DESC de Maladies Infectieuses et Tropicales

10 Avril 2017

Jean-Christophe Lagier,

IHU Méditerranée Infection, Marseille

Partie I – Exploration du microbiote digestif

Microbiote digestif

• Le microbiote intestinal, autrefois appelé microflore intestinale, est l’ ensemble des bactéries, virus, champignons qui vivent dans le tube digestif

• Chaque individu héberge 1010 à 1014 (100 000 milliards) bactéries vivantes dans son intestin ce qui représente 10 à 100 fois le nombre de cellules du corps humain

PHYLA OU EMBRANCHEMENTS BACTERIENS

Bacteroidetes Bacteroides fragilis

Firmicutes Staphylococcus Clostridium Lactobacillus

Actinobacteria Bifidobacterium

Proteobacteria (<10%) Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Escherichia

coli

Bifidobacterium

longum

Techniques d’étude

• Techniques culture-dépendantes

– Bactéries vivantes

• Techniques moléculaires indépendantes de la culture

– ADN de la bactérie (bactérie vivante ou morte)

– Une grande partie des espèces bactériennes du microbiote digestif n’avaient jamais été cultivées et sont retrouvées uniquement par la biologie moléculaire

SEQUENCAGE MOLECULAIRE

Techniques moléculaires indépendantes de la culture

PCR à large échelle (pyroséquençage)

PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION

Une séquence d’ ADN bactérien <=> Un phylotype (et non une

espèce)

Goldstandard de l’étude des écosystèmes complexes

Phylum relative abundance depends significantly of 16S hypervariable region

independently of pyrosequencing chemistry

Claesson, Nucl Acid Res, 2010

Genus relative abundance and richness depends significantly of

16S hypervariable region

(454 Titanium)

Bifidobacteria detected only by v3/v4 primers in this study

Ralstonia detected only by v4/v5 primers in this study

Claesson, Nucl Acid Res, 2010

Primer bias Turnbaugh, PNAS, 2010

V2 primers lacks Bifidobacteria

Biais de profondeur

Culturomics

Stool

Pyrosequencing 16S

New species: Genome sequencing

PCR ARNr 16S No identification

Maldi-TOF

Microbial culturomics

Multiplying culture conditions -Increasing of fastidious bacterial growth -Eliminating dominant populations

+ 1 obese stool sample

– 32 500 colonies tested by MALDI-TOF

– 212 culture conditions

– 340 bacterial species including • 31 new bacterial species (including 6 new genera)

• 174 isolated for the first time in the human gut

• 2 species among rare phyla (Synergistetes, Deinococcus-Thermus)

• Largest genome bacterial species : Microvirga massiliensis (9,35 Mb)

• Senegalvirus : 1st giant virus isolated from human gut

Background : Culturomics

Challenges Réponses

Lutte contre les bactéries majoritaires

Bactéries fastidieuses

Température de croissance

Atmosphere (aerobie, anaerobie Enceinte anaerobie,Microaerophile)

Croissance de bactéries ayant des propriétés

physico chimique différentes

Antibiotiques

Filtrations

Phages

Bactéries extremophiles

Choc thermique

Pre-incubation dans des flacons d’hémocultures avec du jus de rumen et du sang

Milieu spécifiques pour bactéries halophiles (NaCl = 150 G/L)

Bactéries minoritaires

Doublement du nombre de bactéries isolées du tube digestif

Augmentation de plus de 20% du nombre de bactéries isolées chez l’homme

Applications pratiques

Partie II – Role du microbiote digestif

Colonisation du tube digestif

• A la naissance, le tube digestif est stérile et dépourvu de bactéries.

• La colonisation microbienne débute dès les premiers instants de vie et est modifiable selon

– Allaitement (vs biberon)

– Contacts humains (mère)

– Alimentation

– L’environnement

– Facteurs de l’hôte (génétiques ?)

ALLAITEMENT = TRANSMISSION D’UN MICROBIOTE

Le lait maternel est composé d’une flore bactérienne

abondante et très diverse et notamment de Lactobacillus et

de Bifidobacterium

C’est vers l’âge de 2 ans que le microbiote devient stable sur

le plan structurel et fonctionnel.

LE LAIT MATERNEL EST UNE SOURCE DE BACTERIES LACTIQUES POUR LE TUBE DIGESTIF DU BEBE

La même souche bactérienne (Espèce Lactobacillus gasseri) est

retrouvé dans le lait de la maman, dans la bouche du bébé et dans

les selles du bébé

Cette bactérie n’était pas retrouvé sur la peau de la maman ni au

niveau de son vagin.

Martin, J Pediatr, 2003

La COMPOSITION DU MICROBIOTE varie selon les segments du tube digestif

– Teneur du milieu en oxygène – pH – Sécrétions (tolérance à la bile) – Nutriments disponibles – Vitesse du transit (rapide de la

bouche au caecum, plus lent ensuite)

La COMPOSITION DU MICROBIOTE varie selon les segments du tube digestif

Gradient quantitatif croissant oral-aboral Estomac < 103 UFC/g Duodénum 103-104 UFC/g Jéjunum 104-106 UFC/g Iléon 106-108 UFC/g Colon 109 à 1011 UFC/g UFC: unité formant colonie

Gradient qualitatif diminution progressive des bactéries aérobies au profit des bactéries anaérobies

strictes au niveau du colon

Interrelation du régime, de l’hôte et de la flore digestive

• La microflore intestinale est en interrelation permanente avec les aliments et l’organisme humain, l’ensemble constituant un écosystème complexe.

• Toute modification de l’un ou de l’autre de ses constituants est susceptible de perturber l’équilibre et le fonctionnement de l’ensemble.

Effet digestif

• Trophicité

– Etablissement, maturation et entretien de la barrière de la muqueuse intestinale

• Motricité

– Stimulation du transit intestinal

Effets nutritionnels

Dégradation des hydrates de carbone (sucres) non absorbés Cellulose, Amidon, pectine, glycoprotéines Aboutissant à la production d’ « acides gras à chaines courtes »

assimilables par l’hôte (acétate, propionate, butyrate) et de gaz (CO2, H2) L’acide butyrique est la principale source d’énergie de la muqueuse colique

Hydrolyse des lipides alimentaires non absorbés Lipases bactériennes Conjugaison des acides biliaires primaires, indispensable pour une bonne

absorption des graisses

Dégradation de certaines protéines et de certains acides aminés, permettant la récupération de l’azote Tryptophane

Cellulose

Apport vitaminique

• Certaines bactéries sont capables de synthétiser des vitamines

– Riboflavine (Vitamine B2)

– Acide pantothénique (Vitamine B5)

– Pyridoxine (Vitamine B6)

– Biotine (Vitamine B8 ou H)

– vitamine B12 (son déficit entraine une anémie)

– vitamine K (Facteurs II, VII, IX, X –Coagulation)

Protection contre l’infection

• Effet de barrière vis-à-vis des bactéries exogènes “résistance à la colonisation”

– élimination totale de la souche exogène

– maintien de la souche exogène en sous-dominance

• La flore digestive stimule l’immunité locale et générale

Partie III –VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES ET

PATHOLOGIQUES du microbiote digestif

Facteurs de variation de la composItion du microbiote digestif

• Age

• Sexe

• Géographie

• Régime

• Antibiotiques

• Probiotiques

• La composition du microbiote est très dépendante des facteurs environnementaux

• Varie d’une population à une autre (alimentation, hygiène…)

Particularités du microbiote et ethnies

De Filippo et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 ;107:14691-6.

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

• Urbaines (180) – Saoudiens

– Français

– Polynésiens

– Sénégalaises

– Nigériens

• Traditionnelles (220) – Amazoniens

– Pygmées

– Bedouins

– Tuaregs

• Principle Coordinate Analysis – Traditionnelles clusterisent différemment

• Urbaines : clusterisent différemment au niveau de la concentration de Bifidobacterium dans leur microbiote digestif

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

• Microbiote des urbains :

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

Consommation importante de probiotiques et de

produits laitiers

Enrichie par les bactéries contenues dans les probiotiques

• L’ alimentation modifie l'équilibre dans l'intestin – source de bactéries et de virus

• Les bactéries contenues dans les probiotiques pourraient modifier la flore intestinale et avoir ainsi un rôle dans la pandémie actuelle d’obésité

1. Raoult D. Nature 2008; 454:690-691 2. Angelakis E et al. Future Microbiol 2012;7:91-109.

Probiotiques quotidiennement consommés

Probiotiques et obésité: L'hypothèse

Promoteurs de croissance dans l'agriculture

Angelakis E, et al. Lancet Infect Dis 2013;13:889-99

Coloration de gram d’un yaourt

35

Angelakis E, et al. J Food Sci 2011;76:M568-72.

Probiotiques - Yaourts contiennent des quantités très élevées de bactéries

Observation d’un effet espèce dépendant • L. reuteri: obésité • L. casei/paracasei: absence

obésité

Première observation de l’effet anti-obésité des BIFIDUS

(Bifidobacterium animalis) chez l’homme

Les bactéries lactiques, donc l’allaitement et les probiotiques,

pourraient prédisposer ou au contraire protéger contre l’obésité

Le stress oxydatif digestif anormal entraine une perte du microbiote humain mature anaérobie chez les enfants avec malnutrition aiguë sévère

340 procaryotes perdus chez les enfants avec un Kwashiorkor

incluant les 4 archées méthanogènes (=> maldigestion par perte

fermentation/méthanogenèse)

Archaea

L’augmentation du potential redox fécal des enfants avec kwashiorkor

reflète le manque d’anti-oxydants et explique la perte des procaryotes

anaérobies

PREMIERE DEMONSTRATION DU LIEN ANTIOXYDANTS-CONTRÔLE STRESS OXYDATIF-MAINTENANCE MICROBIOTE SAIN

Colite à Clostridium difficile

By F.Rohwer 41

Significant difference between known and predicted species

We know only the tip of the microbial

iceberg.

Métaprotéomique

A retenir

• Nous sommes ce que nous mangeons et la flore intestinale est le reflet de notre alimentation

• La flore intestinale joue un rôle dans l’absorption des nutriments

• Le microbiote intestinal semble impliqué dans de nombreuses pathologies intestinales, métaboliques ou autres

• Il est difficile de faire des conclusions générales sur la flore intestinale car les études sont biaisées par les méthodes utilisées

Microbiote Digestif

Maladies liées au microbiote

Régime

Probiotiques

Antibiotiques

TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FECAL

?

Merci de votre attention

jean-christophe.lagier@univ-amu.fr