoriquement, un nombre plus important de veaux par élevage aurait
pu être échantillonné, toutefois cela aurait été difficile pour des raisons pratiques
compte tenu de la faible taille des élevages concernés. Par ailleurs un effet
dilution aurait pu être obtenu, occultant les virus pour lesquels le nombre de
séquences était faible. En cas d’identification de virus d’intérêt, des PCR
91
spécifiques seront élaborées pour investiguer sa présence au niveau de l’élevage
et au niveau individuel sur des veaux malades et sains. Contrairement aux études
déjà réalisées dans des conditions épidémiologiques d’élevage différentes, nous
n’avons pas prélevé de veaux apparemment sains dans les élevages
sélectionnés. La présence de lots avec un faible nombre d’animaux et en contact
étroit nous a laissé supposer que la plupart des animaux étaient potentiellement
infectés, en incubation ou avec des signes cliniques minimes. Nous avons
toutefois prélevé des échantillons dans des élevages sans troubles respiratoires,
de même structure et dans la même région, pour des analyses comparatives
ultérieures.
Des principaux virus identifiés par NGS, on retrouve les trois pathogènes
connus que sont le BRSV, le BCoV et le BPI3. Le BoHV-1 n’a pas été identifié car
les prélèvements provenaient tous d’élevages indemnes d’IBR. Les deux
méthodes de détection (NGS et qPCR) étaient en accord faible (pour la détection
de BCoV dans les LBA, κ=0.24, test de Cohen avec 95% d’intervalle de confiance)
ou très faible (0.05<κ<0.19) pour toutes les autres comparaisons (Tableau 5). Des
différences dans la préparation des acides nucléiques viraux et dans la sensibilité
des deux techniques expliquent sans doute ces différences. En règle générale nos
résultats ont montré que le NGS est plus sensible que la qPCR (lors de détections
par une seule des deux méthodes, beaucoup plus de détections d’acides
nucléiques viraux ont été observées par NGS que par qPCR ; la qPCR n’ayant
permis la détection que de BCoV et de BRSV dans 2 échantillons, Tableau 5).
Le BRSV est agent pneumo-pathogène majeur, les virus BCoV et BPI3
sont plutôt considérés comme des virus initiateurs favorisant les infections
secondaires bactériennes. Une autre possibilité est la présence de plusieurs virus
respiratoires interagissant pour déclencher la maladie. Comme précisé dans la
partie bibliographique, il existe peu de données sur les co-infections virales dans
la mesure où la pathogenèse de chacun de ces virus a essentiellement été
étudiée lors de mono-infections expérimentales. Dans le cas des études
épidémiologiques, des outils de détection spécifiques aux agents pneumo-
pathogènes bien connus sont utilisés individuellement, donc avec des informations
sur les co-infections très limités.
92
Notre étude de séquençage par une approche exhaustive confirme
l’importance des co-infections virales lors de BPI des jeunes veaux à l’unité de
l’élevage. L’ensemble des ENP et des LBA étaient co-infectés avec en moyenne
3,3 et 3 virus respectivement. Toutefois nos prélèvements représentent un
mélange de 3 à 5 veaux et ces observations doivent être validées au niveau
individuel avant de pouvoir affirmer l’existence de co-infections chez un animal.
L’analyse de mélanges d’échantillons plutôt que de prélèvements individuels a été
utilisée lors des études précédentes de Ng et al et Mitra et al (pour les échantillons
du Mexique), ce qui facilite les comparaisons. Cette méthode d’analyse par
mélange de prélèvements issus d’animaux qui partagent physiquement le même
environnement bien que loin d’être idéale, reste inévitable tant que les coûts du
séquençage NGS sont élevés.
Concernant les co-infections virales, des combinaisons préférentielles
entre les huit virus principaux détectés (BCoV, BRSV, BPI3, BAV, BRAV, BRBV,
BPV2, et EVB) ne peuvent pas être parfaitement établies d’un point de vue
statistique. Ceci est dû au nombre limité d’échantillons inclus dans l’étude (limite
inhérente au choix de l’outil NGS). Cependant, hormis le BCoV qui est ubiquiste
dans tous les prélèvements, une forme d’accordance peut être notée entre BRSV
et BPI3 dans l’appareil respiratoire superficiel et profond, ainsi qu’entre astrovirus
bovin (BAV) et BRSV et BPI3 dans les poumons (tableau 5). En contrepartie, une
discordance est claire entre le BRAV et le BRBV : les deux virus de tropisme
majoritairement nasopharyngé, ne coexistent dans aucun cas, ce qui suggère une
compétition. La très haute prévalence du BCoV, BRSV, et BPI3 parmi les
échantillons nasopharyngiens et bronchoavéolaires complique la recherche de co-
infections préférentielles distinctes. Le développement d’un modèle mathématique
qui prend en compte le tableau d’abondance de virus exhaustif pourra être
envisagé afin de déterminer de potentielles relations de synergies ou
d’antagonismes.
Les résultats obtenus devront-ils nous inviter à reconsidérer la
désignation de « virus majeur ou initiateurs de BPI » ? Vont-ils nous amener à
étudier la pathogenèse de ces virus d’une manière collective et non plus
individuelle vu les interactions très probables entre eux ?
93
Concernant les pathogènes connus, notre étude diffère de celle de Ng et
al. (2015) réalisée aussi chez des veaux malades mais en systèmes laitiers aux
USA. Les auteurs identifient de nombreuses familles virales mais ni BRSV, ni
BCoV, ni BPI3, ni BoHV-1 n’ont été détectés. Compte tenu de l’exhaustivité de la
méthode utilisée, Ng et al. ont considéré que la non–détection des 3 pathogènes
reflète probablement leur absence dans les EN testés ou leur présence à des
quantités inférieures au seuil de détection. D’un autre côté, le statut vaccinal des
animaux n’était pas documenté. Cette étude souffre aussi d’une description
imprécise des critères d’inclusion des veaux, notamment en ce qui concerne les
signes cliniques respiratoires. Par ailleurs les séquences virales ont été obtenues
à partir d’EN. Des échantillons issus de l’appareil respiratoire profond, type LBA
ou ATT, auraient été probablement plus représentatifs des troubles respiratoires
observés. Dans notre étude les fréquences de détection sont quasi identiques
entre ENP et LBA pour ces 3 virus (Tableau 5).
In fine, la question de la participation de ces virus connus comme non-
pneumo-pathogènes dans la maladie respiratoire reste posée : est-ce que leur
innocuité évaluée individuellement reste valide lors d’une infection multiple ?
Peuvent-ils interagir avec d’autres virus ou bactéries ? Et si oui, comment ?
Concernant les virus respiratoires moins étudiés nous avons retrouvé la
présence des BRAV et BRBV, du BPV2 et de l’EVB, comme dans les études de
Ng et al. (2015) et Mitra et al. (2016). Par contre nous n’avons pas détecté de
nidovirus bovin ni de BAD3, ni d’IDV.
L’absence de séquences appartenant à l’adénovirus de type 3 (BAD3)
parmi nos résultats est ambiguë même si sa présence a été confirmée sur le
continent européen dans des études précédentes (20,23,48). Même si peu
probable, une raison technique (faible abondance relative ou absence de
correspondance dans les bases de données par exemples) qui expliquerait cette
absence ne peut être écartée.
L’implication des BRAV et BRBV dans les BPI est encore mal connue.
Notre étude a confirmé pour la première fois sa présence chez les veaux en
systèmes naisseurs, avec une fréquence non négligeable. Il semble que les BRAV
et BRBV puissent jouer un rôle de virus initiateurs, avec une fréquence de
94
détection bien plus importante dans les ENP que dans les LBA au moins pour
BRAV. Il n’existe cependant pour l’instant aucune donnée expérimentale
permettant de le confirmer ou de l’infirmer. Un génome partiel d’EVB a été détecté
dans un seul ENP. Le génome le plus proche aux séquences assemblées est
celui d’un entérovirus bovin de type E. Le tropisme des entérovirus est digestif
avec une implication suspectée dans les diarrhées néonatales et sa présence
avérée dans le système respiratoire des veaux (305). Son implication dans la
maladie respiratoire chez les veaux n’est pas vérifiée. De même, le BPV2 a été
détecté dans un seul ENP. Ce virus n’est pas connu comme étant pneumo-
pathogène. La détection des BPV2 et EVB dans les ENP des veaux pourrait être
accidentelle vu le contact direct des muqueuses nasales avec l’air ambiant. Une
autre possibilité est leur implication dans la flore nasale de l’appareil respiratoire
superficiel. Pour exemple Mitra et al. (2016) ont estimé avoir identifié un nouveau
virus qu’ils ont nommé bocaparvovirus des ongulés de type 6 (UBPV6). Cette
observation a été faite après l’identification d’une séquence de 5 224 paires de
bases issue de l’assemblage de novo, cette séquence partageant 69% d’identité
nucléique avec le bocaparvovirus bovin de type 1 (anciennement parvovirus bovin
de type 1). En utilisant ce nouveau génome comme référence, des séquences
appartenant à UBPV6 ont été détectées dans six veaux symptomatiques et six
autres cliniquement sains.
L’identification d’un astrovirus bovin dans nos prélèvements respiratoires
semble fréquente, ce qui n’avait encore jamais été décrit. La réalité de sa
présence est validée par le nombre d’échantillons positifs provenant de fermes
différentes et par la profondeur ou le nombre de séquences (ou reads) obtenues
dans chaque prélèvement. Plusieurs génomes complets et partiels appartenant à
ce virus ont été ainsi obtenus à partir de 11 LBA et 2 ENP dans 13 élevages
différents (entre 43 et 200 000 reads/échantillon). Une contamination par des
particules fécales par voie aérosol ne peut être écartée ; toutefois la fréquence de
détection dans plusieurs élevages et surtout sa présence principalement dans les
LBA nous incite à penser que ce virus est bien présent dans l’arbre respiratoire
des veaux. L’astrovirus bovin est connu pour son tropisme et son pouvoir
pathogène digestif (306–309) et plus récemment nerveux (310). Dans les études
95
métagénomiques de Mitra et al et Ng et al, l’astrovirus a été détecté dans les
écouvillons nasaux des veaux dans des élevages atteints de BPI (76,180). Plus
récemment, des astrovirus ont été détectés dans des prélèvements respiratoires
chez des patients humains et des porcs en phase aiguë d’atteinte respiratoire
(311,312), mais aussi chez des camélidés cliniquement sains (313,314). Compte
tenu des résultats obtenus, l’implication potentielle de l’astrovirus bovin dans les
BPI mérite d’être investiguée, en commençant par une analyse comparative fine
des séquences obtenues, la mise au point d’un test de détection PCR pour des
études épidémiologiques, voire la réalisation d’infections expérimentales chez le
veau.
En bilan, l’approche métagénomique peut être conçue comme une
première étape d’identification de virus d’intérêt. La puissance de l’outil permet en
effet une détection sans a priori de l’ensemble des virus présents chez l’animal,
sous réserve que l’analyse bio-informatique des métadonnées soit réalisée avec
un maximum de contrôles. Comme pour les PCR, les conditions de prélèvement
(races, types de production, saisonnalité, localisation, ...) peuvent modifier les
résultats. De même le coût des analyses ne permet actuellement que de tester un
nombre limité d’animaux. Enfin, si un virus d’intérêt est identifié, il ne pourra être
considéré comme d’importance réelle que lorsque son pouvoir pathogène aura été
démontré par des études d’infection expérimentale ou par des études
épidémiologiques.
La démonstration du pouvoir pathogène lors d’inoculation d’épreuve est
alors plus difficile pour les virus qui agissent par co-infection avec d’autres virus ou
comme agents initiateurs des infections bactériennes comme c’est le cas pour les
BPI.
96
Caractérisation génétique des coronavirus III.
bovins : évolution et épidémiologie moléculaire
Le coronavirus bovin est très répandu dans toutes les régions du monde
affectant les élevages bovins et les ruminants sauvages (30,35,315–321).
Fréquemment détecté, le BCoV est impliqué dans le développement de maladie
respiratoire, dans les diarrhées chez les veaux et dans la dysenterie hivernale
chez les bovins adultes, des maladies pouvant être à l’origine de perte
économiques importantes (59,72,73,322,323). La famille des Coronaviridae
regroupe les genres Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus et
Deltacoronavirus, virus sont connus pour infecter de nombreuses espèces aviaires
et mammifères (324). BCoV appartient au genre Betacoronavirus, qui regroupe
aussi les coronavirus humain OC43, HKU1, SRAS, et MERS ainsi que le
coronavirus équin EqCoV (58), le coronavirus respiratoire canin CRCoV (66), le
virus hémagglutinant de l'encéphalomyélite porcine HEV (325), le coronavirus
murin (326), et les coronavirus de chauves-souris (BatCoV) HKU4, HKU5 et HKU9
(327–329). Le BCoV est parenté avec plusieurs de ces espèces virales (330). Les
coronavirus constituent une menace constante pour la santé publique, en raison
de leur faible fidélité de réplication et de leur forte variabilité génétique, ce qui les
rend sujets à des changements constants conduisant souvent à des maladies
émergentes (331). L'enquête intensive qui a suivi l'émergence du SRAS-CoV et
du MERS-CoV a confirmé l'origine zoonotique de ces Betacoronavirus, leur bonne
capacité d'adaptation et leur capacité à changer d'espèce hôte. Ainsi, sur la base
de la similarité antigénique, on pense que l'OC43 humain et les coronavirus
respiratoires canins ont émergé de BCoV (332,333).
Le but de cette étude était de caractériser les BCoV des voies
respiratoires supérieures et inférieures d’animaux symptomatiques dans le sud-
ouest de la France. Les virus étant détectés à l’aide de la RT-qPCR et leurs
génomes partiels et complets obtenus par séquençage NGS, nous avons cherché
à isoler les virus, et analysé les données génétiques obtenues en utilisant des
modèles de phylogénie et d'évolution temporelle pour mieux comprendre
l'évolution du BCoV. Alors que notre point de départ était les BCoV d’origine
97
française, notre étude vise à mieux comprendre l'évolution génétique du BCoV à
l'échelle mondiale, en examinant à la fois les caractéristiques génétiques des virus
et les temps de collecte afin de formuler des hypothèses sur l'origine BCoV et la
propagation mondiale sur une échelle spatio-temporelle.
Article : « Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses »
98
Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution
and epidemiology of Bovine Coronaviruses
E. Salem1, D. Vijaykrishna2,3, H. Cassard1, B. Hause4, S. Maman5, G. Meyer1, M.F. Ducatez1#
1 IHAP, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France
2 Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University, Melbourne,
Victoria 3800, Australia
3 Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Medical School, Singapore
4 Diagnostic Medicine/Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Kansas State University,
Manhattan Kansas KS 66506-5802, USA
5 SIGENAE, GenPhySE, Université de Toulouse, INRA, INPT, ENVT, Castanet Tolosan, France.
# To whom correspondence should be addressed.
Mailing address: UMR Interactions Hôtes-Agents Pathogènes 1225, Service maladies contagieuses,
ENVT, 23 Chemin des Capelles, 31076 Toulouse cedex, France. Phone: (+33)561193249. E-mail:
Running title: Genetic evolution of BCoV
99
Abstract
Bovine coronavirus (BCoV) is widespread in cattle and wild ruminant populations throughout the
world. The virus causes neonatal calf diarrhea and winter dysentery in adult cattle as well as
respiratory tract infection in young cattle. In the present study BCoV from both upper and lower
respiratory tracts of symptomatic calves in the Southwest of France were characterized. Through virus
isolation, deep sequencing, and genome analysis we estimated the most common ancestor of BCoV
during 1940’s, and identified the global circulation of two geographically distinct BCoV lineages that
diverged during 1960-1970. European BCoV formed a distinct lineage to those circulating globally
with a predominant number of strains collected in Asia and North America. We found little evidence
of genetic mixing between the lineages, highlighting potential routes of BCoV transmission. A
recombination event in the spike gene (breakpoint at nt 1100) may be at the origin of the genetic
divergence sixty years ago. Gap in BCoV surveillance, leading to limited sequence data, is a bias to
BCoV evolution analyses. Further studies are warranted to understand the mechanisms behind BCoV
tissue tropism, to precise evolution rates and TMRCA, and to understand the reasons for the different
evolution rates of European and non-European BCoV.
Keywords: bovine coronavirus, France, recombination, geographic clustering, molecular clock
100
Introduction 1
Bovine coronavirus (BCoV) is widespread in cattle and wild ruminant populations, resulting in 2
neonatal calf diarrhea and winter dysentery in adult cattle as well as upper and lower respiratory tract 3
infection. BCoV is associated with the bovine respiratory disease complex (BRD), a leading cause of 4
morbidity of young cattle worldwide with large economic costs due to mortality, treatment and 5
impeded growth performances and pose a threat to public health as a result of antibiotic use. Having a 6
multifactorial etiology, BRD is a complex disease triggered by the presence of one or several viruses 7
and/or bacteria (1) favored by an altered state of the host immune system (2) and usually disturbed 8
environmental factors (3) and several physical and biological stressors (2,4,5). Viruses associated with 9
BRD are capable of initiating a cascade of events such as immune suppression (2,6), respiratory 10
epithelium damage (7) and alter commensal flora and local biofilm (8–10) thus leading to complex 11
secondary bacterial infections (8,10,11). 12
BCoV is a pneumoenteric virus frequently isolated from the fecal samples of diarrheic calves (12–15) 13
and from upper and lower respiratory tract samples during BRD episodes worldwide (16–19). While 14
both forms of BCoV infection are widespread with high prevalence among cattle (12,13,15,20,21) and 15
wild ruminants (22), the putative differences between strains isolated from enteric and respiratory 16
tracts are still not clear and it is unknown whether these differences are related to tissue tropism or 17
simply to distinct times and locations of isolation. Some reports suggest that the all BCoV are similar 18
at genomic and antigenic levels (18,23) while others suggest that enteric and respiratory strains are 19
genetically and antigenically different (24,25). 20
Studies on BCoV diversity have been carried out in different parts of the world, but they have been 21
sporadic with most sequences representing a few countries in Europe, Asia, and North America and 22
restricted to a one to few years. Antigenic and genetic differences in north American strains were for 23
example shown by phylogenetic analysis and virus neutralization test (17). The genetic diversity of 24
BCoV strains was also assessed in Japan where a genetic shift was observed in the 1990’s (from 25
101
American-like viruses pre-1996 to more specific Japanese strains post-1996) (26). Genetic partition 26
between European and non-European BCoV strains has recently been identified (27,28). 27
Coronaviruses are enveloped particles with a large non-segmented, linear, polyadenylated, single-28
stranded positive sense RNA genome (29). They belong to the family Coronaviridae in the order 29
Nidovirales within the Coronavirinae subfamily (30). Coronaviruses are classified into 4 genera (31): 30
Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus and Deltacoronavirus, and are known to 31
infect birds and many mammals including humans (32). BCoV are members of the Betacoronavirus 32
genus within the Coronaviridae family, which includes several important human pathogens of 33
zoonotic origin, such as the Human Coronavirus (HCoV) OC43, HKU1, MERS, and SARS, and 34
mammalian viruses including equine coronaviruses (EqCoV) (33), canine respiratory coronaviruses 35
(CRCoV) (34), swine hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) (35), murine coronaviruses 36
(30), and bat coronaviruses (BatCoV) HKU4, HKU5 and HKU9 (36–39). BCoV are most closely 37
related to members of the Betacoronavirus1 species PHEV, OC43 and EqCoV and share similarity in 38
genome organization (40). 39
Coronaviruses pose a constant public health threat, due to their low replication fidelity and high 40
genetic variability making them prone to a constant changing pattern often leading to emerging 41
diseases (41). The intensive investigation that followed the emergence of SARS-CoV (42) and MERS-42
CoV (43) confirmed the zoonotic origins of those betacoronaviruses (38,44–46), their efficient 43
adaptability (47), and their potency to switch species (48). Based on antigenic similarity it is thought 44
that the human OC43 and canine respiratory coronaviruses emerged from BCoV (49,50). 45
The aim of the present study was to characterize BCoV from both upper and lower respiratory tracts of 46
symptomatic animals in the Southwest of France. We aimed at isolating the viruses, sequencing their 47
full genomes by deep sequencing, and analyzing the obtained genetic data using phylogeny and time 48
scale evolution models to better understand the virus evolution. While our starting point was French 49
field BCoV, our study aims at a better understanding of BCoV genetic evolution at a global scale, 50
102
looking both at the genetic characteristics of viruses and at the collection times in order to draw 51
hypotheses on BCoV origin (in time and space) and global spread. 52
Material and methods 53
All methods were carried out in accordance with relevant guidelines and regulations. All experimental 54
protocols were approved by the Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse and/or the Genotoul 55
bioinformatics platform Toulouse Midi-Pyrenées. 56
Sample collection and processing 57
Deep nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavage (BAL) were collected from herds affected with 58
respiratory disease in the south west of France during 2014. The calves included in this study 59
presented acute signs of pneumonia during BRD episodes and were not vaccinated nor treated prior to 60
sampling. Four calves were sampled from each of the affected herds and samples were pooled 61
separately by tissue type (NS or BAL). Swabs were inserted deep in the calf nostril (approximatively 62
20 cm deep) and rotated for 30 seconds against the nasal mucosae. Swabs were placed in PBS, 63
vortexed and kept on ice for no more than 2 hours until being stored at -80°C. Bronchoalveolar 64
lavages (BALs) by bronchoscopy were performed under deep anesthesia: 10mg/kg Diazepam and 65
10mg/kg ketamine were injected intravenously and a sterile flexible bronchoscope (Olympus) was 66
passed through the pharynx and visually guided to the first bronchial division corresponding to the 67
caudal segment of the right apical lung lobe. The lung lobe was then lavaged with 100 ml of sterile 68
isotonic saline solution and the liquid was immediately aspirated after the infusion and refrigerated 69
until further processing. 70
Sample preparation and NGS sequencing 71
Pools of both sample types were filtered by a syringe driven 0.45µm filter, and the BALs were 72
concentrated by centrifugation (100 000 g, 2h, 4°C). 300µl of PBS were added to the pellet and left at 73
4°C overnight before suspension. All samples were then treated with a cocktail of nucleases for 1 hour 74
103
at 37°C to eliminate the host nucleic acids (Exonuclease I (20U, Thermo Fischer, USA), Benzonase 75
(25U, Merck chemical, Germany), Turbo DNAse (2U, Thermo Fisher Scientific, USA), RNase I (10U, 76
Thermo Fischer, USA)). Viral nucleic acids were purified using the QIAamp MinElute virus spin kit 77
(Qiagen, USA). Sequence-independent, single primer amplification was carried out as described by 78
Liais et al (51). Briefly, reverse transcription was performed using tagged random hexamers, first and 79
second strands were then randomly amplified by PCR. PCR products were purified and libraries 80
processed using the Truseq nano kit (Illumina, USA) for next-generation sequencing with Illumina 81
Miseq v2 platform (San Diego, USA) generating paired 250 bp reads. 82
Bioinformatics analysis was carried out using an in-house bioinformatics pipeline. Briefly, sequences 83
reads from each library were filtered, demultiplexed, sorted and pair-end reads merged. Viral 84
composition and relative abundance were determined using GAAS (52), the metagenomes were 85
compared to NCBI RefSeq virus database using Blastx. BCoV reads were also mapped against the 86
Mebus BCoV genome (accession U00735.2) using Burrows-Wheeler Alignment Tool. Reads of 87
BCoV were as well assembled using CLC Genomics Workbench (Qiagen, USA). Specific primers 88
were designed based on the extracted reads for RT PCR to fill sequence gaps between the contigs and 89
the produced amplicons were sequenced on a 3130XL Applied Biosystems capillary sequencer 90
(Applied Biosystems, USA). 91
Screening for bovine respiratory pathogens 92
Samples were screened using the LSI VetMAX Screening pack – Ruminant Respiratory Pathogens 93
real-time PCR kit (Life technologies, USA) according to the manufacturer instructions for the 94
detection of Mycoplasma bovis, Histophilus somni, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, 95
Bovine coronavirus, Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and Bovine parainfluenza-3 virus 96
(BPI-3). 97
BCoV isolation 98
104
Virus isolation was attempted in Human Rectal Tumor-18G (HRT-18G) cells as follows: samples 99
filtered by a syringe driven 0.22µM filter were propagated on HRT-18G (ATCC CRL-11663) cells in 100
the presence of TPCK trypsin (1µg/ml, Thermo Fisher Scientific, USA) in optiMEM Reduced Serum 101
Media (Thermo Fisher Scientific, USA) supplemented with Penicillin (500 µg/ml), Streptomycin (500 102
Units/ml) (Life technologies, USA), Ciprofloxacin (10 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA), Amphotericin B 103
(2.5 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA) and BM-cyclin (15 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA). The cells were 104
incubated for 4 days at 37°C before pooling and filtration of the supernatant. 105
Virus sequence datasets and phylogenetic analysis 106
Viruses sequenced in this study (Table 1) were combined with BCoV nucleotide sequence data 107
available in GenBank, along with their sampling dates, host and sample type (respiratory or fecal) 108
(Table 2). We focused on the spike (S) and nucleocapsid (N) genes as the large majority of the 109
available BCoV sequence data was on S and N genes. Multiple sequence alignments were generated 110
with Clustal Omega (53,54) and manually optimised with BioEdit v7.1 (55). Maximum likelihood 111
(ML) trees were constructed in MEGA v6 (56) using the best-fit nucleotide substitution models: 112
Tamura-Nei model with gamma-distributed rate variation (TN93+G) for N gene and the general time 113
reversible model with gamma-distributed rate variation and a proportion of invariant sites (GTR+G+I) 114
for the S gene. The quality of nucleotide sequences along with their temporal signal were assessed 115
using a regression of the root-to-tip distances of the ML tree and virus sampling dates in TempEst v1.5 116
(57). Samples that deviated from the regression were assumed to either be erroneous or incorrectly 117
labelled and were removed from subsequent analysis. 118
Recombination detection 119
Recombination detection was conducted for the N and S gene datasets using the Genetic Algorithm of 120
Recombination Detection (GARD) method (58) in the Datamonkey server of HyPhy v2 (58,59). 121
Datasets of recombination-free sequences were constructed by dividing the original alignments at the 122
detected breakpoints and were used in all subsequent analyses. 123
105
Molecular dating 124
Nucleotide substitution rates and the evolutionary time scale of divergence of BCoV lineages were 125
estimated using the year of virus sampling used as tip-calibrations in a relaxed molecular clock 126
method under the Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) framework in BEAST v1.7.1 (60), 127
implemented on a Galaxy workbench (http://galaxy-workbench.toulouse.inra.fr/). Molecular clock 128
branch rates were derived from a log-normal distribution (61). The Hasegawa-Kishino-Yano (HKY) 129
nucleotide substitution model was specified separately for codon positions 1 + 2 and 3, and used a 130
constant population size coalescent model. Analysis were run for 2x108 generations, sampling every 131
10,000 generations. Defaults were used for all priors expect for the clock rate for which a uniform 132
prior distribution was specified with an initial value of 10-4 substitutions/nucleotide/year. 133
Convergence of each of the parameters with a minimum effective sample size of 500, following a 134
burning of 10%, was assessed using Tracer (60). Maximum clade credible trees with the mean time of 135
the most recent common ancestor (tMRCA) and their 95% highest posterior density (HPDs) were 136
generated using the TreeAnnotator program included in the BEAST package and visualized in FigTree 137
v1.4.3. 138
Selective pressure analysis 139
Selection pressure acting on the S gene were investigated by estimating the ratio between the mean 140
number of non-synonymous (dN) and synonymous (dS) nucleotide substitution site (dN/dS) using the 141
Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC), Fixed Effects likelihood (FEL) (62,63) and the Mixed 142
Effects Model of Evolution (MEME) method implemented in the datamonkey server of HyPhy v2 143
(59). 144
Results 145
BCoV genomes and isolation 146
106
Upper (NS) and lower (BAL) respiratory tract samples were collected from 31 calves exhibiting acute 147
respiratory disease during 2014 in the southwest of France. Nucleic acids extracted from purified 148
samples were subjected to NGS sequencing, focusing on BCoV genetic material arising separately 149
from the upper and lower respiratory samples of infected cattle. In total, five complete and two partial 150
BCoV genomes were generated (accession numbers MG757138-44), from which the nucleocapsid (N) 151
gene and spike (S) gene sequences were extracted and utilized for subsequent evolutionary analysis 152
(Supplementary Tables 1 and 2). Attempts of virus isolation in HRT-18G cells resulted in the 153
successful isolation of one strain, BCoV/France/ICSA17_LBA/2014, collected from the BAL sample 154
of infected calf in 2014. 155
BCoV and co-infecting pathogens 156
A greater proportion of BCoV were detected in NS samples (with lower Ct values) compared to BAL 157
in 3 out of 4 pools studied, whereas one sample (ICSA21) exhibited about ten times more BCoV in 158
BAL than in NS. Screening for other respiratory pathogens using real-time PCR resulted in the 159
identification of co-infecting agents (Table 1), including P. multocida, M. haemolytica, M. bovis and 160
H. somni. All samples had at least one co-infecting pathogen, with P. multocida in 3/4 calves, 161
followed by M. haemolytica, BRSV, M. bovis, BPI-3, and H. somni (Table 1). 162
Recombination of BCoV 163
Since coronavirus genomes are known to undergo recombination we inferred the occurrence of 164
recombinant breakpoints along the N and S gene alignments of BCoV collected since the 1960’s, and 165
found one recombination breakpoint in the S gene at nucleotide 1101 with significant differences in 166
evolutionary histories (KH test) between the two loci at nucleotide positions 1–1100 and 1101–4089, 167
whereas no breakpoints were detected in the N gene. These results suggest that a single phylogenetic 168
tree may not accurately describe the evolutionary history of S gene and data were therefore partitioned 169
for subsequent phylogenetic analysis. 170
107
Phylogenetic relationships and spatio-temporal evolution of recent BCoV 171
Phylogenetic analysis was conducted using 95 BCoV S gene sequences including seven from the 172
present study, and 54 BCoV N gene sequences including five newly generated sequences. Our 173
sequence dataset was predominantly restricted to sequences originating from North America, Asia and 174
Europe highlighting the paucity of BCoV surveillance and the lack of well curated sequence datasets 175
from around the globe. S gene alignments were partitioned at the detected recombination breakpoint to 176
create S gene datasets ranging from nucleotide positions 1–1100 and 1101–4089. In both data 177
partitions, BCoV circulating since the 1990s formed two broad spatially segregated phylogenetic 178
groups in Asia and Europe, respectively, derived from Mebus/1972-like strain collected in North 179
America. However, there were several topological differences between the S gene data partitions that 180
occurred both during the emergence of lineages in Europe and Asia, but we also identified topological 181
differences within the Asian and European clade suggesting continued recombination among co-182
circulating lineages following spatial segregation (Fig. 1 and 2). 183
The Asian lineage of BCoV was predominated by strains collected in South Korea during 2002–2010 184
and both S gene partition phylogenies suggest that these strains were derived from strains similar to 185
those reported from North America during 1994–1998. Estimation of tMRCA of the South Korean 186
lineages showed that the mean tMRCA of S gene loci 1 was significantly more recent during 1995 187
(mean tMRCA 1995, Highest posterior density [HPD] 1992.5–1998.7) than in data partition-2 which 188
constituted two distinct lineages that diverged during 1986 (mean tMRCA 1986, HPD, 1980–1991), 189
however the tMRCAs of the two co-circulating lineages overlapped with the tMRCA of partition-1 190
highlighting the co-circulation of multiple lineages in South Korea. In addition, two strains collected 191
recently from cattle in China exhibited differences in origin between the S data partitions: their first 192
1000 nucleotides appear to be derived independently from strains similar to those collected in North 193
America during 1994–1998, whereas the second but longer partition were derived directly from South 194
Korean specimens collected during 2002–2010. These results suggest historical movement of BCoV 195
between the North America and Eurasia landmasses as well as between Asian countries. 196
108
The European lineage (EU-lineage) was represented by BCoV collected from several countries in 197
Europe since the 1990s, including France, Denmark, Germany, Italy and Sweden, however excluding 198
France most BCoV sequence data in Europe derives from 2002–2010. There is also evidence that the 199
EU-lineage evolved through recombination as the ancestral relationship of these lineages to 200
M80844/Geissen-Germany/1989 differed between the two loci (Fig. 1 and 2), indicating that the 201
recombination event (breakpoint at nt position 1100) may be at the origin of the distinct Asian and 202
European lineages. 203
BCoV sequences collected from calves in France between 2013–2014 revealed a greater genetic 204
heterogeneity in S gene loci-1 (1–1000 nts) with evidence of co-circulation of two lineages that 205
diverged as early as 2000 (mean tMRCA, Aug 2000 (95% Highest posterior density [HPD], 1998.5–206
2009.8)) (Fig. 1), whereas loci 2 exhibited fewer differences between contemporary viruses and 207
revealed a mean divergence of approximately 4 years (mean tMRCA, Mar 2009 (95% HPD, 2007.5–208
2010.8)). When looking specifically at the Southwestern French BCoV sequences, 209
BCoV/France/ICSA21L3/2014 differed from its counterparts on locus 1 (being closely related to a 210
recent Northwestern French sequence, BCoV/France/EPI-Caen/2013) but clustered with its 211
Southwestern counterparts for the locus 2 (Fig. 2). These results highlight a complex evolutionary 212
history that is determined by migration and pervasive recombination. 213
Our N gene dataset comprised lower sampling outside of France. All N gene sequences of BCoV 214
strains from France, isolated since 2003, formed a monophyletic group, with the mean tMRCA of the 215
contemporary BCoV (2013–2014) isolates estimated during 2004 (95% HPD, 1999.2–2009.2), 216
indicating a result that overlaps with the tMRCA of both S gene partitions. 217
Evolutionary rate and TMRCA of BCoV 218
We estimated the evolutionary rate for the S and N gene datasets using the relaxed clock model, and 219
found a relatively lower rates of nucleotide substitution rates in BCoV datasets, ranging from a mean 220
rate of 0.81 x 10-3 (95% HPD, 0.5–0.8 x 10-3) for S gene data partition-1, 1.0 x 10-3 (HPD, 0.7–1.3 x 221
109
10-3) for S gene data partition-2 and a lower but with wide-confidence intervals were observed for the 222
N gene dataset (mean rate, 0.2 x 10-3 (95% HPD, 0.1–0.4 x 10-3)). These estimates were similar to 223
those estimated for other Coronaviruses, for example the mean nucleotide substitution rate of MERS 224
was estimated at 1.1 (95% CI, 0.8–1.4 x 10-3) (64). Estimates of the coefficient of variance of the 225
relaxed clock model ranges from a mean of 0.61 for the S gene partition-1, to 0.7 for S partition-2 and 226
the N gene datasets, and HPD intervals of all datasets were lower than 1, indicating that there was 227
significant variation in nucleotide substitution rates along the BCoV branches and also suggests that 228
the relaxed clock model was more appropriate than using a strict clock model. 229
The tMRCA of globally sampled BCoV for the N and S genes was estimated during 1940 and 1964, 230
suggesting the common ancestor for known BCoV was about 51 to 75 years prior to the last included 231
sequence date (2015). Whereas the most common recent ancestor of the EU lineage was 1978–1981 232
(Fig. 1 and 2). The recombination event that likely led to the 2 main lineages with clear geographic 233
distinction (US/Asia and European lineages) co-circulating today may thus have occurred in the 234
1960’s–70’s. 235
Selective pressure 236
The selection analysis for the S gene was conducted using 2 partitions. The average dN/dS rate ratio 237
was estimated to be 0.310 for the S gene, with 28 positively selected amino acids (from SLAC, FEL 238
and MEME – see Methods) (Table 2). Amino acids 35, 113, 115, 447, 499, 501, 525, 716, 893, and 239
1239 were detected as positively selected in at least 2 of the 3 used models (Table 2). 240
Discussion 241
Prevalence of BCoV in Europe 242
Bovine coronavirus is considered widespread in Europe and worldwide in both its enteric and 243
respiratory forms. Furthermore, BCoV is considered a main pathogen associated with pneumonia in 244
feedlots in North America (15,16,65,66). Although BCoV is no less a very common pathogen in 245
110
Europe, limited data is available on its epidemiology. Norwegian studies have revealed a high 246
seroprevalence in cattle with 39.3% and 80.7% in calves and herds, respectively, in 2009 and 72.2% in 247
herds tested in 2016 (21,67). In Italy, four respiratory disease outbreaks during 2006 were associated 248
with BCoV without concurrent detection of other known respiratory pathogen but with the detection of 249
BCoV in the intestines in two of the four outbreaks (19). In Belgium, seroconversion for BCoV was 250
detected in 30% of veal calves herds (68). In a retrospective study in Ireland (2008-2012), BCoV was 251
the most frequently detected virus in cattle nasal swabs from respiratory disease outbreaks (69). In 252
France, BCoV was detected in 17 to 63% of respiratory samples collected in 2 independent studies 253
(70). Taken together, literature on BCoV in Europe is limited but highlights the high circulation of the 254
pathogen at the continental scale. 255
No obvious link between virus tropism and genetic markers 256
It is so far unknown whether a unique or distinct BCoV are responsible for respiratory and enteric 257
infections (18,23,25,71). As recently observed in Austria and Slovakia (23), we did not succeed in 258
identifying genetic determinants of tissue tropism, nor between enteric and respiratory BCoV strains, 259
nor between strains present in the upper and lower respiratory tracts. In the absence of viral genetic 260
determinants of tissue tropism, the immune status of the animals at the time of the BCoV infection, 261
infectious dose, and route of inoculation (oro-fecal versus aerosol) may play a role in determining site 262
of infection (72). Further studies are clearly warranted to understand the mechanisms behind the 263
differential tissue tropism of BCoV. 264
Little exchanges of BCoV viruses between Europe and the other continent 265
Among available BCoV complete genomes, a minority are from European origins. In this study we 266
therefore characterized respiratory strains of BCoV, from both upper and lower respiratory tracts, at 267
the genetic level. Despite recent efforts, there are notable gaps in our understanding of bovine 268
coronavirus dynamics and diversity. Our results show that the French strains described here cluster 269
with all other Europeans strains, thus indicating a homogeneous evolution of BCoV in Europe, 270
111
whereas a greater mixing was observed between isolates collected in North America and Asia. This 271
pattern of geographical and temporal distinction between strains was previously described for BRSV, 272
for which distinct phylogenic groups with continent-specific strains were identified (73–75). Similarly, 273
BVDV also harbors a geographic clustering (76). This peculiar evolutionary process could be 274
explained by the relative isolation of Europe as far as cattle traffic is concerned. According to FAOstat 275
(77), cattle traffic involving Europe is mainly unidirectional with export of live animals from France 276
(for the most part) to other continents with a negligible importation activity. On the other hand, the 277
import/export activity between North America and East Asia is much more fluid. In addition, Kin et al 278
recently highlighted this important trade constraint on BCoV spread at a global scale (28). It is 279
however unclear why/how BCoV, BRSV, or BVDV, would spread differently than other bovine RNA 280
viruses. Influenza D viruses (IDV), which primarily infects Bovine hosts, seem for example to have 281
emerged recently but genetically and antigenetically similar viruses circulate in Europe and North 282
America (78–81). One may thus hypothesize that different routes of transmission may be used for the 283
different pathogens. In addition, human coronaviruses were shown to induce short term immunity 284
(82). If BCoV led to similar responses in cattle, herds with animals of multiple ages as seen more often 285
in France than in North America, might face re-infections with BCoV, and might maintain virus over 286
long periods of time, which would impact the virus evolution. 287
Recombination likely drove the different evolutionary process taken by the Asian and North American 288
strains and the Europeans strains; in the first partition of the S gene dataset, the strains M80844 289
Giessen/1989 clustered along with French strain D00731/1979, US strain AF058942 LY138 290
Utah/1965, South Koreans EU401988 SUN5/1994 and EU401987 A3/1994 and North Americans 291
AF220295 Quebec/1972 and U00735 Mebus/1972 suggesting a common ancestor of this cluster. 292
Whereas, in the partition 2 of the S dataset, we noticed a change in the phylogenic scheme: the 293
M80844 Giessen/1989 there clustered with all Europeans strains while the more recent North Korean 294
(year 2002) and recent Chinese KM985631 HLJ/T4/2014 and KU886219 AKS/01/2015 clustered with 295
the US strains of the 1990’s, suggesting a common origin. The old BCoV strains (< year 1994) seemed 296
112
to have the same origin irrespective of their geographic origin until an event of recombination led the 297
European strains to evolve separately. 298
Evolution of BCOV 299
Using the different models (constant population under strict and relaxed clock for all the strains and 300
the constant population and BSP under relaxed clock for the European strains), the mean substitution 301
rates calculated for the spike genes ranged between 3.9 and 9.8 x 10-4 nucleotide substitution per site 302
per year, very similar range as previously published: 2.1-10.5 x 10-4 (83,84). The slower evolution of 303
N than of S gene is also in line to previous reports from the literature (84). Substitution rates were in 304
the same range for other Betacoronaviruses with 0.6 x 10-3, 0.7 ± 2 × 10-3 for HCoV-OC43 and 305
TGEV, respectively (85,86). We observed a slightly faster evolution for European BCoV than for the 306
whole dataset (Table 2). An important bias in our analyses comes from the lack of sequence data and a 307
timing difference between European and American BCoV: most North American specimens were at 308
least ten years older than European strains. In addition, the production systems (different numbers of 309
animals per farms, feedlots in North America but not in Europe), the virus prevalence, and the vaccine 310
coverages are likely different: the selection pressures must be different. Our selection pressure 311
calculations did unfortunately not allow for highlighting any difference in selection pressure between 312
the continents. The 10 positively selected amino acids detected here (Table 3) were spread out over the 313
whole spike protein and could not be linked to a biological function due to the limited research so far 314
carried out on BCoV: no spike structure has so far been resolved (comparison is only possible with the 315
SARS spike), and no clear antigenic sites have been detected to the best of our knowledge. Further 316
studies are thus warranted to understand the role of these positions in BCoV evolution. 317
As far as the TMRCA is concerned, our analysis with the new sequence data confirmed the values 318
previously estimated: 1978 (95% CI: 1910-1963) or 1944 (95% CI: 1910-1963) (83,84). Here again, 319
more sequences available throughout the last few decades would allow for an increased precision in 320
the TMRCA. We showed here for the first time that a recombination event may be at the origin of the 321
113
viruses that evolved separately in Europe on the one hand side and in America/Asia on the other hand 322
side. This event likely occurred in the 1960’s-1970’s, when cattle exchanges between Europe and the 323
other continents was already very limited. 324
Conclusions 325
Taken together, our results showed that while no genetic determinant of tissue tropism could be 326
identified in BCoV sequences, the BCoV ancestor emerged in the 1940’s, and that two geographically 327
distinct lineages diverged from the 1960’s-1970’s with no genetic mixing detected thus far. Further 328
studies are warranted to understand the mechanisms behind BCoV tissue tropism, and improved 329
surveillance and sequencing to precisely estimate the evolutionary and epidemiological parameters, of 330
circulation BcoV and identify the recombinations in genomic evolution. 331
References
1. Grissett, G. P., White, B. J. & Larson, R. L. Structured Literature Review of Responses of Cattle to Viral and Bacterial Pathogens Causing Bovine Respiratory Disease Complex. J. Vet. Intern. Med. 29, 770–780 (2015).
2. Caswell, J. L. Failure of respiratory defenses in the pathogenesis of bacterial pneumonia of cattle. Vet. Pathol. 51, 393–409 (2014).
3. Hilton, W. M. BRD in 2014: where have we been, where are we now, and where do we want to go? Anim. Health Res. Rev. 15, 120–2 (2014).
4. Hodgson, P. D. et al. Stress significantly increases mortality following a secondary bacterial respiratory infection. Vet. Res. 43, 21 (2012).
5. Hodgson, P. D. et al. Effect of stress on viral-bacterial synergy in bovine respiratory disease: Novel mechanisms to regulate inflammation. Comp. Funct. Genomics 6, 244–250 (2005).
6. Risalde, M. A. et al. Pathogenic mechanisms implicated in the intravascular coagulation in the lungs of BVDV-infected calves challenged with BHV-1. Vet. Res. 44, 1–13 (2013).
7. Valarcher, J.-F. & Taylor, G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet. Res. 38, 153–80 (2007).
8. Boukahil, I. & Czuprynski, C. J. Mannheimia haemolytica biofilm formation on bovine respiratory epithelial cells. Vet. Microbiol. 197, 129–136 (2016).
9. Elswaifi, S. F., Scarratt, W. K. & Inzana, T. J. The role of lipooligosaccharide phosphorylcholine in colonization and pathogenesis of Histophilus somni in cattle. Vet. Res. 43, (2012).
114
10. Sandal, I. et al. Histophilus somni biofilm formation in cardiopulmonary tissue of the bovine host following respiratory challenge. Microbes Infect. 11, 254–263 (2009).
11. Zecchinon, L., Fett, T. & Desmecht, D. How Mannheimia haemolytica defeats host defence through a kiss of death mechanism. Veterinary Research 36, 133–156 (2005).
12. Gomez, D. E., Arroyo, L. G., Poljak, Z., Viel, L. & Weese, J. S. Detection of Bovine Coronavirus in Healthy and Diarrheic Dairy Calves. J. Vet. Intern. Med. (2017). doi:10.1111/jvim.14811
13. Ribeiro, J., Lorenzetti, E., Alfieri, A. F. & Alfieri, A. A. Molecular detection of bovine coronavirus in a diarrhea outbreak in pasture-feeding Nellore steers in southern Brazil. Trop. Anim. Health Prod. 48, 649–653 (2016).
14. Alkan, F. et al. The Detection and Genetic Characterization Based on the S1 Gene Region of BCoVs from Respiratory and Enteric Infections in Turkey. Transbound. Emerg. Dis. 58, 179–185 (2011).
15. Hasoksuz, M. et al. Detection of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in an Ohio feedlot. J. Vet. Diagn. Invest. 14, 308–13 (2002).
16. Fulton, R. W. et al. Bovine coronavirus (BCV) infections in transported commingled beef cattle and sole-source ranch calves. Can. J. Vet. Res. 75, 191–199 (2011).
17. Fulton, R. W., Ridpath, J. F. & Burge, L. J. Bovine coronaviruses from the respiratory tract: Antigenic and genetic diversity. Vaccine 31, 886–892 (2013).
18. Saif, L. J. Bovine respiratory coronavirus. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 26, 349–364 (2010).
19. Decaro, N. et al. Respiratory disease associated with bovine coronavirus infection in cattle herds in Southern Italy. J. Vet. Diagnostic Investig. 20, 28–32 (2008).
20. Bok, M. et al. Molecular and antigenic characterization of bovine Coronavirus circulating in Argentinean cattle during 1994-2010. Vet. Microbiol. 181, 221–229 (2015).
21. Toftaker, I., Sanchez, J., Stokstad, M. & Nødtvedt, A. Bovine respiratory syncytial virus and bovine coronavirus antibodies in bulk tank milk – risk factors and spatial analysis. Prev. Vet. Med. 133, 73–83 (2016).
22. Alekseev, K. P. et al. Bovine-like coronaviruses isolated from four species of captive wild ruminants are homologous to bovine coronaviruses, based on complete genomic sequences. J. Virol. 82, 12422–31 (2008).
23. Vilček, S., Jacková, A., Kolesárová, M. & Vlasáková, M. Genetic variability of the S1 subunit of enteric and respiratory bovine coronavirus isolates. Acta Virol. 61, 212–216 (2017).
24. Hasoksuz, M., Lathrop, S., Al-dubaib, M. A., Lewis, P. & Saif, L. J. Antigenic variation among bovine enteric coronaviruses (BECV) and bovine respiratory coronaviruses (BRCV) detected using monoclonal antibodies. Arch. Virol. 144, 2441–7 (1999).
25. Gélinas, A. M., Boutin, M., Sasseville, A. M. J. & Dea, S. Bovine coronaviruses associated with enteric and respiratory diseases in Canadian dairy cattle display different reactivities to anti-HE
115
monoclonal antibodies and distinct amino acid changes in their HE, S and ns4.9 protein. Virus Res. 76, 43–57 (2001).
26. Kanno, T., Hatama, S., Ishihara, R. & Uchida, I. Molecular analysis of the S glycoprotein gene of bovine coronaviruses isolated in Japan from 1999 to 2006. J. Gen. Virol. 88, 1218–1224 (2007).
27. Gunn, L., Collins, P. J., O’Connell, M. J. & O’Shea, H. Phylogenetic investigation of enteric bovine coronavirus in Ireland reveals partitioning between European and global strains. Ir. Vet. J. 68, 31 (2015).
28. Kin, N. et al. Comparative molecular epidemiology of two closely related coronaviruses, bovine coronavirus (BCoV) and human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), reveals a different evolutionary pattern. Infect. Genet. Evol. 40, 186–191 (2016).
29. Vijgen, L. et al. Circulation of genetically distinct contemporary human coronavirus OC43 strains. Virology 337, 85–92 (2005).
30. Fields, B. N., Knipe, D. M. (David M. & Howley, P. M. Fields virology. (Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, 2013).
31. Wertheim, J. O., Chu, D. K. W., Peiris, J. S. M., Kosakovsky Pond, S. L. & Poon, L. L. M. A Case for the Ancient Origin of Coronaviruses. J. Virol. 87, 7039–7045 (2013).
32. Fehr, A. R. & Perlman, S. Coronaviruses: An Overview of Their Replication and Pathogenesis. 1282, 1–23 (2015).
33. NEMOTO, M. et al. Antibody response to equine coronavirus in horses inoculated with a bovine coronavirus vaccine. J. Vet. Med. Sci. (2017). doi:10.1292/jvms.17-0414
34. Decaro, N. & Buonavoglia, C. Canine Coronavirus: Not Only an Enteric Pathogen. Vet. Clin. North Am. - Small Anim. Pract. 41, 1121–1132 (2011).
35. Dong, B. et al. Identification and genetic characterization of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus from domestic piglets in China. Arch. Virol. 159, 2329–2337 (2014).
36. van Boheemen, S. et al. Genomic characterization of a newly discovered coronavirus associated with acute respiratory distress syndrome in humans. MBio 3, e00473-12 (2012).
37. Lau, S. K. P. et al. Genetic Characterization of Betacoronavirus Lineage C Viruses in Bats Reveals Marked Sequence Divergence in the Spike Protein of Pipistrellus Bat Coronavirus HKU5 in Japanese Pipistrelle: Implications for the Origin of the Novel Middle East Respiratory Sy. J. Virol. 87, 8638–8650 (2013).
38. Yang, Y. et al. Receptor usage and cell entry of bat coronavirus HKU4 provide insight into bat-to-human transmission of MERS coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 12516–12521 (2014).
39. Lau, S. K. P. et al. Coexistence of Different Genotypes in the Same Bat and Serological Characterization of Rousettus Bat Coronavirus HKU9 Belonging to a Novel Betacoronavirus Subgroup. J. Virol. 84, 11385–11394 (2010).
40. Brian, D. A. & Baric, R. S. in Coronavirus Replication and Reverse Genetics 1–30 (Springer-Verlag, 2005). doi:10.1007/3-540-26765-4_1
116
41. Denison, M. R., Graham, R. L., Donaldson, E. F., Eckerle, L. D. & Baric, R. S. Coronaviruses. RNA Biol. 8, 270–279 (2011).
42. Drosten, C. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348, 1967–1976 (2003).
43. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D. M. E. & Fouchier, R. A. M. Isolation of a Novel Coronavirus from a Man with Pneumonia in Saudi Arabia. N. Engl. J. Med. 367, 1814–1820 (2012).
44. Wang, Q. et al. Bat origins of MERS-CoV supported by bat Coronavirus HKU4 usage of human receptor CD26. Cell Host Microbe 16, 328–337 (2014).
45. Han, H.-J., Yu, H. & Yu, X.-J. Evidence for zoonotic origins of Middle East respiratory syndrome coronavirus. J. Gen. Virol. 97, 274–80 (2016).
46. Mohd, H. A., Al-Tawfiq, J. A. & Memish, Z. A. Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) origin and animal reservoir. Virol. J. 13, 87 (2016).
47. Lau, S., Wong, A., Lau, T. & Woo, P. Molecular Evolution of MERS Coronavirus: Dromedaries as a Recent Intermediate Host or Long-Time Animal Reservoir? Int. J. Mol. Sci. 18, 2138 (2017).
48. Lu, G., Wang, Q. & Gao, G. F. Bat-to-human: spike features determining ‘host jump’ of coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, and beyond. Trends Microbiol. 23, 1–11 (2015).
49. Nidovirales - Positive Sense RNA Viruses - Positive Sense RNA Viruses (2011) - International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). (2011).
50. Vijgen, L. et al. Complete Genomic Sequence of Human Coronavirus OC43 : Molecular Clock Analysis Suggests a Relatively Recent Zoonotic Coronavirus Transmission Event Complete Genomic Sequence of Human Coronavirus OC43 : Molecular Clock Analysis Suggests a Relatively Recent. J. Virol. 79, 1595–1604 (2005).
51. Liais, E. et al. Novel avian coronavirus and fulminating disease in Guinea Fowl, France. Emerg. Infect. Dis. 20, 105–108 (2014).
52. Angly, F. E. et al. The GAAS metagenomic tool and its estimations of viral and microbial average genome size in four major biomes. PLoS Comput. Biol. 5, (2009).
53. Goujon, M. et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Res. 38, W695–W699 (2010).
54. Sievers, F. et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).
55. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41, 95–98 (1999).
56. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725–2729 (2013).
57. Rambaut, A., Lam, T. T., Max Carvalho, L. & Pybus, O. G. Exploring the temporal structure of heterochronous sequences using TempEst (formerly Path-O-Gen). Virus Evol. 2, vew007 (2016).
117
58. Kosakovsky Pond, S. L., Posada, D., Gravenor, M. B., Woelk, C. H. & Frost, S. D. W. GARD: a genetic algorithm for recombination detection. Bioinformatics 22, 3096–3098 (2006).
59. Delport, W., Poon, A. F. Y., Frost, S. D. W. & Kosakovsky Pond, S. L. Datamonkey 2010: A suite of phylogenetic analysis tools for evolutionary biology. Bioinformatics 26, 2455–2457 (2010).
60. Drummond, A. J. & Rambaut, A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evol. Biol. 7, 214 (2007).
61. Drummond, A. J., Ho, S. Y. W., Phillips, M. J. & Rambaut, A. Relaxed phylogenetics and dating with confidence. PLoS Biol. 4, 699–710 (2006).
62. Kosakovsky Pond, S. L. & Frost, S. D. W. Not So Different After All: A Comparison of Methods for Detecting Amino Acid Sites Under Selection. Mol. Biol. Evol. 22, 1208–1222 (2005).
63. Pond, S. L. K. & Frost, S. D. W. Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments. Bioinformatics 21, 2531–2533 (2005).
64. Cotten, M. et al. Spread, circulation, and evolution of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. MBio 5, e01062-13 (2014).
65. Storz, J. et al. Isolation of respiratory bovine coronavirus, other cytocidal viruses, and Pasteurella spp from cattle involved in two natural outbreaks of shipping fever. J Am Vet Med Assoc 216, 1599–1604 (2000).
66. Cho, K. O., Hoet, A. E., Loerch, S. C., Wittum, T. E. & Saif, L. J. Evaluation of concurrent shedding of bovine coronavirus via the respiratory tract and enteric route in feedlot cattle. Am. J. Vet. Res. 62, 1436–1441 (2001).
67. Gulliksen, S. M. et al. Respiratory infections in Norwegian dairy calves. J. Dairy Sci. 92, 5139–5146 (2009).
68. Pardon, B. et al. Prevalence of respiratory pathogens in diseased, non-vaccinated, routinely medicated veal calves. Vet. Rec. 169, 278 (2011).
69. O’Neill, R., Mooney, J., Connaghan, E., Furphy, C. & Graham, D. A. Patterns of detection of respiratory viruses in nasal swabs from calves in Ireland: a retrospective study. Vet. Rec. 175, 351–351 (2014).
70. Meyer, G. et al. Vers une identification de nouveaux virus respiratoires bovins. NEVA 8, 80–86 (2015).
71. Hasoksuz, M., Lathrop, S. L., Gadfield, K. L. & Saif, L. J. Isolation of bovine respiratory coronaviruses from feedlot cattle and comparison of their biological and antigenic properties with bovine enteric coronaviruses. Am. J. Vet. Res. 60, 1227–33 (1999).
72. Behura, S. K. et al. Tissue Tropism in Host Transcriptional Response to Members of the Bovine Respiratory Disease Complex. Sci. Rep. 7, 17938 (2017).
73. Valentova, V., Antonis, A. F. G. & Kovarcik, K. Restriction enzyme analysis of RT-PCR amplicons as a rapid method for detection of genetic diversity among bovine respiratory syncytial virus isolates. Vet. Microbiol. 108, 1–12 (2005).
118
74. Sarmiento-Silva, R. E., Nakamura-Lopez, Y. & Vaughan, G. Epidemiology, molecular epidemiology and evolution of bovine respiratory syncytial virus. Viruses 4, 3452–3467 (2012).
75. Valarcher, J. F., Schelcher, F. & Bourhy, H. Evolution of bovine respiratory syncytial virus. J. Virol. 74, 10714–28 (2000).
76. Vilcek, S., Durkovic, B., Kolesarova, M. & Paton, D. J. Genetic diversity of BVDV: Consequences for classification and molecular epidemiology. in Preventive Veterinary Medicine 72, 31–35 (Elsevier, 2005).
77. FAO statistics. Trade sheets. Available at: http://www.fao.org/faostat/en/#data/TM. (Accessed: 25th January 2018)
78. Collin, E. a. et al. Cocirculation of Two Distinct Genetic and Antigenic Lineages of Proposed Influenza D Virus in Cattle. J. Virol. 89, 1036–1042 (2015).
79. Ducatez, M. F., Pelletier, C. & Meyer, G. Influenza D Virus in Cattle , France , 2011 – 2014. EID J. 21, 2011–2014 (2015).
80. Flynn, O. et al. Influenza D Virus in Cattle, Ireland. 24, 2016–2018 (2018).
81. Foni, E. et al. Influenza D in Italy: towards a better understanding of an emerging viral infection in swine. Sci. Rep. 1–7 (2017). doi:10.1038/s41598-017-12012-3
82. Callow, K. A., Parry, H. F., Sergeant, M. & Tyrrell, D. A. The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiol. Infect. 105, 435–46 (1990).
83. Bidokhti, M. R. M. et al. Evolutionary dynamics of bovine coronaviruses: Natural selection pattern of the spike gene implies adaptive evolution of the strains. J. Gen. Virol. 94, 2036–2049 (2013).
84. Vijgen, L. et al. Evolutionary History of the Closely Related Group 2 Coronaviruses: Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus, Bovine Coronavirus, and Human Coronavirus OC43. J. Virol. 80, 7270–7274 (2006).
85. Sánchez, C. M. et al. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses. Virology 190, 92–105 (1992).
86. Lau, S. K. P. et al. Molecular Epidemiology of Human Coronavirus OC43 Reveals Evolution of Different Genotypes over Time and Recent Emergence of a Novel Genotype due to Natural Recombination. J. Virol. 85, 11325–11337 (2011).
Acknowledgments
We are grateful to the Genotoul bioinformatics platform Toulouse Midi-Pyrenées and Sigenae group
for providing help and/or computing and/or storage resources on the Galaxy interface http://sigenae-
workbench.toulouse.inra.fr. This work was supported by the ‘RESPICARE’ grant of the Institut
Carnot Santé Animale (ICSA), and by the French Ministry of Agriculture. Elias Salem is supported by
a PhD scholarship of the Lebanese University.
119
Contributions
E. Salem, H. Cassard, G. Meyer, M. Ducatez initiated the research, performed the field and laboratory
work. E. Salem, D. Vijaykrishna, B. Hause, S. Maman and M. Ducatez run the bioinformatics and
molecular evolution analyses. E. Salem, D. Vijaykrishna and M. Ducatez drafted the manuscript. All
authors reviewed the final manuscript.
Competing Interests
The authors declare no competing interests.
Figures legends
Figure 1. Dated phylogeny of BCoV S gene partition 1 (nt 1-1100). Tree generated using the relaxed
clock model and a constant coalescent tree prior. Nodes correspond to mean tMRCAs. 95% HPD are
indicated on nodes with grey boxes. French sequences (including those generated in the present study),
European, Asian, and North American sequences are in red, orange, blue and green fonts, respectively.
Figure 2. Dated phylogeny of BCoV S gene partition 2 (nt 1101-4089). Tree generated using the
relaxed clock model and a constant coalescent tree prior. Nodes correspond to mean tMRCAs. 95%
HPD are indicated on nodes with grey boxes. French sequences (including those generated in the
present study), European, Asian, and North American sequences are in red, orange, blue and green
fonts, respectively.
120
Figure 1 :
121
Figure 2 :
122
Table 1. Presence of co-infecting pathogens as determined by real time using the LSI vetmax
screening kit.
1BAL, bronchoalveolar lavage and NS, nasal swabs. 2Ct values >40 are not shown. P.: Pasteurella;
M.: Mycoplasma; H.: Histophilus; BCoV: Bovine coronavirus; BRSV: Bovine respiratory syncytial
virus; BPI-3: Bovine parainfluenza-3 virus.
Table 2. Amino acid sites detected to be under positive selection (with p-values <0.1) through
either of the selection methods (SLAC, FEL, and MEME).
Sample
Ct value2
Id Type1
P. multocida M. haemolytica M. bovis H. somni BCoV BRSV BPI-3
ICSA-4 BAL 26,75 30,17 22,74
ICSA-16 BAL
39,01 24,19
ICSA-17 BAL 27,04
38,9
ICSA 21 BAL 29,32 27,31 29,27
38,61
ICSA-4 NS 32,1 27,9 29,4 32,61
ICSA-16 NS
18,67
ICSA-17 NS 28,9
ICSA 21 NS 24,4 26,7 34,93
Codon SLAC p-value FEL p-value MEME p-value
35 0.0600 0.0700 0.0130
113 0.0340 0.0220 0.0700
115 0.0670 0.0210 #N/A
155 #N/A #N/A 0.0500
179 #N/A #N/A 0.0680
257 #N/A 0.0820 #N/A
123
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
Sites with p-values <0.05 are shown in bold. Codons positively selected as shown by at least 2 of the 3
selection methods are underlined. #N/A: no positive selection detected.
304 #N/A #N/A 0.0160
447 0.0260 0.0260 0.0660
484 #N/A #N/A 0.0980
499 0.0230 0.0090 #N/A
501 0.0010 0.0040 0.0060
509 #N/A 0.0410 #N/A
525 0.0220 0.0280 0.0910
543 #N/A #N/A 0.0760
689 #N/A #N/A 0.0380
716 0.0590 0.0490 #N/A
744 #N/A #N/A 0.0060
767 #N/A #N/A 0.0000
769 #N/A #N/A 0.0940
892 #N/A #N/A 0.0710
893 #N/A 0.0410 0.0010
1085 #N/A #N/A 0.0030
1188 #N/A #N/A 0.0040
1206 #N/A 0.0450 #N/A
1237 #N/A #N/A 0.0380
1239 #N/A 0.0110 0.0960
1269 #N/A #N/A 0.0000
1362 #N/A 0.0150 #N/A
124
Supplementary Table 1. Details of the strains used for S gene sequences analyses
Accession
number Strain/isolate Host species
Type of
sample Country Sampling year
KU886219 AKS 1 bovine - China 2015
DQ389658 KWD17 bovine enteric South Korea 2002
DQ389656 KWD15 bovine enteric South Korea 2002
DQ389655 KWD14 bovine enteric South Korea 2002
DQ389653 KWD12 bovine enteric South Korea 2002
HM573330 Nyala 10.01 Nyala enteric South Korea 2010
HM573326 Wisent 10.01 Wisent enteric South Korea 2010
DQ389633 KCD2 bovine enteric South Korea 2004
DQ389654 KWD13 bovine enteric South Korea 2002
DQ389634 KCD3 bovine enteric South Korea 2004
DQ389635 KCD4 bovine enteric South Korea 2004
DQ389632 KCD1 bovine enteric South Korea 2004
DQ389636 KCD5 bovine enteric South Korea 2004
DQ389639 KCD8 bovine enteric South Korea 2004
DQ389641 KCD10 bovine enteric South Korea 2004
DQ389637 KCD6 bovine enteric South Korea 2004
DQ389638 KCD7 bovine enteric South Korea 2004
DQ389640 KCD9 bovine enteric South Korea 2004
DQ389659 KWD18 bovine enteric South Korea 2002
AY935643 KWD7 bovine enteric South Korea 2002
DQ389652 KWD11 bovine enteric South Korea 2002
DQ389657 KWD16 bovine enteric South Korea 2002
DQ389660 KWD19 bovine enteric South Korea 2002
KM985631 HLJ-14/CHN bovine enteric China 2014
AY935641 KWD5 bovine enteric South Korea 2002
AY935646 KWD10 bovine enteric South Korea 2002
AY935637 KWD1 bovine enteric South Korea 2002
AY935642 KWD6 bovine enteric South Korea 2002
125
AY935638 KWD2 bovine enteric South Korea 2002
AY935644 KWD8 bovine enteric South Korea 2002
AY935639 KWD3 bovine enteric South Korea 2002
AB354579 kakegawa bovine enteric Japan 1976
EU401988.1 SUN5 bovine enteric South Korea 1994
EU401987.1 A3 bovine enteric South Korea 1994
MG757144 BCoV/France/13-ICSA17-LBA/2014 bovine respiratory France 2014
MG757140 BCoV/France/11-ICSA16-LBA/2014 bovine respiratory France 2014
MG757139 BCoV/France/12-ICSA16-EN/2014 bovine respiratory France 2014
MG757138 BCoV/France/ICSA21L3/LBA/2014 bovine respiratory France 2014
MG757143 BCoV/France/2-ICSA4-EN/2014 bovine respiratory France 2014
KF169922 SWE/AC/06-1 bovine enteric Sweden 2006
KF169924 SWE/M/06-4 bovine enteric Sweden 2006
KF169940 SWE/P/10-4 bovine enteric Sweden 2010
KF169939 SWE/Y/10-3 bovine enteric Sweden 2010
KF169938 SWE/M/10-2 bovine enteric Sweden 2010
KF169937 SWE/M/10-1 bovine enteric Sweden 2010
KT318119 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/09 bovine enteric France 2013
KT318123 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/13 bovine enteric France 2014
KT318121 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/11 bovine enteric France 2013
KT318122 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/12 bovine enteric France 2014
KT318118 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/08 bovine enteric France 2013
KT318117 BCoV/FRA/EPI/Caen/2012/07 bovine enteric France 2012
KF169914 DEN/03-2 bovine enteric Denmark 2003
EU019216 Buffalo Buffalo enteric Italy 2007
KT318112 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/02 bovine enteric France 2005
KT318124 BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 bovine enteric France 2004
KT318113 BCoV/FRA/EPI/Caen/2007/03 bovine enteric France 2007
KF169933 SWE/I/08-3 bovine enteric Sweden 2008
EU814647 438/06-TN bovine respiratory Italy 2006
KT318114 BCoV/FRA/EPI/Caen/2008/04 bovine enteric France 2008
KT318116 BCoV/FRA/EPI/Caen/2010/06 bovine enteric France 2010
126
KF169909 SWE/02-1 bovine respiratory Sweden 2002
KF169910 SWE/02-2 bovine respiratory Sweden 2002
KF169912 SWE/02-4 bovine respiratory Sweden 2002
KF169935 SWE/C/09-2 bovine respiratory Sweden 2009
KF169929 SWE/I/07-5 bovine enteric Sweden 2007
KF169934 SWE/P/09-1 bovine enteric Sweden 2009
KF169921 SWE/N/05-2 bovine enteric Sweden 2005
KF169920 SWE/N/05-1 bovine enteric Sweden 2005
KF169923 SWE/M/06-3 bovine enteric Sweden 2006
KF169936 SWE/U/09-3 bovine respiratory Sweden 2009
KF169930 SWE/C/07-6 bovine enteric Sweden 2007
KF169925 SWE/Z/07-1 bovine enteric Sweden 2007
KF169932 SWE/C/08-2 bovine enteric Sweden 2008
KF169931 SWE/AC/08-1 bovine enteric Sweden 2008
KF169926 SWE/C/07-2 bovine enteric Sweden 2007
EF445634 339/06 bovine enteric Italy 2006
KF169917 DEN/05-2 bovine enteric Denmark 2005
KF169919 DEN/05-4 bovine enteric Denmark 2005
KF169918 DEN/05-3 bovine respiratory Denmark 2005
KT318111 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/01 bovine respiratory France 2005
KT318115 BCoV/FRA/EPI/Caen/2003/05 bovine enteric France 2003
KF169915 DEN/03-3 bovine enteric Denmark 2003
KF169913 DEN/03-1 bovine enteric Denmark 2003
KF169908 SWE/C/92 bovine enteric Sweden 1992
M80844 Giessen bovine respiratory Germany 1989
D00731.1 Bovine bovine enteric France 1979
AF391541 BCoV-ENT bovine enteric USA Texas 1998
DQ915164 Alpaca bovine enteric USA Oregon 1998
AF391542 BCoV-LUN bovine respiratory USA Texas 1998
AF058943 LSU-94LSS-051-2 bovine respiratory USA Louisiana 1994
AF058944 OK-0514-3 bovine respiratory USA 1996
AF058942 LY138 bovine enteric USA Utah 1965
127
AF220295 Quebec bovine _ Quebec 1972
U00735 Mebus bovine enteric USA 1972
KF272919.1 RVLC7 bovine enteric Ireland 2011
128
Supplementary Table 2. Details of the strains used for N gene sequences analyses
Accession
number Strain/ isolate Host species
Type of
sample Country
Sampling
year
KU886219.1 BCV-AKS-01 Bovine - China 2015
M36656.1 F15 Bovine enteric France 1979
EU019216.1 Bubalus/Italy/179/07-11 Bubalus enteric Italy 2006
KM985634.1 HLJ-14/CHN Bovine enteric China 2014
EU401983.1 A3 Bovine enteric South Korea 1994
EU401984.1 SUN5 Bovine enteric South Korea 1994
AB354579.1 Kakegawa Bovine enteric Japan 1976
U00735.2 Mebus Bovine enteric USA 1972
KT318083.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/02 Bovine enteric France 2005
KT318087.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2003/05 Bovine enteric France 2003
KT318084.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/01 Bovine respiratory France 2005
KT318085.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2007/03 Bovine enteric France 2007
KT318096.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 Bovine enteric France 2004
KT318088.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2010/06 Bovine enteric France 2010
KT318086.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2008/04 Bovine enteric France 2008
MG757140 BCoV/France/11-ICSA16-LBA/2014 Bovine respiratory France 2014
MG757141 BCoV/France/ICSA17_LBA/2014 Bovine respiratory France 2014
MG757142 BCoV/France/19-pool-LBA/2014 Bovine respiratory France 2014
MG757139 BCoV/France/12-ICSA16-EN/2014 Bovine respiratory France 2014
MG757138 BCoV/France/ICSA21L3LBA/2014 Bovine respiratory France 2014
KT318092.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/10 Bovine enteric France 2013
KT318089.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2012/07 Bovine enteric France 2012
KT318095.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/13 Bovine enteric France 2014
KX982264.1 BCoV Bovine enteric France 2014
KT318093.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/11 Bovine enteric France 2013
KT318094.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/12 Bovine enteric France 2014
KT318090.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/08 Bovine enteric France 2013
KT318091.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/09 Bovine enteric France 2013
129
EU401980.1 0501 Bovine enteric South Korea 2005
EU401981.1 0502 Bovine enteric South Korea 2005
AF058943.1 LSU-94LSS-051-2 Bovine respiratory USA 1994
AF058944.1 OK-0514-3 Bovine respiratory USA 1996
FJ425186.1 US/OH-WD358/1994 Waterbuck enteric USA 1994
FJ425185.1 US/OH-WD358-GnC/1994 Waterbuck enteric USA 1994
DQ811784.2 DB2 Bovine - Maryland USA 1984
FJ425189.1 US/OH-WD388/1994 Sambar deer enteric USA 1994
EF424621.1 US/OH1/2003 Sable antelope enteric USA 2003
EF424623.1 US/OH3/2003 Giraffe enteric USA 2003
AF391542.1 BCoV-LUN Bovine respiratory Texas USA 1998
AF391541.1 BCoV-ENT Bovine enteric Texas USA 1998
EF424617.1 R-AH65 Bovine respiratory Ohio USA 2001
DQ915164.2 Alpaca Alpaca enteric USA 1998
EF424620.1 R-AH187 Bovine respiratory Ohio USA 2000
FJ425187.1 US/OH-WD470/1994
White-tailed
deer enteric Ohio USA 1994
AF058942.1 LY 138 Bovine enteric Utah USA 1965
130
Résultats et discussion
Le coronavirus bovin est répandu en Europe et dans le monde sous ses
deux formes entérique et respiratoire. De plus, le BCoV est considéré comme un
pathogène principal associé à la pneumonie dans les parcs d'engraissement en
Amérique du Nord. Même si BCoV est très commun en Europe, les données
disponibles sur son épidémiologie sont limitées. En France, le BCoV a été détecté
dans 17 à 63% des échantillons respiratoires collectés dans 2 études
indépendantes par des méthodes de criblage conventionnelles. La littérature sur
BCoV en Europe est limitée mais met en évidence la circulation importante de
l'agent pathogène à l'échelle continentale.
Dans cette étude, nous n'avons pas réussi à identifier de déterminants
génétiques du tropisme tissulaire entre les souches BCoV entériques et
respiratoires, ou entre les souches présentes dans les voies respiratoires
supérieures et inférieures. D'autres études seront nécessaires pour comprendre
les mécanismes à l'origine du tropisme tissulaire du BCoV.
Parmi les génomes complets de BCoV disponibles, une minorité est
d'origine européenne. Dans cette étude, nous avons donc caractérisé au niveau
génétique des souches respiratoires de BCoV, à la fois des voies respiratoires
superficielles et inférieures.
Malgré les efforts récents, il existe des lacunes notables dans notre
compréhension de la dynamique et de la diversité des coronavirus bovins. Nos
résultats montrent que les souches françaises décrites ici se regroupent avec
toutes les autres souches européennes, indiquant ainsi une évolution homogène
du BCoV en Europe, alors qu'une plus grande diversité a été observée entre les
isolats collectés en Amérique du Nord et en Asie. Ce modèle de distinction
géographique et temporelle entre les souches a été précédemment décrit pour le
BRSV, pour lequel des groupes phylogéniques distincts avec des souches
spécifiques au continent ont été identifiés. Ce processus évolutif particulier
pourrait s'expliquer par l'isolement relatif de l'Europe en ce qui concerne le
commerce du bétail. Ces échanges sont principalement unidirectionnels avec
131
l'exportation d'animaux vivants majoritairement de la France vers d'autres
continents et avec une activité d'importation négligeable.
Un évènement de recombinaison a été détecté dans le gène de la spicule
(S) qui a probablement conduit le processus évolutif vers une divergence entre
souches asiatiques et nord-américaines d’une part et souches européennes
d’autre part. Deux regroupements phylogénétiques distincts, séparés par la
recombinaison, ont été observés. Les anciennes souches de BCoV (pré-1994)
semblaient avoir un ancêtre commun quelle que soit leur origine géographique.
L’événement de recombinaison a probablement eu lieu dans les années 1960-
1970, alors que les échanges de bétail entre l'Europe et les autres continents
étaient déjà très limités.
Les taux de substitution moyens calculés pour les gènes S variaient entre
3,9 et 9,8 x 10-4 substitutions nucléotidiques par site et par an et une évolution
plus lente du gène codant pour la nucléocapside (N). En outre, nous avons
observé une évolution légèrement plus rapide pour les souches BCoV
européennes comparées aux autres souches. Nos calculs sur la pression de
sélection ont permis d’identifier 10 acides aminés sélectionnés positivement mais
n'ont pas permis de mettre en évidence une différence de pression de sélection
entre les continents. D'autres études sont donc nécessaires pour comprendre le
rôle de ces positions dans l'évolution de BCoV.
132
CHAPITRE 2 : IDENTIFICATION ET
CARACTERISATION DU BACTERIOTE
RESPIRATOIRE BOVIN
Introduction I.
Les approches NGS à l’heure actuelle sont considérées comme les
plus performantes pour la caractérisation des communautés microbiennes de
l’appareil respiratoire. Mais ces outils ne sont pas parfaits. Quelquefois ils ne
permettent pas d’identifier des microbes qui pourtant sont détectés positifs par
d’autres techniques réputées moins sensibles. Ainsi dans la première étude de
Holman et al (294) qui compare culture bactérienne et NGS (plateforme Roche
454), le genre Bacillus avait poussé sur trois milieux différents et dans la grande
majorité des prélèvements à tous les temps, alors qu’il n’était identifié par NGS
qu’au jour 60 et avec une abondance relative de 0,1%. La même observation a été
faite pour le genre Pasteurella où 2 échantillons étaient positifs par NGS au jour
60 (0,05% d’abondance relative) alors que 17,1% des prélèvements étaient
positifs par culture bactérienne. De même, les genres Aerococcus, Dietzia,
Proteus, Rothia, et Microccoccus/Macrococcus identifiés en culture classique
étaient absents parmi les taxons du NGS. Les raisons possibles de ces
divergences peuvent être liées à la sensibilité et/ou la spécificité des méthodes
utilisées. Concernant la méthode NGS, les étapes de conditionnement, de
purification, d’amplification moléculaire et de séquençage peuvent apporter des
biais d’interprétation en favorisant certains taxons. Des raisons techniques en
rapport avec l’affinité des amorces utilisées ou l’absence de séquences
représentant ces genres dans les bases de données utilisées lors de l’affiliation
peuvent aussi expliquer l’absence d’identification de certains microbes. Après tout,
le « profiling » d’un microbiote est basé sur les abondances relatives donc les
taxons les plus minoritaires sont écrasés par les plus majoritaires et risquent de ne
pas ressortir lors des tests statistiques. Enfin, les résultats NGS reposent sur des
133
algorithmes et tests statistiques qui se révèlent quelquefois peu cohérents entre
eux. Par exemple l’utilisation de LEfSE, (algorithme qui sert à l’identification des
biomarqueurs et des fonctionnalités génomiques marquant une différence entre
deux ou plusieurs conditions biologiques) lors de l’étude de Zeineldin (2017) a
abouti à l’identification de groupes d’OTU caractéristiques de l’appareil respiratoire
supérieur et d’autres caractéristiques de l’appareil respiratoire profond. Ces
identifications ont été incohérentes avec celles obtenues par le test de Wilcoxon/
Kruskal-Wallis utilisé dans le même objectif.
Si on s’intéresse aux bactéries respiratoires pathogènes connues, souvent
la présence de Mannheimia haemolytica n’est pas un indicateur de BPI dans les
études NGS. Son abondance diminue même avec l’apparition des signes cliniques
respiratoires dans l’étude de Holman (102). De même, l’abondance du genre
Pasteurella subit une diminution entre le début de l’allotissement et 40 jours plus
tard à une période où les BPI sont présentes (295). Les résultats obtenus peuvent
s’expliquer par le lieu de prélèvement. Le portage nasopharyngé de M.
haemolytica chez des animaux sains est bien connu et son imputabilité dans les
BPI repose théoriquement sur sa présence dans l’appareil respiratoire profond. Si
les études NGS portent majoritairement sur le microbiote nasopharyngé, une
étude semble cependant indiquer que M. haemolytica puisse être identifiée parmi
les composants du bactériote pulmonaire des bovins cliniquement sains (300). Les
mêmes auteurs confirment aussi que l’apparition des signes cliniques est associée
à un changement vers une dominance du biotype A1 de M. haemolytica (300). Le
genre Mycoplasma est le genre majoritaire trouvé dans l’appareil respiratoire
superficiel et profond comme confirmé dans la majorité des études identifiant les
communautés microbiennes respiratoires chez les veaux (296,298,334,335). Pour
le moment seul M. bovis est considéré comme un pathogène respiratoire majeur
dans les BPI. Le rôle de M. dispar reste discuté. Dans l’ensemble des études, y
compris la nôtre, la présence de M. bovis est toujours associée à la maladie
respiratoire. Par contre M. dispar a été trouvé dans tous les sites du tractus
respiratoire, surtout profond, chez des veaux sains ou atteints de BPI. Timsit
(Timsit et al., 2018) observe une tendance à la disparition de l’espèce M. bovis
dans les prélèvements riches en M. dispar, suggérant une compétition entre les
134
deux espèces et un caractère protecteur de M. dispar vis-à-vis d’une infection à M.
bovis.
Récemment, il a été suggéré que certains organismes commensaux
peuvent protéger l'hôte contre les « ennemis » pathogènes, un processus appelé
«résistance à la colonisation». Ces protecteurs commensaux défendent l'hôte soit
en inhibant directement l'agent pathogène, soit en renforçant l'immunité de l'hôte.
Des données récentes sur les deux variétés de résistance à la colonisation
montrent comment la présence de bactéries communes spécifiques peut modifier
la pathologie induite par les bactéries infectieuses. Ces études démontrent
comment le séquençage de la communauté microbienne peut être utilisé pour
savoir si un agent infectieux induit une maladie chez certains hôtes, mais pas chez
tous.
La résistance à la colonisation a déjà été montrée pour plusieurs
microbiotes complexes. Pour exemple Buffie et al. (292) sont partis du fait que les
souris traitées avec des antibiotiques présentaient une susceptibilité plus
importante à l'infection par Clostridium difficile, causant une diarrhée induite par
les antibiotiques. Par séquençage NGS et modélisation des interactions
microbiennes, les auteurs ont identifié Clostridium scindens comme un agent
commensal associé à la résistance à la colonisation par C. difficile. Son
élimination par antibiothérapie permet ainsi une prolifération de C. difficile.
Pour la pathologie respiratoire, les données suggèrent que les familles
Lactobacillaceae et Bacillaceae sont positivement associées à l’état de santé
(102,294,297) chez les veaux. Leur effet inhibiteur sur les pasteurelles
pathogènes a aussi été montré (98,101). Toutefois certaines études apparaissent
contradictoires. Si le genre Acinetobacter est associé à la présence de BPI pour
M. Zeineldine (334) et E. Timsit (295), l’inverse est montré dans l’étude de Holman
(294).
In fine la démonstration de la présence de bactéries commensales des
tissus respiratoires des bovins qui participent à la résistance contre les
pathogènes respiratoires dépendra, non seulement des études de caractérisation
à haut débit des communautés microbiennes mais aussi d’études d’interactions
135
précises et fonctionnelles qui mettront en évidence des mécanismes
d’interactions.
La perturbation de l'équilibre des communautés bactériennes peut
conduire à une résistance affaiblie, une prolifération bactérienne, et un
désengagement des pathogènes résidents et opportunistes. Cet état dysbiotique
peut conduire à un microbiote virulent et nommé «pathobiome». Dans les
maladies respiratoires bovines, de nombreuses perturbations environnementales,
comme une forte densité, le transport et des changements de température,
peuvent entraîner une dysbiose, cependant la raison majeure est considérée
comme infectieuse.
Les principaux objectifs de cette étude étaient d'explorer la structure du
microbiote des voies respiratoires supérieures et inférieures de deux populations
de veaux ; cliniquement sains et cliniquement atteints par la BPI et pour étudier
l'effet de la présence d’un pathogène respiratoire sur la structure. Les veaux inclus
dans l'étude provenaient de 29 élevages différents de veaux engraisseurs de la
région Occitanie dans le sud-ouest de la France au cours de la période 2014-
2016. Afin de ne pas interférer dans la composition microbienne, les veaux n'ont
pas été traités avec des antibiotiques ni vaccinés avant l'échantillonnage. Les
veaux en bonne santé provenant d'établissements similaires ne présentaient
aucun symptôme respiratoire. L'effet du temps n'a pas été exploré dans cette
étude et donc la modification de la structure du microbiote des mêmes animaux
non plus.
136
Article : « Microbial ecology of the upper and II.
lower respiratory tract in calves: interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia »
137
Microbial ecology of the upper and lower respiratory tract in calves:
interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia
E. Salem1, H. Cassard 1, N. Herman1, SM. De La Giclais 3, G. Stratan 3, M. Bernard 4,
N. Villa-Vialaneix 5, and G. Meyer, 1,*
1 IHAP, UMR1225, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France; 2 MIA-T,
UR875, INRA, Toulouse, France ; 3 Université de Toulouse, INSA, Toulouse, France ; 4GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, France ;
5MIAT, Université de Toulouse, INRA, F-31326 Castanet-Tolosan, France.
ABSTRACT
Bovine respiratory disease (BRD) complex is a major economic and public health
burden that affects young bovines worldwide, with a multifactorial etiology involving
the presence of one or several viruses and/or bacteria. These respiratory pathogens
act in the presence of a very complex network of resident bacterial species called the
“microbiota”. Recent evidence suggests that the upper respiratory tract (URT)
microbiota plays an important role in respiratory health and disease susceptibility in
cattle (1–3) .Whereas only few data are available for the LRT. The objectives were to
describe the mosaic structures of the URT and LRT microbiota and their interactions
in healthy calves and calves with bronchopneumonia (BP) and to determine if well-
known respiratory viruses or bacteria have an impact on the URT and LRT
microbiota. Deep nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavages (BAL) were
performed in 3 to 5 calves of 23 herds suffering from acute BP and not vaccinated
nor treated with antibiotics. Similar samples were taken in healthy calves of 6 similar
herds. DNA of calves from the same herd were extracted and pooled for sequencing.
The V1-V3 hypervariable region of the bacterial 16S ribosomal RNA gene was
138
amplified from the pools and sequenced using the Illumina Hiseq platform.
Comparisons and diversity analysis of the bacterial communities based on measures
of taxonomic richness (Alpha diversity metrics) and distances between samples (Beta
diversity metrics) were done. At the phylum level, the LRT is associated with high
relative abundance of Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria in clinically
healthy calves and Tenericutes, Proteobacteria, and Fusobacteria in BRD affected
calves. The URT of the clinically healthy calves was mostly associated with
Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria and Tenericutes, Bacteroidetes, and
Firmicutes in BRD affected calves. At the genus level, Mycosplasma were found to
be the most abundant in both URT and LRT across all groups and in both health
status. Alpha and beta diversity analyses as well as linear discriminant analysis
(LDA) effect size algorithm (LEfSe) and sPLS-regression mode method with PLS-DA
projections show significant differences of bacterial communities in terms of
taxonomy, richness and diversity between the URT and the LRT. Finally sPLS-
regression method was done separately for BAL and NS pools to describe
relationships between microbiota of URT and LRT and the presence of bovine
respiratory pathogens (BRSV, BPI3, BCoV, M. Haemolytica, P. multocida; h.somni,
M. bovis). In the URT the presence of P. multocida and H.somni is associated with an
important number of resident bacteria. A negative association was found between the
presence of BRSV and BPI3 (association with a small number of bacteria) and the
presence of H. somni. In the LRT M. haemolytica is associated with a large number
of bacteria, while its absence is associated with the presence of P. multocida and H.
somni. The impact of the presence of any of BRSV, BPI3 and or BCOV on the
moicrobiota was also investigated.
INTRODUCTION
Bovine respiratory disease (BRD) complex or infectious bronchopneumonia (BP) is a
major economic and public health burden (4) that affects young bovines worldwide,
with a multifactorial etiology; BP is a complex disease triggered by the presence of
one or several viruses and/or bacteria (5) favored by an altered state of the host
immune system (6) and usually disturbed environmental factors (7). The severity of
BP consequently depends on the causative agents, the host immune response,
139
environment factors such as temperatures and biosecurity, and several other
physical and biological stressors (6,8,9).
BP pathogens act by initiating a cascade of subsequent events of immune
suppression (6,10), damaging the respiratory epithelium (11) and/or altering the local
biofilms (12–14) and normal commensal flora thus leading to complex secondary
bacterial invasion (12,14,15). The main viruses associated with BP are bovine
respiratory syncytial virus (BRSV), bovine parainfluenza type-3 virus (BPI3), bovine
coronavirus (BCOV) bovine herpesvirus-1 (BOHV-1), and bovine adenovirus 3. Most
of them are able to induce immune suppression leading the way for secondary
bacterial infections (16–20). The main bacteria are Pasteurella multocida,
Histophilus somni, Mannheimia haemolytica and Mycoplasma bovis. Furthermore
A more recent consideration is the presence in the upper (URT) but also the lower
(LRT) respiratory tracts of a very complex network of bacterial species called the
“microbiota”, and its potential interaction with BP pathogens. This is particularly true
for P. multocida, H. somni, and M. haemolytica which are considered as components
of the normal flora of the upper respiratory tract and which may become opportunistic
colonizers following several events such as a primary viral infection (21,22). This
raises the question of their real role and the way they became virulent.
Determining the structure of the respiratory tract microbiome in health and in
pneumonia carries the great potential to advance pulmonary infectious diseases
prevention and management. Recent technologies in the field of next generation
sequencing (NGS) are allowing us to explore these microbiomes in health and
disease conditions and their relationship with the outer environment disturbances and
different conditions. NGS studies on the bovine virome and microbiome were
recently led in American feedlot young cattle describing the dynamics of the upper
respiratory tract bacterial communities (1–3,23–27) and new viral species
discoveries (19,20,28,29).
The aim of this study is first to understand the mosaic structures of the upper and
also the lower respiratory microbiomes and their associations with pathogens in
140
cases of BP of newborn calves and finally to evaluate the impact of a viral infection to
the structures of these microbiomes.
MATERIAL AND METHODS
Experimental design
Seventy calves, between 2 to 8 weeks old, from 23 breeding farms of South of
France were included in this study, all the calves presented acute signs of
bronchopneumonia (BP) and where not vaccinated nor treated with antibiotics prior to
sampling. Criteria for BP were the presence of respiratory clinical signs in more than
10% of calves, including hyperthermia (>40°C), tachypnea (respiratory rate >45),
dyspnea and abnormal lung sounds (wheezing...) at auscultation, starting from less
than two days. In addition to the clinically affected animals, 6 breeding farms free of
BP from more than one year and without BP at the time of sampling were selected as
control group. The clinically healthy calves originated from similar breeding facilities
and the calves were clinically examined before sampling. Equally, the clinically
healthy calves were neither treated for antibiotic nor vaccinated. In each farm 3 to 5
calves were sampled by nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavages (BAL) to
determine pathogens and microbiota of both upper and lower respiratory tracts (URT
and LRT) respectively.
NS was inserted deep in the calf nostril to a depth of 20 cm approximatively and
rotated during 30 seconds against the nasal mucosae. Swabs were directly aliquoted
in 1 ml PBS and kept on ice for no more than 2 hours until being stocked at -80°C.
BALs were performed by bronchoscopy under deep anesthesia (10mg/kg Diazepam
and 10mg/kg ketamine, intravenous route). Briefly a plastic rigid and sterile tube was
inserted in the buccal cavity up to the larynx and the sterile flexible bronchoscope
(Olympus, CF-EL, 1.3 meters long, 7.5 mm internal diameter, Shinjuku, Tokyo,
Japan) was introduced in the plastic tube and visually inserted in the trachea via the
epiglottis then guided to the first bronchial division corresponding to the caudal
segment of the right apical lung lobe. The lung lobe was then lavaged with 100 ml of
sterile isotonic saline solution and the liquid was immediately aspirated and
refrigerated until treatment. Typically, the BAL procedure took 5 to 10 minutes and
141
lung abnormalities (inflammation, fibrinous content) were recorded. BALs were kept
on ice for no more than 2 hours until being treated. BALs were processed as follows:
20 mL of BALs were centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes to collect supernatant
and cells. The rest was directly stored at -80°C. Tube and endoscope were washed
and fully disinfected between each farm according the manufacturers
recommendations. The sampling was performed in accordance with accepted human
standards of animal care (European Community council 2010/63/EU).
Finally individual NS and BAL samples were pooled in an average of 4 samples per
pool, where each pool of NS or BAL represents a farm.
Microbial DNA extraction
Microbial DNA extraction was performed from each NS and BAL pool sample using
the Qiamp UCP minikit (Qiagen, USA), with the pretreatment protocol of Microbial
DNA from Biological Fluids or Cultures followed by a mechanical pre-lysis, according
to the manufacturer instructions. Briefly, 400µl of NS liquid and 1500µl of BAL were
concentrated by maximum speed centrifugation (13 000 rpm) then mechanically
disrupted by vortexing using the Pathogen Lysis Tube (Qiagen, USA) in the presence
of beads before being chemically lysed with proteinase K (Qiagen, USA) and 70°C in
order to denature the Gram-positive bacterial cell walls. The samples are then
transferred onto the QIAamp UCP Mini column (Qiagen, USA) and serially washed
before eluting the DNA in 50µl of AVE Buffer. Total DNA concentration was
quantified the QubitTM fluorometer (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) and
the quality checked with the ratio 260/280nm wavelengths using the ClariostarTM
Plate Reader (BMG LABTECH, Germany).
Amplification and Illumina sequencing of the V1-V3 hypervariable region of the 16S rRNA
Microbial DNA was subject to polymerase chain reaction PCR amplification of the V1-
V3 hypervariable region of the 16SrRNA gene using the following primers: 27-F
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) and 534-R (ATTACCGCGGCTGCTGG). The
generated amplicons were then purified. Adaptors were tagged individually through
142
fusion primer PCR according to Illumina instructions. We used the HiseqTM 2500
platform (Illumina, USA). Dual indices and Illumina sequencing adapters were used
according to the manufacturer instructions. The sequencing run was conducted using
the 2x300bp v2 reagent kit generating 300bp long reads in a paired-end reaction.
Our analysis involved two sequencing runs that included the BP and clinically healthy
groups separately.
RNA extraction and Real Time qPCR
Specific pathogens detection was done by RTqPCR using the LSI VetMAX Screening
pack – Ruminant Respiratory Pathogens real time PCR kit (Life technologies, Grand
Island, NY, USA). The following pathogens: M. bovis, H. somni, P. multocida, M.
haemolytica, BCOV, BRSV and BPI3 were screened in all our respiratory (NS and
BAL) pool samples of clinically healthy and BP affected groups.
Bioinformatics processing, composition and statistical analysis
All sequencing reads generated by the Hiseq were analyzed using the Galaxy
workbench implemented workflow FROGS (30). First, raw sequences were pre-
processed by merging the paired-end reads with Flash (31), trimming the primers
sequences with Cutadapt (32) and deleting the reads with the wrong length,
containing ambiguous bases, and not containing the right primers (33). Swarm (34), a
clustering algorithm was used to generate OTUs and define the seed sequence for
every OTU defined. Chimeras, defined as anomalous sequences formed by different
sequences joined together during the PCR were also detected and removed. The
resulted OTUs were filtered using a minimum BLAST identity of 98% and sorted
according to their sizes. The resulting abundance table formed is affiliated against the
Silva123 16S reference database where every OTU seed sequence was
taxonomically assigned up to the species level. Finally, the reads were normalized to
the level of the poorest library. Bacterial community composition, alpha diversity
(Observed, Chao1, and Shannon) and beta diversity (UniFrac and Bray-Curtis) were
further calculated using the phyloseq package wrapped into the Galaxy workbench.
143
In order to identify taxa displaying significant differences between the upper and
lower respiratory tracts in BP group, the abundances values were analyzed using the
linear discriminant analysis (LDA) effect size algorithm (LEfSe) (35) implemented in
Galaxy workbench (http://galaxy-workbench.toulouse.inra.fr/). The LEfSE algorithm
first use the non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test to detect
features with significant differential abundance with respect to the class of interest;
biological significance is subsequently investigated using a set of pairwise tests
among subclasses using the (unpaired) Wilcoxon rank-sum test. As a last step,
LEfSe uses Linear Discriminant Analysis to estimate the effect size of each
differentially abundant feature and, if desired by the investigator, to perform
dimension reduction.
To further explore the dynamics of the respiratory microbiota in both URT and LRT
and to better understand the interactions between the microbiota and the presence of
respiratory pathogens, an exploratory analysis was also performed using sPLS-
regression mode method. Analyses were done with logarithmic transformations of
count tables. To compare NS and BAL samples, sparse PLS-DA (Partial least
squares regression (PLS), discriminant version) was performed using paired or
unpaired analysis after the individual contribution has been removed with a multilevel
approach as implemented in the R package mixOmics. Student test was performed
to assess whether the selected variables are differentially abundant between the two
conditions tested. Boxplots were performed to display the abundance differences of
these bacteria between NS and BAL samples. We also looked at the ajusted p-
values using the Benjamini-Hochberg method which controls the False Discovery
Rate (FDR, proportion of False Positives in bacteria declared differentially
expressed).
To investigate associations between the presence of respiratory pathogens (BRSV,
BPI3, BCOV, M. Haemolytica, P. multocida; H.somni, M. bovis) and microbiota in the
URT and LRT, an exploratory analysis was performed using PLS-DA and sPLS-DA
regression mode method with abundance data as explanatory variables and the
presence of pathogens as variables to predict. For each condition NS and BAL
samples were analyzed separately. Student tests were performed to assess whether
144
the selected variables were differentially abundant between the two conditions
tested. All results were considered significant at p < 0.05.
Finally relations between the presence of respiratory virus (BRSV and/or BCOV
and/or BPI3) and the microbiota structure was analyzed using the same method
(sPLS-regression method with abundance data as explanatory variables and the
presence of any of the following viruses-BRSV, BCoV, and/or BPI3- as variables to
predict). The analysis was done separately for BAL and NS pools. Student tests were
performed to assess whether the selected variables were differentially abundant
between the two conditions tested. All results were considered significant at p < 0.05.
RESULTS
RTqPCR detection of respiratory pathogens
The results for the presence of bovine major respiratory pathogens using real-time
RT-PCR are summarized in Table 1. The screening included BRSV, BPI3, BCOV, P.
multocida, M. haemolytica, and M. bovis. Among the 6 healthy pools, one was lightly
positive with P. multocida in the NS, another was also lightly positive with P.
multocida in the BAL, a third had the NS positive with P. multocida and the BAL with
M. haemolytica. The Cq values in this group ranged between 31 and 35.
Hiseq sequencing data
Pools (N=23) of both NSs and BALs from calves showing signs of acute BP were
sequenced using the Illumina Hiseq platform. The run generated around 77 million
raw reads from which 61.8 million were kept after the pre-processing and chimeras
removal steps. The number of reads per pool ranged between 547.4k and 858,200
reads. 406 bacterial OTUs were identified at the species level after filtering on the
98% identity cutoff, having a size ranging from 224 to 880,500 sequences per OUT
(Supplementary data1).
Pools (N=6) of both NSs and BALs from healthy calves were also sequenced using
the Illumina Hiseq platform. The run generated around 8.4 million raw reads from
which, 4 million were kept after the pre-processing and chimera removal steps. The
145
number of reads per sample ranged between 174,000 and 539,000 reads. 308
bacterial OTUs were identified at the species level after filtering on the 98% identity
cutoff, having a size ranging from 204 sequences to 393,000 sequences per OUT
(Supplementary data 2).
At the genus level, the taxa from the BP sequencing run were clustered in 151 OTU
and the taxa from the healthy sequencing run in 144 OTU. In terms of common taxa
between the two groups, 101 genera were found to be common (Fig. 1C).
Dominant taxa in the different group of samples in term of relative abundances
The microbial composition in the upper and the lower respiratory tract of the calves
exhibiting or not signs of BP are illustrated in Figure 1 (Fig. 1, A & B).
In BP calves, regardless of the sample nature, the most abundant OTUs identified
were: Mycoplasma bovirhinis (22.24%), Mycoplasma dispar (18.09%), Cilia-
associated respiratory bacterium 246-57 (7.77%), Stenotrophomonas maltophilia
(4.42%), an unknown genus of the family Leptotrichiaceae (3.64%), Alcaligenes
faecalis (2.84%), an unknown species of the genus Pseudobachtrum (2.64%),
Streptococcus pluranimalium (1.97%), Stenotrophomonas sp. (1.42%) and
Pseudomonas sp. (1.38%).
In the upper respiratory tract
At the phylum level, differences were observed in relative abundance between BP
and healthy farms. The top 5 most abundant OTUs in NS of BP farms were
Tenericutes (48.76%), Bacteroidetes (16.48%), Firmicutes (13.62%), Proteobacteria
(9.82%), and Actinobacteria (9.24%) while Tenericutes (28.72%), Proteobacteria
(20.06%), Actinobacteria (16.88%), Firmicutes (28.07%), and Bacteroidetes (5.16%)
were mainly found in control group
At the genus level, the top 10 most abundant OTUs in NS of BP group were
Mycoplasma (47.66%), Cilia-associated respiratory bacterium (13.97%),
Corynebacterium (5.53%), Streptococcus (4.94%), Moraxella (4.32%),
146
Staphylococcus (2.82%), Pasteurella (1.99%), an unknown genus of
Leptotrichiaceae family (1.43%), Mannheimia (1.16%), and Ureaplasma (1.07%).
Similar results were found in the healthy group but in a different order of magnitude:
Mycoplasma (28.09%), Corynebacterium (12.24%), Streptococcus (10.46%),
Neisseria (9.95%), and Enterococcus (5.49%).
At the species level, the top 5 most dominant OTUs in NSs were: Mycoplasma dispar
(23.64%), Streptococcus plurianimalium (10.11%), Neisseria dentiae (7.82%),
Enterococcus hirae (5.38%), and Mycoplasma bovoculi M165/69 (2.56%). The top 5
most dominant OTUs in the control group were: Mycoplasma bovirhinis (35.5%),
Cilia-associated respiratory bacterium (14%), Mycoplasma dispar (10.2%),
Streptococcus pluranimalium (4.6%), and an unspecified species of the
Corynebacterium genus (2.9%).
In the lower respiratory tract
At the phylum level, by comparison with NS, the composition of the BAL microbiota
was characterized by a very low abundance of Firmicutes and a relative high
abundance of Proteobacteria. The top 5 most abundant OTUs were Tenericutes
(38.45%), Proteobacteria (38.17%), Fusobacteria (7.85%), Bacteroidetes (7.18%),
and Actinobacteria (4.91%) in the in BP group and Tenericutes (41.94%),
Proteobacteria (38.01%), Actinobacteria (14.65%), Firmicutes (2.78%), and
Bacteroidetes (2.19%) in the control group. At the genus level, the 10 most abundant
OTUs in BALs of the BP group were Mycoplasma (37.35%), Stenotrophomonas
(14.64%), Alcaligenes (7.37%), an unknown genus of Leptotrichiaceae family
(5.75%), Pseudochrobactrum (5.16%), Pseudomonas (3.15%), Delftia (2.53%),
Achromobacter (2.32%), Fusobacterium (1.84%), and Cilia-associated respiratory
bacterium (1.84%). The top 5 most abundant taxa in control group were Mycoplasma
(41.97%), Pseudochrobactrum (17.13%), Stenotrophomonas (10.08%),
Glutamicibacter (4.36%), and Paeniglutamicibacter (4.27%).
The top 5 most dominant species in BALs of BP were Mycoplasma dispar (25.6%),
Mycoplasma bovirhinis (10.4%), Stenotrophomonas maltophilia (8.6%), an
147
unspecified species of the Leptotrichiaceae family (6%), and Alcaligenes faecalis
(5.6%). The top 5 most dominant OTUs in BAL of control group were Mycoplasma
dispar (41.91%), Pseudobactrum sp. (17.11%), Streptococcus plurianimalium
(7.94%), Stenotrophomonas maltophilia (4.26%), and Neisseria dentiae (2.89%).
Microbial alpha and beta diversities in the URT and LRT
We then evaluated the variability within and between samples for each condition in
NS and BALs. The metrics of alpha diversity were computed using the observed
richness index, the Chao1 richness index (ANOVA) and the Shannon diversity index
(ANOVA). Results indicated that the microbial richness in NS was significantly (p<
0.01) higher in both groups of calves (BP and clinically healthy) compared to the
microbia richness of BALs.
The beta diversity metrics performed on the BP group also showed a clear
dissimilarity in taxa diversity between the URT and LRT. First the UniFrac distances
wich is a phylogenetic beta diversity metric clearly indicates a taxonomic dissimilarity
(MANOVA P=0.0004) between both NS and BAL samples (Fig. 3A). In the clinically
healthy group, this dissimilarity was also visible though less prominent (only in
Jaccard P=0.0025 and UniFrac P=0.0024 metrics). When Principal Coordinates
Analysis (PCoA) was performed on the UniFrac matrix of distances, a clear
separation of the NSs and BALs group was obtained in addition to a wide variation
between the NSs samples.
Differences in microbial taxa between the URT and LRT of calves with BP
The dissimilarities between the upper and lower respiratory microbiota were first
discerned using the Linear Discriminant Analysis (LDA) Effect Size (LEfSe) (Fig. 4).
By applying the LEfSe algorithm on relative abundances values, we have identified
taxa at the family level that are statistically different among the NS and BAL in both
BP and clinically healthy calf groups. In calves with BP, 51 and 11 families were
preferentially and statistically associated with the URT and LRT respectively while
differences were lower in the healthy calves with respectively 20 and 2 family
associated with the URT and LRT. Most families (17/20) found in NS of healthy
148
calves were also found preferentially in NS of BP calves. The Flavobacteriacae was
statistically associated with NS for healthy calves and BAL for BP calves. The
Pasteurellacae family containing major pathogens of BP was preferentially
associated with NS only in BP calves.
In BP calves the main bacterial families characterizing the lower respiratory tract
included Alcaligenaceae, Brucellaceae, Pseudomonaceae, Comamonadaceae,
Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Flavobacteriaceae, Enterobacteriaceae,
Thermoactinomycetaceae, and Caulobacteraceae. Bacterial families characterizing
the nasopharyngeal cavity included: Chitinophagaceae, Corynebacteriaceae,
Streptococcaceae, Moraxellaceae, Pasteurellaceae, Staphylococcaceae,
Sphingomonadaceae, Carnobacteriaceae, Acholeplasmataceae, and Bacteroidales
S24_7 group. Other NS specific families included: Actinomycetaceae,
Nocardiodaceae, Bacillaceae, Micrococcaceae, Prevotellaceae, Neisseriaceae,
Clostridiaceae, Lactobacillacea, and Enterobacillacea.
To further explore the difference between the URT and LRT we used a different
biostatistical approach using a sPLS-regression mode method. Analysis with
logarithmic transformations of count tables at the genus level and expressed as PLS-
DA projection shows a strong separation between NS and BAL samples mainly on
the first axis (Fig 5A). When statistical analyses were performed only 6 genus were
associated with the NS of BP calves, including Moraxella, Aquamicrobium,
Peptocostridium, Caryphanon and Intestinibacter (Fig 5B and 5C).
The microbiota structure dynamics and correlation with major infectious respiratory pathogens
We first identify possible relation between the presences of one of the known
infectious respiratory pathogens and the microbiota structure in both URT and LRT of
calves with BP using a multivariate analysis on the microbiota abundance values
(mixMC framework) (36) and shown as projections using sparse Partial Least
Square Discriminant Analysis (sPLS-DA). The abundance data were used as
explanatory variables and the results of the RTPCR assay for the respiratory
pathogens (Table 1) were used as variables to predict.
149
In the URT (Fig. 6A), the first axis is mostly driven by the absence of P. multocida
that is associated to a small group of bacteria, while its presence is associated to a
larger group of bacteria. The second axis is mostly driven by the opposition between
the presence of BPI3 and BRSV that is opposed to the presence of H. somni. The
first two viruses are mainly associated to one farm (probably) and to the presence of
a small group of bacteria, while H. somni is associated to the presence of another
group of bacteria.
In the LRT (Fig. 6B) the first axis is mostly driven by the presence of M. haemolytica
(in two samples mainly) that is associated to a large group of bacteria, while its
absence is associated to the presence of P. multocida and H. somni and a small
group of two bacteria. The second axis is mostly driven by the presence of M. bovis
(present in two samples) that is associated to a large group of bacteria while its
absence is associated to the presence of BCOV and only one bacterium.
We then further evaluate if the presence of one of the three BCOV, BRSV and BPI3
viruses has an impact on the URT and LRT microbiota structure by using the sPLS-
regression method, with abundance data as explanatory variables and the presence
of any of the three viruses as variables to predict. In sPLS-DA projection plot, the
clusters that represent the projection of the individuals on the first two components
and that characterize the presence/absence of the group of viruses are well
separated for the URT (Fig. 7A) while separation was less evident in the LRT (Fig.
7B). The contribution plots (Fig. 7C and 7D) display the abundance of taxa and in
which status (presence/absence) they are the most abundant in the URT and LRT.
For example, it seems that Leucobacter, Gelidibacter, Faecalicoccus, Vagococcus,
and Mycoplasma are abundant when a viral infection is present in NS and the
opposite for Pseudochrobactrum, Mannheimia, Ochrobactrum, Trueperella,
Chryseobacterium, and Helcococcus. To evaluate the significance of the selected
bacteria in the process of appearance or absence of these three viruses, Student
tests were performed for each of them. The p-values obtained lead to the conclusion
that none of the bacteria are found differentially abundant between infected and non-
infected samples with this group of viruses in both the URT and LRT.
150
A comparison of the relative abundance was then performed for the selected species
(Fig 7C and 7D) that are also found in the control samples data. Results (Fig. 8, for 4
taxa) showed that the difference between BP samples with or without the presence of
viruses and control samples in terms of relative abundance of common bacteria
seems to be insignificant. It appears that the absence or presence of the group of
viruses does not affect the quantity of bacteria studied.
DISCUSSION
The respiratory microbiota at equilibrium is considered to be beneficial to the host by
modeling the immune system in early life and providing colonization resistance.
Perturbation of the equilibrium of the bacterial communities can lead to a weakened
resistance, bacterial overgrowth, and unshackling of resident pathogens. This
dysbiotic state may lead to a virulent and unbalanced microbiota or “pathobiome”. In
bovine respiratory disease, many environmental disturbances can lead to dysbiosis
like high density, transportation, and temperature changes. However, the major
reason is thought to be infectious. The main objectives of this study were to explore
the structure of the microbiota in URT and LRT in clinically healthy calves and calves
suffering from BP and to study the effect of a respiratory pathogen on the microbiota
structure. The calves sampled in the study originated from 23 different veal breeding
farms of the south west of France during the period 2014-2016. In order to not
interfere in the microbial composition, the calves were not treated with antibiotics
before sampling nor vaccinated. The healthy calves originated from similar facilities
were no respiratory symptoms were observed. By comparision with previous US
studies, the effect of time wasn’t explored in this study and so the microbiota
structure modification. The farm system tested here (moderate density herds with
small effectives and extensive environments) with no modifications of management
differs from American feedlot breeding system in which the BP occurs after few
weeks of the calves’ allotment.
The nasopharyngeal and pulmonary microbial structures were relatively consistent
across all the individual samples belonging to the same group (clinically healthy or
BP). In the clinically healthy group, the dominant nasopharyngeal phyla were:
151
Tenericutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes, and
dominant genera: Mycoplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Neisseria, and
Enterococcus. Whereas the dominant bronchoalveolar phyla were Tenericutes,
Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes, and dominant genera:
Mycoplasma, Pseudochrobactrum, Stenotrophomonas, Glutamicibacter, and
Paeniglutamicibacter.
In the BP group, the dominant nasopharyngeal phyla were: Tenericutes,
Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, and Actinobacteria, and dominant genera:
Mycoplasma, Cilia-associated respiratory bacterium, Corynebacterium,
Streptococcus, and Moraxella. Whereas the dominant bronchoalveolar phyla were
Tenericutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes, and Actinobacteria and
dominant genera: Mycoplasma, Stenotrophomonas, Alcaligenes, an unknown genus
of Leptotrichiaceae family, and Pseudochrobactrum.
Compared to other studies (1–3,24–27), our finding seems to be comparable at the
phylum level suggesting the presence of a consensus “normal” URT microbiota
composed of the phyla: Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, and
Bacteroidetes and that of the LRT: Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, and
Firmicutes. However, this is not the case at the genus level in both URT and LRT. In
fact, except from Mycoplasma which is the ubiquitous genus across all studies in the
nasopharyngeal cavities during health and disease, no consensus microbiota could
be established. The explication of this variation seems to be linked with the different
environments and rearing conditions of the animals in every study. Actually, the
microbial ecosystem is thought to be shaped by a combination of selective and
random events, where the pressure exerted by the environment, as well as the
physico-chemical conditions are at the origin of the structure of the different
microbiomes in each part of the respiratory tree (de Steenhuijsen Piters et al., 2015).
A particular observation in our samples was the high abundances of Mycoplasma
bovirhinis and Mycoplasma dispar. Mycoplasmas belong to the Mycoplasmataceae
family of the Mollicutes phylum. The genus Mycoplasma comprises about 100
species, 40 of which are isolated from ruminants. The major pathogenic species in
152
cattle are M. mycoides subsp. mycoides responsible for contagious bovine
pleuropneumonia (CBPP) but not present in EU and Mycoplasma bovis, an agent of
BP. In France, M. bovis pneumonia is mainly found in beef and veal cattle farms (37)
and its presence appears to correlate with the occurrence of pneumonia since the
bacterium is isolated only from the lungs of animals with chronic and acute
respiratory clinical signs (38). On the other hand, Mycoplasma dispar and
Mycoplasma bovirhinis (39) are established commensal residents of the upper
respiratory cavities of cattle. The loads of M. dispar in the respiratory system
increases significantly during BP, but this relationship is considered associative and
not causative (40). In addition, M. dispar was not revealed as a pathogenic agent as
demonstrated during an experimental infection (41).
Diversity was compared between the two sites in every group, at the phylum level.
The most abundant taxa in clinically healthy URT and LRT were composed of
Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria. In BP group, the dominant phyla
were Tenericutes, Bacteroidetes, and Firmicutes in the URT while in the LRT the
dominant phyla were Tenericutes, Proteobacteria, and Fusobacteria. While the
structure in healthy calves seems to be identical in both sites at the phylum level, a
divergence starts to appear while descending the taxonomical level. For a better
clarity, biodiversity metrics (alpha and beta) were calculated; the microbiota of the
nasopharyngeal cavity was clearly ecologically richer than those of the lungs in both
health and diseased animals. When compared together (beta diversity metrics), both
sites (URT and LRT) in a same group showed very distinctive ecosystems. When
UniFrac metric was used to compare the ecosystems in the NS and BAL samples in
the same groups, the matrix of values showed a very significant dissimilarity between
the URT and LRT mostly noticed in BP group. This disparity in healthy conditions
was also demonstrated by Zeineldine et al. (26). Being explored by two different runs
of NGS sequencing, the abundances results of both BP and health groups couldn’t
be compared together, so being not the same, differences in microbial diversities
between healthy and affected calves weren’t computed.
Studies on the synergistic and antagonistic relationships between bacteria in bovine
pneumonia are scarce. In humans, these interactions are described between
153
commensal bacteria that colonize the respiratory tract and those considered
pathogenic or between the pathogenic bacteria themselves (42,43). Positive
associations exist when one microorganism promotes the presence and survival of
another through mechanisms of mutualism, commensalism or symbiosis, or by
means that help to evade the host's immune system. Negative associations are due
to interactions of amensalism (antagonism) or predation between competing bacterial
species in the same habitat or when the immune system indirectly favors the
presence of a species. These mechanisms include: the production of hydrogen
peroxide (H2O2) by resistant bacteria for the elimination of competing species (44),
biochemical reactions leading to the destruction of surface proteins needed for
adhesion to the epithelium of competing bacteria (45), and modulation of the immune
system to cause clearance of competing species (46).
In bovine respiratory pathology, several studies suggest a beneficial effect of the
Lactobacillaceae and Bacillaceae families, where the abundance of members of
these families was correlated with an inhibitory effect or a decline in the abundance
of established pathogenic bacteria (2,47,48). In the present study, Lactobacillaceae
and Bacillaceae families were almost exclusively present in the nasopharyngeal
cavities, and no specific correlation patterns or significant shifts in abundances were
noticed. The relative abundances of Lactobacillaceae taxa in the nasopharyngeal
samples of clinically healthy group and the BP group were 0.22% and 0.14%
respectively and 0.04% and 0.03% for the Bacillaceae family.
In the present study, we’ve first used the LEfSE algorithm in order to identify
statistically different OTUs between the NS and BAL samples in each group.
Chitinophagaceae, Corynebacteriaceae, Streptococcacea, Moraxellaceae, and
Pasteurellaceae were the families statistically related to the URT in the BP group.
Very little is known about the Cilia-associated respiratory bacillus (CAR) from the
Chitinophagaceae family (now reclassified as Filobacteriaceae). However, the few
available studies suggest their presence in the respiratory tract of cattle (49,50) as
well as in wild red deer, roe deer and chamois in northern Italy (51). Besides, a
correlation with inflammatory lesions in the tracheal epithelium in veal calves and
adult cattle has been suspected (52). In the present study, CAR was shown to be
154
one of the most abundant taxa in the nasopharyngeal cavities in the BP affected
calves and the Chitinophagaceae family as the most related to the URT in the same
group. These findings should drive us to investigate more closely the role of CAR in
the respiratory disease in cattle.
Stenotrophomonas maltophilia is a non-fermenting ubiquitous Gram-negative bacilli
found in a wide range of environmental habitats (53). With an increasing reputation
as a lower respiratory tract pathogen in human, the infection with S. matophilia is
associated with high morbidity and mortality in severely immunocompromised and
debilitated individuals. On the other hand, S. matophilia infection is considered as
nosocomial due to it is ability to colonize and to forming biofilms in all kinds of
surfaces especially in medical equipment, (53–55). Moreover, several studies
designate S. matophilia as a contaminant of bronchoscopes (56,57), so whether its
presence in the lower respiratory tract is real or due to the presence of biofilms in the
used material is subject to further investigations.
Principal Component Analysis (PCA) is a multidimensional descriptive method that
allows exploring the links between variables and the similarities between individuals.
The objective of the PCA is to identify the largest sources of variation and to project
the data into a space of reduce dimension by maximizing the variability of the
projection. In other words, PCA reduces the number of variables, in this way the
information becomes less redundant. To better understand the similarities between
samples in both respiratory tract sites, the sparse PLS-DA was further performed. As
seen in the circle plot of the NS samples, several associations were noticed; M. bovis
was associated with P. multocida and less tightly with a group of taxa formed by the
genera Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax, Sphingomonas, and Agreia. As for
M. haemolytica, it was associated with Murdochiella, and H. somni was associated
with Plonomicrobium sp., the genera Histophilus, Pasteurella and Mannheimia. The
latter three genera are members of the Pasteurellaceae family and are established
commensals of the nasopharynx mucosa and asymptomatic carriage in cattle. This
family is quite known in the context of bacterial superinfections following respiratory
infections primed by viruses or by mycoplasmas. This exact phenomenon was
noticed in vitro by Corbeil et al. (1985) (47). In this study, resident respiratory flora
155
was shown to enhance or inhibit the growth of M. haemolytica, P. multocida, and H.
somni isolates. Also in the same study of Corbeil et al., most isolates of the
respiratory flora were beneficial to Pasteurella growth, including the genera
Micrococcus, Corynebacterium and Staphylococcus.
Similarly, the statistical interpretation in our study shows an opposition (inverse
correlation) between the presence of BPI3 and BRSV on one hand and that of
Histophilus somni on the other hand. It has been shown that H. somni stimulates the
expression of antiviral proteins and inhibits the replication of BRSV in vitro in
epithelial cells (Lin, 2016). In this same study, the supernatant of H. somni culture
induced an overexpression of the transcription of different antiviral protein genes
(IFIH1, ISG15, MX1, and RSAD2) once added to the culture of BAT2 cells.
The BRSV and BPI3, on the other hand, are tightly associated together and with
several bacteria in addition to BCoV. The same analysis was however less
conclusive in the bronchoalveolar samples.
Similarly, the virus-bacteria interactions in the pathogenesis of bovine respiratory
infections are not fully understood. The most known mechanism during a virus-
bacteria co-infection is the ability of respiratory viruses to impede the immune
response of the host thereby promoting bacterial proliferation. Examples of this
mechanism are the blocking of the expression of certain MHC receptors by the
BoHV1 (58), the decrease in phagocytosis following BPI3 infection (59), and
sometimes a complete evasion from the immune response, a very well-known
mechanism of the BRSV (60, 61). In the present study, we tried to determine the
potential relationships between the presence of a virus on the structure of the
microbiota in the URT and LRT using the principal component analysis. Many of the
bacterial genera revealed by the analysis are not known in bovine respiratory
pathology and their possible interactions with one of the defined viruses, in any way,
must be further investigated. Despite not statistically significant, the genus
Mannheimia interestingly showed an increased abundance in the absence of a virus
in the nasopharyngeal cavities, same for the genus Trueperella. In contrast, the
genus Mycoplasma was revealed more abundant during a virus infection, M. bovis
156
showed also the same pattern when the analysis was done on the species level (data
not shown). The same analysis was less conclusive in the lower respiratory tract.
CONCLUSION
As a conclusion, the microbial ecology of the calves in health and during BP seems
to be diverse with a clear distinct structure of the microbiota observed between the
upper and lower respiratory tracts. The genus Mycoplasma was omnipresent in both
clinically healthy and affected groups in both respiratory sites. Some patterned
relationships were observed, notably between the presence of a known respiratory
pathogen (bacteria or virus) and the respiratory structure of either the URT or the
LRT microbiomes, raising the question of how these pathogens interact between
themselves and with the resident microbiota.
REFERENCES
1. Timsit E, Workentine M, Schryvers AB, Holman DB, van der Meer F, Alexander TW. Evolution of the nasopharyngeal microbiota of beef cattle from weaning to 40 days after arrival at a feedlot. Vet Microbiol [Internet]. 2016;187:75–81. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2016.03.020
2. Holman DB, McAllister TA, Topp E, Wright A-DG, Alexander TW. The nasopharyngeal microbiota of feedlot cattle that develop bovine respiratory disease. Vet Microbiol [Internet]. 2015 Oct 22 [cited 2016 Apr 18];180(1–2):90–5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26249828
3. Holman DB, Timsit E, Alexander TW. The nasopharyngeal microbiota of feedlot cattle. Sci Rep [Internet]. 2015 Jan [cited 2016 Apr 18];5(1):15557. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4620444&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
4. DeDonder KD, Apley MD. A literature review of antimicrobial resistance in Pathogens associated with bovine respiratory disease. Anim Heal Res Rev. 2015;16(2):1–10.
5. Grissett GP, White BJ, Larson RL. Structured Literature Review of Responses of Cattle to Viral and Bacterial Pathogens Causing Bovine Respiratory Disease Complex. J Vet Intern Med [Internet]. 2015;29(3):770–80. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25929158
157
6. Caswell JL. Failure of respiratory defenses in the pathogenesis of bacterial pneumonia of cattle. Vet Pathol [Internet]. 2014;51(2):393–409. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24021557
7. Hilton WM. BRD in 2014: where have we been, where are we now, and where do we want to go? Anim Health Res Rev [Internet]. 2014;15(2):120–2. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25358813
8. Hodgson PD, Aich P, Stookey J, Popowych Y, Potter A, Babiuk L, et al. Stress significantly increases mortality following a secondary bacterial respiratory infection. Vet Res. 2012;43:21.
9. Hodgson PD, Aich P, Manuja A, Hokamp K, Roche FM, Brinkman FSL, et al. Effect of stress on viral-bacterial synergy in bovine respiratory disease: Novel mechanisms to regulate inflammation. Comp Funct Genomics. 2005;6(4):244–50.
10. Risalde MA, Molina V, Sánchez-Cordón PJ, Romero-Palomo F, Pedrera M, Garfia B, et al. Pathogenic mechanisms implicated in the intravascular coagulation in the lungs of BVDV-infected calves challenged with BHV-1. Vet Res. 2013;44(1):1–13.
11. Valarcher J-F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res [Internet]. 2007;38(2):153–80. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17257568
12. Boukahil I, Czuprynski CJ. Mannheimia haemolytica biofilm formation on bovine respiratory epithelial cells. Vet Microbiol [Internet]. 2016;197:129–36. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2016.11.012
13. Elswaifi SF, Scarratt WK, Inzana TJ. The role of lipooligosaccharide phosphorylcholine in colonization and pathogenesis of Histophilus somni in cattle. Vet Res. 2012;43(1).
14. Sandal I, Shao JQ, Annadata S, Apicella MA, Boye M, Jensen TK, et al. Histophilus somni biofilm formation in cardiopulmonary tissue of the bovine host following respiratory challenge. Microbes Infect [Internet]. 2009;11(2):254–63. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.micinf.2008.11.011
15. Zecchinon L, Fett T, Desmecht D. How Mannheimia haemolytica defeats host defence through a kiss of death mechanism. Vol. 36, Veterinary Research. 2005. p. 133–56.
16. Hägglund S, Svensson C, Emanuelson U, Valarcher JF, Alenius S. Dynamics of virus infections involved in the bovine respiratory disease complex in Swedish dairy herds. Vet J. 2006;172(2):320–8.
158
17. Autio T, Pohjanvirta T, Holopainen R, Rikula U, Pentikäinen J, Huovilainen A, et al. Etiology of respiratory disease in non-vaccinated, non-medicated calves in rearing herds. Vet Microbiol [Internet]. 2007 Jan 31 [cited 2018 May 10];119(2–4):256–65. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037811350600383X
18. Mosier D. Review of BRD pathogenesis: the old and the new. Anim Health Res Rev [Internet]. 2014;15(2):166–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351390
19. Ng TFF, Kondov NO, Deng X, Van Eenennaam A, Neibergs HL, Delwart E. A Metagenomics and Case-Control Study To Identify Viruses Associated with Bovine Respiratory Disease. J Virol [Internet]. 2015 May 15 [cited 2018 Apr 5];89(10):5340–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25740998
20. Mitra N, Cernicchiaro N, Torres S, Li F, Hause BM. Metagenomic characterization of the virome associated with bovine respiratory disease in feedlot cattle identified novel viruses and suggests an etiologic role for influenza D virus. J Gen Virol [Internet]. 2016 Aug 1 [cited 2016 Sep 20];97(8):1771–84. Available from: http://jgv.microbiologyresearch.org/content/view.action?itemId=http%253A%252F%252Fsgm.metastore.ingenta.com%252Fcontent%252Fjournal%252Fjgv%252F10.1099%252Fjgv.0.000492&view=&itemType=http%253A%252F%252Fpub2web.metastore.ingenta.com%252Fns%252FArticle
21. Ellis J a. Update on bacterial pathogenesis in BRD. Anim Health Res Rev [Internet]. 2009;10(2):149–53. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003652
22. Taylor JD, Fulton RW, Lehenbauer TW, Step DL, Confer AW. The epidemiology of bovine respiratory disease: What is the evidence for predisposing factors? Can Vet J [Internet]. 2010;51(10):1095–102. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2942046&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
23. Holman DB, Timsit E, Amat S, Abbott DW, Buret AG, Alexander TW. The nasopharyngeal microbiota of beef cattle before and after transport to a feedlot. BMC Microbiol [Internet]. 2017 Dec 22 [cited 2018 May 16];17(1):70. Available from: http://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-017-0978-6
24. Johnston D, Earley B, Cormican P, Murray G, Kenny DA, Waters SM, et al. Illumina MiSeq 16S amplicon sequence analysis of bovine respiratory disease associated bacteria in lung and mediastinal lymph node tissue. BMC Vet Res
159
[Internet]. 2017;13(1):118. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28464950
25. Gaeta NC, Lima SF, Teixeira AG, Ganda EK, Oikonomou G, Gregory L, et al. Deciphering upper respiratory tract microbiota complexity in healthy calves and calves that develop respiratory disease using shotgun metagenomics. J Dairy Sci [Internet]. 2017;100(2):1445–58. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022030216308724
26. Zeineldin M, Lowe J, de Godoy M, Maradiaga N, Ramirez C, Ghanem M, et al. Disparity in the nasopharyngeal microbiota between healthy cattle on feed, at entry processing and with respiratory disease. Vet Microbiol [Internet]. 2017;208(February):30–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.07.006
27. Zeineldin MM, Lowe JF, Grimmer ED, De Godoy MRC, Ghanem MM, Abd El-Raof YM, et al. Relationship between nasopharyngeal and bronchoalveolar microbial communities in clinically healthy feedlot cattle. BMC Microbiol. 2017;17(1):1–11.
28. Hause BM, Collin EA, Anderson J, Hesse RA, Anderson G. Bovine rhinitis viruses are common in U.S. cattle with bovine respiratory disease. PLoS One. 2015;10(3):1–12.
29. Tokarz R, Sameroff S, Hesse RA, Hause BM, Desai A, Jain K, et al. Discovery of a novel nidovirus in cattle with respiratory disease. J Gen Virol. 2015;96(8):2188–93.
30. Escudié F, Auer L, Bernard M, Mariadassou M, Cauquil L, Vidal K, et al. FROGS: Find, Rapidly, OTUs with Galaxy Solution. Bioinformatics [Internet]. 2017 Apr 15 [cited 2018 Jun 4];34(8):1287–94. Available from: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/34/8/1287/4708232
31. Magoč T, Salzberg SL. FLASH: Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 2011;27(21):2957–63.
32. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal [Internet]. 2011;17(1):10. Available from: http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200
33. Kozich JJ, Westcott SL, Baxter NT, Highlander SK, Schloss PD. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl Environ Microbiol. 2013;79(17):5112–20.
160
34. Mahé F, Rognes T, Quince C, de Vargas C, Dunthorn M. Swarm: robust and fast clustering method for amplicon-based studies. PeerJ [Internet]. 2014;2:e593. Available from: https://peerj.com/articles/593
35. Segata N, Izard J, Waldron L, Gevers D, Miropolsky L, Garrett WS, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol [Internet]. 2011 Jun 24 [cited 2018 Jun 4];12(6):R60. Available from: http://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2011-12-6-r60
36. Cao KAL, Costello ME, Lakis VA, Bartolo F, Chua XY, Brazeilles R, et al. MixMC: A multivariate statistical framework to gain insight into microbial communities. Moreno-Hagelsieb G, editor. PLoS One [Internet]. 2016 Aug 11 [cited 2018 Jun 4];11(8):e0160169. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0160169
37. Arcangioli MA, Duet A, Meyer G, Dernburg A, Bézille P, Poumarat F, et al. The role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaks in veal calf feedlots. Vet J [Internet]. 2008 Jul 1 [cited 2018 Mar 22];177(1):89–93. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023307001128
38. Thomas A, Mainil J, Linden A. Mycoplasma bovis : synthèse des connaissances actuelles. Ann Méd Vét [Internet]. 2003 [cited 2018 Mar 22];1(147):23–39. Available from: https://orbi.uliege.be/bitstream/2268/26837/1/2003-M bovis synthèse des connaissances actuelles.pdf
39. Hata E, Murakami K. Complete Genome Sequence of Mycoplasma californicum Strain HAZ160_1 from Bovine Mastitic Milk in Japan. Genome Announc [Internet]. 2014 Sep 28 [cited 2018 Mar 21];2(4):e00684-14-e00684-14. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28963211
40. Tortorelli G, Carrillo Gaeta N, Mendonça Ribeiro BL, Miranda Marques L, Timenetsky J, Gregory L. Evaluation of Mollicutes Microorganisms in Respiratory Disease of Cattle and Their Relationship to Clinical Signs. J Vet Intern Med [Internet]. 2017;(June):1215–20. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/jvim.14721
41. Tegtmeier C, Angen, Grell SN, Riber U, Friis NF. Aerosol challenge of calves with Haemophilus somnus and Mycoplasma dispar. Vet Microbiol [Internet]. 2000 Mar 15 [cited 2018 Mar 21];72(3–4):229–39. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113599001819?via%3Dihub
42. Lee KH, Gordon A, Betsy F, Foxman B. The role of respiratory viruses in the etiology of bacterial pneumonia. Evol Med Public Heal [Internet]. 2016;2016(1):95–109. Available from:
161
http://emph.oxfordjournals.org/content/2016/1/95.abstract%5Cnhttp://emph.oxfordjournals.org/lookup/doi/10.1093/emph/eow007
43. Bosch AATM, Biesbroek G, Trzcinski K, Sanders EAM, Bogaert D. Viral and Bacterial Interactions in the Upper Respiratory Tract. PLoS Pathog. 2013;9(1).
44. Regev-Yochay G, Trzciński K, Thompson CM, Malley R, Lipsitch M. Interference between Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus: In vitro hydrogen peroxide-mediated killing by Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol [Internet]. 2006 Jul 1 [cited 2018 Apr 1];188(13):4996–5001. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16788209
45. Shakhnovich EA, King SJ, Weiser JN. Neuraminidase expressed by Streptococcus pneumoniae desialylates the lipopolysaccharide of Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae: A paradigm for interbacterial competition among pathogens of the human respiratory tract. Infect Immun [Internet]. 2002 Dec 1 [cited 2018 Apr 1];70(12):7161–4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12438402
46. Lysenko ES, Ratner AJ, Nelson AL, Weiser JN. The role of innate immune responses in the outcome of interspecies competition for colonization of mucosal surfaces. PLoS Pathog [Internet]. 2005 [cited 2018 Apr 1];1(1):0003-0011. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.ppat.0010001
47. Corbeil LB, Woodward W, Ward ACS, Mickelsen WD, Paisley L. Bacterial interactions in bovine respiratory and reproductive infections. J Clin Microbiol [Internet]. 1985 May [cited 2018 Mar 27];21(5):803–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3998115
48. Timsit E, Workentine M, van der Meer F, Alexander T. Distinct bacterial metacommunities inhabit the upper and lower respiratory tracts of healthy feedlot cattle and those diagnosed with bronchopneumonia. Vet Microbiol [Internet]. 2018 Jun 8 [cited 2018 Jun 13];221:105–13. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113518305637
49. Hastie AT, Evans LP, Allen AM. Two types of bacteria adherent to bovine respiratory tract ciliated epithelium. Vet Pathol [Internet]. 1993;30(1):12–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8442323
50. Nietfeld JC, Fickbohm BL, Rogers DG, Franklin CL, Riley LK. Isolation of cilia-associated respiratory (CAR) bacillus from pigs and calves and experimental infection of gnotobiotic pigs and rodents. J Vet Diagn Invest. 1999;11(3):252–8.
162
51. Bergottini R, Mattiello S, Crippa L, Scanziani E. Cilia-associated respiratory (CAR) bacillus infection in adult red deer, chamois, and roe deer. J Wildl Dis [Internet]. 2005;41(2):459–62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16107685
52. Pravettoni D, Toccacieli S, Monestiroli S, Crippa L, Canali E, Salvi S, et al. Cilia-Associated Respiratory (CAR) bacillus infection in veal calves and adult cattle. Dtsch Tierarztl Wochenschr [Internet]. 2001;108(9):386–9. Available from: http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-0035463087&partnerID=tZOtx3y1
53. An S qi, Berg G. Stenotrophomonas maltophilia. Trends in Microbiology [Internet]. 2018 Jul 10 [cited 2018 Jun 13];637–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29754971
54. Baranzelli A, Wallyn F, Nseir S. Infections bronchopulmonaires à Stenotrophomonas maltophilia et à Acinetobacter baumannii [Internet]. Vol. 69, Revue de Pneumologie Clinique. 2013 [cited 2018 Jun 13]. p. 250–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23583504
55. Chawla K, Vishwanath S, Gupta A. Stenotrophomonas maltophilia in Lower Respiratory Tract Infections. J Clin Diagn Res [Internet]. 2014 Dec [cited 2018 Jun 13];8(12):DC20-2. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25653948
56. Ofstead CL, Heymann OL, Quick MR, Eiland JE, Wetzler HP. Residual moisture and waterborne pathogens inside flexible endoscopes: Evidence from a multisite study of endoscope drying effectiveness. Am J Infect Control [Internet]. 2018 Jun [cited 2018 Jun 13];46(6):689–96. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29609854
57. Guy M, Vanhems P, Dananché C, Perraud M, Regard A, Hulin M, et al. Outbreak of pulmonary Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia infections related to contaminated bronchoscope suction valves, Lyon, France, 2014. Eurosurveillance [Internet]. 2016 Jul 14 [cited 2018 Jun 13];21(28):30286. Available from: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=22530
58. Jones C, Chowdhury S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines [Internet]. Vol. 8, Animal Health Research Reviews. 1996 [cited 2018 Apr 4]. p. 187–205. Available from: https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/572269643E1D1B24E65EA86B743532B9/S146625230700134Xa.
163
pdf/review_of_the_biology_of_bovine_herpesvirus_type_1_bhv1_its_role_as_a_cofactor_in_the_bovine_respiratory_disease_complex_and_de
59. Ellis JA. Bovine Parainfluenza-3 Virus [Internet]. Vol. 26, Veterinary Clinics of North America - Food Animal Practice. Elsevier; 2010 [cited 2018 Apr 4]. p. 575–93. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072010000356?via%3Dihub
60. Gershwin LJ. Bovine respiratory syncytial virus infection: immunopathogenic mechanisms. Anim Heal Res Rev [Internet]. 2007 [cited 2018 Apr 1];8(2):207–13. Available from: https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/9D16B2C5CB3261884F14E6B4DA6EEA19/S1466252307001405a.pdf/bovine_respiratory_syncytial_virus_infection_immunopathogenic_mechanisms.pdf
61. Gershwin LJ, Berghaus LJ, Arnold K, Anderson ML, Corbeil LB. Immune mechanisms of pathogenetic synergy in concurrent bovine pulmonary infection with Haemophilus somnus and bovine respiratory syncytial virus. Vet Immunol Immunopathol [Internet]. 2005 Aug 15 [cited 2018 Mar 27];107(1–2):119–30. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165242705001236?via%3Dihub
164
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Relative abundance of bacterial 16S rRNA gene sequences at the phylum
in BAL and NS of calves with (A) or without (B) BP. (C) Venn diagram of unique and
common taxa at the genus level between BP and clinically healthy calves with no
regard of sample nature (NS or BAL), 101 bacterial genera were found to be common
in the two groups.
Figure 2: The alpha diversity metrics (Observed richness, Chao1, and Shannon)
distribution in function of the sample nature: NS or BAL in calves with (A) or without
(B) BP. The observed richness index is a qualitative metric of OTU present in each
habitat, it is considered as a computation of the OTUs regardless of the relative
abundance. Chao1 richness index (ANOVA) is a nonparametric estimator of the
minimum richness and is based on the number of rare OTUs (singletons and
doublets) within a sample. The Shannon diversity index (ANOVA) accounts for both
richness and abundance in a single value of evenness, reflectes our ability to identify
all present OTUs in the samples.
Figure 3: A) Distances matrix computed using the UniFrac distances according to
the sample type (NS and BAL pairs of samples), Dissimilarity is clear (P = 0.0001)
between the NS and the BAL pools. B) Principal Coordinates Analysis (PCoA)
performed on the UniFrac matrix of distances, each point on the graph represents the
entire microbiome of a single sample and each axis reflects the percent of variation
between the samples, samples that cluster together have similar microbial
community profiles. The UniFrac distance between a pair of samples (e.g. NS1 and
BAL1) is defined as: unique branch length/observed branch length, where the unique
branch length only leads to OTU(s) observed in sample NS1 or sample BAL1 and the
observed branch length represents the total branch length observed in either sample
NS1 or sample BAL1. C
Figure 4: LEfSe plots displaying bacterial families with significantly different
abundance between the nasal (NS) and bronchoalveolar lavage (BAL) samples (LDA
score log10 ≥ 2.0) in clinically healthy (A) and BP (B) pools. Differences are
165
represented in the color of the most abundant class (red indicating BAL, Green
indicating NS).
Figure 5: Differences of bacteria genus between the URT and LRT of BP calves
using a sPLS-regression mode method. A) PLS-DA projection shows a strong
separation between NS and BAL samples. B) Taxa (genus level) that were
statistically associated with the URT. C) example of a box plot for the Moraxella
genus in BP and clinically healthy calves
Figure 6: the projection of the variables selected by sPLS onto correlation circles. A)
Represents the detected associations between respiratory pathogens and the
microbiota in NS, while B) represents the detected associations between respiratory
pathogens and the microbiota in BAL.
Figure 7: Contribution of BRSV, BPI3, and BCoV viruses on the URT and LRT
microbiota. The virus group was defined and used as a target for prediction.
Differences of bacteria genus taxa between the presence (1)/absence (0) of the
group of viruses in the URT (A) and LRT (B) using a sPLS-regression mode method
(PLS-DA projection). The contribution plots displaying the abundance of each
bacterial genus and in which status (presence/absence) they are the most abundant
in respiratory samples B) Nasal swabs and C) Bronchoalveolar lavages. The
outcome 0 (in blue) indicates a contribution of the absence of a virus on the
abundance of the bacterial genus. The outcome 1 (in orange) indicates a contribution
of the presence of a virus on the abundance of the bacterial genus.
Figure 8: Boxplots of selected bacteria distributions for Leucobacter,
Pseudochrobatum, Corynebacterium confusum and Gelidibacter in control and BP
calves with or without presence of the group of viruses.
166
Figure 1:
167
Figure 2:
A) Calves with BP B) Healthy calves
B)
A) B)
Figure 3:
168
Figure 4
A) Clinically healthy calves
:
B) Calves with BRD
169
Figure 5:
Figure6:
B)
A)
B) C)
A) B)
170
Figure 7:
C) D)
A) B)
171
Figure 8:
172
Table 1: Presence of respiratory major pathogens in the BP group as determined by
real time using the LSI Vetmax screening kit.
bRSV1
bPI-32
BCoV3
P.m4
M.h5
M.b6
H.s7
Id BAL8 NS9 BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS
ICSA-1 P10 p p p p p
ICSA-3 p p p
ICSA-4 p p p p p p p
ICSA-6 p
ICSA-7 p p p p p
ICSA-9 p p p
ICSA-10 p p p p
ICSA-11 p p p p p
ICSA-15 p p p p p p p
ICSA-16 p p p
ICSA-17 p p p
ICSA-18 p p p p
ICSA-19 p p p p p
ICSA-20 p p p p p p
ICSA-21 p p p p p p p
ICSA-23 p p p p p
ICSA-24 p p p p
173
ICSA-25 p p p p p p p
ICSA-26 p p p
ICSA-28 p p p
ICSA-29 p
ICSA-30 p p p p
ICSA-31 p p p p
1BRSV: Bovine respiratory syncytial virus, 2BPI-3: Bovine parainfluenza-3 virus, 3BCoV: Bovine coronavirus, 4P.m:
Pasteurella multocida, 5M.h: Mannheimia haemolytica, 6M.b: Mycoplasma bovis, 7H.s: Histophilus somni, 8BAL:
bronchoalveolar lavage and 9NS: nasal swabs, 10p : present.
174
Résultats et discussion
La structure microbienne nasopharyngée et pulmonaire était relativement
constante dans tous les échantillons individuels appartenant au même groupe
(cliniquement sain ou BP). Dans le groupe cliniquement sain, les phylums
(embranchement) nasopharyngés dominants étaient : Tenericutes,
Proteobacteries, Actinobacteries, Firmicutes et Bacteroidetes. Et les genres
dominants étaient : Mycoplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Neisseria et
Enterococcus. Alors que les phylums broncho-alvéolaires dominants étaient :
Tenericutes, Proteobacteria, Actinobactaria, Firmicutes et Bacteroidetes. Et les
genres dominants étaient cette fois : Mycoplasma, Pseudochrobactrum,
Stenotrophomonas, Glutamicibacter et Paeniglutamicibacter.
Dans le groupe de veaux atteints par la BPI, les phylums nasopharyngés
dominants étaient : Tenericutes, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria et
Actinobacteria ; les genres dominants : Mycoplasma, Cilia-associated respiratory
bacterium, Corynebacterium, Streptococcus et Moraxella. En parallèle, les
phylums broncho-alvéolaires dominants étaient : Tenericutes, Proteobacteria,
Fusobacteria, Bacteroidetes et Actinobacteria ; et les genres dominants :
Mycoplasma, Stenotrophomonas, Alcaligenes, ainsi qu’un genre non déterminé de
la famille Leptotrichiaceae et Pseudochrobactrum. Une observation particulière
dans cette étude a été la forte abondance de Mycoplasma bovirhinis et de
Mycoplasma dispar.
Alors que la structure chez les veaux en bonne santé semble être
identique dans les deux sites au niveau de l'embranchement, une divergence
apparaît aux niveaux taxonomiques les plus précis. Pour une meilleure clarté, des
mesures de la biodiversité (alpha et beta) ont été calculées ; le microbiote de la
cavité nasopharyngienne était clairement écologiquement plus riche que celui des
poumons indépendamment de l’état de santé. Comparés ensemble, les indices de
beta diversité des deux sites (ENP et BAL) dans un même groupe présentaient
des écosystèmes très distincts, cette différence était bien prononcée lors de la
BPI.
175
Dans cette étude, nous avons utilisé l'algorithme LEfSe afin d'identifier des
OTU statistiquement différentes entre les échantillons nasopharyngiens et
broncho-alvéolaires dans chaque groupe. Les familles Chitinophagaceae,
Corynebacteriaceae, Streptococcacea, Moraxellaceae et Pasteurellaceae étaient
statistiquement corrélées à la cavité nasopharyngée chez les animaux du groupe
BPI. Le Cilia-associated respiratory bacterium (CAR) était l'un des taxons les plus
abondants dans les cavités nasopharyngiennes des veaux BPI, ainsi, la famille
des Chitinophagaceae était la plus apparentée aux cavités nasopharyngiennes
dans le même groupe. Ces résultats devraient nous inciter à examiner de plus
près le rôle de cette bactérie dans la maladie respiratoire chez les bovins.
Plusieurs associations ont été observées à l’aide de PLS-DA ; M. bovis
était associé à P. multocida et moins étroitement à un groupe de taxons formés
par les genres Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax, Sphingomonas et Agreia.
Quant à M. haemolytica, il était associé à Murdochiella, et H. somni était associé à
Plonomicrobium sp., aux genres Histophilus, Pasteurella et Mannheimia. D'autre
part, le BRSV et le BPI3 sont étroitement associés entre eux et avec plusieurs
bactéries en plus du BCoV, une observation déjà formulée dans les résultats du
chapitre « identification des virus respiratoires bovins ».
Des associations potentielles entre la présence d'un virus sur la structure
du microbiote dans les voies respiratoires supérieures et inférieures ont été
recherchées. Curieusement, le genre Mannheimia a montré une augmentation de
l'abondance en l'absence de virus dans les cavités du nasopharynx, de même
pour le genre Trueperella. En revanche, le genre Mycoplasma s'est révélé plus
abondant lors d'une infection virale.
176
CHAPITRE 3 : L’INFLUENZAVIRUS DE TYPE
D : REPARTITION GEOGRAPHIQUE ET POUVOIR
PATHOGENE
Introduction I.
Suite à la découverte du virus de l’IDV aux USA, l’équipe virologie (IHVV)
de l’Unité Mixte de Recherche Interactions Hôtes – Agents pathogènes 1225
(Toulouse France) a décidé de rechercher si le virus était présent dans la
population bovine en France. En bilan, des prélèvements respiratoires (n=134) ont
été analysés pour recherche d’IDV, 6 échantillons soit 4,5% des prélèvements, se
sont avérés positifs par RT-qPCR (208).
Cette première description de l’IDV en Europe a très vite été suivie par
son identification en Asie et dans différents pays d’Amérique du Nord et Centrale.
Dans la mesure où aucune donnée n’existait pour le continent Africain, nous nous
sommes très vite concentrés sur sa présence dans ce continent, qui présente une
diversité animale très riche et une niche de maladie infectieuses de nature variée.
Dans le cadre de cette étude, 2083 échantillons de sérums collectés entre 1991 et
2015 sur des bovins, des porcs, des petits ruminants et des dromadaires au
Maroc (n=200), au Bénin (n= 308), au Togo (n=540), au Kenya (n=1231), et en
Côte d’Ivoire (n=203) ont été testés pour détecter la présence d’anticorps anti IDV,
par technique IHA ainsi que par séroneutralisation. Les antigènes utilisés pour ces
tests étaient les souches D/bovine/Nebraska/9-5/2012 et la souche française
récente D/bovine/France/5920/2014. Cette dernière a été isolée sur un fragment
de poumons d’un veau mort suite à une atteinte de BPI en Bourgogne en 2014.
Cet échantillon faisait partie des échantillons positifs en RT-qPCR de l’étude de
Ducatez et al. 2015 (208).
Par ailleurs, lors des premières détections d’IDV en France nous avons
observé des co-infections avec le BRSV, le BoHV-1, P. multocida, M. haemolytica
177
et H. somni dans 4 prélèvements alors que pour 2 prélèvements collectés en 2014
seul l’IDV était détecté. Ces prélèvements provenant d’animaux morts ou
gravement atteints de BPI, nous nous sommes alors posé la question du pouvoir
pathogène d’IDV. L’hypothèse d’un pouvoir pathogène respiratoire de l’IDV était
confortée par les études réalisées aux USA notamment. Si le virus était
historiquement isolé chez le porc, les études épidémiologiques montraient
clairement que l’hôte principal de l’IDV est le bovin (Hause et al., 2014). Par
ailleurs les analyses statistiques effectuées dans les études de métagénomique
de Mitra (180) et de Ng (76) montraient une corrélation entre la présence du
génome de l’IDV et la présence de BPI chez les veaux prélevés. De même la
fréquence de détection de l’IDV était statiquement plus importante chez les veaux
atteints de BPI.
Si l’IDV était étroitement associé aux BPI, l’importance de son pouvoir
pathogène n’était pas connue. Comme nous l’avons vu dans la partie
bibliographique les BPI sont des maladies multifactorielles mettant en cause des
facteurs de risques liés à la conduite d’élevage et à l’environnement et
essentiellement des agents infectieux comme des bactéries, virus ou parasites.
Les virus impliqués dans les BPI sont nombreux et leurs mécanismes d’action
variés. Leur pouvoir pathogène est quelquefois considéré comme modéré, on
parle alors souvent d’agents initiateurs qui favorisent les infections bactériennes.
Même si cette assertion est réductrice, la dysbiose du microbiote représente
l’étape inévitable qui aggrave la situation. Il est aussi possible que les virus
respiratoires exercent leurs pouvoirs pathogènes lorsqu’ils sont associés, comme
cela est le cas dans 4 de nos 6 premiers prélèvements positifs à l’IDV.
Afin de mieux comprendre le rôle de l’IDV dans le syndrome respiratoire
chez les bovins, une infection expérimentale a été faite dans les limites des
consignes de l’éthique et le bien-être animal.
178
Article : « Serologic evidence for influenza C and II.
D virus among ruminants and Camelids, Africa, 1991-2015 »
179
180
181
182
183
Résultats et discussion
Les résultats des sérologies étaient similaires quel que soit la souche
utilisée. Les résultats montrent que le virus IDV circule dans le Nord et l’Ouest de
l’Afrique depuis au moins 2012. En effet, des anticorps ont été détectés chez des
bovins au Maroc entre 2012 et 2015, chez des bovins au Togo et au Bénin depuis
2014, ainsi que chez des petits ruminants au Togo depuis 2013. Il semblerait de
plus que l’infection progresse puisque les taux de prévalence chez les bovins
augmentent au fil des années (23%, 41%, et 42% de séroprévalence au Maroc en
2013, 2014, et 2015 respectivement ; 0% et 21% de séroprévalence au Togo en
2009 et 2015 respectivement). Aucun des échantillons prélevés au Bénin sur des
porcs et des petits ruminants ne s’est révélé séropositif vis-à-vis de l’IDV. Seuls
2% des bovins béninois (n=207) étaient séropositifs pour IDV. Concernant le
Kenya, les échantillons de bovins testés se sont tous avérés séronégatifs. Par
contre, les résultats sur des échantillons de dromadaires montrent que presque
tous les animaux avaient des anticorps anti-IDV ou anti-ICV, qu'il y avait une
réactivité croisée chez les dromadaires entre les deux virus et que 9% des
échantillons avaient des anticorps anti-ICV. Les dromadaires pourraient donc être
un hôte nouvellement découvert pour ICV, et éventuellement pour IDV.
L’ensemble des résultats suggère qu’IDV est un virus répandu dans le
monde. La détection d'anticorps contre l'IDV chez les ruminants en Afrique
soulève la question de l'origine et de la voie de transmission du virus, de son
pouvoir pathogène et de son tropisme d’hôte. De même ces données permettront
de mieux comprendre la dynamique d’évolution dans l’espace de ce virus.
Lors de la découverte de l’IDV en France, les questions portaient sur
l’origine de l’IDV en France par rapport aux souches américaines. Les bovins
français ont-ils été contaminés par leurs congénères Nord-américains ou vice
versa ? Y a-t-il eu une co-évolution ? Les différentes souches proviennent-elles de
sites distincts ou bien d’hôtes différents ? Compte tenu des données récentes
d’identification, des restrictions aux échanges de bovins entre les différents pays
identifiés, on peut supposer une co-évolution de ce virus sur les différents
continents.
184
Article : « Pathogenesis, host innate immune III.
response and aerosol transmission of influenza D virus in cattle »
185
Pathogenesis, host innate immune response and aerosol transmission of Influenza D virus in cattle
Elias Salem,a Sara Hägglund,b Hervé Cassard,c Tifène Corre,a Katarina Näslund,d
Charlotte Foret,a David Gauthier,e, Anne Pinard,e Maxence Delverdier,a,c Siamak
Zohari,b,d Jean-François Valarcher,b Mariette Ducatez,a and Gilles Meyer,a,c *
a IHAP, UMR1225, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France ;
b Swedish University of Agricultural Sciences, Host Pathogen Interaction Group,
Department of Clinical Sciences, Uppsala, Sweden; c Université de Toulouse, Ecole Vétérinaire de Toulouse (ENVT), 31076 Toulouse
cedex 03 ;
d Department of Virology, Immunobiology and Parasitology, National Veterinary
Institute, Uppsala, Sweden; e INRA, UE 1277, Experimental Infectiology Platform (PFIE), INRA-Val de Loire
research Centre, Nouzilly, France
186
ABSTRACT
The recently discovered influenza D virus (IDV) of the Orthomyxoviridae family has
so far been detected in swine and ruminants on four continents, confirming a
worldwide distribution. Cattle are considered to be the primary host and reservoir and
previous studies suggested a tropism of IDV for the upper respiratory tract and a
putative role in the Bovine Respiratory Disease complex. This study aimed to
characterize host pathogen interactions and the pathogenicity of IDV in naive calves,
as well as the ability of this virus to transmit by air. Eight naive calves were infected
by aerosol with a recent French strain (D/bovine/France/5920/2014) and were
housed in one pen. Three non-infected contact animals were housed in the same unit
but 3 meters apart from this pen, and five non-infected calves were housed in a
separate unit. The level of viral replication, pathology and innate and adaptive
immune responses were studied, and air samples were analyzed for IDV-RNA. The
virus replicated in the epithelial cells of the bronchioles and caused moderate lesions
of interstitial pneumonia and moderate dyspnea. Analyses of bronchoalveolar
lavages indicated the induction of overexpression of pathogen recognition receptors
and the chemokines CCL2, CCL3 and CCL4 in the lower respiratory tract, but without
overexpression of genes involved in the interferon type I pathway. It was
demonstrated that IDV can be airborne transmitted and infect naïve contact calves on
short distances. These results suggest that IDV is a respiratory virus with moderate
pathogenicity and probably a high level of transmission.
IMPORTANCE
Influenza D virus (IDV), a new Genus of the Orthomyxoviridae family, has a broad
187
geographical distribution and can infect several animal species. Cattle are so far
considered as the primary host for IDV, but the pathogenicity and the prevalence of
this virus is still unclear. We demonstrated that under experimental conditions (in a
controlled environment and in the absence of co-infecting pathogens), IDV is able to
cause mild to moderate disease and targets both the upper and lower respiratory
tract. The virus can transmit by direct as well as aerosol contacts. While this study
evidenced overexpression of pathogen recognition receptors and chemokines in the
lower respiratory tract, IDV-specific IgG1 production as early as 10 days post
challenge, and likely both Th1 and Th2 responses, further studies are warranted to
better understand the immune responses triggered by IDV and the role of the virus as
part of the Bovine Respiratory Disease complex.
KEYWORDS: influenzavirus D, cattle, BRD, respiratory, pathogenicity
INTRODUCTION
The bovine respiratory disease (BRD) complex is a significant economic and public
health burden (1) that affects young bovines worldwide. BRD is triggered by the
presence of one or several viruses and/or bacteria (2) that are favored by a set of
predisposing factors such as altered state of the host immune system (3) and
environmental factors (4). Respiratory viruses may induce the disease alone, such as
Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), or cause disease by initiating a cascade
of subsequent events of immune suppression (3,5), damaging the respiratory
epithelium (6), the airway clearance mechanisms (7) and altering the local biofilms
188
(8–10) and normal commensal flora thus leading to complex secondary bacterial
invasion (8,10,11). Several viruses are thought to initiate and contribute to BRD,
including BRSV, bovine parainfluenza type-3 virus (BPI3), bovine coronavirus
(BCoV), bovine herpesvirus-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV).
Recently a new virus, now called influenza D virus (IDV) was identified in the USA in
2011, first in swine (12) and then in cattle (13) with respiratory disease. IDV is an
enveloped single-stranded negative-sense RNA virus of the Orthomyxoviridae family.
Like influenza C virus (ICV), the IDV genome is divided into seven segments
whereas influenza A and B genomes are divided into eight segments (12,13). The
genetic identity on the whole genome between ICV and IDV only reaches 52% and
the two viruses are not able to reassort together (14). In addition, IDV was unable to
cross-react with ICV positive sera. These three points lead to classification of the
novel IDV in a new genus then in the Deltainfluenzavirus genus of Orthomyxoviridae
family (13).
Since its discovery, both IDV and anti-IDV antibodies were successively detected in
North and Central America, Europe, Asia and Africa (12,14–21). While IDV is thought
to be circulating among several mammalian species (14), cattle are considered to be
the primary host and reservoir. First, IDV was isolated in many occasions from bovine
respiratory samples, and high seroprevalence and virus prevalence within bovine
herds were recorded globally (12,17,21–23). Furthermore, detection of IDV in the
respiratory tract of cattle during BRD suggest that it could be a virus contributing to
this major complex (24,25). However, since IDV was isolated from calves without
BRD, its pathogenicity in cattle remains unclear. Two recent studies of IDV
pathogenesis suggested that calves experimentally infected with strains isolated in
189
the USA (25,26) showed mild clinical signs of respiratory disease along with virus
replication and lesions mainly restricted to the upper respiratory tract (URT). One
study also clearly demonstrated that IDV is transmitted by direct close contact
between calves (26).
The French IDV D/bovine/France/5920/2014 (IDV 5920) strain was recently isolated
from the lower respiratory tract (LRT) of a calf suffering from BRD. Other classic
respiratory viruses or bacteria were not detected (16) and this suggests that IDV
5920 may replicate in the LRT and induce clinical respiratory signs. Based on this
virus, we developed a new calf model to i) attempt to reproduce clinical signs in the
LRT, ii) study the viral replication, the viral tropism and the pathology, iii) characterize
local and systemic immune responses, and v) investigate if this virus could be
transmitted by airborne route at a short distance.
RESULTS
IDV induces moderate clinical signs and pathology in both URT and LRT
After challenge and throughout the entire experiment (Fig. 1), no clinical signs
(Clinical score (CS) < 1, clinical cutoff) were observed in calves in the control and
contact groups, except in one control calf at D12 and D13. This calf showed signs of
apathy, loss of appetite and difficulties to walk due to arthritis in one stifle, but no
respiratory signs were observed. This animal recovered after antibiotic treatment. For
the five calves infected with IDV 5920 and euthanized at the end of experimentation,
clinical scores (CS)
190
accumulated CS of 13.5 and 16) to moderate (Calves no. 7142, 7165 and 7180,
accumulated CS of 33, 33.5 and 63) respiratory clinical signs. The average CS at D7,
D8 and D9 were significantly higher in infected animals compared to in the controls
(P<0.0001 at D7 and D8, P>0.05 at D9) (Fig. 2A). Moreover, the mean accumulated
CS were higher for the 5 infected animals compared to controls (Fig. 2B), although
no statistical significance could be demonstrated. Mild clinical signs of respiratory
disease included some spontaneous coughing and slight tachypnea (35-40
breaths/minute). Moderate respiratory signs, observed between D5 and D8, were
characterized by repeated spontaneous coughing, abdominal dyspnea with
increased respiratory rates (between 35 and 65 breaths/minute) and abnormal lung
sounds (wheezing) but without consequences on appetite or general state. No
hyperthermia was detected in any of the infected animals and all calves recovered by
D12.
Similarly, three inoculated calves were euthanized at D8. At this date calf 6533
showed major respiratory clinical signs (Clinical score of 6.5, starting at D4) while
calves 6531 and 7144 were only mildly affected (CS of 2 starting at D6). These
animals had macroscopic lung lesions characterized by patchy areas of atelectasis
with deep red texture. The lesions were restricted to the cranial right lobe and
covered about 5-10% of the entire lung surface for two calves (no. 6531 and 6533)
and less than 5% for the last one (calf n°. 7144). No gross lesions were found in
nasal cavities, larynx and trachea. At D22 and D23 (end of the experiment), no
macroscopic lesions were observed in any animal, except in one infected calf (no.
7165) which showed fibrinous and necrotic pleuro-pneumonia with several abscesses
in the cranial lobes. Bacteriology indicated the presence of Trueperella pyogenes, a
191
bacterium typically involved in secondary respiratory infection of calves.
Histological examination was performed for all calves on olfactory bulb, nasal
mucosa, trachea, mediastinal and tracheal lymph nodes and lung tissue sections with
gross lesions when present, collected from the right and left cranial, the intermediate
and the right and left caudal lobes. Microscopic lesions with light distribution ((3 or
less lesion foci for a sample) were observed in the nasal mucosa and the right cranial
lobe of 2 infected calves euthanized at D8 (no. 6531 and 6533), and in the right
cranial and accessory lobes of the lung of two infected calves euthanized at D22 (no.
7147 and 7165). No microscopic lesions were observed in the lung paremchym from
other lobes. At D8 of euthanasia calf 6533 showed major respiratory clinical signs
(Clinical score of 6.5, starting at D4) while calf 6531 was only mildly affected (CS of
2). The lesions characterized those of a subacute rhinitis (infiltration of the lamina
propria by mononuclear cells in nasal epithelium) and a subacute bronchointerstitial
pneumonia (neutrophils in bronchial lumens, neutrophilic and macrophagic alveolitis,
peribronchial and septal lymphoplasmocytic infiltration in the lung, respectively).
IDV replicates in both URT and LRT
To assess the shedding of IDV in both URT and LRT, the presence of IDV RNA was
monitored by RT-qPCR in deep nasal swabs (NS) between D0 and D22 and
bronchoalveolar lavages (BALs) on D-1, D2, D7, D14 and D22. No virus was
detected in control calves. In inoculated calves IDV detection in NS started at D1 in
four calves and D2 for the other four. A peak of replication was observed at D4 with a
mean titer of 5.6 x 108 (± 3.9 sd) IDV RNA copies/mL (Fig. 3A). The duration of
-12 days interval]. In addition, the IDV genome was
192
detected in BALs of infected calves with titers ranging between 5.1 x 103 and 1.4 x
105 RNA copies/mL in 3, 2 and 1 out of the five tested calves at D2, D7 and D14
respectively (Fig. 3B). The presence of IDV in the lower respiratory tract was
confirmed by analyses of IDV RNA in respiratory tissue samples collected on the
three infected calves euthanized at D8 and on infected and contact calves at D22
(Table1). Viral RNA was easily detected, between 6.3 x 103 and 4 x 105 RNA
copies/30mg of tissue, in NS, trachea, cranial and caudal lobes of the lungs and also
the mediastinal and tracheal lymph nodes. Similarly, contact calves harbored viral
RNA in such tissues at D22, but additionally in tonsils and the olfactory bulb (Table1).
No virus could be detected in infected calves euthanized at the end of the experiment
on D23. Finally, to localize where IDV replicates, immunohistochemistry (IHC) was
performed on lung tissue sections from two infected calves euthanized at D8 (the
cranial and intermediate lung lobes, which were positive by RT-qPCR) and on similar
sections from control calves. Results showed IDV antigen deposition in the
epithelium of the bronchioles (Fig. 4) with a nuclear and cytoplasmic localization. All
tissues from the control animals were IDV negative.
IDV transmission may occur by direct or aerosol transmission
IDV was detected in nasal secretions from the three calves in the contact group
(separated by fence 3 meters apart from the infected group and without effluent
contact), with shedding starting at least 10 days after the infected calves, at D11, D17
and D21 respectively (Fig. 3A). For the calf starting shedding at D11 (no. 7155), IDV
was detected in NS until D19. For the other two calves, IDV was still present in NS at
the end of the experiment (D22). To investigate aerosol transmission, we performed
193
virus detection in 24 air samples collected over the course of the experiment in the
contact calves’ area, the separating space and finally the infected calves’ area. The
IDV genome was detected in air samples in the three locations at D3, D5, D7, D9 and
D13 in a range of 5.2 to 6.1 Log10 RNA copies/m3 of air (Fig. 3C) with a maximum
between D 5 and 7 although not significant. IDV detection started at D3 in the
infected group area and D5 in the separating space and group contact area. After D9
IDV was only detected in aerosols of the group contact area.
IDV infection induces innate immune responses in BALs characterized by
mRNA overexpression of pathogen recognition receptors and proinflammatory
cytokines
Since IDV was able to replicate in the LRT and no data was available on IDV innate
local immunity in the natural host we first analyzed BAL, collected from infected
calves and controls at D0, D2, D7 and D14, for the transcriptomic response of 46
molecules. These included pathogen recognition receptors (PRRs), cytokines,
chemokines and antiviral molecules involved in the interferon type I (IFN-I) response
(Table 2). The D0 was considered as a reference before challenge; D2 corresponded
to the initiation of IDV replication and innate immunity, D7 to the peak of clinical signs
and D14 to the recovery of infected calves.
Four genes coding for IL4, IL5, IL10 and MYD88 failed to pass the Fluidigm PCR
quality check. Significant statistical differences between the two groups and the way
of the expression (over or under expressed) for infected calves compared to controls
are shown in Table 2 for each molecule and each day. CNRQ data of Fluidigm qPCR
are available as supplementary data 1.
194
IDV infection induced an active and significant overexpression of PRRs mRNA in
calves, mainly TLR3, TLR7, TLR9, NOD2 and RIG-1 at D2 (Table 2). However, no
significant differences between CNRQ values were found for INFα gene, genes
involved in the interferon pathway (IRF1, IRF3, IRF7, STAT2) or interferon antiviral
induced molecule ISG15. In contrast, CNRQ values of SOCS1 and SOCS3 were
significantly (P<0.001 at D2) increased at D2. Concerning proinflammatory cytokine
mRNAs, significant differences were mainly observed for CCL3, CCL4 and CX3CL1
at D2 and D14, CCL2 at D7 and D14, ITGAL (also named LFA-1A or CD11a) at D14
and CX3CR1 at all days. All the genes were overexpressed in infected calves except
for ITGAL which was significantly under-expressed (P<0.01 at D14). In addition, IL6
was significantly overexpressed at D2 (P<0.01) and D14 (P<0.01) for infected calves
while no differences were observed between IDV and control groups for IL1β, TNFα,
TNFβ and NF-ĸB. The cellular adaptive immune response was also characterized by
an overexpression in the IDV group of INFγ at D2 and D14, IL2 at D6 and IL13 at D2,
D6 and D14.
We then further analyzed protein expression of 15 bovine chemokines in BAL cells
using a multiplex Luminex assay. When statistically analyzed using the same method
as for mRNA expression, results of adjusted protein concentrations indicated
significant overexpression of TNFα at D2 and D7, CXCL10, IL1-R and IL10 at D7 and
IL2 at D2 and D14 (Table 3). Values for CCL3, INFγ, IL8 at D2 and D7 and CCL4 at
D2 were also upregulated for IDV infected calves but without significant differences,
probably due to individual variability between calves. Protein concentrations were
similar between the two groups for IL4, IL6, CCL2, IL1α, IL1β, and IL17a. Identical
results were obtained using median fluorescence intensity (MFI) or Log transformed
195
MFI as outputs (data not shown).
IDV induces both humoral and cell mediated systemic immune responses
The three colostrum-deprived controls remained seronegative for IDV
hemagglutination-inhibiting (HI) antibodies throughout the experiment, and no
increase of HI antibody titers was detected in the serum of the two control calves fed
with IDV-positive colostrum (Fig. 5A). Two infected calves had already seroconverted
by D7 (Calf no. 6131 and 7144) with HI titers of 1:10 (limit of detection, LOD, 1:10),
and all five infected calves were seropositive at D15 (titers between 1:40 and 1:160,
Fig. 5A). In addition, the calf N° 7155 from the contact group who started shedding
IDV at D11 also developed a humoral response by D22, with a HI titer of 1:40. Sera
from infected calves were additionally analyzed by IDV-specific IgG1 and IgG2
ELISAs (Fig. 5B). In agreement with the HI data, IDV-specific IgG1 seroconversions
were detected in all infected animals. Whereas one calf had already seroconverted
by D10 (no. 7165), a slight response was observed below the LOD in sera of the
remaining four calves by D10, and these had all seroconverted by D22. No IDV-
specific IgG2 antibodies were detected throughout the study; however, a weak
response below the LOD was observed in two calves (no. 7142 and 7180) by D22,
suggesting a low starting production of IgG2 in sera.
In the search for IDV-specific cellular memory responses in peripheral blood, 22 days
after challenge, we analysed the proliferation and the cytokine production of IDV-
restimulated PBMC. To eliminate unspecific responses against the cells in which IDV
was propagated, responses induced by uninfected cell lysate were deduced from
those induced by IDV-infected cell lysate. Overall, the IDV-specific proliferation was
196
significantly stronger at D22 compared to at D-1 (Fig. 6), both after restimulation with
live and inactivated virus (p=0.045 and p=0.031, respectively, two-sided paired T-
test). The strongest proliferation was detected in calves no. 7142 and 7165 at D22,
likewise after using both live and inactivated virus (Figure 5).
Live virus induced a weaker proliferation or more cell death than inactivated virus but
was nevertheless used for cytokine analyses, to mimic the natural situation. Out of 15
analyzed cytokines, only the IDV-specific CCL-4 responses were significantly
different in PBMC collected from D22, compared to in those collected on D-1 (greater
on D22, p=0.025). On the other hand, regardless if cells derived from calves that had
previously been challenged or not, IDV infection of lymphocytes consequently
induced IL-1α and IL-8, at statistically significantly greater levels than control antigen
(p=0.043 and p=0.0003 for IL-1α; p=0.005 and p=0.0014 for IL-8, in cells from D-1
and D22, respectively).
DISCUSSION
Following its first detection in 2011, IDV is intriguing the scientific community: its
pathogenesis, tropism, natural reservoir, route of transmission and role in respiratory
affections are still not well-known. Studies using next-generation sequencing on the
samples collected from young cattle with sign of respiratory disease suggested a
positive relation between BRD and the presence of IDV in the URT (24,27). On the
other hand, when IDV was intranasally inoculated in calves, the virus and the
microscopic lesions were mainly detected in the nasal cavities and trachea and only
exceptionally in lungs (25,26). In this study we confirm a higher level of IDV RNA
loads in the URT than in BALs, suggesting a preferential tropism of IDV for the URT
197
of cattle as also suggested in ferret, swine (12,18), and guinea pig (28). In contrast to
data ported above (and by using the same mode method of infection), we found
minimal lesion in the nose and trachea, suggesting that differences may exist due to
factors link to the host or the virus strain. In addition, our data on IDV pathogenicity
did not completely agree with previous results since we found a widespread infection
of LRT which potentially makes this virus a stronger cause of bronchopneumonia. By
using a French IDV strain isolated from cattle with lower respiratory clinical signs (16)
and infection by aerosol, we were indeed able to detect IDV in LRT of infected calves
from D2 to D14 in BALs and several lobes of the lungs at D8. This was confirmed by
detection of IDV antigen in epithelial cells of bronchioles which is also in agreement
with our previous field observations (16). Infection of the LRT is also suggested by
the clinical signs typical of the LRT infection (dyspnea with surrounding wheezes) in
two calves, which was not the case in the two previous experimental infections
performed with different viral strains (25,26). Differences may be related to the IDV
strain, the method of inoculation and/or the host. Here we used colostrum deprived
calves of dairy production, while Ferguson et al. (2016) waited for the disappearance
of maternal antibodies before inoculation. Consequently, infected calves were older
and probably more mature immunologically. We can also not exclude that IDV
colostrum may have stimulated the priming of the cellular immune response in the
study of Ferguson et al. (2016). The French IDV strain used here and the
D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 virus used by Ferguson et al are part of the
D/swine/Oklahoma/2011 lineage (whole genome sequences). No sequence data of
the whole genome is to date available for the challenge strain,
D/bovine/Kansas/162655/2012 used by Hause et al. (25). Therefore, no proper
198
genetic comparison could be performed between the 3 inoculum stains of IDV but we
can hypothesize that this might have played a role on disease outcome and tissue
tropism.
Despite the infection of the LRT, the clinical impact of IDV was moderate in this
study, as infected calves quickly recovered from the infection. The quick recovery of
the calves correlates with the limited extension of gross and histopathologic lesions
of interstitial bronchopneumonia observed in the three animals euthanized at D8,
indicating milder pathogenicity of IDV in the LRT compared to that of other respiratory
viruses, such as BRSV. Beside the biological characteristics of IDV, this could also
be due to experimental conditions including the virus, the dose and the route of
inoculation. However in our study we used a high quantity of virus to infect animals
(107 TCID50 per calf) and a nebulization method which was previously shown to be
very efficacious for BRSV experimental infection in calves (29). On the other hand,
our IDV inoculum was produced on cells from human (HRT18G) and swine (ST)
origins with 8 passages that might have attenuated the virus. An inoculum produced
by several passages in calves might be better suited since the virus by this way may
increase its fitness to the host and thereby raise its potential to replicate and induce
clinical signs. Nevertheless, the moderate pathogenicity is in agreement with the
previous experimental infections (25,26) but also with epidemiological findings.
Seroprevalence of IDV in cattle is under investigation in France and preliminary data
indicate that over 50% of adult cattle may be seropositive (data not shown)
suggesting that the virus may spread a lot without inducing clinical signs in large part
of the cattle population. In addition, IDV was detected only with low frequency in the
LRT of calves suffering from severe BRD and frequently in association with other
199
pathogens (16). Therefore, IDV might have a role of a predisposing factor to BRD. It
is indeed well known that BRD involves several interacting microorganisms which
may collaborate to induce clinical signs and lung lesions (30). In our study, the
presence of co-infecting microorganisms was prevented by performing the
experiment in isolation units in which co-infections are not occurring suggesting that
the observed clinical signs are solely those of the IDV. This was confirmed by the
absence of respiratory pathogen microbial qPCR detection in BALs before and after
challenge. All these points suggest that at the current stage IDV can be considered
as a respiratory virus that can replicate in the URT and LRT. Its limited pathogenicity
is associated with mild clinical respiratory signs and can probably be considered as
predisposing or co- factor of respiratory disease such as other viruses like BCoV and
BPI3.
The local innate immune response induced by IDV in the LRT was also investigated.
Our data suggest a high capacity of IDV to stimulate transcription of the membrane or
cytosolic PRRs, such as TLR3, TLR7, TLR9 and RIG-1. In contrast, IFN-I and IFN-I
pathway molecules such as IRF3, IRF7 or IFN-I stimulated genes (ISG15) were not
overexpressed in infected calves by comparison with control animals.
Phosphorylation and translocation of IRF3 and IRF7 were tough not tested here.
Furthermore, transcription of SOCS1 and SOCS3, which are cytokine-inducible
negative regulators of cytokines and members of the STAT-induced STAT inhibitor
(SSI) family, were overexpressed at the same time. These data allow us to explore
further the ability of IDV to interfere with the IFN-I response at both the transcriptomic
and protein levels as shown for IAV NS1 protein (31,32). This also suggests that IDV
is rather well adapted to cattle and it would be interesting to compare if the similar
200
response would be observed in pigs or other species. We also found overexpression
of mRNAs of several chemokines along the course of infection, mainly observed for
CCL2 (also named MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β) and the tandem
CX3CL1/CX3CR1. In agreement with this, CCL4 production were induced by IDV in
PBMC in vitro, and in higher amounts by PBMC collected after IDV challenge. The
soluble form CX3CL1 is chemotactic for T-cells and monocytes but not for neutrophils
while the membrane-bound form promotes adhesion of those leukocytes to
endothelial cells. Both CCL3 and CCL4 act as a chemoattractant for monocytes, but
also, in a lesser extent, neutrophils and natural killer cells (NK), as well as antigen-
specific T and B cells for CCL3 (33). Neutrophils might additionally have been
stimulated by IL-8 production, as demonstrated in vitro and in vivo at D2 in BALs.
These results may explain our histopathological observations in IDV calves showing
a peribronchial and septal lymphoplasmocytic infiltration in the lung, a moderate
infiltration of neutrophils in the bronchial lumens and a light neutrophilic and
macrophagic alveolitis. The moderate infiltration of inflammatory cells is also
correlated with a down regulation in IDV calves of ITGAL mRNA expression, which is
involved in leukocyte adhesion and transmigration of leukocytes including T-cells and
neutrophils (34). On overall this also confirms well the interaction and replication of
IDV in the lower respiratory tract. We do not know if overexpression of chemokines
may contribute to limit the severity of the disease in our study. For IAV both CCL3
and CCL4 contribute to promote recovery by inducing inflammatory responses (35),
probably by inducing the synthesis and release of other pro-inflammatory cytokines
such as interleukin 1 (IL-1), IL-6 and TNF-α from fibroblasts and macrophages
(36,37) and/or by skewing a Th1 protective response (38) when associated with its
201
receptor CCR5. We did not find IL-1 overexpression at either the mRNA or protein
levels in the lung suggesting a moderate proinflammatory response and/or limited
pathogenicity of IDV in the LRT, but IL-1α and IL-1β were induced by IDV in vitro. We
also observed an IL6 overexpression at the transcription but not at the protein level,
the protein
level. These differences may be due to technical sensitivity or timing of sample
collection but overall it suggests that an inflammatory response occur which might
also contribute to limit the Th1 response. In addition, our results suggest a mixed
the two calves which showed a proliferative lymphocytic response. Unfortunately, we
were not technically able to detect IL4, IL5 or IL-12 mRNA transcripts in the BALs to
more precisely define the cell specific response. The systemic and the local cell
response has to be investigated more precisely to define clearly.
Finally, the aerosol transmission of IDV was also examined in this study. The
airborne transmission of IAV was extensively studied and it is now acknowledged that
in certain conditions of temperature, humidity, and strains, particles of IAV could be
transmitted by respiratory droplets at least over short distances (39). Our study
demonstrated that the efficient transmission of IDV infection via aerosol to a
seronegative calf can occur under experimental conditions and that IDV is an
airborne transmitted pathogen. The first contact calf began to shed the virus at D11
actively. Considering an incubation period of 2 to 4 days, this calf may have been
infected between D7 and D9, when IDV excretion in the infected group remained
high. For the two other contact calves we can estimate the infection period between
202
D15 and D19, at the period of highest excretion of the first contact calf. We can
consequently hypothesize that the first contact calf was infected by airborne
transmission from the infected group and that this calf contaminated the two other
ones by close contact. The aerosol transmission also correlates with progressive
detection of the virus in air samples from D3 to D13 firstly in the infected zone then in
the intermediate and contact areas. The relative quantities of IDV RNA in aerosols
are relatively low (5 logs by m3) but well in the range of the observed IAV RNA
copies detected in swine barns (1.2 x106 RNA copies/m3 ((40); 3 x105 copies/m3
(41)). To date we do not know the minimum infectious dose for IDV in cattle. Since
IDV RNA was found in the LRT of all the three contact calves at D22, we can
hypothesize an effective and probably high rate of IDV transmission between calves
by natural transmission as also suggested by our epidemiological data. The capacity
of IDV to be airborne transmitted, at least over short distances, and the high efficacy
of transmission must also be considered in regards to the very high thermal and acid
stability of the virus by comparison with IAV, IBV or ICV (42) and potential high
resistance of the virus outdoors. Further studies will be useful in order to explain the
physical and chemical conditions and the strain related differences on the
aerosolization and transmission of IDV infection.
Taken together this study suggests that IDV is a respiratory virus with moderate
pathogenicity but probably a high level of transmission. The role of IDV in BRD as a
predisposing or cofactor with other virus and/or bacteria of cattle still need to be fully
assessed in experimental conditions.
203
MATERIALS AND METHODS
Cells and virus
The influenza D strain D/bovine/France/5920/2014 was isolated from a lung fragment
of a calf dead from BRD in 2014 in France (16). Lung extract was propagated on
Human Rectal Tumor-18G (ATCC CRL-11663) cells for five days in presence of
TPCK trypsin (1µg/ml, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) in opti-MEM
Reduced Serum Media (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)
supplemented with penicillin (500 µg/ml) streptomycin (500 Units/ml) (Life
technologies, Carlsbad, California, USA) , ciprofloxacin (10 µg/ml, Sigma-Aldrich,
USA), amphotericin B (2.5 µg/ml, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) and BM-cyclin (15
µg/ml, Sigma-Aldrich, Missouri, USA). For the second, third and fourth passages, the
supernatant was propagated on swine testis (ST) cells for five days in presence of
OPTIMEM medium supplemented with the same products and the progeny
supernatant was filtered. The virus solution was verified free from other major
respiratory pathogens by qPCR using the LSI VetMAX Screening pack – Ruminant
Respiratory Pathogens real time PCR kit (Life technologies, Carlsbad, California,
USA), and titrated using tissue culture infectious dose (TCID50) as previously
described (26), using the Spearman-Kärber titration method.
Ethics statement
Animal experiment was performed in biosafety level 3 facilities at the Research
Platform for Infectious Disease (PFIE, National Institute for Agronomic Research
(INRA), Nouzilly, France) in accordance with accepted human standards of animal
204
care (European Community council 2010/63/EU) and under national ethical
agreement number APAFIS#6204-20 1 60725 14353285 v5 (French Ministry of
Agriculture, Ethics Committee N°019).
Calves and experimental design
Fourteen Normand and Holstein calves, born in a bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and
bovine viral diarrhea virus (BVDV) free experimental station of INRA, were colostrum
deprived (43) and transferred to PFIE between 3 to 7 days of age. The calves were
then fed with commercial milk and reared for 2-6 weeks of age before the inoculation.
To reach the number of animals necessary for the statistical significance of some of
the tests, two additional calves with maternal antibodies against IDV were added in
the control group. Before challenge all calves tested negative for IDV, BRSV, BCoV,
BPI3, M.bovis, H.somni, P.multocida, and M. haemolytica pathogens (LSI VetMAX
Screening pack qPCR – Ruminant Respiratory Pathogens, Life technologies,
Carlsbad, California, USA). Absence of BVDV was confirmed by negative detection
of the NS3 antigen (Serelisa BVDV-BD, Synbiotics, Lyon, France). In addition, the 14
colostrum-deprived calves also tested negative for anti-IDV antibodies using HI
assay.
Two separated pens were used: five mock infected calves (control group, 3 deprived
and 2 IDV antibodies calves) were placed in the first whereas eleven colostrum-
deprived calves, eight of which to be inoculated, were placed in the second pen. In
the latter pen, calves were divided into two groups separated by steel panels, 3
meters apart. Eight calves were inoculated (inoculated group) while the three others
(contact group) were not, in order to evaluate the aerosol transmission of IDV. The
205
two groups did not share any equipment, food, water, space, or fomite. The rule
consisted in manipulating the three indirect-contact calves first, and then personal
protective equipment was completely changed before manipulating infected calves.
The five calves were infected at day 0 (D0) with 107 TCID50 (10ml in Opti-MEM™) of
D/bovine/France/5920/2014 by aerosol inhalation using a compressor connected to a
mask covering the nostrils and mouth as previously described (29). Calves of the
control group received ST cells supernatant (10 ml in Opti-MEM™). The contact
calves were not inoculated.
Clinical examination
Calves were examined by the same investigator twice a day from 3 days before
infection (D-3) to D22 for body temperature, nasal discharge, coughing, decreased
appetite, general state, abnormal breathing, respiratory rate and abnormal lung
sounds. Clinical scores were assessed for each calf as already described (43). Briefly
scores were assessed as follows: scores for rectal temperatures (T) were 0 (T <
39°C), 1 (39,1°C < T < 40°C), 2 (40,1°C< T < 41°C) or 3 (T > 41°C); scores for
respiratory rates (RR/min) were 0 (RR < 30), 1 (31 < RR < 40), 2 (41 < RR < 60), 3
(61 < RR < 80) or 4 (RR > 80); a score between 0 (normal), 1 (mild) and 2 (severe)
was attributed for nasal discharge, coughing, and the general state respectively while
dyspnea (absent, weak, moderate, high) and appetite (drop in milk consumption of
0%, <30%, 30-60%, or > 60%) were scored from 0 to 3. Daily individual accumulated
scores were calculated for each calf by adding the score of every parameter. In
addition, mean accumulated clinical scores (ACS) were calculated for each group as
the mean of the individual area under daily clinical scores using the trapezoid
206
method.
Gross lesions, histopathology and immunohistochemistry
Euthanasia and necropsy were carried out at D8 for 3 infected calves and at D22 for
the remaining 13 calves. Euthanasia was achieved by intravenous injection of 25 mL
of pentobarbital sodium injection (Dolethal, Vetoquinol, France; 182.2 mg of
pentobarbital per kg) before complete exsanguination. Extracted lungs were
photographed and examined for gross lesions then lavaged with saline isotonic fluid.
Tissue samples were then collected for histopathology and virology, including cranial
right and left, intermediate, caudal right and left lobes of the lungs, the nasal and
tracheal mucosa, tonsils, lymph nodes (mediastinal, tracheobronchial and
mesenteric), kidney, spleen, liver and intestine (duodenum, jejunum and colon).
Every tissue and organ was divided in three parts, one in 10% buffered formalin for
histology and immunohistology, one stored at -80°C for RNA isolation and
subsequent RTqPCR and a third part in RNA Later (Qiagen, Hilden, Germany) for
eventual later use.
For histopathology, fixed tissue samples were paraffin wax-embedded, sectioned at
3-5 µm and stained with hemalun and eosin. A pathologist described and scored the
severity of microscopic lesions in slides of the lungs and respiratory lymph nodes as
either light (3 or less small lesion foci in one section), moderate (> 3 small lesion foci
per section), or marked (diffuse lesions in the section).
To confirm the presence of the IDV in the respiratory tract tissues,
immunohistochemical staining was performed on paraffin-embedded sections of
207
lungs with a polyclonal rabbit anti influenza D virus antibody obtained by multiple
immunizations of rabbits. Slides were retrieved in Pronase Antigen Retrieval Solution
(Dako, USA) at 0.05% and left 10 minutes at 37°C. They were then incubated with
the rabbit antiserum at 1/100 dilution overnight at 4°C. The staining was revealed
with a polymer conjugated with horseradish peroxidase HRP (polymer-HRP dual
envision, Dako, USA) and the diaminobenzidine chromagen of the HRP (Diagomics,
France). A rabbit normal serum was used as negative control.
Samples collection
Nasal swabs (both nostrils) were taken daily from D0 to D22, collected in 1mL of PBS
and directly stored at -80°C. Bronchoalveolar lavages (BALs) were performed for 5
control calves and 5 inoculated calves at D-1, D2, D7, D14, and D22 by endoscopy
(Olympus, CF-EL, Shinjuku, Tokyo, Japan) under general anesthesia (10 mg/kg
ketamine and 10 mg/kg diazepam) as already described (43). During the process,
airways abnormalities (inflammation, fibrinous content) were recorded. For each BAL,
a same volume of 100 mL of a sterile isotonic sodium chloride solution was injected
into the same location of the right lobe. BALs after euthanasia (D22 and D8 for the 3
other inoculated calves) were performed by direct extraction and lavages of the lungs
with 250 ml of sterile isotonic saline solution as previously described (44). In one hour
after collection, crude BAL, BAL supernatant and cells (obtained after centrifugation
of 15 mL of BAL, 2500 rpm, 15 minutes) were aliquoted and stored at -80°C.
Air sampling was carried out at D1, D2, D4, D6, D8, D10, D12, D14, D16 and D18
post-infection in the same locations every time; starting in the center of the contact
calf area, then the center of the separating space and finally the center of the
208
infected calf area. Air samples were collected using the Coriolis MICRO (Bertin
Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France) air sampler according to the
manufacturers’ procedures. The collector was placed at 1m above ground, and after
every collection, the collector was thoroughly rinsed and disinfected. Briefly, 10 ml of
PBS supplemented with 0.01% of Tween 20 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) were
added to the collector reservoir, the Coriolis collector was run for 15 minutes during
which 4.5m3 of ambient air was captured and mixed in the PBS-Tween solution.
Immediately after collection, aliquots of 140µL were stored at -80°C for further RNA
extraction and IDV genome detection by RT-qPCR.
209
Virus quantification
IDV detection and quantification was performed by RT-qPCR in nasal swabs, BALs
and air samples. Viral RNA was extracted from 200µl of liquid samples using the
extraction kit QIAamp cador Pathogen (Qiagen, Hilden, Germany) on the Qiagen
Qiacube automated (Qiagen, Hilden, Germany) platform. Tissues where extracted
manually using Qiagen QiaAmp (Qiagen, Hilden, Germany) and Macherey Nagel
RNA blood (Macherey Nagel, Dϋren, Germany) respectively.
IDV genome was analyzed by an RTqPCR targeting a 135 bp fragment of
Polymerase Basic 1 (PB1) segment gene as previously published (12) in the
LightCycler 96 Real-Time PCR System (Roche, Basel, Switzerland) using the
QuantiNova Probe PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany). In order to quantify the IDV
genome in samples, blunt-ended PCR product of D/bovine/5920/2014 was inserted
in the plasmid pSC-amp/kan of the StrataClone blunt PCR cloning kit (Agilent, Santa
Clara, California, USA). Amplified plasmids were linearized with EcoRV restriction
enzyme before in vitro transcription according to the instructions of the MEGAscript
kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Purified RNA was then
quantitated by UV light absorbance (A260) using CLARIOstar reader (BMG Labtech,
Ortenberg, Germany) stored at -80°C and used to make a standard curve for PB1
gene quantification. IDV loads in NS and BALS were expressed as the daily mean. In
addition, individual accumulated viral sheddings (AVS) in nasal secretions were
calculated for each calf as the area under IDV titres using the trapezoid method.
Host humoral response
210
Antibody response was first tested by HI at D0, D3, D6, D10, D15 and D22 as
described previously (45), the sera were all treated with Receptor Destroying Enzyme
(RDE) (Denka Seiken, Japan) and hemadsorbed on packed horse red blood cells
(RBC). Four hemagglutination units of D/bovine/France/5920/2014 and 1% horse
RBC were used for HI assays. The IDV antibody response was also assessed by two
ELISAs for detection of IDV IgG1 and IgG2 at D0, D10 and D22. For antigen
preparation, the IDV strain D/bovine/France/5920/2014 was propagated on swine
testis fibroblasts (ATCC® CRL-1746™). Infected and uninfected cells were frozen on
day 4 post inoculation, then thawed and pelleted by centrifugation at 1000 g and
21°C for 10 min. The cell pellets were re-suspended in H2O containing 0.5% Triton-X
(Sigma), and centrifuged as above and the supernatants were used as ELISA
antigen and control antigen, respectively. For analysis of IDV-specific IgG1 and IgG2
antibodies, 96-well ELISA plates (PolySorp®, Nunc™, Denmark) were coated during
18 hours at 4°C with IDV-antigen or control antigen in 0,05M sodiumcarbonate-
bicarbonate buffer, pH 9.6. The wells were thereafter blocked for 1h at 25°C with
0.05% PBS-Tween, prior to addition of i) 1:50 diluted serain 0.05% PBS-Tween, ii)
monoclonal mouse anti-bovine IgG1 antibodies (MCA627 BioRaD, clone K37 2G6) or
mouse anti-bovine IgG2 antibodies (MCA626 BioRaD, clone K192 4F10), iii)
monoclonal rat anti-mouse IgG1 antibodies conjugated with HRP (MCA336P
BioRaD, clone LO-MG1-2), iv) TMB substrate and v) H2O2. Samples and antibodies
were incubated for 1 h at 37°C prior to three washes with 0.05% PBS-tween solution.
Corrected OD (COD) values were calculated by subtracting absorbance values at
450 nm of wells containing control antigen from wells containing IDV antigen. Data
were expressed as percentage of the COD of positive control sera.
211
Host cell-mediated immune response
The cell mediated immune response was tested by IDV-specific lymphocyte
proliferation assays. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained
through centrifugation of heparinized blood diluted 1:1 in PBS, at 1100 x g and 21°C
for 45 min, over Ficoll-Paque PLUS (density 1.077 g/mL, GE Healthcare). The cells
were washed three times with PBS and by centrifugation (once at 500 x g and 21°C
for 10 min, and twice at 200 x g and 21°C for 10 min) and were frozen at -80°C until
analysis. Cells from five IDV-infected calves, collected on the day before challenge
(D-1) and D22, were thawed and immediately stimulated ex vivo, in triplicate, as
previously described [1], with either a) heat-inactivated IDV-infected or uninfected cell
lysate, or b) unheated IDV-infected or uninfected cell lysate. The strain
D/bovine/France/5920/2014 propagated in swine testis fibroblasts were used for this
purpose. After six days of incubation at 37°C, Alamar Blue® reagent (Invitrogen,
Sweden) was added according to the manufacturers’ instructions. Absorbance was
measured by spectrophotometry at 570 nm and 595 nm after another 24 hours of
incubation at 37°C. Corrected OD values were calculated between IDV- and control
antigen-stimulated PBMCs, as described previously (29).
Transcriptomic analyses in BALs
BALs at D-1, D2, D7 and D10 were analyzed for calf transcriptomic response of 46
bovine genes involved in the inflammatory response and innate immune response
using the high-throughput microfluidic qPCR platform BioMark (Fluidigm, California,
United States) technology. Briefly cDNAs were generated from 300 ng of clean total
RNA using random hexamer primers and the Revertaid reverse transcriptase
212
(ThermoFisher). Primer pairs were designed using Primer3 software based on the
relevant bovine mRNA sequences and synthesized commercially (Eurogentec). They
were previously validated for RT-qPCR (Roche, LightCycler480) system using
negative and positive samples. Two genes encoding IL4, IL5 do not pass the
validation and were ruled off. Genes and primers are listed in Supplementary data 3.
Pre amplification of cDNA was carried out with a pool of forward and reverse primers
(0.2µM) on an ABI thermocycler with an initial step of activation (95°C for 10 min)
followed by 14 cycles of two steps (95°C for 15 s and 60°C for 4 min).
Preamplification products were then treated with Exonuclease I (40 UI) and diluted 5
times in low EDTA TE. Standards were prepared by sequential two-fold dilutions of a
pool of all samples (2µl from each). qPCR of preamplification products were then run
on the BioMark qPCR with a cycling program as follows: 50°C for 2 min for
amplification phase and 10 min at 95°C for activation of the hot-start enzyme,
followed by 35 cycles of denaturation at 95°C for 15 s, annealing at 60°C for 1 min,
and elongation at 72°C for 20 s. Melting curve analysis was performed after
completion of the qPCR collecting fluorescence intensities between 60 and 95°C.
Once the quality test passed, the data of the run were exported to the Biogazelle
qBase+ software (refernces). Relative expressions at each day were done by ΔΔCT
analysis after normalization (GeNorm analysis) on the two most stable bovine
housekeeping genes (hprt and ywha7) on a list of 6 genes previously mentioned in
the literature (gapdh, hprt, rpl19, rpl26, sdha and ywha7 genes).
Protein quantification in BALs and PBMC supernatant using bioluminoassay
Protein extraction on cell extracts of BALs was done after washing twice with ice-cold
213
PBS. Just before use, cell pellet was resuspended for 15 min on ice in NP40 Cell
Lysis Buffer (ThermoFisher Cat. No. FNN0021) containing 1 mM PMSF (stock 0.3 M
in DMSO) and protease inhibitor cocktail (Sigma, Cat. No. P-2714). The lysate was
centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at 2–8°C, and stored at -20°C after total protein
concentration determination. Protein extraction on (24 hours) stimulated lymphocyte
supernatants was done after cell centrifugation at 14,000 rpm for 10 min at 4°C to
remove any cells or cellular debris. Clarified medium was aliquoted and stored at –
80°C for analysis. Just before analysis, thawed samples were clarified by centrifuging
at 14,000 rpm for 10 min at 4°C in a refrigerated microcentrifuge to prevent clogging
of the Luminex™ probe and/or filter plate. Protein quantification was done by
Luminex technology using the Millipex® MAX Magnetic Bead Panel coupled with
Luminex xMAP® platform (SPRCUS706, EMD Millipore, Burlington, Massachusetts)
according to the manufacturer’s instructions. Fifteen bovine proteins were quantified :
IL-1α, IL1β, IL-1RA, IL-6, IL-4, IL-17a, IL-2, IFNγ, IL-8, IP-10, IL-10, CCL2, CCL3,
CCL4 and TNFα. Mean fluorescence or protein concentration (according to a
reference range for each target) were analyzed as described in statistics section.
Statistical analysis
Statistical analyses for clinical and virological examinations were performed using
GraphPad (La Jolla, USA). Logarithmic transformation was applied to fulfill the
conditions of variances in homogeneity and normality when necessary (qPCR data).
Data were expressed as arithmetic mean ± standard error of the mean (SEM). A two-
way ANOVA with repeated measures (three-factor splitplot anova) was used to
analyze the clinical and qPCR results. When effects of the “day” and “treatment”
214
factors were significant among interactions, a Bonferroni test between contrasts was
used to compare the treatments on each day post challenge. P values were indicated
in the text, levels of significance are indicated on the graphs with stars: * p<0.05, **
p<0.01, *** p<0.001. A one-way ANOVA was used to compare the AVS and ACS.
When the effect of the “treatment” factor was significant, a Newman-Keuls test was
used to compare the treatment effects at each time point. A T-test (Mann-Whitney
test) was also run for these parameters.
Statistical analysis of Fluidigm transcriptomic results was carried out on the log
transformed calibrated normalized relative quantities (CNRQ) values of mRNA
expression by comparing the slopes from D0 to Dx between infected and control
calves. We used a linear mixed model with random effect for group, considering
interactions between time and status (infected or control) and fit by maximum
likelihood t-tests use Satterthwaite approximations to degrees of freedom (Formula: Y
~ Status * Time + (1 | Calves)). This model takes into account the heterogeneity of
cytokine RNA data at D0, when calves were not infected, and the different predictions
of evolution between infected and control groups when interaction (ANOVA type III) is
significant. The cytokine and proliferation data from in vitro PBMC stimulations were
analysed by using two-sided paired T tests in Minitab 18 statistical software.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank Gilles Foucras and Didier Raboisson for their
valuable scientific support, Angelique Teillaud and Cecile Caubet for precious
215
technical assistance, Olivier Boulesteix and Edouard Guitton for their work in the
animal facility. This work was funded by the French National Agency for Research
(ANR), project ‘FLUD’. E. Salem is supported by a PhD scholarship from the
Lebanese University.
SLU authors would like to thank the Cells for Life Platform, partly funded by the
Infrastructure Committee at SLU, Sweden, for providing facilities and equipment, and
the staff at the Clinical Science laboratory at SLU for their technical support.
REFERENCES
1. DeDonder KD, Apley MD. A literature review of antimicrobial resistance in Pathogens associated with bovine respiratory disease. Anim Heal Res Rev. 2015;16(2):1–10.
2. Grissett GP, White BJ, Larson RL. Structured Literature Review of Responses of Cattle to Viral and Bacterial Pathogens Causing Bovine Respiratory Disease Complex. J Vet Intern Med [Internet]. 2015;29(3):770–80. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25929158
3. Caswell JL. Failure of respiratory defenses in the pathogenesis of bacterial pneumonia of cattle. Vet Pathol [Internet]. 2014;51(2):393–409. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24021557
4. Hilton WM. BRD in 2014: where have we been, where are we now, and where do we want to go? Anim Health Res Rev [Internet]. 2014;15(2):120–2. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25358813
5. Risalde MA, Molina V, Sánchez-Cordón PJ, Romero-Palomo F, Pedrera M, Garfia B, et al. Pathogenic mechanisms implicated in the intravascular coagulation in the lungs of BVDV-infected calves challenged with BHV-1. Vet Res. 2013;44(1):1–13.
6. Valarcher J-F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res [Internet]. 2007;38(2):153–80. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17257568
7. Cortjens B, de Boer OJ, de Jong R, Antonis AF, Sabogal Piñeros YS, Lutter R,
216
et al. Neutrophil extracellular traps cause airway obstruction during respiratory syncytial virus disease. J Pathol [Internet]. 2016 Feb [cited 2018 Oct 1];238(3):401–11. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/path.4660
8. Boukahil I, Czuprynski CJ. Mannheimia haemolytica biofilm formation on bovine respiratory epithelial cells. Vet Microbiol [Internet]. 2016;197:129–36. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2016.11.012
9. Elswaifi SF, Scarratt WK, Inzana TJ. The role of lipooligosaccharide phosphorylcholine in colonization and pathogenesis of Histophilus somni in cattle. Vet Res. 2012;43(1).
10. Sandal I, Shao JQ, Annadata S, Apicella MA, Boye M, Jensen TK, et al. Histophilus somni biofilm formation in cardiopulmonary tissue of the bovine host following respiratory challenge. Microbes Infect [Internet]. 2009;11(2):254–63. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.micinf.2008.11.011
11. Zecchinon L, Fett T, Desmecht D. How Mannheimia haemolytica defeats host defence through a kiss of death mechanism. Vol. 36, Veterinary Research. 2005. p. 133–56.
12. Hause BM, Ducatez M, Collin EA, Ran Z, Liu R, Sheng Z, et al. Isolation of a Novel Swine Influenza Virus from Oklahoma in 2011 Which Is Distantly Related to Human Influenza C Viruses. Fouchier RAM, editor. PLoS Pathog [Internet]. 2013 Feb 7 [cited 2018 Mar 13];9(2):e1003176. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23408893
13. Hause BM, Collin EA, Liu R, Huang B, Sheng Z, Lu W, et al. Characterization of a novel influenza virus in cattle and swine: Proposal for a new genus in the Orthomyxoviridae family. MBio. 2014;5(2):1–10.
14. Collin E a., Sheng Z, Lang Y, Ma W, Hause BM, Li F. Cocirculation of Two Distinct Genetic and Antigenic Lineages of Proposed Influenza D Virus in Cattle. J Virol [Internet]. 2015;89(2):1036–42. Available from: http://jvi.asm.org/lookup/doi/10.1128/JVI.02718-14
15. Chiapponi C, Faccini S, De Mattia A, Baioni L, Barbieri I, Rosignoli C, et al. Detection of Influenza D Virus among Swine and Cattle, Italy. Emerg Infect Dis [Internet]. 2016;22(2):352–4. Available from: http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/22/2/15-1439_article.htm
16. Ducatez MF, Pelletier C, Meyer G. Influenza D Virus in Cattle , France , 2011 – 2014. EID J. 2015;21(2):2011–4.
217
17. Ferguson L, Eckard L, Epperson WB, Long LP, Smith D, Huston C, et al. Influenza D virus infection in Mississippi beef cattle. Virology [Internet]. 2015;486:28–34. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2015.08.030
18. Foni E, Chiapponi C, Baioni L, Zanni I, Merenda M, Rosignoli C, et al. Influenza D in Italy : towards a better understanding of an emerging viral infection in swine. Sci Rep [Internet]. 2017;7(May):1–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41598-017-12012-3
19. Horimoto T, Hiono T, Mekata H, Odagiri T, Lei Z, Kobayashi T, et al. Nationwide distribution of bovine influenza D virus infection in Japan. PLoS One. 2016;11(9):1–7.
20. Jiang W-M, Wang S-C, Peng C, Yu J-M, Zhuang Q-Y, Hou G-Y, et al. Identification of a potential novel type of influenza virus in Bovine in China. Virus Genes [Internet]. 2014;49(3):493–6. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s11262-014-1107-3
21. Murakami S, Endoh M, Kobayashi T, Takenaka-Uema A, Chambers JK., Uchida K, et al. Influenza D virus infection in herd of cattle, Japan. Emerg Infect Dis [Internet]. 2016;22(8):2015–7. Available from: http://dx.doi.org/10.3201/eid2208.160362
22. Luo J, Ferguson L, Smith DR, Woolums AR, Epperson WB, Wan X-F. Serological evidence for high prevalence of Influenza D Viruses in Cattle, Nebraska, United States, 2003–2004. Virology [Internet]. 2017;501(October 2016):88–91. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0042682216303464
23. Quast M, Sreenivasan C, Sexton G, Nedland H, Singrey A, Fawcett L, et al. Serological evidence for the presence of influenza D virus in small ruminants. Vet Microbiol [Internet]. 2015;180(3–4):281–5. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.09.005
24. Mitra N, Cernicchiaro N, Torres S, Li F, Hause BM. Metagenomic characterization of the virome associated with bovine respiratory disease in feedlot cattle identified novel viruses and suggests an etiologic role for influenza D virus. J Gen Virol [Internet]. 2016 Aug 1 [cited 2016 Sep 20];97(8):1771–84. Available from: http://jgv.microbiologyresearch.org/content/view.action?itemId=http%253A%252F%252Fsgm.metastore.ingenta.com%252Fcontent%252Fjournal%252Fjgv%252F10.1099%252Fjgv.0.000492&view=&itemType=http%253A%252F%252Fpub2web.metastore.ingenta.com%252Fns%252FArticle
218
25. Hause BM, Huntimer L, Falkenberg S, Henningson J, Lechtenberg K, Halbur T. An inactivated influenza D virus vaccine partially protects cattle from respiratory disease caused by homologous challenge. Vet Microbiol [Internet]. 2017;199:47–53. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113516308239
26. Ferguson L, Olivier A, Genova S, Epperson WB, Smith D, Schneider L, et al. Pathogenesis of Influenza D viurs in Cattle. J Virol. 2016;90(12):5636–42.
27. Ng TFF, Kondov NO, Deng X, Van Eenennaam A, Neibergs HL, Delwart E. A Metagenomics and Case-Control Study To Identify Viruses Associated with Bovine Respiratory Disease. J Virol [Internet]. 2015 May 15 [cited 2018 Apr 5];89(10):5340–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25740998
28. Sreenivasan C, Thomas M, Sheng Z, Hause BM, Collin EA, Knudsen DEB, et al. Replication and Transmission of the Novel Bovine Influenza D Virus in a Guinea Pig Model. J Virol [Internet]. 2015;89(23):11990–2001. Available from: http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-84949642312&partnerID=tZOtx3y1
29. Blodörn K, Hägglund S, Gavier-Widen D, Eléouët J-F, Riffault S, Pringle J, et al. A bovine respiratory syncytial virus model with high clinical expression in calves with specific passive immunity. BMC Vet Res [Internet]. 2015;11(1):76. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4377052&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
30. Murray GM, O’Neill RG, More SJ, McElroy MC, Earley B, Cassidy JP. Evolving views on bovine respiratory disease: An appraisal of selected key pathogens – Part 1 [Internet]. Vol. 217, Veterinary Journal. W.B. Saunders; 2016 [cited 2018 Sep 20]. p. 95–102. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023316301605?via%3Dihub
31. García-Sastre A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Res [Internet]. 2011 Dec [cited 2018 Jul 24];162(1–2):12–8. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168170211004114
32. Hale BG, Randall RE, Ortin J, Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses [Internet]. Vol. 89, Journal of General Virology. Microbiology Society; 2008 [cited 2018 Aug 1]. p. 2359–76. Available from:
219
http://jgv.microbiologyresearch.org/content/journal/jgv/10.1099/vir.0.2008/004606-0
33. Jones E, Price DA, Dahm-Vicker M, Cerundolo V, Klenerman P, Gallimore A. The influence of macrophage inflammatory protein-1α on protective immunity mediated by antiviral cytotoxic T cells. Immunology [Internet]. 2003 May 1 [cited 2018 Aug 1];109(1):68–75. Available from: http://doi.wiley.com/10.1046/j.1365-2567.2003.01636.x
34. Ostermann G, Weber KSC, Zernecke A, Schröder A, Weber C. JAM-1 is a ligand of the β2 integrin LFA-1 involved in transendothelial migration of leukocytes. Nat Immunol [Internet]. 2002 Feb 14 [cited 2018 Aug 1];3(2):151–8. Available from: http://www.nature.com/articles/ni755
35. Menten P, Wuyts A, Van Damme J. Macrophage inflammatory protein-1 [Internet]. Vol. 13, Cytokine and Growth Factor Reviews. Pergamon; 2002 [cited 2018 Aug 1]. p. 455–81. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S135961010200045X
36. Ramos I, Fernandez-Sesma A. Cell receptors for influenza A viruses and the innate immune response [Internet]. Vol. 3, Frontiers in Microbiology. Frontiers; 2012 [cited 2018 Aug 1]. p. 117. Available from: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2012.00117/abstract
37. Xu W, Chen M, Ge N, Xu J. Hemagglutinin from the H5N1 virus activates Janus kinase 3 to dysregulate innate immunity. Zheng SG, editor. PLoS One [Internet]. 2012 Feb 16 [cited 2018 Aug 1];7(2):e31721. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0031721
38. Andres PG, Beck PL, Mizoguchi E, Mizoguchi A, Bhan AK, Dawson T, et al. Mice with a Selective Deletion of the CC Chemokine Receptors 5 or 2 Are Protected from Dextran Sodium Sulfate-Mediated Colitis: Lack of CC Chemokine Receptor 5 Expression Results in a NK1.1+ Lymphocyte-Associated Th2-Type Immune Response in the Intestine. J Immunol [Internet]. 2000 Jun 15 [cited 2018 Aug 1];164(12):6303–12. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10843684
39. Tellier R. Aerosol transmission of influenza A virus: a review of new studies. J R Soc Interface [Internet]. 2009;6 Suppl 6(Suppl 6):S783-90. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19773292%5Cnhttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC2843947
40. Neira V, Rabinowitz P, Rendahl A, Paccha B, Gibbs SG, Torremorell M. Characterization of Viral Load, Viability and Persistence of Influenza A Virus in
220
Air and on Surfaces of Swine Production Facilities. Meng X-J, editor. PLoS One [Internet]. 2016 Jan 12 [cited 2018 Aug 1];11(1):e0146616. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0146616
41. Corzo CA, Culhane M, Dee S, Morrison RB, Torremorell M. Airborne Detection and Quantification of Swine Influenza A Virus in Air Samples Collected Inside, Outside and Downwind from Swine Barns. Kimman T, editor. PLoS One [Internet]. 2013 Aug 8 [cited 2018 Aug 1];8(8):e71444. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0071444
42. Yu J, Hika B, Liu R, Sheng Z, Hause BM, Li F, et al. The Hemagglutinin-Esterase Fusion Glycoprotein Is a Primary Determinant of the Exceptional Thermal and Acid Stability of Influenza D Virus. mSphere [Internet]. 2017 [cited 2018 Jun 21];2(4):1–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28808690
43. Lhermie G, Ferran AA, Assié S, Cassard H, El Garch F, Schneider M, et al. Impact of Timing and Dosage of a Fluoroquinolone Treatment on the Microbiological, Pathological, and Clinical Outcomes of Calves Challenged with Mannheimia haemolytica. Front Microbiol [Internet]. 2016;7(March):1–13. Available from: http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fmicb.2016.00237/abstract
44. Riffault S, Meyer G, Deplanche M, Dubuquoy C, Durand G, Soulestin M, et al. A new subunit vaccine based on nucleoprotein nanoparticles confers partial clinical and virological protection in calves against bovine respiratory syncytial virus. Vaccine. 2010;28(21):3722–34.
45. Salem E, Cook EAJ, Lbacha HA, Oliva J, Awoume F, Aplogan GL, et al. Serologic evidence for influenza c and d virus among ruminants and Camelids, Africa, 1991-2015. Emerg Infect Dis. 2017;23(9):1556–9.
221
FIG 1 A) Experiment Timeline and sampling. B) Fourteen naive calves were allocated in two separated pens, one with five mock infected calves (control group) and the second with eleven calves. In the latter pen, calves were divided into two groups separated by steel panels, 3 meters apart. Eight calves (infected group) were inoculated at day 0 (D0) with 107 TCID50 of IDV 5920 while the three others (contact group) were not, in order to evaluate the aerosol transmission of IDV..
FIG 2 Mean clinical scores (A) and mean accumulated clinical scores (B) between calves infected by IDV (in blue) or not infected without (in orange) or with contact (green) with infected calves. * = p<0.05;**= p<0.01, *** = p<0.001.
FIG 3 IDV RNA loads in nasal secretions (A) and BALs (B) in infected calves (blue), control (orange) and contact (green) calves. IDV was also detected in air samples (C) collected over the course of the experiment. -: negative
FIG 4 Immunostaining of left cranial lobe (A) of calf N°7165 infected with IDV showing cytoplasmic and nuclear labelling of the bronchiolar epithelium by the anti-IDV polyclonal antibody. (B) Negative control of the same slide with the substitution of the IDV polyclonal serum by a rabbit normal serum; magnification x200. FIG 5 (A) Antibody response in calves infected (blue) or not (orange) with IDV assessed by IHA and B) Specific ELISAs for IDV IgG1 (blue) or IgG2 (green) responses in infected calves. The line in B) represent the positive threshold. FIG 6 IDV-specific lymphocyte proliferative response on PBMC of infected calves, at D0 and D22 and stimulated ex-vivo with either A) heat-inactivated influenza D-infected or uninfected cell lysate, or B) untreated influenza D-infected or uninfected cell lysate. After six days of incubation, proliferative response was determined by corrected optical density (COD) of Alamar Blue® (Invitrogen, Sweden). Results are expressed as the mean COD of triplicate samples, with standard deviations indicated by upward deflecting lines.
222
FIG.1
FIG. 2
223
FIG 3
FIG 4 Immunostaining of left cranial lobe of calf N°7165 infected with IDV showing cytoplasmic and nuclear labelling of the bronchiolar epithelium by the anti-IDV polyclonal antibody (on the left). Negative control of the same slide with the substitution of the IDV polyclonal serum by a rabbit normal serum (on the right); magnification x200.
224
FIG 5
FIG 6
-1 2 2 -1 2 2 -1 2 2 -1 2 2 -1 2 2
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
CO
D
7 1 4 2
7 1 4 7
7 1 6 1
7 1 6 5
7 1 8 0
A )
*
*
-1 2 2 -1 2 2 -1 2 2 -1 2 2 -1 2 2
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
D a y s p o s t c h a lle n g e
CO
D
B )
*
225
Table 1: IDV detection (Log10 RNA loads/30 mg of tissue) in post-mortem samples of the three infected calves euthanized at D8 and three contact calves euthanized at D22 as determined by RT-qPCR; Lca: left cranial lobe; Rca: right cranial lobe; Lcaud: left caudal lobe; Rcaud: right caudal lobe; Access: accessory lobe; NS: nasal mucosa; LNme: mediastinal lymph node; LNtrach: tracheal lymph node. -: negative
RNA copies (Log10) in 30mg of tissue
RESPIRATORY OTHER
Lca Rca Lcaud Rcaud Access NS Trachea LN medi LN trach Tonsils Olfactory
bulb
INFECTED D7
6531 4.2 4.5 - 3.9 4.2 - 3.8 4.6 4.2 - -
6533 4.7 5.6 - 5 - 4.2 - - 4.1 - -
7144 4 5.4 5 4.4 3.8 3.9 4.7 5 - -
CONTACT 7164 5.7 5.4 6.2 4.6 4.9 9.1 4.5 4.6 4.6 6 6
D22 7163 - - - - - - - - - - 3.8
7155 - - - - - 4.8 - - - - 3.8
226
Table 2: Chemokine- and cytokine mRNA expression (using RT-qPCR Fluidigm assay) in BALs between infected and control calves. Statistics were done by comparing the slopes of the curves for each day on day zero between infected and control calves using a linear mixed model with random effect for group and considering interactions between time and status. Statistical differences were indicated as follows *: p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.0005. The arrow represents the way of modification for infected calves compared to controls: ↑increase of mRNA expression; ↓ decrease of mRNA expression
mRNA in BALS D2 D7 D14 infected/
control mRNA in
BALS D2 D7 D14 infected/ control
CCL2 ** * ↑ STAT2CCL3 *** * ↑ SOCS1 *** * ↑CCL4 * * ↑ SOCS3 *** * ↑CCL8 IL1bCCR5 IL6 ** ** ↑CSF2 TNFaCSF3 * * ↑ TNFb
CX3CL1 * * ↑ NFkBCX3CR1 ** ** *** ↑ INFg * * ↑CXCL1 IL12aCCL11 * ↑ IL13 *** ** * ↑ITGAL ** ↓ IL1aRIG-1 *** *** ↑ IL2 ** ↑TLR2 * ↑ IL8TLR4 SPATLR3 ** ↑ PTGS1TLR7 ** ↑ PTGS2TLR9 ** * * ↑ TGFB1 * ↑NOD2 * * RPL19INFa RPL26IRF1 GAPDHIRF3 SDHIRF7 YWAH7ISG15 HPRT
house keeping genes
227
Table 3: Chemokine- and cytokine concentrations in BAL cells between infected calves and controls as determined by Luminex assay. A linear mixed model was used with random effect for group and considering interactions between time and status. Statistical differences were indicated as follows *: p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.0005. The arrow represents the way of modification for infected calves compared to controls: ↑increase of mRNA expression; ↓ decrease of mRNA expression
SUPPLEMENTARY DATA
S1 : CNRQ results of transcriptomic assays
S2: Concentrations of chemokines/cytokines in BAL
S3: List of primers used for the transcriptomic assays
Proteins in BALS D2 D7 D14 infected/
control
CCL2CCL3CCL4
CXCL10 * ↑INFgTNFa * * ↑IL10 * ↑IL4IL2 * * ↑IL17IL1AIL1BIL6IL8 * ↑
IL1-R * ↑
228
Résultats et discussion
On peut supposer que dans certaines conditions, liées aux facteurs
d’ambiance ou à l’hôte, l’IDV est capable d’induire une maladie avérée chez le
veau. Pour évaluer la pathogénicité de l’IDV, Ferguson et al. 2016 (215) ont
inoculé 3 veaux laitiers par voie intranasale. Un jour après l’inoculation, un veau
naïf a été mis en contact avec chaque veau inoculé. Les animaux inoculés et ceux
à leur contact ont tous séroconverti et le virus a été détecté dans leur tractus
respiratoire haut. Les animaux ont présenté des symptômes respiratoires frustes,
sans augmentation du rythme cardiaque et du rythme respiratoire et sans
élévation de la température rectale. L’IDV seul semble donc avoir un pouvoir
pathogène limité et se transmet entre animaux par contact rapproché.
La contamination horizontale rapide a aussi été montrée sur le terrain au
Japon sur un troupeau de bovin présentant des troubles respiratoires (210). 28
échantillons de sérum ont été alors prélevés et analysés et huit échantillons se
sont alors révélés positifs, avec des titres assez faibles en anticorps. Du fait que
certains bovins présentaient des symptômes respiratoires légers, les auteurs ont
prélevé à nouveau les 28 mêmes bovins un mois plus tard. Sur les 20 bovins qui
avaient des sérums négatifs lors des premiers sondages sérologiques, 19 se sont
révélés positifs lors de ce second test. Ces résultats montrent que l’IDV peut se
propager rapidement au sein d’un troupeau. Dans ce cas précis, il semble que la
plupart des animaux aient été infectés de façon subclinique par l’IDV.
229
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
230
Les bronchopneumonies infectieuses sont des affections
économiquement importantes des jeunes bovins avec des coûts financiers
considérables dus entre autres à la mortalité, aux traitements et aux retards de
croissance. Les facteurs déclenchant les BPI sont nombreux et comprennent les
agents infectieux, l’âge et la race des bovins atteints et l’ensemble des facteurs
d’élevage qui agissent en facilitant la transmission des agents pathogènes et en
augmentant la réceptivité et la sensibilité des animaux. Cette complexité se
retrouve au niveau des agents infectieux incriminés qui sont nombreux (virus et
bactéries), possèdent un pouvoir pathogène direct plus ou moins important et qui
peuvent agir seuls ou en association. Quoiqu’encore peu nombreuses, plusieurs
études ont été publiées pour comprendre les interactions entre pathogènes
respiratoires (100,112,113,115,336). Dans ce travail nous nous sommes
intéressés à deux autres questions scientifiques.
La première question portait sur l’existence de virus respiratoires
nouveaux et leurs rôles dans les BPI. Les méthodes nouvelles pour la détection
des virus ont en effet permis de mettre en évidence des virus respiratoires
préalablement inconnus comme l’influenza D (190) et le nidovirus bovin (178) ou
des virus connus dont le rôle dans la pathologie respiratoire reste mal compris
comme les virus de la rhinite bovine A et B. En partant du fait que les données
diagnostiques suggèrent l’existence de pathogènes encore non identifiés, nous
avons poursuivi ce type d’étude dans des élevages naisseurs français soit par une
approche NGS sans à priori en identifiant le virome respiratoire des veaux atteints
de BPI, soit par une approche classique plus ciblée quand le virus émergent était
déjà identifié, comme ce fut le cas de l’IDV.
La deuxième question portait sur le fait que nous savons maintenant qu'il
existe un écosystème abondant et diversifié dans les voies respiratoires
superficielles et profondes. Cette connaissance a fait l’objet de plusieurs études et
revues, principalement chez les enfants et les patients immunodéprimés, sur les
interactions possibles entre agents pathogènes et microbiome respiratoire
(93,94,251,337–340). Plus récemment des données ont été publiées sur la
dynamique du microbiome respiratoire bovin dans les systèmes d’engraissement
américains et canadiens (102,294,295,297–300,334,341,342). Dans ce travail notre
231
second objectif était de caractériser le bactériote résident dans les voies respiratoires
des veaux atteints ou pas de BPI et d’identifier les interactions potentielles entre
communautés bactériennes résidentes et agents pathogènes respiratoires.
Identification et caractérisation de nouveaux virus respiratoires
Concernant le premier point, l’approche virome respiratoire nous a permis de
détecter un nombre conséquent de genres viraux dans les prélèvements de LBA et
d’EN (Annexe 1). Par rapport aux études déjà publiées par Ng et al. (2015) et Mitra
et al. (2016) aux USA sur des veaux en feedlots, nos prélèvements sont cependant
moins riches en termes de diversités de familles et genres viraux identifiés. Ces
différences peuvent être liées à l’origine des prélèvements. Les nôtres étaient
réalisés dans des élevages naisseurs sans échange particulier d’animaux et sur une
zone géographique restreinte et différente, contrairement aux études américaines où
les élevages étaient repartis entre le Kansas, le Mexique et la Californie. Par ailleurs,
le feedlot peut présenter un modèle très dynamique pour les maladies infectieuses
vu le grand nombre de bovins confinés dans un espace relativement petit et
d’animaux provenant d’origines très différentes. Ce « dynamisme » n’existe pas dans
les élevages naisseurs que nous avons testé. Des raisons techniques peuvent aussi
être envisagées. Bien que la même stratégie ait été utilisée dans les trois études, les
modes opératoires étaient différents ainsi que le choix des réactifs, des amorces, des
kits d’isolements et les plateformes NGS (Illumina Miseq dans l’étude de Mitra et al.
(180) versus Illumina Hiseq dans l’étude de Ng et al. (76) et la nôtre).
Les études NGS ont comme inconvénient de n’explorer qu’une situation à un
temps donné sur un nombre limité d’échantillons. Nos résultats reflètent la situation
dans les élevages naisseurs du Sud-Ouest mais n’est en rien représentative de ce
qui se passe dans l’ensemble des cheptels français. Ainsi, afin d’avoir une vision plus
exhaustive des virus circulants en France, un nombre supérieur d’élevages devrait
être envisagé dans les études futures. De plus, comme toute étude NGS, notre
travail a des limites. La première est de ne pas avoir testé des veaux sains en
parallèle, notamment si on veut corréler présence d’un virus et pouvoir pathogène
232
respiratoire. Nous avons fait le choix d’identifier dans un premier temps le virome
chez des animaux malades pour identifier des cibles principales en investiguant
l’appareil respiratoire profond, contrairement aux études américaines. Il est clair que
pour chaque cible identifiée, il faudra par la suite préciser son implication en
pathologie respiratoire, notamment en caractérisant sa fréquence chez des animaux
atteints ou pas de BPI. C’est le cas pour les BRAV et BRBV identifiés dans les
études américaines ou l’astrovirus bovin identifié dans notre étude. De même dans
l’étude de Mitra et al (180), trois espèces différentes de parvovirus ont été détectées
dont un (UBPV6) considéré comme potentiellement nouveau. Nous n’avons pas
trouvé d’UBPV6 dans nos prélèvements. Cette découverte particulièrement
intéressante doit inviter les auteurs à explorer méticuleusement ces virus en termes
de présence réelle et d’intégrité. Ainsi Naccache et al. (343) a révélé que le virus
« hybride » entre un parvovirus et un circovirus détecté dans le liquide
céphalorachidien d’un patient humain hospitalisé n’était qu’une simple contamination
provenant des colonnes à silice utilisées durant l’extraction. Cette découverte de
génome « contaminant » impose de confirmer par d’autres moyens la découverte
d’un nouveau virus. Cette prudence concernant l’interprétation des résultats issus
des analyses NGS est particulièrement requise durant les analyses bio-informatiques
en utilisant des outils d’assemblage de novo durant lesquelles des génomes sont
construits à partir des reads de petites tailles sans vérifier l’authenticité de ces
génomes par d’autres outils et approches à stratégies différentes. Cela est
notamment vrai pour la détection de l’astrovirus, du parvovirus de type 2, et de
l’entérovirus dans notre étude.
Une deuxième limite de notre étude était l’analyse NGS sur des mélanges de
prélèvements. Le choix était double, le premier était de se placer au niveau de
l’élevage comme unité épidémiologique ce qui nous parait plus correct avec la
réalité, le deuxième était de pouvoir tester plus d’unités compte tenu des coûts très
élevés du séquençage NGS. Si cette approche est acceptable pour le virome, elle
est plus discutable pour l’étude du bactériote considéré comme le deuxième génome
d’un organisme et ce, malgré les données montrant une homogénéité entre les
structures des bactériotes des veaux d’un même environnement
(102,295,297,298,334,341).
233
Comme démontré dans ce travail, les co-infections se sont avérées très
fréquentes avec notamment une grande fréquence d’agents infectieux non compris
dans les valences vaccinales actuelles, qui ciblent le VRSB, le BPI3, le BVDV, le
BoHV-1 et M. haemolytica. En France, il n’existe pas de données exhaustives
récentes sur la prévalence des virus et bactéries respiratoires. Durant ce travail, une
mise à jour des connaissances sur la circulation des agents infectieux respiratoires a
donc été faite. Le VRSB, considéré comme un des virus les plus prévalents en
France, s’est révélé comme étant toujours très présent. Plus intéressant nos résultats
sur le virome respiratoire ont montré que le BCoV, un virus dont le pouvoir
pathogène est discuté, s’est avéré être le plus prévalent, y compris dans les
prélèvements de l’appareil respiratoire profond. Le BCoV appartient au genre
Betacoronavirus de la famille des Coronaviridae qui regroupe des virus responsables
de maladies très sévères comme le MERS et le SARS. Les Betacoronavirus ont
montré une capacité élevée d’adaptation et de saut d’espèce ; les MERS-CoV et
SARS-CoV proviennent de coronavirus propres aux chiroptères, tout comme le
coronavirus humain (OC43) et le CR-CoV des chiens dérivent du BCoV. Ce
dynamisme élevé du coronavirus a été évalué dans ce travail. Grâce aux outils de
séquençage NGS et de bio-informatique, des souches de BCoV respiratoires isolées
de poumons de veaux ont été analysées et comparées à la totalité des souches
présentes sur les bases de données de NCBI. Dans cette étude, la ségrégation entre
souches de BCoV européennes d’une part et souches Asiatiques et Nord-
Américaines d’autre part a été démontrée. Par ailleurs nous avons identifié un
phénomène de recombinaison au niveau de la position 1100 du gène de la spicule
(S). La recombinaison est un processus connu chez les coronavirus, qui crée de
nouvelles opportunités pour surmonter les pressions sélectives et s'adapter aux
nouveaux environnements et hôtes. La recombinaison a ainsi été associée dans la
littérature à l'expansion des hôtes, à l'émergence de nouveaux variants, à
l'augmentation de la virulence et de la pathogenèse, à la modification des tropismes
tissulaires et à l'évolution de la résistance aux antiviraux. Le phénomène de
recombinaison détecté dans notre étude semble être responsable de l’évolution
génétique séparée des souches BCoV entre les continents. Cette disparité évolutive
semble logique en considérant les données du commerce mondial des bovins. Selon
234
les données de la FAO, la France n’importe quasiment pas de bovins mais elle en
exporte beaucoup. Ces échanges sont cependant beaucoup moins importants que
ceux existant entre les pays asiatiques et l’Amérique du Nord. Si l’idée de l’isolement
de l’Europe et particulièrement de la France face au « spillover » d‘agents infectieux
bovins peut ainsi être suggérée par notre étude pour le coronavirus, la situation est
cependant bien différente pour l’IDV puisque nous avons montré que des souches
génétiquement apparentées appartenant au même groupe phylogénétique circulent
en même temps en Europe et aux Etats-Unis. Cette question intrigante sur l’origine
et la transmission des virus bovins sur de longues distances mérite d’être mieux
étudiée dans des travaux futurs.
Dans le même esprit, nous avons pu identifier la présence d’un astrovirus
jamais décrit jusqu’à présent dans les prélèvements respiratoires. L’astrovirus bovin
est connu pour posséder un tropisme entérique et nerveux
(306,307,309,310,314,344) mais les études qui caractérisent les différentes
propriétés de ce virus sont rares. Dans cette thèse, nous décrivons la détection d’un
astrovirus, principalement dans l’appareil respiratoire profond, 13 mélanges de LBA
et 2 mélanges d’EN étant positifs, respectivement. Dans la mesure où ce virus
possède un tropisme digestif, une contamination des prélèvements par la flore
buccale et/ou fécale a été envisagée. La méthodologie utilisée (protection du
passage de l’endoscope), la présence plus fréquente de l’astrovirus dans le LRT et
l’absence d’autres virus à tropisme digestif dans nos résultats infirment cette
hypothèse. Par ailleurs la profondeur du séquençage (nombre de reads ou
séquences) obtenu pour la grande majorité des prélèvements suggère que
l’astrovirus est présent en quantités importantes. En l’état, il serait intéressant de
poursuivre cette piste en élaborant des travaux complémentaires sur ce virus et son
rôle dans les BPI. Un premier travail consistera à développer une RT-qPCR
spécifique de ce virus pour confirmer les résultats observés et effectuer des études
comparatives sur veaux malades/veaux sains à partir des banques d’échantillons
disponibles mais aussi de nouveaux prélèvements de terrain. Une autre possibilité
sera d’isoler le virus et d’explorer la capacité du virus à infecter le tissu respiratoire
sur des explants pulmonaires bovins.
235
In fine, le nombre de nouveaux virus décrits dans la littérature augmente
chaque année, avec des études exhaustives qui rapportent la découverte de
nouveaux génomes ou la description d’un métagénome. Cependant, trop souvent,
l'importance accordée à la quantité de nouveaux virus ou génomes est préjudiciable
à la signification d'une découverte. De nombreuses analyses complémentaires sont
en effet nécessaires pour caractériser définitivement un virus et son pouvoir
pathogène. Pour exemple, les caractéristiques moléculaires d'un nouveau virus
devraient être déterminées par des analyses in silico, comme des analyses
phylogénétiques et d’horloge moléculaire ; la recherche de marqueurs moléculaires
de pathogénicité, transmission, etc. ; ou par des tests de culture in vitro comme les
études du tropisme cellulaire et du profil transcriptionnel. De même, lorsque les
données sont difficiles à obtenir, comme dans le cas de génomes entièrement
nouveaux ou de virus non cultivables, des données sur le pouvoir pathogène d'un
nouveau candidat peuvent être récoltées par des études épidémiologiques sur des
cohortes d'individus ou des bibliothèques de prélèvements (prévalence virale et
séroprévalence dans différentes populations, études cas-témoins, charge virale chez
les patients/animaux sains versus malades, tropismes tissulaires et excrétion virale).
La reproduction expérimentale de la pathologie respiratoire chez l’hôte naturel reste
finalement un élément majeur pour comprendre la pathogénicité d’un virus
nouvellement détecté. C’est ce que nous avons réalisé pour l’IDV.
Pendant la première phase de ce travail, notamment lors des étapes de
validation du séquençage à haut débit, la circulation de l’IDV chez les veaux en
France a été démontrée par les encadrants de ce travail (208). Nous nous attendions
donc à retrouver l’IDV parmi les résultats du virome respiratoire, mais cela n’a pas
été le cas lors du séquençage profond. Si on tient compte d’une prévalence
virologique de 4,5% chez les veaux atteints de BPI (208), le nombre de fermes
testées peut expliquer ce résultat. L’isolement d’une souche D/5920 française sur un
poumon de veau issu de l’étude de Ducatez et al (208) nous a permis de tester le
pouvoir pathogène de l’IDV. Le fait de détecter dans nos prélèvements respiratoires
l’IDV seul mais aussi en association avec d’autres pathogènes nous a en effet
interrogé sur son rôle dans les BPI en tant que pathogène majeur ou modéré. A la
même période des études ont été publiées qui reposaient soit sur des données de
236
séquençage soit sur des données d’infections expérimentales. Les auteurs Ng et al.
(76) et Mitra et al. (180) ont évalué chez des veaux en feedlots américains, le rôle
d’IDV en calculant de manière basique, à l’aide de tests statistiques (Fisher et odd
ratio), l’association entre la présence du génome viral et les signes cliniques
respiratoires. Bien que ces tests aient indiqué une association entre IDV et
pathologie respiratoire, ces résultats ne sont qu’une indication sur le pouvoir
pathogène du virus. En contrepartie, les études d’infections expérimentales chez le
veau de Ferguson et al. (215) et de Hause et al. (216) ont suggéré un pouvoir
pathogène modéré d’IDV, plutôt limité à l’appareil respiratoire supérieur, mais n’ont
pas mis en évidence de mécanisme d’action particulier.
Nos résultats de PCR quantitative suggèrent que le tropisme d’IDV porte
avant tout sur l’URT. Nous avons pu cependant démontrer qu’IDV se réplique aussi
dans l’appareil respiratoire profond en induisant, pour une partie des veaux, des
signes cliniques (dyspnée avec râles sifflants) certes modérés mais spécifiques
d’une atteinte pulmonaire. Aucun autre agent pathogène respiratoire connu n’a été
détecté chez ces veaux. Les différences avec l’étude de Ferguson et al. (215)
peuvent s’expliquer par le nombre de veaux infectés (3 versus 8 dans notre étude), la
souche d’inoculation (D/OK versus D/5920) et le schéma expérimental. Notamment
nous avons utilisé des jeunes veaux dépourvus d’anticorps colostraux alors que
Ferguson et al. (215) ont attendu la disparition des anticorps colostraux avant
d’infecter des veaux, par conséquent plus âgés et probablement plus matures d’un
point de vue immunitaire. Par ailleurs la présence du colostrum peut aussi avoir
favorisé l’initiation d’une réponse immunitaire cellulaire contre IDV. Compte tenu de
la forte prévalence sérologique d’IDV dans les troupeaux français (entre 38 et 70%,
données personnelles), l’infection de veaux sous couvert d’une immunité maternelle
est probablement fréquente sur le terrain et pourrait alors être cliniquement plus
modérée.
Si l’on considère l’ensemble des données obtenues, on remarque que IDV
possède un pouvoir pathogène modéré lors d’infection expérimentale, comme c’est
le cas pour les BCoV et BPI3. Cette hypothèse est compatible avec le fait que la
prévalence d’IDV est élevée dans les élevages français (entre 38 et 70%, données
personnelles) alors que sa fréquence de détection lors de BPI sévère avoisine les
237
4,5% (208). Son rôle en tant que co-contaminant mérite d’être mieux exploré, par
exemple par des études de co-infections sur explants de tissus pulmonaires avec
d’autres virus ou bactéries respiratoires. Dans ce contexte, l’étude de la réponse
immunitaire innée respiratoire induite par IDV nous est apparue importante à
investiguer chez l’hôte naturel. En tant que première ligne de défense, elle peut
expliquer les modulations de l’infection et de la maladie. Elle pourrait être
indirectement impliquée en favorisant ou pas les co-infections ou surinfections
bactériennes, comme cela a été démontré pour l’infection avec le BRSV, le BPI3, le
BVDV chez les bovins et avec les virus influenza A chez l’homme et la volaille.
L’inflammation aiguë associée pourrait aussi induire une dysbiose microbienne
participant à la maladie. Enfin, la caractérisation de la réponse innée chez le veau
servira de standard comparatif sur des études ultérieures in vitro et ex vivo.
Curieusement nos résultats indiquent que IDV est capable d’activer la transcription
des PRR membranaires et cytosoliques dans le LRT sans que l’on ne détecte une
augmentation de transcription de l’INF-I ou des molécules impliquées dans les voies
de signalisation de l’INF-I. Des études ultérieures seront nécessaires pour infirmer ou
confirmer ces résultats et évaluer si IDV est capable d’inhiber la réponse INF-I,
comme cela est montré pour IAV (345). On pourra par exemple allonger la liste des
ARN cibles à tester, étudier la réponse transciptomique par une approche NGS sans
à priori et/ou aller évaluer la réponse INF-I à l’échelle protéique par des approches
en cultures cellulaires ou explants pulmonaires.
Par rapport aux études précédentes nous avons finalement montré la
capacité d’IDV à se transmettre entre veaux par voie aéroportée sur de courtes
distances. Ce mode de transmission est courant pour les IAV chez l’Homme mais
également en élevages de volailles et de porcs (346,347). Des données récentes
(195) indiquent que IDV est plus résistant que les autres influenzavirus par rapport à
des modifications de température et de pH et probablement dans les conditions
extérieures. La voie aéroportée pourrait ainsi faciliter la contamination intra-troupeau,
voir inter-troupeau s’il s’avérait que le virus puisse rester infectieux sur de plus
longues distances. La contamination facilitée de ce virus explique aussi sa forte
prévalence sérologique.
238
Pour finir sur cette première partie, l’identification d’un astrovirus respiratoire,
et dans une moindre mesure la très forte prévalence du BCoV dans l’appareil
respiratoire profond et la caractérisation du pouvoir pathogène de l’IDV nous
interrogent ainsi sur leurs contributions aux BPI. Comme décrits dans la partie
bibliographique les virus sont souvent caractérisés comme pathogènes majeurs et/ou
agents initiateurs, ces critères reposant sur des données épidémiologiques et
d’infections expérimentales. L’adjectif « initiateur » a été longtemps utilisé pour
désigner un virus qui, à lui seul, ne provoque pas de signes cliniques sévères chez
un veau après inoculation. Pourtant ces virus sont très fréquemment détectés durant
les épisodes de BPI aiguës et sans forcément être associés à des pathogènes
majeurs. Les questions qui se posent alors sont les suivantes : quand on a détecté
un pathogène majeur n’y a-t-il pas d’autres agents qui pourraient faciliter son action ?
L’association de virus dits initiateurs peut-elle engendrer de la clinique et si oui, par
quels mécanismes ? Ces agents dits initiateurs ne participeraient-ils pas à une
dysbiose du microbiote et consécutivement à une sensibilité accrue des veaux aux
BPI ? Par ailleurs la notion de pathogènes majeurs versus initiateurs n’est-elle pas
modulable en fonction des caractéristiques de l’hôte, que ce soit la race, les
éléments facilitateurs et la qualité de la réponse immunitaire ? On comprend ici toute
la complexité de ces affections multifactorielles.
Caractérisation du microbiote respiratoire bovin et relations avec les agents pathogènes respiratoires
En s’inspirant des études d’analyse du microbiote respiratoire chez l’homme
nous avons décidé d’explorer le microbiote respiratoire bovin à l’aide des outils NGS
les plus performants. Il faut toutefois garder en mémoire que ces outils ne sont pas
parfaits. Quelquefois ils ne permettent pas d’identifier des microbes qui pourtant sont
détectés positifs par d’autres techniques réputées moins sensibles. Les étapes de
conditionnement, de purification, d’amplification moléculaire et de séquençage
peuvent apporter des biais d’interprétation en favorisant certains taxons sur d’autres.
Des raisons techniques en rapport avec l’affinité des amorces utilisées ou l’absence
de séquences représentant ces genres dans les bases de données utilisées lors de
239
l’affiliation peuvent aussi expliquer l’absence d’identification de certains micro-
organismes. Après tout, le « profiling » d’un microbiote est basé sur les abondances
relatives donc les taxons les plus minoritaires sont parfois écrasés par les plus
majoritaires et risquent de ne pas ressortir lors des tests statistiques. En plus, les
résultats NGS reposent sur des algorithmes et tests statistiques qui se révèlent
quelquefois peu cohérent entre eux. Nous avons par exemple mis en évidence les
contradictions entre les résultats obtenus avec l’algorithme LEfSE et avec le test de
Wilcoxon/ Kruskal-Wallis.
Nous avons choisi une approche NGS par séquençage 16S car elle
correspondait mieux à nos objectifs de caractérisation de la composition microbienne
et d’étude des liens et interactions entre les différents composants du microbiome.
Cette méthode est celle retenue dans la majorité des études qui portent sur les
communautés bactériennes dans les différents habitats. En conséquence les
résultats produits enrichissent continuellement les banques (RDP, Silva,
Greengenes,…) et offrent ainsi une assurance vis-à-vis de l’identité des séquences
identifiées durant l’étape d’affiliation. De plus, les circuits de traitement des données
de séquençage sont beaucoup plus normalisés, révisés et mis à jour régulièrement
que ceux utilisés pour la métagénomique bactérienne. Dans notre étude le pipeline
FROGS a été utilisé pour l’analyse bio-informatique et écologique. Ce circuit bio-
informatique a été développé par une équipe de l’INRA de Toulouse, il est simple
d’utilisation et couramment utilisé. Toutefois, bien que l’affiliation des taxons dans
l’approche 16S soit assurée pour la totalité des séquences générées, le niveau
taxonomique le plus bas atteint reste le genre. Cela limite forcement les hypothèses
biologiques. L’autre approche non ciblée de métagénomique (shotgun sequencing)
aurait pu également être utilisée, elle permet d’éviter l’introduction de biais
méthodologique lié à l’amplification d’un gène. Toutefois des biais propres à cette
méthode existent, notamment lors des étapes de purification, d’enrichissement et
selon la chimie de séquençage choisie. Plus important, le séquençage
métagénomique risquait de ne pas être assez profond pour détecter les séquences
appartenant à des genres bactériens peu représentés, surtout lorsque les résultats
sont « contaminés » par un nombre majoritaire de séquences liées à l’hôte.
240
Qualitativement, nous avons comparé la structure du bactériote chez le veau
avec ou sans BPI ainsi que la composition en abondance relative de chaque
composant. Un consensus taxonomique de bactériote normal au niveau des
embranchements (phylum) en comparant nos résultats et ceux des études déjà
réalisées sur les bovins (296–298,334,341). Ce consensus est composé par
l’abondance, dans le tractus respiratoire superficiel, de bactéries des phylums
Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, et Bacteroidetes, et, dans le
tractus profond, des phylums Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, et
Firmicutes. Un tel consensus n’a pas pu être établi à un niveau taxonomique plus fin
(familles, genres, ou espèces), vu les résultats divergents entre les différentes
études. Les différences observées peuvent être liées à de nombreux paramètres
présents tels que l’environnement, le type d’exploitation, la race, l’âge, le statut
vaccinal, l’alimentation…(297,334). Comme déjà expliqué dans la partie
bibliographique de cette thèse, la différenciation du microbiote respiratoire est aussi
modélisée par les structures anatomiques et histologiques complexes de l’arbre
respiratoire ainsi que les conditions physico-chimiques qui règnent à chaque
niveau (humidité, oxygénation, acidité, et nature des cellules épithéliales) (260).
Ainsi, cette disparité taxonomique visualisée par les différents outils utilisés dans
notre étude (diversité Beta et LEfSe) peut être expliquée.
Quel que soient les conditions de prélèvements nous avons détecté une
abondance importante des espèces Mycoplasma dispar, Mycoplasma bovirhinis et
Cilia-associated respiratory bacterium. Leur rôle en tant que pathogène majeur direct
est probablement nul mais leurs abondances pourraient suggérer un rôle indirect,
comme cela a été proposé pour M. dispar (39). Toutefois leur présence à la fois chez
les veaux malades et sains ne va pas dans le sens de cette hypothèse.
De même en utilisant des outils d’écologie moléculaire nous avons comparé
les diversités des bactériotes nasopharyngés et pulmonaires des veaux et montré
une différence qualitative et quantitative des genres bactériens, comme déjà suggéré
dans d’autres études (296–298,334,341). Le bactériote des cavités nasales des
veaux atteints de BPI est clairement plus riche comparé à celui des poumons, en
termes d’abondances et de diversité taxonomique. Cette divergence est
considérablement moins importante quand on étudie le microbiote des veaux sains.
241
Une hypothèse serait alors de dire que l’apparition de BPI sélectionne des genres
bactériens différents entre tractus respiratoires superficiels et profonds et/ou que la
présence de genres spécifiques dans les tractus respiratoires profonds et superficiels
favorise l’apparition de BPI. Pour confirmer cette hypothèse, il serait nécessaire de
suivre l’évolution du microbiote chez les mêmes animaux avant et pendant les BPI.
La dynamique et l’évolution du bactériote respiratoire bovin ont été évaluées dans
différentes études canadiennes dans lesquelles un échantillonnage était réalisé sur
les mêmes individus avant et après transport des veaux (341) ou avant et après
allotissement (294). Dans la première étude, bien que tous les animaux soient restés
cliniquement sains, les résultats ont montré un changement brusque de la structure
du bactériote des veaux après leur transport vers un parc d'engraissement
(enrichissement des genres Pasteurella, Bacillus et Proteus au jour J0 du transport,
des genresStreptococcus et Acinetobacter au jour 2, Bifidobacterium au jour 7 et
Mycoplasma au jour 14). Dans l’évaluation du bactériote après allotissement dans la
deuxième étude, les genres Pseudomonas, Shewanella, Acinetobacter, et
Carnobacterium étaient les plus dominants à l’entrée, tandis qu’après 60 jours de
l’arrivée dans les parcs d’engraissement, Staphylococcus, Mycoplasma, Mannheimia
et Moraxella dominaient. Il apparait ainsi évident que le microbiote évolue en fonction
de différents contextes d’élevage mais jusqu’à présent il n’existe pas de données sur
l’impact d’une maladie en système respiratoire bovin.
Dans notre étude nous avons aussi décrit les interactions entre agents
pathogènes connus et communautés bactériennes et le possible impact de la
présence de virus respiratoires sur le microbiote. Plusieurs associations ont été
observées, M. bovis était associé à P. multocida et moins étroitement à un groupe de
taxons formé par les genres Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax,
Sphingomonas et Agreia. Quant à M. haemolytica, il était associé à Murdochiella et
H. somni était associé à Plonomicrobium sp., aux genres Histophilus, Pasteurella et
Mannheimia. Des relations de corrélations très similaires ont été observées in vitro
par Corbeil et al. (1985) (348). Dans cette étude, il a été démontré que la flore
respiratoire résidente a la capacité de favoriser ou inhiber la croissance des isolats
de M. haemolytica, P. multocida et H. somni. La plupart des isolats de la flore
respiratoire étaient bénéfiques pour la croissance des pasteurelles, notamment les
242
genres Micrococcus, Corynebacterium et Staphylococcus. De même l’interprétation
statistique montre dans notre étude une opposition (corrélation inverse) entre la
présence de BPI3 et BRSV d’une part et celle d’Histophilus somni d’autre part. Il a
été montré qu’H. somni stimule in vitro en cellules BAT2 l’expression de protéines
antivirales (IFIH1, ISG15, MX1, et RSAD2) et inhibe la réplication du BRSV (113).
Concernant les interactions entre bactériote respiratoire et présence d’au
moins un des virus BRSV, BPI3, BCoV, il n’a pas été possible de montrer un impact
significatif même si des différences entre communautés bactériennes ont été
identifiées selon la présence ou non des virus. Les explications sont multiples. La
première est le faible nombre de prélèvements disponibles pour les études
statistiques qui nous ont amenés à fusionner les différents virus dans un même
groupe. Si cela a un sens statistique c’est moins défendable sur le plan biologique où
on peut supposer que les modes d’interaction avec la flore résidente sont multiples et
virus-dépendants. La deuxième pourrait être l’absence d’interactions directes entre
flore résidente et virus respiratoires.
En conclusion, nos travaux descriptifs sur la détection de nouveaux virus et
leur présence au sein d’un microbiote résident pose la problématique des
interactions entre microbes sensu lato dans un environnement dynamique qui
dépend aussi des conditions de vie et donc d’élevage des animaux. Le challenge
reste toutefois immense pour identifier et comprendre l’ensemble des interactions
microbiennes. Nous considérons cette thématique comme extrêmement
enrichissante et prometteuse pour peu que l’on puisse aller vers des aspects
mécanistiques. La détection de l’IDV en est un exemple. Probablement faut-il le
prendre comme un virus dont le pouvoir pathogène se module en fonction de l’hôte,
de sa flore résidente et de la présence ou non d’autres agents infectieux
respiratoires.
243
BIBLIOGRAPHIE 1. Valarcher J-F, Hägglund S. Viral respiratory infections in cattle. In: World
Buiatrics Congress 2006. Nice; 2006.
2. Taylor JD, Fulton RW, Lehenbauer TW, Step DL, Confer AW. The
epidemiology of bovine respiratory disease: What is the evidence for
predisposing factors? Can Vet J [Internet]. 2010;51(10):1095–102. Available
from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2942046&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
3. Taylor JD, Fulton RW, Lehenbauer TW, Step DL, Confer AW. The
epidemiology of bovine respiratory disease: what is the evidence for preventive
measures? Can Vet journal La Rev vétérinaire Can [Internet].
2010;51(12):1351–9. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2978987&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
4. Chase CCL, Hurley DJ, Reber AJ. Neonatal Immune Development in the Calf
and Its Impact on Vaccine Response [Internet]. Vol. 24, Veterinary Clinics of
North America - Food Animal Practice. Elsevier; 2008 [cited 2018 May 17]. p.
87–104. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072007000771?via%3
Dihub
5. Heinrichs A. A Short Review: The Immune System of the Dairy Calf and the
Importance of Colostrum IgG. J Dairy, Vet Anim Res [Internet]. 2017 May 15
[cited 2018 May 17];5(3):1–4. Available from:
http://medcraveonline.com/JDVAR/JDVAR-05-00144.php
6. Assié S, Seegers H, Bouet JM, Beaudeau F. Economic impact related to
respiratory disorders of non-weaned calves in Charolais cow-calf farms in Pays
de la Loire (France). In: 52 Meeting of the European Association of Animal
Production [Internet]. Institut de l’Elevage; 2001 [cited 2018 May 19]. p. 187.
Available from: http://agris.fao.org/agris-
244
search/search.do?recordID=FR2003000687
7. Bareille N, Seegers H, Denis G, Quillet JM, Assié S. Impact technique et
économique des troubles respiratoires des jeunes bovins lors de
l’engraissement. 15 Rencontres Rech Ruminants. 2008;(1):77–80.
8. Dupuy C, Morignat E, Demont P, Maugey X, Vinard J-L, Hendrikx P, et al.
Valorisation des données de saisie des bovins. Point Vétérinaire [Internet].
2014;344:62–6. Available from: https://prodinra.inra.fr/record/271983
9. Wittum TE, Salman MD, King ME, Mortimer RG, Odde KG, Morris DL. The
influence of neonatal health on weaning weight of Colorado USA beef calves.
Prev Vet Med [Internet]. 1994 Apr 1 [cited 2018 May 19];19(1):15–25. Available
from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167587794900116
10. Mounaix B, Roussel P, Ribaud D, Seegers H, Assié S. Description de la
mortalité des veaux dans les exploitations françaises d’élevage de bovins
allaitants. In: 18 Rencontres Recherches Ruminants (RRR). 2011. p. 267–70.
11. Bareille N. Evaluations des conséquences économiques des BPIE chez les
bovins en engraissement. Bull des GTV. 2011;(61):63–8.
12. Assié S, Seegers H, Beaudeau F. Incidence of respiratory disorders during
housing in non-weaned Charolais calves in cow-calf farms of Pays de la Loire
(western France). Prev Vet Med [Internet]. 2004 May 14 [cited 2018 Feb
21];63(3–4):271–82. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167587704000534?via%3
Dihub
13. Dunn TR, Ollivett TL, Renaud DL, Leslie KE, LeBlanc SJ, Duffield TF, et al.
The effect of lung consolidation, as determined by ultrasonography, on first-
lactation milk production in Holstein dairy calves. J Dairy Sci [Internet]. 2018
Jun 7 [cited 2018 May 19];101(6):5404–10. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29525311
14. Dedonder KD, Apley MD. A literature review of antimicrobial resistance in
Pathogens associated with bovine respiratory disease [Internet]. Vol. 16,
Animal Health Research Reviews. 2015 [cited 2018 Sep 24]. p. 125–34.
245
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26373635
15. Cameron A, McAllister TA. Antimicrobial usage and resistance in beef
production [Internet]. Vol. 7, Journal of Animal Science and Biotechnology.
BioMed Central; 2016 [cited 2018 Sep 24]. p. 68. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27999667
16. Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé. Liste
des antibiotiques critiques. 2016.
17. Rice J a, Carrasco-Medina L, Hodgins DC, Shewen PE. Mannheimia
haemolytica and bovine respiratory disease. Anim Health Res Rev.
2007;8(2):117–28.
18. Timsit E, Bareille N, Seegers H, Lehebel A, Assié S. Visually undetected fever
episodes in newly received beef bulls at a fattening operation: Occurrence,
duration, and impact on performance. J Anim Sci [Internet]. 2011 Dec 1 [cited
2018 May 19];89(12):4272–80. Available from:
http://academic.oup.com/jas/article/89/12/4272/4772100
19. Tessier V, Roy O, Audeval C, Ridremont B. Maladies respiratoires des veaux
non sevrés : prévalence des agents pathogènes selon l’âge des veaux et
comparaison de deux types de prélèvements. Journée Natl des GTV.
2013;831–6.
20. Autio T, Pohjanvirta T, Holopainen R, Rikula U, Pentikäinen J, Huovilainen A,
et al. Etiology of respiratory disease in non-vaccinated, non-medicated calves
in rearing herds. Vet Microbiol [Internet]. 2007 Jan 31 [cited 2018 May
10];119(2–4):256–65. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037811350600383X
21. Hotchkiss EJ, Dagleish MP, Willoughby K, McKendrick IJ, Finlayson J, Zadoks
RN, et al. Prevalence of Pasteurella multocida and other respiratory pathogens
in the nasal tract of Scottish calves. Vet Rec [Internet]. 2010 Oct 9 [cited 2018
May 19];167(15):555–60. Available from:
http://veterinaryrecord.bmj.com/cgi/doi/10.1136/vr.c4827
22. Angen Ø, Thomsen J, Larsen LE, Larsen J, Kokotovic B, Heegaard PMH, et al.
246
Respiratory disease in calves: Microbiological investigations on trans-tracheally
aspirated bronchoalveolar fluid and acute phase protein response. Vet
Microbiol [Internet]. 2009 May 28 [cited 2018 Apr 30];137(1–2):165–71.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037811350800610X?via%3
Dihub
23. Pardon B, Bleecker K De, Bax B, Callens J, Deprez P. Identification of
infectious agents associated with bovine respiratory disease in white veal
calves in Belgium. In: 26th world Buiatrics Congress [Internet]. Santiago; 2010
[cited 2018 Mar 22]. p. 9820. Available from:
https://biblio.ugent.be/publication/1079219/file/1079221
24. Gagea MI, Bateman KG, van Dreumel T, McEwen BJ, Carman S, Archambault
M, et al. Diseases and Pathogens Associated with Mortality in Ontario Beef
Feedlots. J Vet Diagnostic Investig [Internet]. 2006;18(1):18–28. Available
from: http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/104063870601800104
25. Pelletier C. Apport des outils de diagnostic moléculaire dans le diagnostic des
pathologies multifactorielles. Bull des GTV. 2011;(61):37–45.
26. Poumarat F, Chazel M, Tardy F, Gaurivaud P, Arcangioli M-A, LeGrand D, et
al. VIGIMYC , le réseau national d ’ épidémio-surveillance des mycoplasmoses
des ruminants , bilan 2003-2007. 2007.
27. Le Grand D, Bézille P, Calavas D, Poumarat F, Brank M, Citti C, et al.
Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in
France. Vet Rec [Internet]. 2002 Mar 2 [cited 2018 May 19];150(9):268–73.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11918048
28. Thomas A, Mainil J, Linden A. Mycoplasma bovis : synthèse des
connaissances actuelles. Ann Méd Vét [Internet]. 2003 [cited 2018 Mar
22];1(147):23–39. Available from:
https://orbi.uliege.be/bitstream/2268/26837/1/2003-M bovis synthèse des
connaissances actuelles.pdf
29. Arcangioli MA, Duet A, Meyer G, Dernburg A, Bézille P, Poumarat F, et al. The
247
role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaks in veal calf
feedlots. Vet J [Internet]. 2008 Jul 1 [cited 2018 Mar 22];177(1):89–93.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023307001128
30. Beaudeau F, Björkman C, Alenius S, Frössling J. Spatial patterns of bovine
corona virus and bovine respiratory syncytial virus in the Swedish beef cattle
population. Acta Vet Scand [Internet]. 2010 May 21 [cited 2018 Jun
21];52(1):33. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20492637
31. Luzzago C, Bronzo V, Salvetti S, Frigerio M, Ferrari N. Bovine respiratory
syncytial virus seroprevalence and risk factors in endemic dairy cattle herds.
Vet Res Commun [Internet]. 2010 Jan 18 [cited 2018 Jun 21];34(1):19–24.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19921456
32. Gulliksen SM, Jor E, Lie KI, Løken T, Åkerstedt J, Østerås O. Respiratory
infections in Norwegian dairy calves. J Dairy Sci [Internet]. 2009 Oct [cited
2018 Jun 21];92(10):5139–46. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19762832
33. Valarcher J-F, Schelcher F, Bourhy H. Evolution of Bovine Respiratory
Syncytial Virus. J Virol [Internet]. 2000;74(22):10714–28. Available from:
http://jvi.asm.org/cgi/content/abstract/74/22/10714
34. Pelletier C. In-house multiplex real time PCR for simultaneous diagnosis of six
major respiratory pathogens in young cattle: three years of experience in
Burgundy. In: 16th International Symposium of the WAVLD- Berlin. Berlin;
2013.
35. Gélinas AM, Boutin M, Sasseville AMJ, Dea S. Bovine coronaviruses
associated with enteric and respiratory diseases in Canadian dairy cattle
display different reactivities to anti-HE monoclonal antibodies and distinct
amino acid changes in their HE, S and ns4.9 protein. Virus Res [Internet]. 2001
Jul 1 [cited 2018 Jun 21];76(1):43–57. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016817020100243X
36. Le Grand D, Arcangioli M-A, Poumarat F, Bezille P. Epidémiologie et
248
thérapeutique des infections à Mycoplasma bovis : une synthèse. 2004.
37. Lysnyansky I, Ron Y, Yogev D. Juxtaposition of an active promoter to vsp
genes via site-specific DNA inversions generates antigenic variation in
Mycoplasma bovis. J Bacteriol [Internet]. 2001 Oct 1 [cited 2018 May
19];183(19):5698–708. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11544233
38. Hata E, Murakami K. Complete Genome Sequence of Mycoplasma
californicum Strain HAZ160_1 from Bovine Mastitic Milk in Japan. Genome
Announc [Internet]. 2014 Sep 28 [cited 2018 Mar 21];2(4):e00684-14-e00684-
14. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28963211
39. Tortorelli G, Carrillo Gaeta N, Mendonça Ribeiro BL, Miranda Marques L,
Timenetsky J, Gregory L. Evaluation of Mollicutes Microorganisms in
Respiratory Disease of Cattle and Their Relationship to Clinical Signs. J Vet
Intern Med [Internet]. 2017;(June):1215–20. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1111/jvim.14721
40. Tegtmeier C, Angen, Grell SN, Riber U, Friis NF. Aerosol challenge of calves
with Haemophilus somnus and Mycoplasma dispar. Vet Microbiol [Internet].
2000 Mar 15 [cited 2018 Mar 21];72(3–4):229–39. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113599001819?via%3
Dihub
41. Martel J. Les pasteurelloses bovines : évolution du groupe bactérien ,
importance de l ’ antibiorésistance. Bull Acad Vét Fr. 2002;(J 55):303–12.
42. Lopez A, Maxie MG, Savan M, Ruhnke HL, Thomson RG, Barnum DA, et al.
The pulmonary clearance of Pasteurella haemolytica in calves infected with
bovine virus diarrhea or Mycoplasma bovis. Can J Comp Med [Internet]. 1982
Jul [cited 2018 Mar 21];46(3):302–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7127194
43. Larsen J, Pedersen AG, Davies RL, Kuhnert P, Frey J, Christensen H, et al.
Evolution of the leukotoxin promoter in genus Mannheimia. BMC Evol Biol
[Internet]. 2009 May 29 [cited 2018 May 18];9(1):121. Available from:
249
http://bmcevolbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2148-9-121
44. Katsuda K, Hoshinoo K, Ueno Y, Kohmoto M, Mikami O. Virulence genes and
antimicrobial susceptibility in Pasteurella multocida isolates from calves. Vet
Microbiol [Internet]. 2013 [cited 2018 Mar 22];167(3–4):737–41. Available from:
https://ac.els-cdn.com/S0378113513004689/1-s2.0-S0378113513004689-
main.pdf?_tid=1ec176d8-de3f-454b-8d6d-
aa43eb5d830a&acdnat=1521715530_24c49b470503f184fb0ceaffc804e646
45. Ellis J a. Update on viral pathogenesis in BRD. Anim Health Res Rev [Internet].
2009;10(2):149–53. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003652
46. Sellyei B, Rónai Z, Jánosi S, Makrai L. Comparative analysis of Pasteurella
multocida strains isolated from bovine respiratory infections. Acta Microbiol
Immunol Hung [Internet]. 2015;62(4):453–61. Available from:
http://www.akademiai.com/doi/abs/10.1556/030.62.2015.4.9
47. Angen Ø, Thomsen J, Larsen LE, Larsen J, Kokotovic B, Heegaard PMH, et al.
Respiratory disease in calves: Microbiological investigations on trans-tracheally
aspirated bronchoalveolar fluid and acute phase protein response. Vet
Microbiol [Internet]. 2009 May 28 [cited 2018 Mar 22];137(1–2):165–71.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037811350800610X
48. Nikunen S, Härtel H, Orro T, Neuvonen E, Tanskanen R, Kivelä SL, et al.
Association of bovine respiratory disease with clinical status and acute phase
proteins in calves. Comp Immunol Microbiol Infect Dis [Internet]. 2007 May 1
[cited 2018 Mar 22];30(3):143–51. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147957106001044
49. Corbeil LB. Histophilus somni host–parasite relationships [Internet]. Vol. 8,
Animal Health Research Reviews. Cambridge University Press; 2007 [cited
2018 Mar 22]. p. 151–60. Available from:
https://www.cambridge.org/core/product/identifier/S1466252307001417/type/jo
urnal_article
250
50. Pérez DS, Pérez FA, Bretschneider G. Histophilus somni : pathogenicity in
cattle, an update. An Vet [Internet]. 2010 [cited 2018 Mar 22];26:5–21.
Available from:
https://digitum.um.es/xmlui/bitstream/10201/20617/1/Histophilus somni
actualizacion de la patogenicidad en vacuno.pdf
51. Sandal I, Inzana TJ. A genomic window into the virulence of Histophilus somni
[Internet]. Vol. 18, Trends in Microbiology. 2010 [cited 2018 Mar 22]. p. 90–9.
Available from: https://ac.els-cdn.com/S0966842X0900256X/1-s2.0-
S0966842X0900256X-main.pdf?_tid=2c0c9944-f690-4b2c-abe0-
83b42c69a777&acdnat=1521725366_8198ecd039bb1dd118caf77a3d09f4a4
52. Sarmiento-Silva RE, Nakamura-Lopez Y, Vaughan G. Epidemiology, molecular
epidemiology and evolution of bovine respiratory syncytial virus. Viruses.
2012;4(12):3452–67.
53. Schrijver RS. Pathogénie des infections dues au virus respiratoire syncitial
bovin. In : Comptes rendus du congrès de la S.F.B. Paris. 1997.
54. Valarcher J-F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res
[Internet]. 2007;38(2):153–80. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17257568
55. Jones C, Chowdhury S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1
(BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and
development of improved vaccines [Internet]. Vol. 8, Animal Health Research
Reviews. 1996 [cited 2018 Apr 4]. p. 187–205. Available from:
https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-
core/content/view/572269643E1D1B24E65EA86B743532B9/S1466252307001
34Xa.pdf/review_of_the_biology_of_bovine_herpesvirus_type_1_bhv1_its_role
_as_a_cofactor_in_the_bovine_respiratory_disease_complex_and_de
56. Ellis JA. Bovine Parainfluenza-3 Virus [Internet]. Vol. 26, Veterinary Clinics of
North America - Food Animal Practice. Elsevier; 2010 [cited 2018 Apr 4]. p.
575–93. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072010000356?via%3
251
Dihub
57. Wertheim JO, Chu DKW, Peiris JSM, Kosakovsky Pond SL, Poon LLM. A Case
for the Ancient Origin of Coronaviruses. J Virol [Internet]. 2013;87(12):7039–
45. Available from: http://jvi.asm.org/cgi/doi/10.1128/JVI.03273-12
58. Nemoto M, Kanno T, Bannai H, Tsujimura K, Yamanaka T, Kokado H. Antibody
response to equine coronavirus in horses inoculated with a bovine coronavirus
vaccine. J Vet Med Sci [Internet]. 2017 Oct 6 [cited 2017 Nov 15];79(11).
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28993568
59. Saif LJ. Bovine respiratory coronavirus. Vet Clin North Am - Food Anim Pract
[Internet]. 2010;26(2):349–64. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.cvfa.2010.04.005
60. Cho KO, Hoet AE, Loerch SC, Wittum TE, Saif LJ. Evaluation of concurrent
shedding of bovine coronavirus via the respiratory tract and enteric route in
feedlot cattle. Am J Vet Res. 2001;62(9):1436–41.
61. Fulton RW, Step DL, Wahrmund J, Burge LJ, Payton ME, Cook BJ, et al.
Bovine coronavirus (BCV) infections in transported commingled beef cattle and
sole-source ranch calves. Can J Vet Res. 2011;75(3):191–9.
62. Hasoksuz M, Hoet AE, Loerch SC, Wittum TE, Nielsen PR, Saif LJ. Detection
of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in an Ohio
feedlot. J Vet Diagn Invest [Internet]. 2002;14(4):308–13. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12152810
63. Storz J, Purdy CW, Lin X, Burrell M, Truax RE, Briggs RE, et al. Isolation of
respiratory bovine coronavirus, other cytocidal viruses, and Pasteurella spp
from cattle involved in two natural outbreaks of shipping fever. J Am Vet Med
Assoc [Internet]. 2000;216(10):1599–604. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10825949
64. Gulliksen SM, Jor E, Lie KI, Løken T, Åkerstedt J, Østerås O. Respiratory
infections in Norwegian dairy calves. J Dairy Sci [Internet]. 2009;92(10):5139–
46. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002203020970846X%5Cnhtt
252
p://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002203020970846X/pdfft?md5=
884058d6ff8a8e770820ffd401191920&pid=1-s2.0-S002203020970846X-
main.pdf
65. Toftaker I, Sanchez J, Stokstad M, Nødtvedt A. Bovine respiratory syncytial
virus and bovine coronavirus antibodies in bulk tank milk – risk factors and
spatial analysis. Prev Vet Med [Internet]. 2016;133:73–83. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.09.003
66. Decaro N, Campolo M, Desario C, Cirone F, D’Abramo M, Lorusso E, et al.
Respiratory disease associated with bovine coronavirus infection in cattle herds
in Southern Italy. J Vet Diagnostic Investig. 2008;20(1):28–32.
67. Pardon B, De Bleecker K, Dewulf J, Callens J, Boyen F, Catry B, et al.
Prevalence of respiratory pathogens in diseased, non-vaccinated, routinely
medicated veal calves. Vet Rec. 2011;169(11):278.
68. O’Neill R, Mooney J, Connaghan E, Furphy C, Graham DA. Patterns of
detection of respiratory viruses in nasal swabs from calves in Ireland: a
retrospective study. Vet Rec [Internet]. 2014;175(14):351–351. Available from:
http://veterinaryrecord.bmj.com/cgi/doi/10.1136/vr.102574
69. Meyer G, Pelletier C, Herman N, Ducatez M, Cassard H, Salem E. Vers une
identification de nouveaux virus respiratoires bovins. NEVA [Internet].
2015;8(31):80–6. Available from:
http://neva.fr/file.php/498/06_Vers_une_identification_de_nouveaux_virus_resp
iratoires_bovins_.pdf
70. McNulty MS, Bryson DG, Allan GM, Logan EF. Coronavirus infection of the
bovine respiratory tract. Vet Microbiol [Internet]. 1984 Sep 1 [cited 2018 May
22];9(5):425–34. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0378113584900634
71. Lin X-Q, O’Reilly KL, Storz J. Antibody responses of cattle with respiratory
coronavirus infections during pathogenesis of shipping fever pneumonia are
lower with antigens of enteric strains than with those of a respiratory strain. Clin
Diagn Lab Immunol [Internet]. 2002;9(5):1010–3. Available from:
253
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12204951%5Cnhttp://www.pubmedcentral
.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC120065
72. Ribeiro J, Lorenzetti E, Alfieri AF, Alfieri AA. Molecular detection of bovine
coronavirus in a diarrhea outbreak in pasture-feeding Nellore steers in southern
Brazil. Trop Anim Health Prod. 2016;48(3):649–53.
73. Boileau MJ, Kapil S. Bovine Coronavirus Associated Syndromes. Vet Clin
North Am - Food Anim Pract [Internet]. 2010;26(1):123–46. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.cvfa.2009.10.003
74. Mattson DE, Norman BB, Dunbar JR. Bovine adenovirus type-3 infection in
feedlot calves. Am J Vet Res [Internet]. 1988 Jan [cited 2018 Apr 5];49(1):67–
9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2833138
75. Hartel H, Nikunen S, Neuvonen E, Tanskanen R, Kivela S-L, Aho P, et al. Viral
and Bacterial Pathogens in Bovine Respiratory Disease in Finland. Acta Vet
Scand [Internet]. 2004;45(4):193–200. Available from:
http://www.actavetscand.com/content/45/4/193
76. Ng TFF, Kondov NO, Deng X, Van Eenennaam A, Neibergs HL, Delwart E. A
Metagenomics and Case-Control Study To Identify Viruses Associated with
Bovine Respiratory Disease. J Virol [Internet]. 2015 May 15 [cited 2018 Apr
5];89(10):5340–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25740998
77. Darweesh MF, Rajput MKS, Braun LJ, Ridpath JF, Neill JD, Chase CCL.
Characterization of the cytopathic BVDV strains isolated from 13 mucosal
disease cases arising in a cattle herd. Virus Res [Internet]. 2015 Jan 2 [cited
2018 May 22];195:141–7. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016817021400402X?via%3
Dihub
78. Ridpath J. The contribution of infections with bovine viral diarrhea viruses to
bovine respiratory disease [Internet]. Vol. 26, Veterinary Clinics of North
America - Food Animal Practice. Elsevier; 2010 [cited 2018 May 22]. p. 335–
48. Available from:
254
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072010000095?via%3
Dihub
79. Ellis JA, West KH, Cortese VS, Myers SL, Carman S, Martin KM, et al. Lesions
and Distribution of Viral Antigen Following an Experimental Infection of Young
Seronegative Calves with Virulent Bovine Virus Diarrhea Virus-Type II. Can J
Vet Res. 1998;62(3):161–9.
80. Chase CCL, Thakur N, Darweesh MF, Morarie-kane SE, Rajput MK. Immune
response to bovine viral diarrhea virus — looking at newly defined targets.
Anim Heal Res Rev [Internet]. 2015 Jun 8 [cited 2018 May 22];16(1):4–14.
Available from:
https://www.cambridge.org/core/product/identifier/S1466252315000110/type/jo
urnal_article
81. Lanyon SR, Hill FI, Reichel MP, Brownlie J. Bovine viral diarrhoea:
Pathogenesis and diagnosis. Vet J [Internet]. 2014 Feb 1 [cited 2018 May
22];199(2):201–9. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023313003614?via%3
Dihub
82. Burciaga-Robles LO, Step DL, Krehbiel CR, Holland BP, Richards CJ,
Montelongo MA, et al. Effects of exposure to calves persistently infected with
bovine viral diarrhea virus type 1b and subsequent infection with mannheima
haemolytica on clinical signs and immune variables: Model for
bovinerespiratory disease via viral and bacterial interactio. J Anim Sci
[Internet]. 2010 Jun 1 [cited 2018 Mar 27];88(6):2166–78. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20154164
83. Fulton RW, Ridpath JF, Saliki JT, Briggs RE, Confer AW, Burge LJ, et al.
Bovine viral diarrhea virus (BVDV) 1b: predominant BVDV subtype in calves
with respiratory disease. Can J Vet Res [Internet]. 2002 Jul [cited 2018 May
22];66(3):181–90. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12146890
84. Hay KE, Ambrose RC, Morton JM, Horwood PF, Gravel JL, Waldron S, et al.
255
Effects of exposure to Bovine viral diarrhoea virus 1 on risk of bovine
respiratory disease in Australian feedlot cattle. Prev Vet Med [Internet]. 2016
Apr 1 [cited 2018 May 22];126:159–69. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167587716300423?via%3
Dihub
85. Hilton L, Moganeradj K, Zhang G, Chen Y-H, Randall RE, McCauley JW, et al.
The NPro Product of Bovine Viral Diarrhea Virus Inhibits DNA Binding by
Interferon Regulatory Factor 3 and Targets It for Proteasomal Degradation. J
Virol [Internet]. 2006 Dec 1 [cited 2018 May 18];80(23):11723–32. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16971436
86. Shahriar FM, Clark EG, Janzen E, West K, Wobeser G. Coinfection with bovine
viral diarrhea virus and Mycoplasma bovis in feedlot cattle with chronic
pneumonia. Can Vet J [Internet]. 2002 Nov [cited 2018 Apr 17];43(11):863–8.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12497963
87. Welsh MD, Adair BM, Foster JC. Effect of BVD virus infection on alveolar
macrophage functions. Vet Immunol Immunopathol [Internet]. 1995 Jun 1 [cited
2018 Apr 17];46(3–4):195–210. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016524279405366Z
88. Brodersen BW, Kelling CL. Effect of concurrent experimentally induced bovine
respiratory syncytial virus and bovine viral diarrhea virus infection on
respiratory tract and enteric diseases in calves. Am J Vet Res [Internet]. 1998
Nov [cited 2018 Mar 27];59(11):1423–30. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9829401
89. Elvander M, Baule C, Persson M, Egyed L, Ballagi-Pordany A, Belak S, et al.
An experimental study of a concurrent primary infection with bovine respiratory
syncytial virus (BRSV) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in calves. Acta
Vet Scand [Internet]. 1998 [cited 2018 Mar 27];39(2):251–64. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9787488
90. Gånheim C, Hultén C, Carlsson U, Kindahl H, Niskanen R, Waller KP. The
acute phase response in calves experimentally infected with bovine viral
256
diarrhoea virus and/or Mannheimia haemolytica. J Vet Med Ser B [Internet].
2003 May 1 [cited 2018 Mar 27];50(4):183–90. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1046/j.1439-0450.2003.00658.x
91. Collier JR, Chow TL, Benjamin MM, Deem AW. The combined effect of
infectious bovine rhinotracheitis virus and Pasteurella hemolytica on cattle. Am
J Vet Res. 1960;21:195–8.
92. Hägglund S, Svensson C, Emanuelson U, Valarcher JF, Alenius S. Dynamics
of virus infections involved in the bovine respiratory disease complex in
Swedish dairy herds. Vet J [Internet]. 2006 Sep 1 [cited 2018 Apr
4];172(2):320–8. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023305001255
93. Lee KH, Gordon A, Betsy F, Foxman B. The role of respiratory viruses in the
etiology of bacterial pneumonia. Evol Med Public Heal [Internet].
2016;2016(1):95–109. Available from:
http://emph.oxfordjournals.org/content/2016/1/95.abstract%5Cnhttp://emph.oxf
ordjournals.org/lookup/doi/10.1093/emph/eow007
94. Bosch AATM, Biesbroek G, Trzcinski K, Sanders EAM, Bogaert D. Viral and
Bacterial Interactions in the Upper Respiratory Tract. PLoS Pathog. 2013;9(1).
95. Regev-Yochay G, Trzciński K, Thompson CM, Malley R, Lipsitch M.
Interference between Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus:
In vitro hydrogen peroxide-mediated killing by Streptococcus pneumoniae. J
Bacteriol [Internet]. 2006 Jul 1 [cited 2018 Apr 1];188(13):4996–5001. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16788209
96. Shakhnovich EA, King SJ, Weiser JN. Neuraminidase expressed by
Streptococcus pneumoniae desialylates the lipopolysaccharide of Neisseria
meningitidis and Haemophilus influenzae: A paradigm for interbacterial
competition among pathogens of the human respiratory tract. Infect Immun
[Internet]. 2002 Dec 1 [cited 2018 Apr 1];70(12):7161–4. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12438402
97. Lysenko ES, Ratner AJ, Nelson AL, Weiser JN. The role of innate immune
257
responses in the outcome of interspecies competition for colonization of
mucosal surfaces. PLoS Pathog [Internet]. 2005 [cited 2018 Apr 1];1(1):0003-
0011. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.ppat.0010001
98. Corbeil LB, Woodward W, Ward ACS, Mickelsen WD, Paisley L. Bacterial
interactions in bovine respiratory and reproductive infections. J Clin Microbiol
[Internet]. 1985 May 1 [cited 2018 Apr 18];21(5):803–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3998115
99. Dassanayake RP, Call DR, Sawant AA, Carol Casavant N, Weiser GC,
Knowles DP, et al. Bibersteinia trehalosi Inhibits the growth of mannheimia
haemolytica by a proximity-dependent mechanism. Appl Environ Microbiol
[Internet]. 2010 Feb 15 [cited 2018 Apr 20];76(4):1008–13. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20038698
100. Bavananthasivam J, Dassanayake RP, Kugadas A, Shanthalingam S, Call DR,
Knowles DP, et al. Proximity-dependent inhibition of growth of Mannheimia
haemolytica by Pasteurella multocida. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2012
Sep 15 [cited 2018 Apr 20];78(18):6683–8. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22798357
101. Amat S, Subramanian S, Timsit E, Alexander TW. Probiotic bacteria inhibit the
bovine respiratory pathogen Mannheimia haemolytica serotype 1 in vitro. Lett
Appl Microbiol [Internet]. 2017 May 1 [cited 2018 Apr 18];64(5):343–9.
Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/lam.12723
102. Holman DB, McAllister TA, Topp E, Wright A-DG, Alexander TW. The
nasopharyngeal microbiota of feedlot cattle that develop bovine respiratory
disease. Vet Microbiol [Internet]. 2015 Oct 22 [cited 2016 Apr 18];180(1–2):90–
5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26249828
103. Santagati M, Scillato M, Patanè F, Aiello C, Stefani S. Bacteriocin-producing
oral streptococci and inhibition of respiratory pathogens. FEMS Immunol Med
Microbiol [Internet]. 2012 Jun 1 [cited 2018 Apr 20];65(1):23–31. Available
from: https://academic.oup.com/femspd/article-lookup/doi/10.1111/j.1574-
695X.2012.00928.x
258
104. Santagati M, Scillato M, Muscaridola N, Metoldo V, La Mantia I, Stefani S.
Colonization, safety, and tolerability study of the Streptococcus salivarius
24SMBc nasal spray for its application in upper respiratory tract infections. Eur
J Clin Microbiol Infect Dis [Internet]. 2015 [cited 2018 Apr 20];34(10):2075–80.
Available from: https://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs10096-015-
2454-2.pdf
105. Gershwin LJ. Bovine respiratory syncytial virus infection: immunopathogenic
mechanisms. Anim Heal Res Rev [Internet]. 2007 [cited 2018 Apr 1];8(2):207–
13. Available from: https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-
core/content/view/9D16B2C5CB3261884F14E6B4DA6EEA19/S146625230700
1405a.pdf/bovine_respiratory_syncytial_virus_infection_immunopathogenic_m
echanisms.pdf
106. Grooms DL, Brock K V, Bolin SR, Grotelueschen DM, Cortese VS. Effects of
constant exposure to cattle persistently infected with BVD virus on morbidity
and mortality rates and performance of feedlot cattle. J Am Vet Med Assoc
[Internet]. 2014 [cited 2018 Apr 17];244(2):212–24. Available from:
https://avmajournals.avma.org/doi/pdf/10.2460/javma.244.2.212
107. Fulton RW, Ridpath JF, Saliki JT, Briggs RE, Confer AW, Burge LJ, et al.
Bovine viral diarrhea virus (BVDV) 1b: Predominant BVDV subtype in calves
with respiratory disease. Can J Vet Res [Internet]. 2002 Jul [cited 2018 Apr
17];66(3):181–90. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12146890
108. Potgieter LND. Immunology of bovine viral diarrhea virus. [Internet]. Vol. 11,
The Veterinary clinics of North America. Food animal practice. Elsevier; 1995
[cited 2018 Sep 24]. p. 501–20. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072015304643?via%3
Dihub
109. Archambault D, Béliveau C, Couture Y, Carman S. Clinical response and
immunomodulation following experimental challenge of calves with type 2
noncytopathogenic bovine viral diarrhea virus. Vet Res [Internet]. 2000 Mar 1
[cited 2018 Sep 24];31(2):215–27. Available from:
259
http://www.edpsciences.org/10.1051/vetres:2000117
110. Prysliak T, Van Der Merwe J, Lawman Z, Wilson D, Townsend H, Van Drunen
Littel-Van Den Hurk S, et al. Respiratory disease caused by Mycoplasma bovis
is enhanced by exposure to bovine herpes virus 1 (BHV-1) but not to bovine
viral diarrhea virus (BVDV) type 2. Can Vet J. 2011;52(11):1195–202.
111. Gershwin LJ, Berghaus LJ, Arnold K, Anderson ML, Corbeil LB. Immune
mechanisms of pathogenetic synergy in concurrent bovine pulmonary infection
with Haemophilus somnus and bovine respiratory syncytial virus. Vet Immunol
Immunopathol [Internet]. 2005 Aug 15 [cited 2018 Mar 27];107(1–2):119–30.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165242705001236?via%3
Dihub
112. Agnes JT, Zekarias B, Shao M, Anderson ML, Gershwin LJ, Corbeil LB. Bovine
respiratory syncytial virus and Histophilus somni interaction at the alveolar
barrier. Pirofski L, editor. Infect Immun [Internet]. 2013 Jul [cited 2018 Mar
27];81(7):2592–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23649093
113. Lin C, Agnes JT, Behrens N, Shao M, Tagawa Y, Gershwin LJ, et al.
Histophilus somni Stimulates expression of antiviral proteins and inhibits BRSV
replication in bovine respiratory epithelial cells. Chang Y-F, editor. PLoS One
[Internet]. 2016 Feb 9 [cited 2018 Apr 18];11(2):e0148551. Available from:
http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0148551
114. Risalde MA, Molina V, Sánchez-Cordón PJ, Pedrera M, Panadero R, Romero-
Palomo F, et al. Response of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines
in calves with subclinical bovine viral diarrhea challenged with bovine
herpesvirus-1. Vet Immunol Immunopathol [Internet]. 2011 Nov 15 [cited 2018
Mar 27];144(1–2):135–43. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165242711002935?via%3
Dihub
115. Alkheraif AA, Topliff CL, Reddy J, Massilamany C, Donis RO, Meyers G, et al.
260
Type 2 BVDV Npro suppresses IFN-1 pathway signaling in bovine cells and
augments BRSV replication. Virology [Internet]. 2017 Jul 1 [cited 2018 Apr
20];507:123–34. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682217301228?via%3
Dihub
116. Rosenthal SR, Ostfeld RS, McGarvey ST, Lurie MN, Smith KF. Redefining
disease emergence to improve prioritization and macro-ecological analyses
[Internet]. Vol. 1, One Health. Elsevier; 2015 [cited 2018 Mar 2]. p. 17–23.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352771415000051?via%3
Dihub
117. Sheng Z, Ran Z, Wang D, Hoppe AD, Simonson R, Chakravarty S, et al.
Genomic and evolutionary characterization of a novel influenza-C-like virus
from swine. Arch Virol. 2014;159(2):249–55.
118. Le Loc’h G, Bertagnoli S, Ducatez MF. Time scale evolution of avipoxviruses.
Infect Genet Evol. 2015;35:75–81.
119. WHO fact sheet. The top 10 causes of death [Internet]. WHO. World Health
Organization; 2017 [cited 2018 Mar 7]. Available from:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/
120. Fauci AS, Morens DM. The Perpetual Challenge of Infectious Diseases. N Engl
J Med [Internet]. 2012 Feb 2 [cited 2018 Mar 4];366(5):454–61. Available from:
http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMra1108296
121. Chiu CY. Viral pathogen discovery. Curr Opin Microbiol [Internet]. 2013 Aug 1
[cited 2018 Feb 26];16(4):468–78. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527413000684
122. Zaki AM, van Boheemen S, Bestebroer TM, Osterhaus ADME, Fouchier RAM.
Isolation of a Novel Coronavirus from a Man with Pneumonia in Saudi Arabia.
N Engl J Med [Internet]. 2012 Nov 8 [cited 2018 Feb 24];367(19):1814–20.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23075143
123. Fouchier RAM, Hartwig NG, Bestebroer TM, Niemeyer B, de Jong JC, Simon
261
JH, et al. A previously undescribed coronavirus associated with respiratory
disease in humans. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2004 [cited 2018 Mar
7];101(16):6212–6. Available from:
http://www.pnas.org/content/pnas/101/16/6212.full.pdf
124. Van Den Hoogen BG, De Jong JC, Groen J, Kuiken T, De Groot R, Fouchier
RAM, et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young
children with respiratory tract disease. Nat Med [Internet]. 2001 Jun 1 [cited
2018 Mar 7];7(6):719–24. Available from:
http://www.nature.com/articles/nm0601_719
125. Nichol ST, Spiropoulou CF, Morzunov S, Rollin PE, Ksiazek TG, Feldmann H,
et al. Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute
respiratory illness. Science [Internet]. 1993 Nov 5 [cited 2018 Mar
7];262(5135):914–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8235615
126. Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team, Dawood FS,
Jain S, Finelli L, Shaw MW, Lindstrom S, et al. Emergence of a Novel Swine-
Origin Influenza A (H1N1) Virus in Humans. N Engl J Med [Internet]. 2009 Jun
18 [cited 2018 Mar 7];360(25):2605–15. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19423869
127. Park DJ, Dudas G, Wohl S, Goba A, Whitmer SLM, Andersen KG, et al. Ebola
Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in
Sierra Leone. Cell [Internet]. 2015 Jun 18 [cited 2018 Mar 7];161(7):1516–26.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26091036
128. Chang C, Ortiz K, Ansari A, Gershwin ME. The Zika outbreak of the 21st
century. J Autoimmun [Internet]. 2016 Apr [cited 2018 Mar 7];68:1–13.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26925496
129. Vouga M, Greub G. Emerging bacterial pathogens: The past and beyond
[Internet]. Vol. 22, Clinical Microbiology and Infection. Elsevier; 2016 [cited
2018 Mar 2]. p. 12–21. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X1500909X?via%3
262
Dihub
130. Fischbach MA, Walsh CT. Antibiotics for emerging pathogens [Internet]. Vol.
325, Science. 2009 [cited 2018 Feb 27]. p. 1089–93. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19713519
131. Tenover FC, Goering R V. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain
USA300: Origin and epidemiology [Internet]. Vol. 64, Journal of Antimicrobial
Chemotherapy. Oxford University Press; 2009 [cited 2018 Mar 10]. p. 441–6.
Available from: https://academic.oup.com/jac/article-
lookup/doi/10.1093/jac/dkp241
132. Buchholz U, Bernard H, Werber D, Böhmer MM, Remschmidt C, Wilking H, et
al. German Outbreak of Escherichia coli O104:H4 Associated with Sprouts. N
Engl J Med [Internet]. 2011 Nov 10 [cited 2018 Mar 8];365(19):1763–70.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22029753
133. Ramamurthy T, Chowdhury G, Pazhani GP, Shinoda S. Vibrio fluvialis: An
emerging human pathogen [Internet]. Vol. 5, Frontiers in Microbiology.
Frontiers; 2014 [cited 2018 Feb 27]. p. 91. Available from:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2014.00091/abstract
134. Grankvist A, Andersson PO, Mattsson M, Sender M, Vaht K, Höper L, et al.
Infections with the tick-borne bacterium “candidatus neoehrlichia mikurensis”
mimic noninfectious conditions in patients with B cell malignancies or
autoimmune diseases. Clin Infect Dis [Internet]. 2014 Jun 15 [cited 2018 Mar
2];58(12):1716–22. Available from: https://academic.oup.com/cid/article-
lookup/doi/10.1093/cid/ciu189
135. Jones KE, Patel NG, Levy MA, Storeygard A, Balk D, Gittleman JL, et al.
Global trends in emerging infectious diseases. Nature [Internet]. 2008 Feb 21
[cited 2018 Mar 3];451(7181):990–3. Available from:
http://www.nature.com/articles/nature06536
136. Daszak P, Lipkin WI. The search for meaning in virus discovery. Curr Opin
Virol [Internet]. 2011 Dec 1 [cited 2018 Feb 26];1(6):620–3. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625711001295?via%3
263
Dihub
137. McFarlane RA, Sleigh AC, McMichael AJ. Land-use change and emerging
infectious disease on an island continent [Internet]. Vol. 10, International
Journal of Environmental Research and Public Health. Multidisciplinary Digital
Publishing Institute; 2013 [cited 2018 Feb 28]. p. 2699–719. Available from:
http://www.mdpi.com/1660-4601/10/7/2699
138. Smits SL, Osterhaus AD. Virus discovery: one step beyond. Current Opinion in
Virology [Internet]. 2013 Apr 1 [cited 2018 Feb 27];e1–6. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S187962571300031X?via%3
Dihub
139. Howard CR, Fletcher NF. Emerging virus diseases: Can we ever expect the
unexpected? [Internet]. Vol. 1, Emerging Microbes and Infections. Nature
Publishing Group; 2012 [cited 2018 Mar 1]. p. e46. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26038413
140. Delwart E. Animal virus discovery: Improving animal health, understanding
zoonoses, and opportunities for vaccine development [Internet]. Vol. 2, Current
Opinion in Virology. Elsevier; 2012 [cited 2018 Mar 6]. p. 344–52. Available
from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625712000399?via%3
Dihub
141. Pillai S, Gopalan V, Lam AKY. Review of sequencing platforms and their
applications in phaeochromocytoma and paragangliomas [Internet]. Vol. 116,
Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2017 [cited 2018 Feb 22]. p. 58–67.
Available from: http://www.croh-online.com/article/S1040-8428(17)30066-5/pdf
142. Escobar-Zepeda A, De León AVP, Sanchez-Flores A. The road to
metagenomics: From microbiology to DNA sequencing technologies and
bioinformatics [Internet]. Vol. 6, Frontiers in Genetics. Frontiers; 2015 [cited
2018 Feb 21]. p. 348. Available from:
http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fgene.2015.00348/abstract
143. Miyamoto M, Motooka D, Gotoh K, Imai T, Yoshitake K, Goto N, et al.
264
Performance comparison of second- and third-generation sequencers using a
bacterial genome with two chromosomes Performance comparison of second-
and third-generation sequencers using a bacterial genome with two
chromosomes. BMC Genomics [Internet]. 2014 Aug 21 [cited 2018 Feb
25];15(1):688–675. Available from:
http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-15-699
144. Thomas T, Gilbert J, Meyer F. Metagenomics - a guide from sampling to data
analysis. Microb Inform Exp [Internet]. 2012 Feb 9 [cited 2018 Feb 21];2(1):3.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22587947
145. Rose R, Constantinides B, Tapinos A, Robertson DL, Prosperi M. Challenges
in the analysis of viral metagenomes. Virus Evol [Internet]. 2016;2(2):vew022.
Available from: https://academic.oup.com/ve/article-
lookup/doi/10.1093/ve/vew022
146. Conceição-Neto N, Zeller M, Lefrère H, De Bruyn P, Beller L, Deboutte W, et
al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral
metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep [Internet].
2015;5(August):16532. Available from:
http://www.nature.com/srep/2015/151112/srep16532/full/srep16532.html
147. Sun G, Xiao J, Wang H, Gong C, Pan Y, Yan S, et al. Efficient purification and
concentration of viruses from a large body of high turbidity seawater. MethodsX
[Internet]. 2014;1:e197–206. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.mex.2014.09.001
148. Kohl C, Brinkmann A, Dabrowski PW, Radoni?? A, Nitsche A, Kurth A. Protocol
for metagenomic virus detection in clinical specimens. Emerg Infect Dis.
2015;21(1):48–57.
149. Thurber R V, Haynes M, Breitbart M, Wegley L, Rohwer F. Laboratory
procedures to generate viral metagenomes. Nat Protoc. 2009;4(4):470–83.
150. Brum JR, Culley AI, Steward GF. Assembly of a Marine Viral Metagenome
after Physical Fractionation. PLoS One. 2013;8(4).
151. Liais E, Croville G, Mariette J, Delverdier M, Lucas MN, Klopp C, et al. Novel
265
avian coronavirus and fulminating disease in Guinea Fowl, France. Emerg
Infect Dis [Internet]. 2014 Jan [cited 2018 Feb 24];20(1):105–8. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24377831
152. Belák S, Karlsson OE, Blomström AL, Berg M, Granberg F. New viruses in
veterinary medicine, detected by metagenomic approaches. Vet Microbiol.
2013;165(1–2):95–101.
153. Berthet N, Reinhardt AK, Leclercq I, van Ooyen S, Batéjat C, Dickinson P, et
al. Phi29 polymerase based random amplification of viral RNA as an alternative
to random RT-PCR. BMC Mol Biol. 2008;9:77.
154. Ma J, Prince A, Aagaard KM. Use of whole genome shotgun metagenomics: A
practical guide for the microbiome-minded physician scientist. Semin Reprod
Med. 2014;32(1):5–13.
155. Sharpton TJ. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.
Front Plant Sci [Internet]. 2014;5(June):209. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4059276&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
156. Capobianchi MR, Giombini E, Rozera G. Next-generation sequencing
technology in clinical virology. Clin Microbiol Infect [Internet]. 2013;19(1):15–22.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23279287
157. Edwards RA, Rohwer F. Viral metagenomics. Nat Rev Microbiol [Internet].
2005 Jun 10 [cited 2018 Mar 15];3(6):504–10. Available from:
http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nrmicro1163
158. Bernardin F, Operskalski E, Busch M, Delwart E. Transfusion transmission of
highly prevalent commensal human viruses. Transfusion [Internet]. 2010 Nov 1
[cited 2018 Mar 14];50(11):2474–83. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1111/j.1537-2995.2010.02699.x
159. Focosi D, Antonelli G, Pistello M, Maggi F. Torquetenovirus: the human virome
from bench to bedside [Internet]. Vol. 22, Clinical Microbiology and Infection.
Elsevier; 2016 [cited 2018 Mar 14]. p. 589–93. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X16300647?via%3
266
Dihub
160. Mokili JL, Rohwer F, Dutilh BE. Metagenomics and future perspectives in virus
discovery [Internet]. Vol. 2, Current Opinion in Virology. Elsevier; 2012 [cited
2018 Feb 26]. p. 63–77. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625711001908?via%3
Dihub#sec0035
161. Rivers TM. Viruses and Koch’s postulates. J Bacteriol. 1937;33(1):1–12.
162. Canuti M, van der Hoek L. Virus discovery: Are we scientists or genome
collectors? [Internet]. Vol. 22, Trends in Microbiology. Elsevier Current Trends;
2014 [cited 2018 Feb 26]. p. 229–31. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X14000274?via%3
Dihub
163. Towner JS, Sealy TK, Khristova ML, Albariño CG, Conlan S, Reeder SA, et al.
Newly discovered Ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in
Uganda. Basler CF, editor. PLoS Pathog [Internet]. 2008 Nov 21 [cited 2018
Mar 12];4(11):e1000212. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19023410
164. McMullan LK, Folk SM, Kelly AJ, MacNeil A, Goldsmith CS, Metcalfe MG, et al.
A New Phlebovirus Associated with Severe Febrile Illness in Missouri. N Engl J
Med [Internet]. 2012 Aug 30 [cited 2018 Mar 12];367(9):834–41. Available
from: http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMoa1203378
165. Kapoor A, Victoria J, Simmonds P, Slikas E, Chieochansin T, Naeem A, et al. A
highly prevalent and genetically diversified Picornaviridae genus in South Asian
children. Proc Natl Acad Sci [Internet]. 2008 Dec 23 [cited 2018 Mar
12];105(51):20482–7. Available from:
http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0807979105
166. Lysholm F, Wetterbom A, Lindau C, Darban H, Bjerkner A, Fahlander K, et al.
Characterization of the viral microbiome in patients with severe lower
respiratory tract infections, using metagenomic sequencing. Highlander SK,
editor. PLoS One [Internet]. 2012 Feb 15 [cited 2018 Mar 12];7(2):e30875.
267
Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0030875
167. Kapoor A, Slikas E, Simmonds P, Chieochansin T, Naeem A, Shaukat S, et al.
A Newly Identified Bocavirus Species in Human Stool. J Infect Dis [Internet].
2009 Jan 15 [cited 2018 Mar 12];199(2):196–200. Available from:
https://academic.oup.com/jid/article-lookup/doi/10.1086/595831
168. Palacios G, Druce J, Du L, Tran T, Birch C, Briese T, et al. A New Arenavirus
in a Cluster of Fatal Transplant-Associated Diseases. N Engl J Med [Internet].
2008 Mar 6 [cited 2018 Mar 12];358(10):991–8. Available from:
http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMoa073785
169. Junglen S, Drosten C. Virus discovery and recent insights into virus diversity in
arthropods [Internet]. Vol. 16, Current Opinion in Microbiology. Elsevier Current
Trends; 2013 [cited 2018 Feb 26]. p. 507–13. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527413000799
170. Wong S, Lau S, Woo P, Yuen K-Y. Bats as a continuing source of emerging
infections in humans. Rev Med Virol [Internet]. 2007 Mar [cited 2018 Mar
13];17(2):67–91. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17042030
171. Lau SKP, Woo PCY, Li KSM, Huang Y, Tsoi H-W, Wong BHL, et al. Severe
acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats.
Proc Natl Acad Sci [Internet]. 2005 Sep 27 [cited 2018 Mar 13];102(39):14040–
5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16169905
172. Yinda CK, Conceição-Neto N, Zeller M, Heylen E, Maes P, Ghogomu SM, et al.
Novel highly divergent sapoviruses detected by metagenomics analysis in
straw-colored fruit bats in Cameroon. Emerg Microbes Infect [Internet]. 2017
May 24 [cited 2018 Mar 13];6(5):e38. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28536431
173. Wang L, Fu S, Cao Y, Zhang H, Feng Y, Yang W, et al. Discovery and genetic
analysis of novel coronaviruses in least horseshoe bats in southwestern China.
Emerg Microbes Infect [Internet]. 2017 Mar 29 [cited 2018 Mar 13];6(3):e14–
e14. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28352124
268
174. Hu B, Zeng LP, Yang X Lou, Ge XY, Zhang W, Li B, et al. Discovery of a rich
gene pool of bat SARS-related coronaviruses provides new insights into the
origin of SARS coronavirus. Drosten C, editor. PLoS Pathog [Internet]. 2017
Nov 30 [cited 2018 Mar 13];13(11):e1006698. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29190287
175. Schountz T, Baker ML, Butler J, Munster V. Immunological control of viral
infections in bats and the emergence of viruses highly pathogenic to humans.
Front Immunol [Internet]. 2017 Sep 11 [cited 2018 Mar 13];8(SEP):1098.
Available from:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.01098/full
176. Veikkolainen V, Vesterinen EJ, Lilley TM, Pulliainen AT. Bats as reservoir hosts
of human bacterial pathogen, Bartonella mayotimonensis. Emerg Infect Dis
[Internet]. 2014 Jun [cited 2018 Mar 13];20(6):960–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24856523
177. Volokhov D V., Becker DJ, Bergner LM, Camus MS, Orton RJ, Chizhikov VE,
et al. Novel hemotropic mycoplasmas are widespread and genetically diverse
in vampire bats. Epidemiology and Infection [Internet]. 2017 Nov 24 [cited 2018
Mar 13];1–14. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29061202
178. Tokarz R, Sameroff S, Hesse RA, Hause BM, Desai A, Jain K, et al. Discovery
of a novel nidovirus in cattle with respiratory disease. J Gen Virol.
2015;96(8):2188–93.
179. Hause BM, Collin EA, Anderson J, Hesse RA, Anderson G. Bovine rhinitis
viruses are common in U.S. cattle with bovine respiratory disease. PLoS One.
2015;10(3):1–12.
180. Mitra N, Cernicchiaro N, Torres S, Li F, Hause BM. Metagenomic
characterization of the virome associated with bovine respiratory disease in
feedlot cattle identified novel viruses and suggests an etiologic role for
influenza D virus. J Gen Virol [Internet]. 2016 Aug 1 [cited 2016 Sep
20];97(8):1771–84. Available from:
http://jgv.microbiologyresearch.org/content/view.action?itemId=http%253A%25
269
2F%252Fsgm.metastore.ingenta.com%252Fcontent%252Fjournal%252Fjgv%
252F10.1099%252Fjgv.0.000492&view=&itemType=http%253A%252F%252F
pub2web.metastore.ingenta.com%252Fns%252FArticle
181. Barb K, Farkas E, Romvary J, Virologica GT-A, 1962 U. Comparative Study of
Influenza Virus Strains Isolated from Domestic Animals in Hungary. Acta Virol
[Internet]. 1962 [cited 2018 May 22];6(3):207–13. Available from:
https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19632700736
182. Molibog E., Smetanin M., Yakhno M. Study of type A influenza virus isolated
from cattle in Udmurtiya. Ekol Virusov. 1975;3:63–7.
183. Fatkhuddinova M, Kiryanova A, Isachenko V, Zakstel’skaya L. Isolation and
identification of influenza A virus in respiratory disease in cattle. Vopr Virusol.
1973;4:474–8.
184. Brown IH, Crawshaw TR, Harris PA, Alexander DJ. Detection of antibodies to
influenza A virus in cattle in association with respiratory disease and reduced
milk yield. Vet Rec [Internet]. 1998 Dec 5 [cited 2018 May 22];143(23):637–8.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9881443
185. Lopez JW, Woods GT. Influenza virus in ruminants: a review. Res Commun
Chem Pathol Pharmacol [Internet]. 1984 Sep [cited 2018 May 22];45(3):445–
62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6390588
186. Graham DA, Calvert V, McLaren IE. Retrospective analysis of serum and nasal
mucus from cattle in Northern Ireland for evidence of infection with influenza A
virus. Vet Rec [Internet]. 2002 Feb 16 [cited 2018 May 22];150(7):201–4.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11878437
187. Crawshaw TR, Brown IH, Essen SC, Young SCL. Significant rising antibody
titres to influenza A are associated with an acute reduction in milk yield in
cattle. Vet J [Internet]. 2008 Oct 1 [cited 2018 May 22];178(1):98–102.
Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023307002419
188. Kalthoff D, Hoffmann B, Harder T, Durban M, Beer M. Experimental infection of
cattle with highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). Emerg Infect Dis
270
[Internet]. 2008 Jul [cited 2018 Mar 26];14(7):1132–4. Available from:
http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/14/7/07-1468_article.htm
189. Lopez JW, Woods GT. Response of calves to exposure with swine influenza
virus. Am J Vet Res [Internet]. 1987 Aug [cited 2018 May 22];48(8):1264–8.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2820279
190. Hause BM, Ducatez M, Collin EA, Ran Z, Liu R, Sheng Z, et al. Isolation of a
Novel Swine Influenza Virus from Oklahoma in 2011 Which Is Distantly Related
to Human Influenza C Viruses. Fouchier RAM, editor. PLoS Pathog [Internet].
2013 Feb 7 [cited 2018 Mar 13];9(2):e1003176. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23408893
191. Hause BM, Collin EA, Liu R, Huang B, Sheng Z, Lu W, et al. Characterization
of a novel influenza virus in cattle and swine: Proposal for a new genus in the
Orthomyxoviridae family. MBio. 2014;5(2):1–10.
192. Eckard LE. Assessment of the Zoonotic Potential of a Novel Bovine Influenza
Virus Assessment of the Zoonotic Potential of a Novel Bovine Influenza Virus.
2016.
193. SIB Swiss Institute of Bioinformatics. Deltainfluenzavirus [Internet]. 2010 [cited
2018 Jun 29]. Available from:
https://viralzone.expasy.org/6077?outline=all_by_species
194. Melman S. Localization of 9-O-Acetylated Sialic Acids in Bovine Respiratory
and Gastrointestinal Tract using Influenza D HEF Protein [Internet]. Universiteit
Utrecht; 2017 [cited 2018 Jun 21]. Available from:
https://dspace.library.uu.nl/handle/1874/353156
195. Yu J, Hika B, Liu R, Sheng Z, Hause BM, Li F, et al. The Hemagglutinin-
Esterase Fusion Glycoprotein Is a Primary Determinant of the Exceptional
Thermal and Acid Stability of Influenza D Virus. mSphere [Internet]. 2017 [cited
2018 Jun 21];2(4):1–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28808690
196. Faccini S, De Mattia A, Chiapponi C, Barbieri I, Boniotti MB, Rosignoli C, et al.
Development and evaluation of a new Real-Time RT-PCR assay for detection
271
of proposed influenza D virus. J Virol Methods [Internet]. 2017;243:31–4.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.01.019
197. Gao Q, Palese P. Rewiring the RNAs of influenza virus to prevent
reassortment. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2009 Sep 15 [cited 2018
May 23];106(37):15891–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19805230
198. Al Faress S, Cartet G, Ferraris O, Norder H, Valette M, Lina B. Divergent
genetic evolution of hemagglutinin in influenza A H1N1 and A H1N2 subtypes
isolated in the south-France since the winter of 2001-2002. J Clin Virol
[Internet]. 2005 Jul 1 [cited 2018 Jun 21];33(3):230–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15911445
199. Chiapponi C, Faccini S, De Mattia A, Baioni L, Barbieri I, Rosignoli C, et al.
Detection of Influenza D Virus among Swine and Cattle, Italy. Emerg Infect Dis
[Internet]. 2016;22(2):352–4. Available from:
http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/22/2/15-1439_article.htm
200. Foni E, Chiapponi C, Baioni L, Zanni I, Merenda M, Rosignoli C, et al. Influenza
D in Italy : towards a better understanding of an emerging viral infection in
swine. Sci Rep [Internet]. 2017;7(May):1–7. Available from:
http://dx.doi.org/10.1038/s41598-017-12012-3
201. Zhai S-L, Zhang H, Chen S-N, Zhou X, Lin T, Liu R, et al. Influenza D Virus in
Animal Species in Guangdong province, Southern China. Emerg Infect Dis
[Internet]. 2017 Aug [cited 2018 Mar 12];23(8):1392–6. Available from:
http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/23/8/17-0059_article.htm
202. Ferguson L, Luo K, Olivier AK, Cunningham FL, Blackmon S, Hanson-dorr K,
et al. Influenza D Virus Infection in Feral Swine Populations , United States.
Emerg Infect Dis [Internet]. 2018 Jun [cited 2018 May 24];24(6):1020–8.
Available from: http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/24/6/17-2102_article.htm
203. White SK, Ma W, McDaniel CJ, Gray GC, Lednicky JA, Hause BM, et al.
Serologic evidence of exposure to influenza D virus among persons with
occupational contact with cattle. J Clin Virol [Internet]. 2016;81:31–3. Available
272
from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1386653216301160
204. Smith DB, Gaunt ER, Digard P, Templeton K, Simmonds P. Detection of
influenza C virus but not influenza D virus in Scottish respiratory samples. J
Clin Virol. 2016;74:50–3.
205. Jiang W-M, Wang S-C, Peng C, Yu J-M, Zhuang Q-Y, Hou G-Y, et al.
Identification of a potential novel type of influenza virus in Bovine in China.
Virus Genes [Internet]. 2014;49(3):493–6. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/s11262-014-1107-3
206. Collin E a., Sheng Z, Lang Y, Ma W, Hause BM, Li F. Cocirculation of Two
Distinct Genetic and Antigenic Lineages of Proposed Influenza D Virus in
Cattle. J Virol [Internet]. 2015;89(2):1036–42. Available from:
http://jvi.asm.org/lookup/doi/10.1128/JVI.02718-14
207. Ferguson L, Eckard L, Epperson WB, Long LP, Smith D, Huston C, et al.
Influenza D virus infection in Mississippi beef cattle. Virology [Internet].
2015;486:28–34. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2015.08.030
208. Ducatez MF, Pelletier C, Meyer G. Influenza D Virus in Cattle , France , 2011 –
2014. EID J. 2015;21(2):2011–4.
209. Horimoto T, Hiono T, Mekata H, Odagiri T, Lei Z, Kobayashi T, et al.
Nationwide distribution of bovine influenza D virus infection in Japan. PLoS
One. 2016;11(9):1–7.
210. Murakami S, Endoh M, Kobayashi T, Takenaka-Uema A, Chambers JK.,
Uchida K, et al. Influenza D virus infection in herd of cattle, Japan. Emerg Infect
Dis [Internet]. 2016;22(8):2015–7. Available from:
http://dx.doi.org/10.3201/eid2208.160362
211. Flynn O, Gallagher C, Mooney J, Irvine C, Ducatez M, Hause B, et al. Influenza
D virus in cattle, Ireland. Vol. 24, Emerging Infectious Diseases. 2018. p. 389–
91.
212. Snoeck CJ, Oliva J, Pauly M, Losch S, Wildschutz F, Muller CP, et al. Influenza
D Virus Circulation in Cattle and Swine, Luxembourg, 2012–2016. Emerg Infect
273
Dis [Internet]. 2018 Jul [cited 2018 Jun 29];24(7):1388–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29912692
213. Mekata H, Yamamoto M, Hamabe S, Tanaka H, Omatsu T, Mizutani T, et al.
Molecular epidemiological survey and phylogenetic analysis of bovine influenza
D virus in Japan. Transbound Emerg Dis [Internet]. 2017;(June):1–6. Available
from: http://doi.wiley.com/10.1111/tbed.12765
214. Luo J, Ferguson L, Smith DR, Woolums AR, Epperson WB, Wan X-F.
Serological evidence for high prevalence of Influenza D Viruses in Cattle,
Nebraska, United States, 2003–2004. Virology [Internet]. 2017;501(October
2016):88–91. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0042682216303464
215. Ferguson L, Olivier A, Genova S, Epperson WB, Smith D, Schneider L, et al.
Pathogenesis of Influenza D viurs in Cattle. J Virol. 2016;90(12):5636–42.
216. Hause BM, Huntimer L, Falkenberg S, Henningson J, Lechtenberg K, Halbur T.
An inactivated influenza D virus vaccine partially protects cattle from respiratory
disease caused by homologous challenge. Vet Microbiol [Internet].
2017;199:47–53. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113516308239
217. Quast M, Sreenivasan C, Sexton G, Nedland H, Singrey A, Fawcett L, et al.
Serological evidence for the presence of influenza D virus in small ruminants.
Vet Microbiol [Internet]. 2015;180(3–4):281–5. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.09.005
218. Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf S, Manichanh C, et al. A human
gut microbial gene catalog established by metagenomic sequencing. Nature.
2010;464(7285):59–65.
219. Hooper L V., Midtvedt T, Gordon JI. How host-microbial interactions shape the
nutrient environment of the mammalian intestine. Annu Rev Nutr [Internet].
2002;22(1):283–307. Available from:
http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.nutr.22.011602.092259
220. Delhaes L, Thumerelle C, Wizla N, Turcq D, Botterel F. Comparaison du
274
microbiote d’un patient atteint de mucoviscidose et de son environnement
domestique par NGS. J Mycol Med [Internet]. 2016;26(2):e8. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1156523316300257
221. Rogers GB, Shaw D, Marsh RL, Carroll MP, Serisier DJ, Bruce KD. Respiratory
microbiota: addressing clinical questions, informing clinical practice. Thorax
[Internet]. 2015;70(1):74–81. Available from:
http://thorax.bmj.com/lookup/doi/10.1136/thoraxjnl-2014-205826
222. Mohr JL. Protozoa as Indicators of Pollution. Sci Mon [Internet]. 1952 [cited
2018 Feb 2];74(1):7–9. Available from: http://www.jstor.org/stable/20835
223. Prescott SL. History of medicine: Origin of the term microbiome and why it
matters. Hum Microbiome J [Internet]. 2017;4:24–5. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.humic.2017.05.004
224. Cox MJ, Cookson WOCM, Moffatt MF. Sequencing the human microbiome in
health and disease. Hum Mol Genet [Internet]. 2013;22(R1):R88–94. Available
from: https://academic.oup.com/hmg/article-lookup/doi/10.1093/hmg/ddt398
225. Marchesi JR, Ravel J. The vocabulary of microbiome research: a proposal.
Microbiome [Internet]. 2015;3(1):31. Available from:
http://www.microbiomejournal.com/content/3/1/31
226. Segal LN, Rom WN, Weiden MD. Lung microbiome for clinicians: New
discoveries about bugs in healthy and diseased lungs. Ann Am Thorac Soc.
2014;11(1):108–16.
227. Merriam-Webster. Microbiome | Definition of Microbiome by Merriam-Webster
[Internet]. 2018 [cited 2018 Feb 2]. Available from: https://www.merriam-
webster.com/dictionary/microbiome
228. Leuwenhoek A Van. An extract of a letter from Mr. Anth. Van Leuwenhoek,
concerning animalcules found on the teeth; of the scaleyness of the skin.
Philos Trans R Soc B Biol Sci ( 1683-1775 ). 1693;17:646–9.
229. Gram H.C. Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und
Trockenpräparaten. Fortschr Med. 1884;2:185–9.
275
230. Gevers D, Knight R, Petrosino JF, Huang K, McGuire AL, Birren BW, et al. The
Human Microbiome Project: A Community Resource for the Healthy Human
Microbiome. PLoS Biol. 2012;10(8).
231. Staley JT, Konopka A. Microorganisms in Aquatic and Terrestrial Habitats.
Annu Rev Microbiol. 1985;39:321–46.
232. Huttenhower C, Gevers D, Knight R, Abubucker S, Badger JH, Chinwalla AT,
et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature
[Internet]. 2012;486(7402):207–14. Available from:
http://dx.doi.org/10.1038/nature11234
233. Stahl DA, Lane DJ, Olsen GJ, Pace NR. Analysis of hydrothermal vent-
associated symbionts by ribosomal RNA sequences. Science [Internet]. 1984
Apr 27 [cited 2018 Jan 30];224(4647):409–11. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17741220
234. Stahl D a, Lane DJ, Olsen GJ, Pace NR. Characterization of a Yellowstone Hot
Spring Microbial Community by 5S rRNA Sequences. 1985;49(6):1379–84.
235. Olsen GJ, Lane DJ, Giovannoni SJ, Pace NR, Stahl DA. Microbial Ecology and
Evolution: A Ribosomal RNA Approach. Annu Rev Microbiol [Internet]. 1986
Oct 28 [cited 2018 Jan 30];40(1):337–65. Available from:
http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.40.100186.002005
236. Giovannoni SJ, Britschgi TB, Moyer CL, Field KG. Genetic diversity in
Sargasso Sea bacterioplankton. Nature [Internet]. 1990 May 3 [cited 2018 Jan
30];345(6270):60–3. Available from:
http://www.nature.com/doifinder/10.1038/345060a0
237. Schmidt TM, Delong EF, Pace NR. Analysis of a Marine Picoplankton
Community by 16S rRNA Gene Cloning and Sequencing. J Bacteriol [Internet].
1991;173(14):4371–8. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16290341%5Cnhttp://link.springer.com/10
.1007/BF01177222%5Cnhttp://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0021979780
905019%5Cnhttp://scitation.aip.org/content/aip/journal/pof2/10/9/10.1063/1.86
9740%5Cnhttp://www.sciencedire
276
238. Eden PA, Schmidt TM, Blakemore RP, Pace2 NR. Phylogenetic Analysis of
Aquaspirillum magnetotacticum Using Polymerase Chain Reaction-Amplified
16s rRNA-Specific DNA. Int J Syst Bacteriol [Internet]. 1991 [cited 2018 Jan
31];41(2):324–5. Available from:
http://www.microbiologyresearch.org/docserver/fulltext/ijsem/41/2/ijs-41-2-
324.pdf?expires=1517409476&id=id&accname=guest&checksum=AF1963DB9
C53F5A263277C71C4DD9B74
239. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Am Soc Microbiol.
1995;59(1):143–69.
240. Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM. Molecular
biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for
natural products. Chem Biol [Internet]. 1998 Oct 1 [cited 2018 Jan
31];5(10):R245–9. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074552198901089
241. Béjà O, Suzuki MT, Koonin E V., Aravind L, Hadd A, Nguyen LP, et al.
Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a
marine microbial assemblage. Environ Microbiol [Internet]. 2000 Oct 1 [cited
2018 Jan 31];2(5):516–29. Available from: http://doi.wiley.com/10.1046/j.1462-
2920.2000.00133.x
242. Gill S, Pop M, Deboy R, Eckburg P, Turnbaugh P, Samuel B, et al.
Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science (80- )
[Internet]. 2006;312(5778):1355–9. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3027896&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
243. Di Bella JM, Bao Y, Gloor GB, Burton JP, Reid G. High throughput sequencing
methods and analysis for microbiome research. J Microbiol Methods [Internet].
2013;95(3):401–14. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2013.08.011
244. Srinivasan R, Karaoz U, Volegova M, MacKichan J, Kato-Maeda M, Miller S, et
277
al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically
relevant bacterial pathogens. Heimesaat MM, editor. PLoS One [Internet]. 2015
Feb 6 [cited 2018 Feb 23];10(2):e0117617. Available from:
http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0117617
245. Dickson RP, Erb-Downward JR, Huffnagle GB. The role of the bacterial
microbiome in lung disease [Internet]. Vol. 7, Expert Review of Respiratory
Medicine. NIH Public Access; 2013 [cited 2018 Sep 18]. p. 245–57. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23734647
246. Nelson KE, Weinstock GM, Highlander SK, Worley KC, Creasy HH, Wortman
JR, et al. A Catalog of Reference Genomes from the Human Microbiome. Sci
Dly [Internet]. 2010 [cited 2018 Feb 1];328(5981):994–9. Available from:
http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.1183605
247. NIH HMP Working Group TNHW, Peterson J, Garges S, Giovanni M, McInnes
P, Wang L, et al. The NIH Human Microbiome Project. Genome Res [Internet].
2009 Dec 1 [cited 2018 Feb 1];19(12):2317–23. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19819907
248. Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, et al. Disordered
microbial communities in asthmatic airways. Neyrolles O, editor. PLoS One
[Internet]. 2010 Jan 5 [cited 2018 Feb 2];5(1):e8578. Available from:
http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0008578
249. Lal CV, Travers C, Aghai ZH, Eipers P, Jilling T, Halloran B, et al. The Airway
Microbiome at Birth. Sci Rep [Internet]. 2016;6(1):31023. Available from:
http://www.nature.com/articles/srep31023
250. Dickson RP, Erb-Downward JR, Freeman CM, McCloskey L, Falkowski NR,
Huffnagle GB, et al. Bacterial Topography of the Healthy Human Lower
Respiratory Tract. Clemente JC, editor. MBio [Internet]. 2017 Mar 14 [cited
2018 Feb 2];8(1):e02287-16. Available from:
http://mbio.asm.org/lookup/doi/10.1128/mBio.02287-16
251. Nayak D, Roth TL, Mcgavern DB. The Lung Microbiome, Immunity and the
Pathogenesis of Chronic Lung Disease. 2014;196(2):367–402.
278
252. Mayhew D, Devos N, Lambert C, Brown JR, Clarke SC, Kim VL, et al.
Longitudinal profiling of the lung microbiome in the AERIS study demonstrates
repeatability of bacterial and eosinophilic COPD exacerbations. Thorax
[Internet]. 2018 Jan 31 [cited 2018 Feb 2];thoraxjnl-2017-210408. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386298
253. Wang Z, Singh R, Miller BE, Tal-Singer R, Van Horn S, Tomsho L, et al.
Sputum microbiome temporal variability and dysbiosis in chronic obstructive
pulmonary disease exacerbations: an analysis of the COPDMAP study. Thorax
[Internet]. 2017 Dec 21 [cited 2018 Feb 2];thoraxjnl-2017-210741. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29269441
254. Dickson RP, Martinez FJ, Huffnagle GB. The role of the microbiome in
exacerbations of chronic lung diseases. Lancet. 2014;384(9944):691–702.
255. van Meel ER, Jaddoe VW V., Bønnelykke K, de Jongste JC, Duijts L. The role
of respiratory tract infections and the microbiome in the development of
asthma: A narrative review. Pediatr Pulmonol [Internet]. 2017;(April):1363–70.
Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/ppul.23795
256. Ipci K, Altıntoprak N, Muluk NB, Senturk M, Cingi C. The possible mechanisms
of the human microbiome in allergic diseases. Eur Arch Oto-Rhino-
Laryngology. 2017;274(2):617–26.
257. Botterel F, Angebault C, Cabaret O, Stressmann FA, Costa J-M, Wallet F, et al.
Fungal and Bacterial Diversity of Airway Microbiota in Adults with Cystic
Fibrosis: Concordance Between Conventional Methods and Ultra-Deep
Sequencing, and Their Practical use in the Clinical Laboratory. Mycopathologia
[Internet]. 2018 Feb 1 [cited 2018 Feb 2];183(1):171–83. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28766039
258. Pittman JE, Wylie KM, Akers K, Storch GA, Hatch J, Quante J, et al.
Association of Antibiotics, Airway Microbiome, and Inflammation in Infants with
Cystic Fibrosis. Ann Am Thorac Soc [Internet]. 2017 Oct [cited 2018 Feb
2];14(10):1548–55. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28708417
279
259. Fastrès A, Felice F, Roels E, Moermans C, Corhay J-L, Bureau F, et al. The
Lung Microbiome in Idiopathic Pulmonary Fibrosis: A Promising Approach for
Targeted Therapies. Int J Mol Sci [Internet]. 2017 Dec 16 [cited 2018 Feb
2];18(12):2735. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29258183
260. de Steenhuijsen Piters WAA, Sanders EAM, Bogaert D. The role of the local
microbial ecosystem in respiratory health and disease. Philos Trans R Soc B
Biol Sci [Internet]. 2015;370(1675):20140294. Available from:
http://dx.doi.org/10.1098/rstb.2014.0294%5Cnhttp://rstb.royalsocietypublishing.
org/lookup/doi/10.1098/rstb.2014.0294%5Cnhttp://rstb.royalsocietypublishing.o
rg/content/370/1675/20140294.full?ijkey=GikMCaOL3zNxNz0&keytype=ref%5
Cnhttp://rstb.royalsocietypublishing
261. Charlson ES, Bittinger K, Haas AR, Fitzgerald AS, Frank I, Yadav A, et al.
Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human
respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med [Internet]. 2011 [cited 2018 Feb
9];184(8):957–63. Available from:
https://www.atsjournals.org/doi/pdf/10.1164/rccm.201104-0655OC
262. Gallacher DJ, Kotecha S. Respiratory Microbiome of New-Born Infants. Front
Pediatr [Internet]. 2016;4(February):1–10. Available from:
http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fped.2016.00010/abstract
263. Dickson RP, Erb-Downward JR, Huffnagle GB. Towards an ecology of the
lung: New conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia
pathogenesis [Internet]. Vol. 2, The Lancet Respiratory Medicine. 2014 [cited
2018 Feb 4]. p. 238–46. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4004084/pdf/nihms574244.pdf
264. Vellend M. Conceptual Synthesis in Community Ecology. Q Rev Biol [Internet].
2010 [cited 2018 Feb 3];85(2):183–206. Available from:
http://userwww.sfsu.edu/parker/bio840/pdfs/2012StudentPapers/TomParker/Ve
llendCommEcolQRB2010.pdf
265. Esposito S, Principi N. Impact of nasopharyngeal microbiota on the
development of respiratory tract diseases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
280
2018;37(1):1–7.
266. Human Microbiome Project Consortium C, Gevers D, Knight R, Abubucker S,
Badger JH, Chinwalla AT, et al. Structure, function and diversity of the healthy
human microbiome. Nature [Internet]. 2012 Jun 13 [cited 2018 Feb
1];486(7402):207–14. Available from:
http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature11234
267. Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras
M, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography [Internet].
Vol. 486, Nature. Nature Publishing Group; 2012 [cited 2018 Feb 5]. p. 222–7.
Available from: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature11053
268. Samuelson DR, Burnham EL, Maffei VJ, Vandivier RW, Blanchard EE, Shellito
JE, et al. The respiratory tract microbial biogeography in alcohol use disorder.
Am J Physiol Cell Mol Physiol [Internet]. 2018 Jan 1 [cited 2018 Feb
2];314(1):L107–17. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28860145
269. Morris A, Beck JM, Schloss PD, Campbell TB, Crothers K, Curtis JL, et al.
Comparison of the respiratory microbiome in healthy nonsmokers and
smokers. Am J Respir Crit Care Med [Internet]. 2013 [cited 2018 Feb
6];187(10):1067–75. Available from:
https://www.researchgate.net/profile/Jeffrey_Curtis2/publication/236046818_Co
mparison_of_the_Respiratory_Microbiome_in_Healthy_Non-
Smokers_and_Smokers/links/5624fe0608ae93a5c92d442d/Comparison-of-the-
Respiratory-Microbiome-in-Healthy-Non-Smokers-and-Smoke
270. Bosch AATM, Piters WAA de S, van Houten MA, Chu MLJN, Biesbroek G,
Kool J, et al. Maturation of the Infant Respiratory Microbiota, Environmental
Drivers, and Health Consequences. A Prospective Cohort Study. Am J Respir
Crit Care Med [Internet]. 2017 Dec 15 [cited 2018 Feb 2];196(12):1582–90.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28665684
271. McAleer JP, Kolls JK. Contributions of the intestinal microbiome in lung
immunity. Eur J Immunol. 2018;48(1):39–49.
281
272. Park YJ, Lee HK. The role of skin and orogenital microbiota in protective
immunity and chronic immune-mediated inflammatory disease. Front Immunol
[Internet]. 2018 Jan 10 [cited 2018 Feb 4];8(JAN):1955. Available from:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.01955/full
273. Hauptmann M, Schaible UE. Linking microbiota and respiratory disease. FEBS
Lett. 2016;590(21):3721–38.
274. Wu BG, Segal LN. Lung Microbiota and Its Impact on the Mucosal Immune
Phenotype. 2017;5(3):1–19.
275. Neish AS. Mucosal immunity and the microbiome. In: Annals of the American
Thoracic Society [Internet]. 2014 [cited 2018 Feb 5]. Available from:
https://www.atsjournals.org/doi/pdf/10.1513/AnnalsATS.201306-161MG
276. Murugesan S, Nirmalkar K, Hoyo-Vadillo C, García-Espitia M, Ramírez-
Sánchez D, García-Mena J. Gut microbiome production of short-chain fatty
acids and obesity in children. European Journal of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases [Internet]. 2017 Dec 2 [cited 2018 Feb 6];1–5. Available
from: http://link.springer.com/10.1007/s10096-017-3143-0
277. Sanz Y, Santacruz A, Gauffin P. Gut microbiota in obesity and metabolic
disorders. Proc Nutr Soc [Internet]. 2010;69(03):434–41. Available from:
http://www.journals.cambridge.org/abstract_S0029665110001813
278. Lyte M. Microbial Endocrinology in the Microbiome-Gut-Brain Axis: How
Bacterial Production and Utilization of Neurochemicals Influence Behavior.
Miller V, editor. PLoS Pathog [Internet]. 2013 Nov 14 [cited 2018 Feb
6];9(11):e1003726. Available from:
http://dx.plos.org/10.1371/journal.ppat.1003726
279. Koeth RA, Wang Z, Levison BS, Buffa JA, Org E, Sheehy BT, et al. Intestinal
microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes
atherosclerosis. Nat Med [Internet]. 2013 [cited 2018 Feb 9];19(5). Available
from:
http://www.lumen.luc.edu/LUMEN/meded/therapy/homepage/DiscussionPaper
_1.pdf
282
280. Ware LB. Use of bronchoalveolar lavage to assess the respiratory microbiome:
signal in the noise. Lancet Respir [Internet]. 2013 [cited 2018 Feb 9];1:354–6.
Available from: http://www.thelancet.com/pdfs/journals/lanres/PIIS2213-
2600(13)70117-6.pdf
281. Charlson ES, Bittinger K, Haas AR, Fitzgerald AS, Frank I, Yadav A, et al.
Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human
respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med [Internet]. 2011 Oct 15 [cited 2018
Feb 9];184(8):957–63. Available from:
http://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/rccm.201104-0655OC
282. Dickson RP, Erb-Downward JR, Martinez FJ, Huffnagle GB. The Microbiome
and the Respiratory Tract. Annu Rev Physiol [Internet]. 2016 [cited 2018 Feb
9];78(1):481–504. Available from:
http://pubmedcentralcanada.ca/pmcc/articles/PMC4751994/pdf/nihms756902.p
df
283. Rogers GB, Wesselingh S. Precision respiratory medicine and the microbiome.
Lancet Respir Med [Internet]. 2016;4(1):73–82. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00476-2
284. Dickson RP, Erb-Downward JR, Huffnagle GB. Towards an ecology of the
lung: New conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia
pathogenesis [Internet]. Vol. 2, The Lancet Respiratory Medicine. Elsevier;
2014 [cited 2018 Feb 4]. p. 238–46. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213260014700281?via%3
Dihub
285. Rogers GB, Hoffman LR, Carroll MP, Bruce KD. Interpreting infective
microbiota: The importance of an ecological perspective. Trends Microbiol
[Internet]. 2013;21(6):271–6. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.tim.2013.03.004
286. Nelson A, De Soyza A, Perry JD, Sutcliffe IC, Cummings SP. Polymicrobial
challenges to Koch’s postulates: Ecological lessons from the bacterial
vaginosis and cystic fibrosis microbiomes. Innate Immun [Internet]. 2012 [cited
283
2018 Feb 12];18(5):774–83. Available from:
http://journals.sagepub.com/doi/pdf/10.1177/1753425912439910
287. Fredricks DN, Relman DA. Sequence-based identification of microbial
pathogens: A reconsideration of Koch’s postulates. Clin Microbiol Rev.
1996;9(1):18–33.
288. Vayssier-Taussat M, Albina E, Citti C, Cosson J-F, Jacques M-A, Lebrun M-H,
et al. Shifting the paradigm from pathogens to pathobiome: new concepts in the
light of meta-omics. Front Cell Infect Microbiol [Internet]. 2014 Mar 5 [cited
2018 Feb 13];4:29. Available from:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2014.00029/abstract
289. Kuss SK, Best GT, Etheredge CA, Pruijssers AJ, Frierson JM, Hooper L V, et
al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic
pathogenesis. Science (80- ) [Internet]. 2011 Oct 14 [cited 2018 Feb
14];334(6053):249–52. Available from:
http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.1211057
290. Cirimotich CM, Dong Y, Clayton AM, Sandiford SL, Souza-Neto JA, Mulenga
M, et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in
Anopheles gambiae. Science (80- ) [Internet]. 2011 [cited 2018 Feb
15];332(6031):855–8. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4154605/pdf/nihms620630.pdf
291. Byrd AL, Segre JA. Adapting Koch’s postulates: Criteria for disease causation
must take microbial interactions into account. Science (80- ) [Internet]. 2016
Jan 15 [cited 2018 Feb 16];351(6270):224–6. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26816362
292. Buffie CG, Bucci V, Stein RR, Mckenney PT, Ling L, Gobourne A, et al.
Precision microbiome restoration of bile acid-mediated resistance to
Clostridium difficile. Nature. 2015;517(7533):205–8.
293. Schieber AMP, Lee YM, Chang MW, Leblanc M, Collins B, Downes M, et al.
Disease tolerance mediated by microbiome E. coli involves inflammasome and
IGF-1 signaling. Science [Internet]. 2015 Oct 30 [cited 2018 Feb
284
15];350(6260):558–63. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26516283
294. Holman DB, Timsit E, Alexander TW. The nasopharyngeal microbiota of feedlot
cattle. Sci Rep [Internet]. 2015 Jan [cited 2016 Apr 18];5(1):15557. Available
from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4620444&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
295. Timsit E, Workentine M, Schryvers AB, Holman DB, van der Meer F, Alexander
TW. Evolution of the nasopharyngeal microbiota of beef cattle from weaning to
40 days after arrival at a feedlot. Vet Microbiol [Internet]. 2016;187:75–81.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2016.03.020
296. Nicola I, Cerutti F, Grego E, Bertone I, Gianella P, D’Angelo A, et al.
Characterization of the upper and lower respiratory tract microbiota in
Piedmontese calves. Microbiome [Internet]. 2017 Nov 21 [cited 2018 Jun
16];5(1):152. Available from:
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-017-
0372-5
297. Timsit E, Workentine M, van der Meer F, Alexander T. Distinct bacterial
metacommunities inhabit the upper and lower respiratory tracts of healthy
feedlot cattle and those diagnosed with bronchopneumonia. Vet Microbiol
[Internet]. 2018 Jun 8 [cited 2018 Jun 13];221:105–13. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113518305637
298. Zeineldin MM, Lowe JF, Grimmer ED, De Godoy MRC, Ghanem MM, Abd El-
Raof YM, et al. Relationship between nasopharyngeal and bronchoalveolar
microbial communities in clinically healthy feedlot cattle. BMC Microbiol.
2017;17(1):1–11.
299. Johnston D, Earley B, Cormican P, Murray G, Kenny DA, Waters SM, et al.
Illumina MiSeq 16S amplicon sequence analysis of bovine respiratory disease
associated bacteria in lung and mediastinal lymph node tissue. BMC Vet Res
[Internet]. 2017;13(1):118. Available from:
285
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28464950
300. Gaeta NC, Lima SF, Teixeira AG, Ganda EK, Oikonomou G, Gregory L, et al.
Deciphering upper respiratory tract microbiota complexity in healthy calves and
calves that develop respiratory disease using shotgun metagenomics. J Dairy
Sci [Internet]. 2017;100(2):1445–58. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022030216308724
301. Lehmkuhl HD, Smith MH, Dierks RE. A bovine adenovirus type 3: isolation,
characterization, and experimental infection in calves. Arch Virol [Internet].
1975 Mar [cited 2018 Apr 5];48(1):39–46. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/BF01320564
302. Kurogi H, Inaba Y, Goto Y, Takahashi A, Sato K, Omori T, et al. Isolation of
rhinovirus from cattle in outbreaks of acute respiratory disease. Arch Gesamte
Virusforsch [Internet]. 1974 Sep [cited 2018 Apr 5];44(3):215–26. Available
from: http://link.springer.com/10.1007/BF01240609
303. Betts AO, Edington N, Jennings AR, Reed SE. Studies on a rhinovirus (EC11)
devived from a calf. II. Disease in calves. J Comp Pathol [Internet]. 1971 Jan 1
[cited 2018 Apr 5];81(1):41-IN9. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0021997571900533
304. Li Y, Wang H, Nie K, Zhang C, Zhang Y, Wang J, et al. VIP: an integrated
pipeline for metagenomics of virus identification and discovery. Sci Rep
[Internet]. 2016;6(September 2015):23774. Available from:
http://www.nature.com/articles/srep23774%5Cnhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pu
bmed/27026381
305. Zhu L, Xing Z, Gai X, Li S, San Z, Wang X. Identification of a novel enterovirus
E isolates HY12 from cattle with severe respiratory and enteric diseases. PLoS
One [Internet]. 2014 [cited 2018 Jun 1];9(5):e97730. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24830424
306. Sharp CP, Gregory WF, Mason C, Bronsvoort BM deC, Beard PM. High
prevalence and diversity of bovine astroviruses in the faeces of healthy and
diarrhoeic calves in South West Scotland. Vet Microbiol [Internet]. 2015;178(1–
286
2):70–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.05.002
307. Alfred N, Liu H, Li M, Hong S, Tang H, Wei Z, et al. Molecular epidemiology
and phylogenetic analysis of diverse bovine astroviruses associated with
diarrhea in cattle and water buffalo calves in China. J Vet Med Sci [Internet].
2015;5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25716289
308. Tse H, Chan WM, Tsoi HW, Fan RYY, Lau CCY, Lau SKP, et al. Rediscovery
and genomic characterization of bovine astroviruses. J Gen Virol.
2011;92(8):1888–98.
309. Nagai M, Omatsu T, Aoki H, Otomaru K, Uto T, Koizumi M, et al. Full genome
analysis of bovine astrovirus from fecal samples of cattle in Japan:
identification of possible interspecies transmission of bovine astrovirus. Arch
Virol [Internet]. 2015 Oct 28 [cited 2018 Jun 1];160(10):2491–501. Available
from: http://link.springer.com/10.1007/s00705-015-2543-7
310. Schlottau K, Schulze C, Bilk S, Hanke D, Höper D, Beer M, et al. Detection of a
Novel Bovine Astrovirus in a Cow with Encephalitis. Transbound Emerg Dis
[Internet]. 2016 Jun [cited 2018 Jun 1];63(3):253–9. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1111/tbed.12493
311. Cordey S, Brito F, Vu DL, Turin L, Kilowoko M, Kyungu E, et al. Astrovirus VA1
identified by next-generation sequencing in a nasopharyngeal specimen of a
febrile Tanzanian child with acute respiratory disease of unknown etiology
[Internet]. Vol. 5, Emerging Microbes and Infections. 2016 [cited 2018 Jun 1]. p.
e67–e67. Available from: http://www.nature.com/articles/emi201667
312. Padmanabhan A, Hause BM. Detection and characterization of a novel
genotype of porcine astrovirus 4 from nasal swabs from pigs with acute
respiratory disease. Arch Virol [Internet]. 2016 Sep 21 [cited 2018 Jun
1];161(9):2575–9. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00705-016-
2937-1
313. Li Y, Khalafalla AI, Paden CR, Yusof MF, Eltahir YM, Al Hammadi ZM, et al.
Identification of diverse viruses in upper respiratory samples in dromedary
camels from United Arab Emirates. Kuhn JH, editor. PLoS One [Internet]. 2017
287
Sep 13 [cited 2018 Jun 1];12(9):e0184718. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28902913
314. Woo PCY, Lau SKP, Teng JLL, Tsang AKL, Joseph S, Xie J, et al. A novel
astrovirus from dromedaries in the middle east. J Gen Virol. 2015;96(9):2697–
707.
315. Kanno T, Hatama S, Ishihara R, Uchida I. Molecular analysis of the S
glycoprotein gene of bovine coronaviruses isolated in Japan from 1999 to
2006. J Gen Virol [Internet]. 2007 [cited 2018 Mar 9];88(4):1218–24. Available
from:
http://www.microbiologyresearch.org/docserver/fulltext/jgv/88/4/1218.pdf?expir
es=1520613046&id=id&accname=guest&checksum=F4919610A75DC32915B
B1DAAA367EFB4
316. Bidokhti MRM, Tråvén M, Ohlson A, Baule C, Hakhverdyan M, Belák S, et al.
Tracing the transmission of bovine coronavirus infections in cattle herds based
on S gene diversity. Vet J [Internet]. 2012;193(2):386–90. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.tvjl.2011.12.015
317. Lee G, Song J-Y, Cho I-S, Yoon S. Cross-reactivity of Vaccine and Fields
Strains of Bovine Coronaviruses in Korea. J Bacteriol Virol [Internet].
2010;40(1):49. Available from:
https://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4167/jbv.2010.40.1.49
318. Gunn L, Collins PJ, O’Connell MJ, O’Shea H. Phylogenetic investigation of
enteric bovine coronavirus in Ireland reveals partitioning between European
and global strains. Ir Vet J [Internet]. 2015;68:31. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4696222&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
319. Lojkić I, Krešić N, Šimić I, Bedeković T. Detection and molecular
characterisation of bovine corona and toroviruses from Croatian cattle. BMC
Vet Res. 2015;11(1):4–9.
320. Alekseev KP, Vlasova AN, Jung K, Hasoksuz M, Zhang X, Halpin R, et al.
Bovine-like coronaviruses isolated from four species of captive wild ruminants
288
are homologous to bovine coronaviruses, based on complete genomic
sequences. J Virol [Internet]. 2008;82(24):12422–31. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2593316&tool=pmce
ntrez&rendertype=abstract
321. Gomez DE, Arroyo LG, Poljak Z, Viel L, Weese JS. Detection of Bovine
Coronavirus in Healthy and Diarrheic Dairy Calves. J Vet Intern Med [Internet].
2017; Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/jvim.14811
322. Park SJ, Kim GY, Choy HE, Hong YJ, Saif LJ, Jeong JH, et al. Dual enteric and
respiratory tropisms of winter dysentery bovine coronavirus in calves. Arch
Virol [Internet]. 2007 Oct 2 [cited 2018 May 22];152(10):1885–900. Available
from: http://link.springer.com/10.1007/s00705-007-1005-2
323. Gélinas AM, Boutin M, Sasseville AMJ, Dea S. Bovine coronaviruses
associated with enteric and respiratory diseases in Canadian dairy cattle
display different reactivities to anti-HE monoclonal antibodies and distinct
amino acid changes in their HE, S and ns4.9 protein. Virus Res.
2001;76(1):43–57.
324. Fehr AR, Perlman S. Coronaviruses: An Overview of Their Replication and
Pathogenesis. 2015;1282:1–23. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2438-7
325. Dong B, Lu H, Zhao K, Liu W, Gao W, Lan Y, et al. Identification and genetic
characterization of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus from
domestic piglets in China. Arch Virol. 2014;159(9):2329–37.
326. Fields BN, Knipe DM (David M, Howley PM. Fields virology [Internet]. Wolters
Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2013 [cited 2017 Nov 20]. 82 p.
Available from: https://locatorplus.gov/cgi-
bin/Pwebrecon.cgi?DB=local&v1=1&ti=1,1&Search_Arg=101601028&Search_
Code=0359&CNT=20&SID=1
327. Boheemen S Van, Graaf M De, Lauber C, Bestebroer TM, Raj VS, Zaki M, et
al. Genomic Characterization of Newly Discovered Coronavirus Associated
with Acute Respiratory Distress Syndrome in Humans. MBio.
289
2012;3(6):e00473-12.
328. Lau SKP, Poon RWS, Wong BHL, Wang M, Huang Y, Xu H, et al. Coexistence
of Different Genotypes in the Same Bat and Serological Characterization of
Rousettus Bat Coronavirus HKU9 Belonging to a Novel Betacoronavirus
Subgroup. J Virol [Internet]. 2010;84(21):11385–94. Available from:
http://jvi.asm.org/cgi/doi/10.1128/JVI.01121-10
329. Yang Y, Du L, Liu C, Wang L, Ma C, Tang J, et al. Receptor usage and cell
entry of bat coronavirus HKU4 provide insight into bat-to-human transmission
of MERS coronavirus. Proc Natl Acad Sci [Internet]. 2014;111(34):12516–21.
Available from: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1405889111
330. Brian DA, Baric RS. Coronavirus Genome Structure and Replication. In:
Coronavirus Replication and Reverse Genetics [Internet]. Berlin/Heidelberg:
Springer-Verlag; 2005 [cited 2018 Mar 15]. p. 1–30. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/3-540-26765-4_1
331. Denison MR, Graham RL, Donaldson EF, Eckerle LD, Baric RS.
Coronaviruses. RNA Biol [Internet]. 2011;8(2):270–9. Available from:
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/rna.8.2.15013
332. Nidovirales - Positive Sense RNA Viruses - Positive Sense RNA Viruses (2011)
- International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [Internet]. 2011
[cited 2018 Feb 19]. Available from: https://talk.ictvonline.org/ictv-
reports/ictv_9th_report/positive-sense-rna-viruses-
2011/w/posrna_viruses/222/coronaviridae
333. Vijgen L, Keyaerts E, Moës E, Thoelen I, Lemey P, Vandamme A, et al.
Complete Genomic Sequence of Human Coronavirus OC43 : Molecular Clock
Analysis Suggests a Relatively Recent Zoonotic Coronavirus Transmission
Event Complete Genomic Sequence of Human Coronavirus OC43 : Molecular
Clock Analysis Suggests a Relatively Recent. J Virol. 2005;79(03):1595–604.
334. Zeineldin M, Lowe J, de Godoy M, Maradiaga N, Ramirez C, Ghanem M, et al.
Disparity in the nasopharyngeal microbiota between healthy cattle on feed, at
entry processing and with respiratory disease. Vet Microbiol [Internet].
290
2017;208(February):30–7. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.07.006
335. Timsit E, Workentine M, Schryvers AB, Holman DB, van der Meer F, Alexander
TW. Evolution of the nasopharyngeal microbiota of beef cattle from weaning to
40days after arrival at a feedlot. Vet Microbiol [Internet]. 2016 May 1 [cited
2016 Apr 18];187:75–81. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27066712
336. Singh K, Ritchey JW, Confer AW. Mannheimia haemolytica: Bacterial-host
interactions in bovine Pneumonia. Vet Pathol [Internet]. 2011 Mar 4 [cited 2018
Mar 27];48(2):338–48. Available from:
http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/0300985810377182
337. Leung RK-K, Zhou J-W, Guan W, Li S-K, Yang Z-F, Tsui -W. Modulation of
potential respiratory pathogens by pH1N1 viral infection. Clin Microbiol Infect
[Internet]. 2013 [cited 2018 Apr 24];19:930–5. Available from:
http://www.clinicalmicrobiologyandinfection.com/article/S1198-743X(14)62977-
3/pdf
338. De Steenhuijsen Piters WAA, Heinonen S, Hasrat R, Bunsow E, Smith B,
Suarez-Arrabal MC, et al. Nasopharyngeal microbiota, host transcriptome, and
disease severity in children with respiratory syncytial virus infection. Am J
Respir Crit Care Med [Internet]. 2016 Nov 1 [cited 2018 Apr 24];194(9):1104–
15. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27135599
339. Reddinger RM, Luke-Marshall NR, Hakansson AP, Campagnari AA. Host
physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus
aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to
invasive disease. MBio [Internet]. 2016 Sep 9 [cited 2018 Apr 15];7(4):e01235-
16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27507829
340. van den Bergh MR, Biesbroek G, Rossen JWA, de Steenhuijsen Piters WAA,
Bosch AATM, van Gils EJM, et al. Associations between Pathogens in the
Upper Respiratory Tract of Young Children: Interplay between Viruses and
Bacteria. PLoS One. 2012;7(10).
291
341. Holman DB, Timsit E, Amat S, Abbott DW, Buret AG, Alexander TW. The
nasopharyngeal microbiota of beef cattle before and after transport to a feedlot.
BMC Microbiol [Internet]. 2017 Dec 22 [cited 2018 May 16];17(1):70. Available
from: http://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-017-
0978-6
342. Lima SF, Teixeira AG V, Higgins CH, Lima FS, Bicalho RC. The upper
respiratory tract microbiome and its potential role in bovine respiratory disease
and otitis media. Sci Rep [Internet]. 2016;6(July):29050. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27363739%5Cnhttp://www.pubmedcentral
.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC4929571%5Cnhttp://www.nature.com/arti
cles/srep29050
343. Naccache SN, Greninger AL, Lee D, Coffey LL, Phan T, Rein-Weston A, et al.
The Perils of Pathogen Discovery: Origin of a Novel Parvovirus-Like Hybrid
Genome Traced to Nucleic Acid Extraction Spin Columns. J Virol [Internet].
2013 Nov 15 [cited 2018 Feb 26];87(22):11966–77. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24027301
344. Schlottau K, Schulze C, Bilk S, Hanke D, Höper D, Beer M, et al. Detection of a
Novel Bovine Astrovirus in a Cow with Encephalitis. Transbound Emerg Dis
[Internet]. 2016 Mar 7 [cited 2016 Apr 16]; Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26948516
345. García-Sastre A. Induction and evasion of type I interferon responses by
influenza viruses. Virus Res [Internet]. 2011 Dec [cited 2018 Jul 24];162(1–
2):12–8. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168170211004114
346. Cowling BJ, Ip DKM, Fang VJ, Suntarattiwong P, Olsen SJ, Levy J, et al.
Aerosol transmission is an important mode of influenza A virus spread. Nat
Commun [Internet]. 2013 Dec 4 [cited 2018 Jul 27];4(1):1935. Available from:
http://www.nature.com/articles/ncomms2922
347. Alonso C, Raynor PC, Goyal S, Olson BA, Alba A, Davies PR, et al.
Assessment of air sampling methods and size distribution of virus-laden
292
aerosols in outbreaks in swine and poultry farms. J Vet Diagnostic Investig
[Internet]. 2017 May 31 [cited 2018 Jul 27];29(3):298–304. Available from:
http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/1040638717700221
348. Corbeil LB, Woodward W, Ward ACS, Mickelsen WD, Paisley L. Bacterial
interactions in bovine respiratory and reproductive infections. J Clin Microbiol
[Internet]. 1985 May [cited 2018 Mar 27];21(5):803–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3998115
293
ANNEXES
Tableau 6: Résultats détaillés du virome respiratoire
Résultats détaillés du virome respiratoire I.
Sample ID
Species virus Genus %Coverage Reads_hit <10 reads
Average depth of coverage
RTPCR detection
LBA 1 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 99.2800 7724 117.9978 BCoV
LBA 1 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.4100 617 7.6107
LBA 1
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 88.5700 168 3.7400
LBA 1
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 88.3000 1313 8.0699
294
EN 1
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 76.9700 1580 11.7251 BCoV
EN 1 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 10.8600 17 .1474
LBA 3
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 94.4300 2258 14.1945 pas de détection
LBA 3
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 93.7800 291 6.5143
LBA 3
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 92.7700 841 9.3033
LBA 3
>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 29.7900 65 .5455
EN 3
>AY864805.1 SARS coronavirus BJ162, complete genome BCoV Betacoronavirus 1.7700 18 .0177 BCoV
LBA 4
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 100.0000 200095 7534.3771 BRSV, BCoV
LBA 4 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.8400 6288 97.2592
LBA 4 >KF906250.1 Dromedary camel BCoV Betacoronavirus 71.2900 573 3.1557
295
coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome
LBA 4
>KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete cds BRBV Aphthovirus 64.8500 91 2.2789
LBA 4
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 23.2800 52 .3749
EN 4
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9300 85928 673.9432
BRSV, BCoV, BPI3
EN 4 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 99.8000 53505 828.8784
EN 4
>KT148961.1 Bovine parvovirus - 2, complete genome BPV2 Copiparvovirus 40.9300 221 7.9089
EN 4
>KJ647285.1 Bovine parainfluenza virus 3 isolate TVMDL16, complete genome BPI3 Respirovirus 19.6900 77 1.1684
LBA 6
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.9800 875801 14590.6435 pas de détection
LBA 6
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 98.7900 373 11.2907
LBA 6
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 90.3700 1660 9.2731
296
LBA 6 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 27.3000 60 .4425
EN 6
>JF749843.1 Foot-and-mouth disease virus - type A isolate Egypt/2006, complete genome BRAV Aphthovirus 63.0000 4771 49.5214 pas de détection
EN 6 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 3.5000 5 (<10 reads) .0428
LBA 7
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.5300 917 11.3383 BRSV
LBA 7
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 89.3300 1653 9.8624
LBA 7
>NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, complete genome BAV Mamastrovirus 75.2500 213 4.6909
LBA 7
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 25.9900 63 .4525
EN 7
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 76.4800 1210 17.8321 pas de détection
EN 7 >KP887098.1 UNVERIFIED: Murine coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 4.0400 16 .0404
LBA 9
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, BCoV Betacoronavirus 99.9600 950109 8020.8525 BCoV
297
complete genome
LBA 9 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 86.7000 381 4.8600
LBA 9
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 73.6100 88 2.1289
LBA 9
>NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, complete genome BRBV Aphthovirus 29.5700 25 .6351
LBA 9
>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 16.3400 31 .2274
EN 9
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.8900 13885 104.3452 BCoV
EN 9
>KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete cds BRBV Aphthovirus 97.2100 2586 70.0357
EN 9
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 6.6600 8 (<10 reads) .0693
LBA 10
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 84.4000 341 4.1382 BCoV
LBA 10
>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, complete genome BCoV Betacoronavirus 77.5600 605 3.5406
LBA 10 >NC_001989.1 Bovine respiratory BRSV Pneumovirus 69.4000 401 5.9045
298
syncytial virus, complete genome
LBA 10 >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, complete genome BAV Mamastrovirus 66.1200 92 2.2133
LBA 10
>KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes, complete cds
Bocaparvovirus 3.8500 9 (<10 reads) .0435
EN 10
>KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete cds BRBV Aphthovirus 99.9100 44798 1201.3592 BCoV
EN 10
>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, complete genome BCoV Betacoronavirus 11.4400 38 .1749
LBA 11
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 97.2800 318 7.4668 BPI3
LBA 11 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.7300 795 9.3280
LBA 11
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 91.9500 1695 9.6416
EN 11
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.8700 16601 260.7001 BPI3, BCoV
EN 11 >KF906249.1 Dromedary camel BCoV Betacoronavirus 98.6600 5640 33.4133
299
coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome
EN 11 >NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, complete genome BRBV Aphthovirus 47.2200 61 1.4322
LBA 15
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9600 379033 3149.2247 pas de détection
LBA 15 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 52.9200 131 1.1090
LBA 15
>NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, complete genome BAV Mamastrovirus 39.6800 43 .6863
LBA 15
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 32.8400 66 .6986
EN 15 NA
NA NA NA NA BCoV
LBA 16
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 93.1400 2245 15.5663 BCoV
LBA 16
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 65.5700 71 1.1787
LBA 16
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 56.4900 187 1.5595
LBA 16 >NC_001989.1 Bovine respiratory BRSV Pneumovirus 34.1100 67 .6206
300
syncytial virus, complete genome
EN 16
>NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, complete genome BRBV Aphthovirus 99.4500 15837 533.3836 BCoV
EN 16
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9700 3909265 33254.6893
EN 16
>KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 isolate XJA13, complete genome BPI3 Respirovirus 14.3100 19 .1792
EN 16
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 1.4700 7 (<10 reads) .0182
LBA 17
>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, complete genome BCoV Betacoronavirus 71.2200 541 2.8059 BCoV
LBA 17 >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, complete genome BAV Mamastrovirus 70.8000 154 4.1496
LBA 17
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 55.5900 128 1.1757
LBA 17
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 20.9500 49 .4031
EN 17
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 98.6900 3701 22.6787 pas de détection
EN 17 >HQ832578.1 Foot-and-mouth disease BRAV Aphthovirus 23.5900 137 1.8136
301
virus - type A isolate IND 161/2003, complete genome
EN 17
>LC000638.1 Bovine parainfluenza virus 3 viral cRNA, complete genome, isolate: HS9 BPI3 Respirovirus 8.3700 33 .1194
EN 17
>KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes, complete cds
Bocaparvovirus 5.7200 15 .0720
EN 17
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 3.8200 15 .0420
LBA 18
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 86.9000 399 6.0948
LBA 18
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 33.3700 95 .6539
EN 18
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.2800 5315 32.6700 pas de détection
EN 18
>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 42.7700 134 3.1477
EN 18
>NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, complete genome BRBV Aphthovirus 34.5600 33 .5528
EN 18 >KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 BPI3 Respirovirus 17.1400 32 .2349
302
isolate XJA13, complete genome
LBA 19
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 75.2900 528 3.3365 BRSV, BCoV
LBA 19 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 5.0200 4 (<10 reads) .0522
EN 19
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9500 939150 7909.5940 BCoV
EN 19
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 5.8100 8 (<10 reads) .0581
LBA 20
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 73.2100 468 3.6550 BCoV
EN 20
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9600 426867 3540.0340 BCoV
EN 20 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 8.8400 20 .1878
EN 20 >LC000638.1 Bovine parainfluenza virus 3 BPI3 Respirovirus 5.6000 12 .0560
303
viral cRNA, complete genome, isolate: HS9
EN 20
>AY593769.1 Foot-and-mouth disease virus A isolate a25 argentina iso38, complete genome BRAV Aphthovirus 4.9700 5 (<10 reads) .0497
LBA 21
>KU558922.1 Betacoronavirus 1 isolate Buffalo coronavirus B1-24F, complete genome BCoV Betacoronavirus 38.6800 112 .7326 BCoV
LBA 21 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 38.3800 116 1.7587
EN 21
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 99.0700 5501 32.5346
EN 21
>KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 isolate XJA13, complete genome BPI3 Respirovirus 16.8800 47 .2299
EN 21
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 8.8600 24 .2461
LBA 23
>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 34.2800 107 1.4534 BRSV
EN 23
>NC_001859.1 Bovine enterovirus, complete genome EVb Enterovirus 92.8900 2233 52.2601 BCoV
304
EN 23
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 70.0800 606 2.4989
EN 23
>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 26.3800 51 .4570
EN 23
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 13.4500 35 .4740
EN 23
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 11.1300 143 1.9650
LBA 24
absence de virus respiratoire - traces de coronaviridae (pas beta)
pas de détection
LBA 24
>KC462884.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asial/HN/2006, complete sequence BRAV Aphthovirus .4600 2 (<10 reads) .0046
LBA 24
>KU316100.1 Human respiratory syncytial virus strain RSVB/Homo sapiens/USA/94E-140-01/1994, complete genome BRSV Pneumovirus .3200 2 (<10 reads) .0032
EN 24
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 78.6900 848 3.8269 pas de détection
EN 24 >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 15.6400 60 .7662
305
serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome
EN 24 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 7.3400 15 .1270
LBA 25
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 10.6500 31 .1464 pas de détection
LBA 25 >NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 5.5900 11 .1421
EN 25
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 97.7300 3874 28.0127 pas de détection
EN 25
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 11.1100 40 .5403
EN 25
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 5.5300 15 .1007
EN 25
>KT071671.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain NX49, complete genome BPI3 Respirovirus 5.1300 25 .0529
LBA 26
>AY593769.1 Foot-and-mouth disease virus A isolate a25 argentina iso38, complete genome BRAV Aphthovirus 1.5700 1 (<10 reads) .0157 pas de détection
306
LBA 26 >KP887098.1 UNVERIFIED: Murine coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus .7800 9 (<10 reads) .0081
EN 26
>HQ832578.1 Foot-and-mouth disease virus - type A isolate IND 161/2003, complete genome BRAV Aphthovirus 92.9100 142199 1954.0993 pas de détection
EN 26
>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, complete genome BCoV Betacoronavirus 63.5800 431 1.7285
EN 26
>KJ647288.1 Bovine parainfluenza virus 3 isolate TVMDL24, complete genome BPI3 Respirovirus .4900 3 (<10 reads) .0049
EN 26
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 2.5100 11 .0375
LBA 28
>KP856967.1 Human respiratory syncytial virus strain RSVA/Homo sapiens/USA/81E-025-01/1981, complete genome BRSV Pneumovirus .7500 4 (<10 reads) .0075 pas de détection
LBA 28 >AY864805.1 SARS coronavirus BJ162, complete genome BCoV Betacoronavirus 1.7700 18 .0177
EN 28
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 73.9300 675 2.9974 pas de détection
EN 28 >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 13.0700 41 .5659
307
serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome
EN 28 >KM402138.1 Porcine bocavirus isolate GD10, complete genome
Bocaparvovirus 7.3500 17 .0982
EN 28
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 6.1600 15 .1023
EN 28
>KT071671.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain NX49, complete genome BPI3 Respirovirus 5.4400 17 .0584
LBA 29
>KP887098.1 UNVERIFIED: Murine coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 2.3300 17 .0261 pas de détection
LBA 29
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 1.1700 2 (<10 reads) .0117
LBA 29
>KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes, complete cds
Bocaparvovirus 1.0900 2 (<10 reads) .0109
EN 29
>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, complete genome BCoV Betacoronavirus 87.8700 1133 7.4964 pas de détection
EN 29 >KM822593.1 Yak astrovirus isolate S8, complete genome BAV Mamastrovirus 25.3800 133 3.6370
EN 29
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 8.8400 19 .2953
308
serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome
LBA 30
>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 75.8200 1400 19.5045 BRSV
LBA 30
>KC412634.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asia1/HN/2006, complete genome BRAV Aphthovirus 1.8300 3 (<10 reads) .0183
EN 30
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 91.2100 12165 176.5679 pas de détection
EN 30
>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome BCoV Betacoronavirus 86.7300 860 5.1425
EN 30
>KC412634.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asia1/HN/2006, complete genome BRAV Aphthovirus 1.8300 3 (<10 reads) .0183
EN 30
>NC_002526.1 Bovine ephemeral fever virus, complete genome
Ephemerovirus 4.7600 28 .0514
LBA 31
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 2.4700 8 (<10 reads) .0247 BRSV
LBA 31 >KP887098.1 UNVERIFIED: Murine coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 2.0500 21 .0211
LBA 31
>KP764763.1 Bovine parainfluenza virus 3 strain TtPIV-1, complete genome BPI3 Respirovirus 1.1700 6 (<10 reads) .0117
309
EN 31
>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome BCoV Betacoronavirus 72.5200 634 2.7901 BCoV
EN 31
>AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome BRAV Aphthovirus 10.6200 42 .5648
EN 31
>NC_001989.1 Bovine respiratory syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 9.2800 25 .1695
EN 31
>KJ647287.1 Bovine parainfluenza virus 3 isolate TVMDL20, complete genome BPI3 Respirovirus 4.3700 22 .0496
L’identification et la caractérisationdes pathogènes respiratoires bovinsest en plein essor. De nouveaux virus ont été identifiésdans l’appareil respiratoire des animaux malades.
Le virus respiratoire syncytial bovin(VRSB) reste actuellement l’agent patho-gène viral majeur le plus fréquemment
isolé parmi les virus respiratoires bovins. Lescoronavirus bovins (bCoV) et, dans unemoindre mesure, les virus parainfuenza(bPI3) sont eux aussi très présents. De nou-veaux virus ont cependant été récemmentidentifiés pour lesquels le pouvoir pathogè-ne est à démontrer. Cet article propose des données actualiséessur la prévalence des agents pathogènesrespiratoires connus, puis présente lesconnaissances sur l’identification de nou-veaux virus respiratoires bovins.
LA PRÉVALENCE ACTUELLE DES PATHOGÈNES RESPIRATOIRESCONNUS EN FRANCE
Les données disponibles en France
� En France, il n’existe pas de donnéesexhaustives récentes sur la séroprévalencedes virus respiratoires.On considère qu’elleest importante, au moins pour le virusrespiratoire syncytial bovin (VRSB) et le virusparainfluenza de type 3 (bPI3) (photo). � La détection directe des virus et desbactéries à partir des prélèvements de
l’appareil respiratoire profond lors debronchopneumonie infectieuse (BPI) estthéoriquement un indicateur plus précis etplus efficace de leur prévalence et de leurimputabilité clinique.� Les études anciennes de prévalence despathogènes respiratoires ont montré desdifférences qui soulignent l’impact destechniques analytiques sur les résultats, etune probable diversité, attribuable a minimaaux facteurs géographiques. Par exemple,dans ces études, les techniques de détectionutilisées étaient différentes selon l’agentinfectieux recherché, avec chacune descaractéristiques propres de sensibilité etspécificité.� Ainsi, en élevages naisseurs, l’infection parle virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) seulet / ou en association était dominante (33 p.cent des veaux) et le coronavirus bovin (BoCV)
actualités en perspectivevers une identificationde nouveaux virusrespiratoires bovins
A C T U A L I T É S
Gilles Meyer1,2
Claire Pelletier3
Nicolas Herman1
Mariette Ducatez2
Hervé Cassard1,2
Elias Salem2
1Université de Toulouse,Institut National Polytechnique (INP),École Vétérinaire de Toulouse (ENVT),31076 Toulouse cedex 032Institut National de la RechercheAgronomique (INRA), Unité mixte de recherche UMR1225,Interactions hôtes - agents pathogènes (IHAP)31076 Toulouse cedex 33Laboratoire départemental d’analyses de Saône et Loire, LDA71, 71009 Mâcon
Essentiel
� En France, il n’existe pasde données exhaustivesrécentes sur la séroprévalencedes virus respiratoires.
� La technique PCR améliorela sensibilité de détectiondes pathogènes respiratoires, notamment desPasteurellacae.
Objectifs pédagogiques
� Connaître les dernièresdonnées sur la prévalencedes agents pathogènes respiratoires connus.
� Présenter les connaissancesrécentes sur l’identificationde nouveaux virus respiratoires bovins.
� Crédit Formation Continue :0,05 CFC par article
� En Suède, selon une étude de 2010, la préva-lence des infections à virus respiratoire syncy-tial bovin (VRSB) dans le cheptel bovin viandevarie entre 8 et 70 p. cent, selon la densité desanimaux et les régions. La prévalence du corona-virus bovin (BCoV) est plus faible mais varieparallèlement à celle du VRSB [2].
� En Italie, en élevage laitier, sur 59 élevages tes-tés, au moins une vache séropositive au VRSBest présente dans ces élevages testés [4]. Dans25 p. cent des élevages, tous les individus testéssont séropositifs.
� En Norvège, la prévalence des veaux de plusde 5 mois dans les élevages laitiers est estiméeen 2009 à 50 p. cent, 39 p. cent et 31 p. cent,respectivement pour les virus bPI3, bCoV etVRSB [5].
En 2013, la prévalence nationale moyenne d’ate-liers infectés par la rhinotrachéite infectieusebovine (IBR) est de 10 p. cent, avec une préva-lence plus importante en atelier allaitant qu’enatelier laitier et une très importante variabilitéentre départements (prévalence troupeau de0,05 p. cent à 90 p. cent).
Encadré - La prévalence des virus respiratoires : synthèse de quelques études
1er Prix éditorial2014
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31
80 - MAI / AOÛT 2015 8
En France, il n’existe pas de données exhaustivesrécentes sur la séroprévalence des virus respiratoires(photo G Meyer).
Reproduction interditeToute reproduction ou représentation, intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, de la présen-te publication sans autorisation est illicite et constitue une contrefaçon. L’autorisation de reproduire un articledans une autre publication doit être obtenue auprès de l’éditeur, NÉVA. L’autorisation d’effectuer des reproductionspar reprographie doit être obtenue auprès du Centre français d’exploitation du droit de la copie (C.F.C.).
NÉVAEUROPARC 15, rue E. Le Corbusier
94035 CRÉTEIL CEDEXTél : (33) 1-41-94-51-51Courriel : [email protected]
actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins
A C T U A L I T É S
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31MAI / AOÛT 2015 - 819
était en 1999 le 2e virus détecté dans l’ordrede fréquence décroissante [17]. � En élevage de veaux de boucherie, dansl’Est de la France en 2008, l’infection par levirus parainfluenza de type 3 (bPI3) était pré-dominante parmi les virus, sans que lesauteurs précisent le statut clinique des lotsde veaux étudiés [1].
Les nouvelles méthodes analytiques
� Pour limiter, à défaut d’éliminer, les varia-bilités liées aux méthodes analytiques, destechniques d’amplification génique entemps réel (qPCR) ont été récemmentmises au point, qui permettent de détecterrapidement le Virus respiratoire syncytialbovin (VRSB), le virus parainfluenza de type 3(bPI3), le Coronavirus bovin (bCoV) et lesbactéries M. bovis, M. haemolytica, P. multo-cida et H. somni. Cette détection peut êtrecouplée à la recherche du virus de la diar-rhée bovine (BVDV) ou de l’herpèsvirusbovin de type 1 (BoHV-1), là aussi par PCR. � Cet outil a récemment été utilisé dansdeux études de prévalence des pathogènesrespiratoires. 1.La première étude (étude 1) est une analy-se de 602 prélèvements respiratoires obtenussur trois années consécutives par le LDA71dans le cadre du diagnostic vétérinaire [12, 13].Les prélèvements respiratoires sont :- un écouvillonnage nasal (EN) ;- une aspiration transtrachéale (ATT) ;- un prélèvement de poumon. 2. La deuxième étude (étude 2), réalisée parl’École Vétérinaire de Toulouse (INP-ENVT),est un peu différente car elle entre dans lecadre d’un projet de recherche ICSA (InstitutCarnot pour la Santé Animale) Respicare.Les critères d’inclusion des prélèvementssont des écouvillons nasaux (EN) et des lava-ges broncho-alvéolaires (endoscopie sousanesthésie, LBA) simultanés chez trois à cinqveaux par élevage, non traités aux antibio-tiques, non vaccinés et en début d’infectionrespiratoire (stade hyperthermie). Quatre-vingt-deux veaux, issus de 19 élevages nais-seurs ont ainsi été testés.
Les résultats de deux études récentes
� Globalement ces études font ressortir lespoints suivants (tableau 1) : 1. Dans respectivement 80 p. cent et 94 p.cent des cas (études 1 et 2), il a été possibled’identifier un des sept agents respiratoiresrecherchés. Les différences peuvent êtreexpliquées par les critères d’inclusion dechaque étude. Par comparaison avec des
techniques conventionnelles (étude 1) latechnique PCR améliore la sensibilité dedétection notamment des bactéries respira-toires, et plus particulièrement P. multocida. 2. Les co-infections sont apparues très fré-quentes dans plus de 40 p. cent des caspour la 1ère étude et plus de 63,2 p. centdes cas pour la 2e (figure 1). Il n’est pas res-sorti d’association préférentielle entre lesagents infectieux au moins pour l’étude 2.� Cette fréquence de co-infections a aussiété récemment observée dans une étudeirlandaise dans laquelle un virus a été identi-fié dans 35 p. cent des troubles respiratoireset où 40 p. cent des veaux infectés avaientplus de deux virus présents [11]. 3. Les différences entre les études 1 et 2s’expliqueraient par une possible suresti-mation de la fréquence (très importante) deP. multocida dans la deuxième étude.Dans cette étude, un nombre non négligea-ble de prélèvement ont des valeurs P. multo-cida très proches de la valeur seuil négative.
Fréquence de détection
Étude 1 (LDA71)Étude 2 (ENVT)
Écouvillons nasaux
Liquide broncho-alvéolaire
�VRSB 22 - 23 % 5,3 % 26,3 %
�bCoV 17 - 19 % 63,2 % 42,1 %
�bPI3V 6 - 8 % 10,5 % 5,3 %
�M. haemolytica 20 - 21 % 26,3 % 15,8 %
� P. multocida 50 - 52 % 74,2 % 74,2 %
�H. somni 22 - 23 % 47,4 % 36,8 %
�M. bovis 9 - 10 % 5,3 % 10,5 %
Tableau 1 - Fréquence de détection des agents pathogènes respiratoires obtenus par le LDA71 dans le cadre du diagnostic vétérinaire
(602 prélèvements, [12, 13])ou par l’INP-ENVT (19 élevages naisseurs, projet Respicare)
Nouveau !
� Des techniques d’amplification génique en temps réel (qPCR) ont été récemment misesau point, qui permettentde détecter rapidementle virus respiratoire syncytial bovin (VRSB), le virus Parainfluenza de type 3 (bPI3), le Coronavirus bovin(bCoV) et les bactéries M. bovis, M. haemolytica,P. multocida et H. somni.
00
Écouvillons nasauxLavages bronchoalvéolaires
Nombre d'agents pathogènes
%
1 2 3 4
5101520253035404550
Figure 1 - Répartition (%) des écouvillons nasaux
et lavages broncho-alvéolaires en fonction du nombre de pathogènes détectés
lors de l’étude 2 (INP-ENVT)
actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31
82 - MAI / AOÛT 2015 10
4. Il existe une grande fréquence de détec-tion du coronavirus bovin (bCoV), variableselon les études entre 17 et 53 p. cent desprélèvements, et cela y compris dans les pré-lèvements de l’appareil respiratoire profond. Pour l’étude 2 menée à l’ENVT, dans 30 p.cent des LBA positifs en bCoV, ce virus est leseul agent pathogène identifié. Pour les 70p. cent restant, les associations les plus fré-quentes sont observées avec H. somni (66 p.cent), puis le VRSB (33 p. cent). Compte tenude cette forte prévalence, il serait intéres-sant de pouvoir mieux caractériser à l’avenirle pouvoir pathogène de ce virus, considérécomme modéré jusqu’à présent. 5. La fréquence actuelle de détection de M.bovis est autour de 10 p. cent, avec desrésultats similaires entre les deux études. 6. La fréquence de H. somni est relative-ment importante (entre 17 et 43 p. cent).Cette bactérie était probablement sous-détectée auparavant, dans la mesure où sonisolement nécessite des conditions particu-lières de culture.� Des différences dans les fréquences dedétection ont été observées lors de la 2eétude selon que la PCR a été réalisée surécouvillons nasaux (EN) ou liquide broncho-alvéolaire (LBA). Ces différences sont parti-culièrement notoires pour le VRSB qui estdétecté quatre fois plus dans le LBA par rap-port aux EN. De même, M. bovis est plus fré-quemment détectée dans le LBA. Ces résultats vont dans le sens de la premiè-re étude bien que les différences observées(analyses par type de prélèvement, ATT ouEN versus poumon) soient nettement moinsimportantes pour le VRSB. En revanche, lesfréquences de détection du bPI3 sont simi-laires quelle que soit la nature du prélève-ment. Les explications seraient liées au tro-pisme tissulaire des agents incriminés ou àleur pouvoir pathogène, en supposant queles prélèvements pulmonaires et les LBAsoient plus représentatifs d’une forme cli-nique sévère. Pour les pasteurelles, la fré-quence de détection est plus grande dansles EN par rapport aux LBA ou ATT, et ce, demanière plus marquée pour P. multocida, aumoins dans la première étude.
Les limites de ces études
� Ces deux études, si elles apportent desindications récentes sur la prévalence desagents pathogènes respiratoires, doiventtoutefois être considérées par rapport à leurslimites liées aux modes opératoires (absencede critères stricts d’inclusion dans l’étude 1,élevages uniquement naisseurs et nombre
limité de prélèvements pour l’étude 2). Par ailleurs, elles concernent principalementles élevages naisseurs.� Les résultats seraient probablement diffé-rents pour les autres types de production.
VERS UNE CARACTÉRISATION DE NOUVEAUX VIRUS RESPIRATOIRESBOVINS ?
� Depuis quelques années, de nouveauxprojets de recherche ont pour but de mieuxcaractériser les pathogènes respiratoires,et notamment d’identifier de nouveauxagents, principalement des virus. � Trois explications majeures peuvent êtreavancées. 1. Même avec des techniques très sensiblescomme les PCR, il existe encore un pour-centage non négligeable de résultats néga-tifs (5 p. cent et 20 p. cent pour les études 1et 2, respectivement), même lorsque l’oncible l’ensemble des pathogènes respiratoi-res connus et que l’on se place dans lesconditions optimales d’échantillonnage. Se pose alors la question de l’existence devirus respiratoires bovins encore non identifiés. � En santé humaine, par exemple, au moinsdeux virus respiratoires pathogènes, leMétapneumovirus humain et le Bocavirus(parvovirus), ont été isolés ces 10 dernièresannées chez l’enfant.2. Si le pouvoir pathogène individuel d’unagent est bien connu, ne le sont, en revan-che, pas les co-infections et leur importance. 3. La troisième explication est d’ordreméthodologique et liée au développementrécent d’outils très performants de détectionet de recherche de pathogènes (figure 2).Parmi ceux-ci le séquençage à haut débit(NGS, pour next generation sequencing)permet maintenant d’analyser des millionsde séquences, à des coûts acceptables pourla recherche, en quelques heures à partird’un même prélèvement [14]. Il permet doncune recherche exhaustive de nouveaux virusou bactéries présents dans l’échantillontesté (figure 3).� Les intérêts de ces techniques reposentsur leur puissance de détection et le carac-tère non ciblé de la recherche. � Leurs limites portent sur l’analyse bioin-formatique de ces megadonnées et leurinterprétation, notamment en termes d’im-putabilité clinique sur le terrain.� Ainsi deux approches peuvent être défi-nies :- une approche ciblée qui repose sur unehypothèse préalable, donc sur les connais-
Nouveau !
� Dans deux études récentesréalisées par la technique PCR,un des sept agents respiratoires recherchés a été identifié.
� Les co-infections sont apparues très fréquentesdans plus de 40 p. cent des cas pour la 1ère étude et plus de 63,2 p. cent des cas pour la 2e.
� Il existe une grande fréquence de détection du Coronavirus bovin(bCoV), variable selon les études entre 17 et 53 p. cent des prélèvements.
� La fréquence actuelle de détection de M. bovisest autour de 10 p. cent.
� Les intérêts des séquençagesà haut débit reposent sur leur puissance de détection et le caractèrenon ciblé de la recherche.
� Leurs limites portent sur l’analyse bioinformatiquede ces mégadonnées et leur interprétation.
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31MAI / AOÛT 2015 - 8311
sances existantes (données préliminaires,pathologie comparée, ...) et “l’intuition”scientifique ; - une approche qui repose sur une recher-che exhaustive de tous les virus et / ou bac-téries présents, puis une analyse des résul-tats obtenus.
Une approche ciblée : un cas d’identification de l’Influenza virus D (IDV)
� La détection récente d’un Influenza virusbovin est typique de l’approche ciblée.
Aux États-Unis
� En 2011, des porcs présentant un syndro-me fébrile ont été échantillonnés aux USA,pour recherche de virus. Un nouveau virus aalors été identifié, puis classifié comme unInfluenza du genre C (C/OK) [6]. Des étudesphylogénétiques et sérologiques ultérieures(inhibition de l’hémagglutination) ont mon-tré que ce virus était finalement différent desInfluenza C, et que ces différences étaientmême plus importantes que celles existantentre les genres A et B du virus Influenza. Il apar conséquent été proposé comme unnouveau genre Influenza D (virus IDV) dansla famille des Orthomyxoviridae [7]. � Dans la mesure où la prévalence du virusInfluenza de type D (IDV) était faible chez lesporcs, ce virus a été recherché dans d’autresespèces, notamment dans l’espèce bovine,en tenant compte des données épidémiolo-giques existantes. Il a été détecté pour lapremière fois en 2012 - 2013 chez des bovinsaméricains présentant des troubles respira-toires. � En 2014, toujours aux USA, la détection parRT-qPCR à partir de 206 écouvillons nasaux(EN) de veaux malades a montré que 5 p.cent d’entre eux étaient positifs à l’IDV [7].
En France
� En France, l’INP-ENVT, en collaborationavec le LDA 71, a recherché l’IDV parRTqPCR sur des prélèvements (EN, aspira-tion transtrachéale ATT, poumons) utiliséspour le diagnostic des virus respiratoiresbovins (Bronchopneumonies infectieuses),et récoltés entre 2010 et 2013 (à raison de 25échantillons par an) et début 2014 (34 échan-tillons) [3]. - Six échantillons, soit 4,5 p. cent, sont IDVpositifs : quatre de la campagne de collectede 2014 et deux échantillons antérieurementrécoltés en 2011 et 2012 et conservés aulaboratoire (tableau 2). - Deux échantillons de 2014 sont négatifspour tous les autres pathogènes recherchés(bCoV, bPI3, VRSB, BVDV, Pasteurella multo-cida, Mannheimia haemolytica, Histophilussomni et M. bovis).
En médecine humaine,
� Au moins deux virus respiratoires pathogènes, le Métapneumovirus humainet le Bocavirus (parvovirus),ont été isolés ces 10 dernières annéeschez l’enfant.
Figure 2 - Démarche méthodologique de la technique NGS appliquée aux prélèvements respiratoires bovins (ENVT, UMR INRA IHAP 1225)
Lavagebronchoalvéolaire
UltracentrifugationSéquençage
Analyse bioinformatiques
Traitementnucléase
Extraction de ARN/ADNet (RT-)PCRaléatoire
Séquences reconnues
94%
82%
12%
6%
Séquences cibléesSéquences cellulaires ou non assignées
6%
Classification
Bactérie
Archéobactéries
Virus
Figure 3 - Résultat d’un NGS sur un lavage broncho-alvéolaire avec identification de l’ensemble des séquences virales, notamment celles du VRSB, responsable
du trouble respiratoire observé (ENVT, UMR INRA IHAP 1225)
A : Varic...virus B : Sim...virusC : Mar...virusD : PercavirusE : BetabaculovirusF : AlphabaculovirusG : Coccolithovirus1 : Bovine herpesvirus 1 2%2 : Suid herpesvirus 1 1%3 : Human herpesvirus 3 0,9%4 : 4 genres viraux de plus5 : Bovineherpesvirus 2 2%6 : 5 genres viraux de plus7 : Gallid herpesvirus 3 2%8 : Lymphocryptovirus 1%9 : Equid herpesvirus 2 1%10: Betaherpesvirinae 0,8%11 : Bovine viral diarrhea virus 1 12%12 : Choristoneura occidentalis
granulovirus 5%13 : 7 genres viraux de plus14 : Siphoviridae 2%15 : 3 genres viraux de plus16 : Emiliania huxleyi virus 86 2%17 : 19 genres viraux de plus
Respiratory syncytial virus 43%
Pneumovirus
MononegaviralesHerpesvirales
Pestivirus
HerpesviridaeAlphaherpesviridae
Gamma-herpesvirinae
Baculoviridae
A
1 2 3 4 5 6 7 8 910
11
12
13
141516
17
B C D
EF
G
Caudovirales
Phycodnaviridae
Virus
RacineVRSB
Paramyxoviridae
actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31
84 - MAI / AOÛT 2015 12
- Des co-infections ont été observées pourles quatre autres échantillons avec le VRSB,Pasteurella multocida, Mannheimia haemo-lytica et Histophilus somni. - Le génome d’un des six isolats français(D/bovine/France/2986/2012) a été séquen-cé. Il est très proche des deux souchesaméricaines connues d’IDV, mais formecependant un rameau génétique différent.
Dans les autres pays
� Depuis, l’IDV a été récemment identifié enChine [15], en Italie, au Royaume-Uni et auChili (communication personnelle) mais il estfort probable que sa distribution soit beau-coup plus étendue.
� Pour le moment, il existe peu de don-nées sur la séroprévalence de l’infectionpar l’IDV chez les bovins.� Aux USA, elle pourrait être élevéepuisque, sur huit élevages testés, sept sesont révélés séropositifs avec une séropréva-lence intra-troupeau importante [7]. � En France, la séroprévalence individuellepourrait aussi être importante (donnéespersonnelles en cours de validation). Il aainsi été suggéré que les bovins sont leréservoir de l’IDV, sans que l’on dispose depreuves scientifiques. Il existe encore moins d’information sur lepouvoir pathogène de ce virus chez lesbovins, même si l’IDV a été majoritairementisolé de veaux présentant des signes cli-niques respiratoires. Des essais en station expérimentale sont encours de programmation aux USA et enFrance, à l’INP-ENVT. � Chez le porc, l’IDV se multiplie sans indui-re de signes cliniques [6]. Ce virus seréplique aussi chez le furet, le principal
modèle animal qui permette l’étude de lapathogénicité des Influenza virus chez l’hom-me. Il n’existe cependant pas de donnéesexhaustives sur le caractère zoonotique dece virus, une seule étude a montré une séro-prévalence de 1,3 p. cent en 2009 dans unecohorte de 306 personnes âgées [6].
Une approche exhaustive par NGS (next generation sequencing) : la caractérisation du “virome”respiratoire des bovins
� Cette approche exhaustive par NGS (next generation sequencing) consiste àséquencer en masse les prélèvementsrespiratoires obtenus chez des animauxmalades et / ou sains. Les millions deséquences obtenues sont ensuite analyséespour identifier l’ensemble des virus (virome)et / ou bactéries présentes. � Compte tenu du caractère novateur de cesapproches, seules deux études ont récem-ment été publiées en 2015 sur la recherchedu virome respiratoire des bovins.
Première étude sur le virome respiratoire des bovins
1. Un nouveau virus sur la recherche du virome respiratoire des bovins ...� La première étude du virome respiratoiredes bovins est relativement limitée. Elle apermis d’identifier un nouveau virus à partirde prélèvements respiratoires post-mortemlors d’une épizootie sévère de bronchop-neumonies infectieuses (BPI) apparue en2013 dans un feedlot du sud-Ouest desÉtats-Unis [16]. � La technique NGS a été utilisée en raisond’une absence de détection d’agents patho-gènes via les techniques classiques d’isole-
Nouveau !
� Un nouveau virus InfluenzaD (virus IDV) dans la familledes Orthomyxoviridae a étédétecté chez les porcs, puis, en 2012-2013, chez des bovins américains.
� En France, le génome d’un des six isolats, a été séquencé. Il est très proche des deuxsouches américainesconnues d’IDV, mais formecependant un rameau génétique différent.
Essentiel
� Même avec des techniquestrès sensibles comme les PCR, il existe encore un pourcentage non négligeable de résultats négatifs, même lorsque l’on cible l’ensemble des pathogènesrespiratoires connus et que l’on se place dans les conditions optimalesd’échantillonnage.
Dated’échantillon
TypeAge
Traitementantibiotique
Vaccination VRSB bPI3 P. multocida M. haemolytica M. bovis H. somni bCoV BoHV-1
25/01/2014Poumon Adulte Oui nd N N fP fP N P nf P
05/02/2014Poumon 12 mois Oui N N N N N N nf nf
18/02/2014Poumon 1 mois Oui Oui N N N N N N N nf
14/03/2014Poumon 1 mois Non Oui N N fP N N fP N nf
30/03/2011Poumon nd nd nd N N P N N N nf nf
17/01/2012écouvillonnasal
nd nd nd P N fP fP N N nf nf
Tableau 2 - Caractérisation des six prélèvements français positifs pour l’influenza virus D
Les prélèvements ont fait enparallèle l’objet d’une recherche
contre les principaux pathogènes respiratoires connus.
- nd : non disponible - nf : non fait
- N : négatif- P : positif- fP : faiblement positif
actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31MAI / AOÛT 2015 - 8513
ment. Un nouveau nidovirus bovin (BoNV)appartenant à un nouveau genre deTorovirinae, une sous-famille de Coronavirusa été identifié. Sur six prélèvements (poumon,trachée et nœud lymphatique trachéo-bron-chique) provenant de quatre bovins, trois sesont avérés contenir des séquences de cenouveau virus. Une étude sérologique sur 127sérums de bovins américains présentant dessignes cliniques respiratoires a montré uneprévalence de 9 p. cent pour le BoVN.
2. ... dont l’imputabilité clinique n’est pas démontrée � L’imputabilité clinique de ce virus n’acependant pas été démontrée. � D’autres virus ont en effet été détectés parcette technique, tels que le bCoV (un prélè-vement sur six) et un herpèsvirus bovin (deuxprélèvements sur six). Par ailleurs, aucunprélèvement de veaux sains du même feed-lot n’a été réalisé à titre comparatif.
La deuxième étude sur des veaux
1. De nouveaux virus identifiés dans les sécrétions nasales des veaux laitiers ...
� La 2e étude par NGS (next generationsequencing) a consisté à rechercher demanière exhaustive des séquences virales àpartir d’écouvillonnages nasaux profondsréalisés chez des veaux laitiers américainsâgés de 1 à 2 mois et présentant des signescliniques respiratoires [10]. Cinquante veauxmalades ont ainsi été prélevés. Par ailleurs,pour chaque veau malade, un veau physi-quement proche mais ne présentant pas designes cliniques a aussi été prélevé. L’analyse métagénomique a été réalisée surles veaux malades par mélange de cinqveaux, soit 10 mélanges au total. L’analyse apermis d’obtenir 23,7 millions de séquencesdont 11,5 millions ont été exploités, après éli-mination des séquences du génome bovin,des séquences de bactéries, des séquencesdoublons et des séquences illisibles. - Dans 32 p. cent des échantillons, il n’a pasété possible d’identifier de séquences vira-les. Différentes raisons peuvent être avan-cées, d’ordre méthodologique (élimination/ dégradation des ARN lors de leurs traite-ments, absence de séquence homologuedans les banques, niveau de présence endessous du seuil de détection, échantillon-nage trop tardif, ...) ou d’ordre biologique(présence de virus respiratoires, mais uni-quement dans l’appareil respiratoire pro-fond, infections uniquement bactériennes). -Dans les autres échantillons, par comparai-son avec les banques génomiques (243 virus
connus), les séquences obtenues présen-tent, par ordre de fréquence décroissant,des homologies avec le rhinovirus bovin detype A (BRAV), l’adénovirus bovin de type 3(bAd3), l’adénovirus-associé (BAAV, depen-doparvovirus B), le rhinovirus bovin de typeB (BRBV), l’astrovirus-BSRI1 (BoAstV-BSRI1),le virus Influenza D bovin (IDV), les picobirna-virus, le parvovirus bovin de type 2 et l’her-pèsvirus bovin de type 6.- Par ailleurs, un nombre élevé de co-infec-tions est, là aussi, observé avec au moinsdeux virus dans 38 p. cent des échantillonsprovenant de veaux malades, versus 8 p.cent pour les veaux contrôles. � Toutefois, il est impossible de savoir danscette étude si les co-infections ont un rôlemajeur dans l’apparition des signes cli-niques respiratoires. 2. ... dont le pouvoir pathogène n’est pas connu� Pour associer la détection de ces virus avecun quelconque pouvoir pathogène (présen-ce de signes cliniques respiratoires), destests PCR, spécifiques des principaux virusidentifiés, ont été élaborés et utilisés paral-lèlement sur les 50 veaux malades et les 50veaux apparemment sains [10] (tableau 3).Une association statistique entre maladie etprésence du virus a pu être observée pourl’adénovirus bovin de type 3 (bAd3), le rhi-novirus bovin de type A (BRAV) et le virusInfluenza D bovin (IDV). � Le bAd3 (Adénovirus bovin de type 3) estun adénovirus très prévalent dans les feed-lots américains (50 p. cent de séroconver-sion), où il a été associé à un syndrome fébri-le sans perte de poids [9]. Son inoculationpar voie intratrachéale à des veaux de 4mois et privés de colostum a provoqué unsyndrome fébrile [8].
Nouveau !
� Un nouveau virus a été identifié : le nidovirusbovin (BoNV) appartenant à un nouveau genre de Torovirinae, une sous famille de coronavirus.
� Cette technique NGS est actuellement utilisée à l’INP-ENVT pour caractériserde manière exhaustive l’ensemble des virus présentsdans l’appareil respiratoireprofond, lors de bronchop-neumonie infectieuse.
Définition
� La caractérisation du viromerespiratoire est réalisée par le séquençage de masse(NGS pour next generationsequencing) des prélèvements respiratoiresobtenus chez des animauxmalades et / ou sains.
Fréquence dedétection des virusidentifiés par NGS(next generation
sequencing)
Veaux malades Veaux sains Différences(test Fisher)
�Adénovirus bovin 3 48 % 10 % p < 0.0001
� Rhinovirus bovin A 24 % 8 % p = 0.009
� Rhinovirus bovin B 10 % 2 % p > 0.2
� Influenzavirus D 14 % 0 % P = 0.012
� Parvovirus bovin 2 8 % 2 % P = 0.36
�Astrovirus bovin 8 % 0 % P = 0.117
� Picobirnavirus bovin 2 % 0 % P = 1
Tableau 3 - Fréquence des agents infectieux détectés par PCR spécifiques chez 50 veaux atteints d’affections respiratoires
et 50 veaux sains provenant des mêmes élevages (d’après [10])
Les différences statistiquement significatives sont en rouge.
actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins
LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIREélevages et santé vol 8 / n°31
86 - MAI / AOÛT 2015 14
� Le BRAV (Rhinovirus bovin de type A) est leplus souvent considéré comme non patho-gène ou de pathogénicité mineure, bienqu’il n’existe aucune donnée expérimentalepermettant de le confirmer ou de l’infirmer. � Pour l’IDV (virus Influenza D bovin), cesrésultats confirment la prévalence nonnégligeable (14 p. cent) de ce virus unique-ment chez les veaux malades. Dans 85 p.cent des situations, l’IDV a été détecté enprésence du bAD3 et du BPV2.
3. L’absence des virus respiratoires pathogène connus ?� En revanche, cette étude n’a pas permisd’identifier les virus respiratoires connus telsque le BoHV-1, le bPI3, le BVDV, le bCoV etle VRSB. Selon les auteurs [10], compte tenude l’exhaustivité de la méthode utilisée, leurnon détection reflète probablement leurabsence dans les écouvillons nasaux testésou leur présence à des quantités inférieuresau seuil de détection. � Mais, le statut vaccinal des animaux n’étaitpas documenté. Cette étude souffre aussid’une description imprécise des critères d’in-clusion des veaux, notamment pour les signescliniques respiratoires. Par ailleurs, les séquen-ces virales ont été obtenues à partir d’écou-villons nasaux et des échantillons de l’appareilrespiratoire profond, type lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou aspiration transtrachéale,(ATT) auraient été probablement plus repré-sentatifs des troubles respiratoires observés.Cette technique NGS est actuellement utili-sée à l’INP-ENVT pour caractériser demanière exhaustive l’ensemble des virusprésents dans l’appareil respiratoire profondlors de BPI (LBA de l’étude 2).� L’approche NGS est une première étaped’identification de virus d’intérêt. La puis-sance de l’outil permet en effet une détec-tion sans à priori de l’ensemble des virusprésents chez l’animal, sous réserve que l’a-nalyse bio-informatique des métadonnéessoit réalisée avec un maximum de contrôles. � Comme pour les PCR, les conditions deprélèvement (races, types de production,saisonnalité, localisation, ...) peuvent modi-fier les résultats.De même, le coût des analyses ne permetactuellement que de tester un nombre limi-té d’animaux.�Si un virus d’intérêt est identifié, il ne pour-ra être considéré comme d’importance réel-le que lorsque son pouvoir pathogène auraété démontré par des études d’inoculationd’épreuve en station expérimentale ou par
des études épidémiologiques. La démons-tration du pouvoir pathogène lors d’inocula-tion d’épreuve est alors plus difficile pour lesvirus qui agissent par co-infection avec d’au-tres virus ou comme agents initiateurs desinfections bactériennes.
CONCLUSION
� Ces dernières années, l’identification et lacaractérisation des pathogènes respiratoi-res bovins est en plein essor. De nouveauxvirus apparaissent, dont la présence dansl’appareil respiratoire des animaux maladesa été clairement établie. Toutefois, il fautbien distinguer les pistes qui relèvent de larecherche des réalités du terrain. Le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB)reste actuellement l’agent pathogène viralmajeur le plus fréquemment isolé. Les coro-navirus bovins (bCoV) et les virus parainfuen-za (bPI3) sont eux aussi très présents maisleur rôle pathogène demande à être mieuxprécisé. � Pour les nouveaux virus, leur importancene pourra être établie qu’après unedémonstration claire de leur pouvoir patho-gène. Là réside toute la difficulté à étudier etcomprendre l’action d’un virus au pouvoirpathogène modéré mais capable d’agir ensynergie avec d’autres virus et / ou bactéries.Les approches, type NGS, devraient nousaider à mieux comprendre l’importance desco-infections en pathologie bovine.
Les auteurs déclarentne pas être en situationde conflit d’intérêt.
Références1. Arcangioli MA, Duet A, Meyer G, coll. The roleof Mycoplasma bovis in bovine respiratory diseaseoutbreaks in veal calf feedlots. Vet J2008;177(1):89-93. 2. Beaudeau F, Björkman C, Alenius S, coll. Spatialpatterns of bovine corona virus and bovine respi-ratory syncytial virus in the Swedish beef cattlepopulation. Acta Vet Scand 2010;21; 52:33.3. Ducatez MF, Pelletier C, Meyer G. Influenza Dvirus in cattle, France, 2011-2014. Emerg Infect Dis.2015;21(2):368-71.4. Luzzago C, Bronzo V, Salvetti S, coll. Bovinerespiratory syncytial virus seroprevalence and riskfactors in endemic dairy cattle herds. Vet ResCommun 2010;34(1):19-24.5. Gulliksen SM, Jor E, Lie KI, coll. Respiratoryinfections in Norwegian dairy calves. J Dairy Sci.2009;92(10):5139-46.6. Hause BM, coll. Isolation of a novel swineinfluenza virus from Oklahoma in 2011 which is dis-tantly related to human influenza C viruses. 2013PLoS pathogens 9(2):e1003176.7. Hause BM, coll. Characterization of a novelinfluenza virus in cattle and Swine: proposal for anew genus in the Orthomyxoviridae family. 2014mBio 5(2):e00031-0001.8. Lehmkuhl HD, Smith MH, Dierks RE. A bovineadenovirus type 3 : isolation, characterization, andexperimental infection in calves. Arch Virol1975;48:39-46.9. Mattson DE, Norman BB, Dunbar JR. Bovineadenovirus type-3 infection in feedlot calves. Am JVet Res 1988;49:67-9.10. Ng TFF, Kondov NO, Deng X, coll. A metage-nomics and case-control study to identify virusesassociated with bovine respiratory disease. J. Virol,2015;89(10):5340-9. doi:10.1128/JVI.00064-1511. O'Neill R, Mooney J, Connaghan E, coll. Pat-terns of detection of respiratory viruses in nasalswabs from calves in Ireland: a retrospective study.Vet Rec. 2014;175:351.12. Pelletier C. In-house multiplex real time PCRfor simultaneous diagnosis of six major respiratorypathogens in young cattle : three years of expe-rience in Burgundy. 16th Intern Symposium of theWAVLD, Berlin 2013. 13. Pelletier C. Use of in-house multiplex real timePCR for simultaneous diagnosis of six major respi-ratory pathogens in young cattle : two years ofexperience in Burgundy. European Buiatric Forum,Marseille, 2013:37. 14. Pelletier C, Pez F, Francilette M, coll. Séquen-çage NGS : applications pratiques en médecinevétérinaire. Le Point Vét, 2015;356:54-7.15. Sheng Z, Ran Z, Wang D, coll. Genomic andevolutionary characterization of a novel influenza-C-like virus from swine. Archives of virology2014;159(2):249-55.16. Tokarz R, Sameroff S, Hesse RA, coll. Discoveryof a novel nidovirus in cattle with respiratory dis-ease. J Gen. Virol, 2015. doi:10.1099/vir.0.000166.17. Valarcher JF. In vivo persistence and geneticevolution of bovine respiratory syncytial virus. PhDThesis Univ C. Bernard Lyon 1, 1999:265.
formation continue1. En élevage naisseurs, lors de broncho-
pneumonies, le coronavirus bovin est-iltrès fréquemment détecté dans les cavi-tés nasales et/ou l’appareil respiratoireprofond ? a. oui b. non
2. Dans les études récentes de prévalencedes pathogènes respiratoires, les co-infections représentent-ellesmoins de 30 p. cent des cas ?
a. oui b. non3. Un Influenzavirus du genre D a été
identifié récemment chez des veaux présentant des affections respiratoires.A-t-il été démontré que ce virus estresponsable des troubles observés ?
a. oui b. non4. Le séquençage de masse (NGS) est-il
une méthode qui permet une rechercheexhaustive de l’ensemble des séquencesvirales présentes dans un échantillon ?
a. oui b. non
Reproduction interditeToute reproduction ou représentation, intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, de la présen-te publication sans autorisation est illicite et constitue une contrefaçon. L’autorisation de reproduire un articledans une autre publication doit être obtenue auprès de l’éditeur, NÉVA. L’autorisation d’effectuer des reproductionspar reprographie doit être obtenue auprès du Centre français d’exploitation du droit de la copie (C.F.C.).
NÉVAEUROPARC 15, rue E. Le Corbusier
94035 CRÉTEIL CEDEXTél : (33) 1-41-94-51-51Courriel : [email protected]