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IDENTIFICATION DE PEPTIDES INHIBITEURS DE L'ENZYME DE CONVERSION DE L'ANGIOTENSINE-I (ACE) DANS DES LAITS FERMENTÉS

PAR LACTOBACILLUS HELVETZCUS

Mdmoire presenté

& la Facult6 des études supérieures de l'Université Laval

pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)

Departement de sciences des aliments et nutrition FACULTÉ D'AGRICULTURE, ALIMENTATION ET CONSOMMATION

UMVERSIT'É LAVAL

MAI 2000

O Benoit Barrette, 2000

National Library I*I of Canada Bibliothèque nationale du Canada

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L'objectif de la présente étude était d'identifier des peptides inhibiteurs de l'enzyme de

conversion de l'angiotensine4 (ACE) dans des laits fermentés par six souches de Lb.

helveticus (R-2 1 1, R-204, R-235, R-23 1, ATCC 10797, ATCC 12046) et une souche de Lb.

delbnieckii subsp. bitlgaricus (ATCC 1 1842). Des fermentations de lait écrémé ont donc

été réalisée à l'aide de ces souches. puis la fraction peptidique dec milieux &mentés a Çté

isolée et analysée par chromatographie (RP-HPLC) afin de détecter la présence de six

peptides reconnus pour leur activité d'inhibition de I'ACE: G~ 23-77. 23-34, QI 28-34,

60-66, P 177-183 et P 193-202. Les résultats de cette Çtude ont démontré que le lait

fermenté par Lb. helveticus R-2 11 est le plus efficace à inhiber I'ACE (ICso= 0.65 rngy'rnl).

Bien qu'une activité d'inhibition de I'ACE ait été mesurée dans la plupart des laits

fermentés, aucun des six peptides à l'étude n'a &té identifié dans les milieux. Par contre. le

peptide P 176- 182. apparenté au peptide inhibiteur 17% 183. a été détecté dans les laits

fermentés par les souches R-2 1 1 (0,79 pg/mi) et R-?W (0.63 pghnl). Ce peptide ne permet

pas d'inhiber I'ACE (IC50= 32,24 mg/d), mais son hydrolyse par la carboxypeptidase A

mène à la libération du peptide B 176-181 qui s'est avéré un puissant inhibiteur de I'ACE

(ICso = 0,22 mgml). Ces résultats suggèrent donc que l'activité antihypertensive de certains

laits fermentés pourrait s'expliquer par la présence de peptides précurseurs, qui suivant leur

hydrolyse par les enzymes du tube digestif, mènent j. la libération de peptides en mesure

d'inhiber fortement 1'ACE .

III

AVANT-PROPOS

Ce projet de recherche a été réalisé dans le cadre du réseau des bactéries lactiques financé

par le CNRSG. Je remercie cette organisation qui m'a assuré le soutien matériel et financier

pour mettre à terme ce projet.

Je tiens à reniercicr nia directrice Dr. Syivie Gauiiiirr pour avoir eu confiance en mes id6es

quant à la réalisation du projet. Elle m'a aussi inculqué la notion de la rigueur scientifique

qui me servira sûrement dans ma carrière. le remercie également mon codirecteur. Dr.

Denis Roy pour ses conseils et pour m'avoir accueilli dans son laboratoire du CRDA ce qui

m'a permis de passer un été magnifique dans la belle ville de Saint-Hyacinthe.

Le projet n'aurait pu être réalisé sans le soutien des professionnels de recherche et je pense

spécialement à Anne-Fraqoise Allain. Lise Lemieux et Céline Paquin qui m'ont aidé

énormément dans l'apprentissage des techniques de chromatographie et de fermentation.

Un gros merci au resto-bar le PUB qui a été le lieu de choix pour l'inspiration scientifique

mais sunout pour fraterniser avec mes collègues du centre de recherche STELA.

Finalement je remercie poussin pour avoir révisé mon mémoire et pour ses encouragements

grandement appréciés.

C

............................................................................................ ........................... RESUME ... D

AVANT-PROPOS ............................................................................................................... IKI

TABLE DES MATIÈRES .................................................................................................. IV

LISTE DES FIGURES ....................................................................................................... VI

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................ Va *

INTRODUCTION GENERALE ....................................................................................... 1

CHAPITRE I : REVUE DE LITTÉRATURE ................................................................... 3

1 . LE LAIT DE VACHE. UN U M E N T RICHE EN COMPOSANTES NUTRlTIVES ET

BIOA C T W ...................................................................................................................... 4

1 . 1 Les composantes nuuitives du lait de vache .................................................................. 4

............................................................................ 1.2 La fraction protéique du lait de vache 6

................................................................. 1.3 Les composantes bioactives du lait de vache 9

2 . LE LAIT FERMENT& UN ALIMENT PROBIOTIQ LIE ET FONCTIONNEL ................. 13

2.1 Historique, définition et diversité ............................. .. .................................................. 13

2.2 Propriétés biologiques associées aux laits fermentés ................................................... 16

2.3 Système protéolytique des bactéries lactiques ............................................................. 19

2.4 Effets physiologiques des peptides bioactifs issus des protéines laitières .................... 24

3 . A CTIVIT~ ANIIH YP ERTENSNE DES LAITS FERMENTES ....................................... -27

3.1 Hypertension: définition et incidence ......................................................................... -27

3.2 Contrôle physiologique de la pression sanguine .......................................................... 27

3.3 Peptides inhibiteurs de 1'ACE issus de l'hydrolyse des protéines laitières ................. 31

3.4 Peptides inhibiteurs de 1'ACE dans les laits fermentés ............................................... 34

BUT. HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS ............................................................................ -42

CHAPITRE II. ......................................................................... .. .... , ................................ 44

. 2 . MATERIEL ET METHODES ....................................................................................... 47

........................................................................................... 2.1 Matériel 47

2.2 Culture des souches ............................... .. ............................................. 47

2.3 Fermentation ............... .., .............................................................................................. 48

2.4 Caractérisation des laits fermentés ................................................................................ 48

2.5 Isolement de la fraction lactosérum des laits fermentés ................................................ 49

2.6 Isolement de la fraction peptidique du lactosérum ...................................................... 50

2.7 Analyse et purification des peptides inhibiteurs de I'ACE par RP-HPLC .................... 50

2.8 Analyse de la composition en acides aminés des peptides ......................................... 53

2.9 Hydrolyse du peptide P 176- 182 par la carboxypeptidase A ........................................ 54

2.10 Meure de l'activité d'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-L ..... 54 I . 2.1 1 Dosage des proteines ......................................................................... 3 5

0

CONCLUSION GENEML,E ........................................................................................... -75

0 #

BIBLIOGRAPHIE GENERALE ...................................................................................... 78

LISTES DES FIGURES

CHAPITRE 1

.............................. Figure 1 La micelle de caséine selon le modèle de Schmidt (1982) 8

Figure 2 Localisation des enzymes dans les bacteries lactiques et leur mode d'action C . ................................................................................... sur les caseines du lait 23

....................................... Figure 3 Régulation physiologique de la pression sanguine 28

Figure 4 Structure du site actif de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-1 (Sz5sz

.............................................................................. et Budv&ri-Bhhy, 1991) 30

CHAPITRE II

Figure 1 Compte bactérien (log UFC/ml) en fonction de la durée de fermentation (pH

6,O) d'un lait écrkrné reconstitué 12% (plp) par six souches de Lb. heZvetic~is

et d'une souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricns ................................... 58

Figure 2 Production d'acide lactique (@IO0 ml) en fonction de la durée de

fermentation (pH 6.0) d'un lait écrémé reconstitué 12% (plp) par six souches

de Lb. helveticus et d'une souche de Lb. delbrireckii subsp. bulgnricns.. .... 59

Figure 3 Taux de protéolyse (mÉq NH2/L), mesuré par la méthode OPA, en fonction

de la durée de fermentation (pH 6'0) d'un lait écrémé reconstitué 12% (p/p)

par six souches de Lb. heiveticus et d'une souche de Lb. deibrifeckii subsp.

bulgaricus ........................................................................................... 6 1

Figure 4 Profil RP-HPLC de a) lait non- fermenté et b) lait fermenté par la souche Lb.

delbrueckii subsp. biilgaricus ATCC 1 1842.. .............................................. -67

Figure 5 Profil RP-HPLC des laits fermentés par les souches Lb. helveticus a) R-2 1 1 et

........................................................................................................... b) R-235 68

F r 6 Prcfi! W-WLC des ! i l s Ce,mmtCs yr r !es s r ï c k s LU. h r ! x : i cx 3) R-201 t:

b) R-23 1 .......................................................................................................... -69

Figure 7 Profil RP-HPLC des laits fermentés par les souches Lb. helveticirs a) ATCC

................................................................................. 10797 et b) ATCC 12046 70

LISTES DES TABLEAUX

CHAPITRE 1

Tableau 1 Teneur en nutriments du lait de vache ................... .. ........................................ 5

Tableau 2 Proportion relative des protéines du lait de vache et certaines de leurs

caractéristiques physico-chimiques ................................................................ -7

.................... Tableau 3 Exemples de composés bioactifs présents dans le lait de vache 10

Tableau 4 Exemples de laits fermentés disponibles sur le marché ................................. 15

Tableau 5 Peptides inhibiteurs de l'AC€ identifiés dans les protéines laitières ........... 39

Tableau 6 Peptides inhibiteur de 1' ACE identifiés dans les produits fermentés ............ 4 1

CHAPITRE II

Tableau 1 Valeurs d'inhibition de 1'ACE (ICSa) ei taux de protéolyse (mÉqL) mesurés

dans les lactosérums isolés des laits fermentés par les différentes souches de

lactobacilles ................................................................................................... 65

Tableau 2 Détection et quantification (pglml) des peptides inhibiteurs de 1'ACE et du

peptide P 176-182 dans les laits fermentés par les différentes souches de

lactobacilles .........................................................................-......................... 72

Tableau 3: Valeurs d'inhibition de I'ACE des peptides 177-183, 0 176-182 et P 176-18 1 obtenus par synthèse chimique et du peptide B 176-18 1 issu de

l'hydrolyse du peptide P 176- 182 par la carboxypeptidase A ........................ 73

INTRODUCTION GÉNÉRALE

Les laits fermentés sont consommés depuis des milliers d'anntes en raison de leur goût

agréable et de leur bonne durée de conservation. mais de nos jours leur popularité est plutôt

associke à leurs effets positifs sur la santé. Un des effets physiologiques le mieux connu

des laits fermentés est l'amélioration de la digestibilité du lactose (Kolars et al., 1984).

Mais des travaux récents monuenr égaiement que seion ies ferments utilisés pour leur

fabrication, les laits fermentés pourraient abaisser le taux de cholestérol sanguin (Taranto er

al., 1998 : Bertolarni et al., 1999). diminuer le risque de contracter des ulcères d'estomac

(Elmstahl et al.. 1998)' réduire la durée des diarrhées d'origine virale (Majamaa et al.,

1995). stimuler le système immunitaire intestinal (Schiffrin et al., 1997), réduire les risques

d'apparition de tumeurs du colon (Wollowski et al.. 1999) et enfin, abaisser la pression

systolique et diastolique chez des patients souffrant d'hypertension artérielle (Hata et al..

1996). En raison de ces effets physiologiques. les laits fermentés s'intègrent donc dans la

nouvelle gamme des aliments fonctionnels qui se définissent comme :

des aliments conventionnels consommés dans le cadre d'une diète

normale, qui démontrent des effets physiologiques bénéfiques pour la

santé eVou qui permettent de réduire les risques de certaines maladies et

ce, au delà de leur fonction nutritionnelle (Stephen, 1998).

Parmi les effets physiologiques des laits fermentés, leur activité antihypertensive est

connue depuis déjà quelques années. En fait, les premiers travaux ponant sur cette activité

biologique remontent à 1994, où Yamamoto et al. (1994b) ont démontré que des laits

fermentes à partir de différentes souches de Lricrobacillus helveticus provoquaient une

baisse significative de la pression artérielle systolique chez des rats hypertendus (SKR). De

nombreux travaux ont ensuite démontré l'effet antihypenensif du lait Calpis. un produit

fabrique au Japon et obtenu par la fermentation d'un lait écrémé à partir des souches

hctobacillus helveticus et Saccharomyces cerevisiae. Pour cette activité biologique, il

semble que certains peptides libérés dans le milieu suite à l'hydrolyse des caséines par les

protéases bactériennes soient responsables des effets observés. En effet, ces peptides

seraient des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-1 (ACE), une enzyme

impliquée dans le mécanisme de contrôle de la pression sanguine. Mais la libération de tels

peptides inhibiteurs dans le milieu de fermentation serait liée à la nature du ferment utilisé

et son activité protéolytique envers les caséines du lait. En effet, Gilbert er al. (1997) ont

montré que la capacité de protéolyse et la spécificité des protéases variaient

cccsidénb!eaect selon !es ;si;èccs de 5ac:CBcs !ac:kpes.

La présente étude avait pour but d'identifier des peptides inhibiteurs de I'ACE dans des

laits fermentés par six souches de Lactobacillus Iielvericus et une souche de Lactobacillus

delbrueckii subsp. bidgaricus. L'identification de ces peptides a été réalisée suite à

l'isolement de la fraction peptidique des différents milieux de fermentation. suivi de son

analyse par chromatographie de phase inverse (RP-HPLC) en présence de standards

peptidiques issus des caséines Q~ et p, et reconnus pour leur activité d'inhibition de

l'enzyme de conversion de l'angiotensine-I (ACE).

La prochaine section du mémoire est une revue de la littérature qui présente les principales

composantes nutritives et bioactives du lait de vache, qui décrit les laits fermentés et leur

propriétés biologiques, en particulier leur activité antihypenensive et les peptides

inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-I (ACE). Cette section se termine

par la présentation du but, de l'hypothèse et des objectifs i la base de ce travail de

recherche.

CHAPITRE 1

REVUE DE LITTÉRATURE

1. Le lait de vache, un aliment &he en composantes nutritives et

bioactives

1.1 Les composantes nutritives du lait de vache

Le lait est produit en réponse à la mise bas d'un jeune mammifère et constitue l'aliment le

mieux adapté aux besoins du nouveau-né (Cayot et Lorient. 1998). Chez l'humain, le guide

alimentaire canadien suggère une consommation journalière minimale de deux portions de

produits laitiers chez un adulte. L'excellente qualité nutritionnelle du lait de vache est

attribuable à son contenu varié en nutriments essentiels, dont les principaux sont les

protéines, le calcium et le phosphore. la vitamine A et plusieurs vitamines du complexe B,

en particulier la riboflavine et la vitamine BI? (Miller et a/., 2000). La teneur des principaux

nutriments du lait de vache est présentée au Tableau 1.

Le lait de vache est une bonne source de protéines d'excellente qualité nutritive qui

représentent environ 358 des solides du lait. La fraction protéique du lait est composée

d'un mélange hétérogène de protéines qui seront décrites plus en détail à la prochaine

section étant donné leur importance comme source de peptides bioactifs. Dans le cas de la

matière grasse, elle compte pour environ 3,4% du lait. Elle est composée en majorité de

triglycérides (98%) contenant des résidus d'acides gras à courte chaîne (entre 4 à 10

carbones), typiques de la matière grasse laitière des ruminants. On y trouve aussi des

phospholipides (0,2 à 1,0%). des stérols libres (0,2 à 0,4%), dont le cholestérol, de même

qu'une quantité variable de vitamines liposolubles (A, DT E, K). Les glucides du lait de

vache se caractérisent par une quantite de lactose plus faible (4.88), comparée à celle

mesurée dans le lait humain (7%). On y trouve également de faibles teneurs en glucose,

galactose et oligossacharides.

Tableau 1 : Teneur en nutriments du lait de vachea.

Nutriments Teneur (par 100 g)

Eau (g) Energie (Kcal) Protéine (N x 6.38, g) Lipides (pj

Acides gras saturés (g) Acides gras monoinsaturés (g) Acides gras polyinsaturés (g) Cholestérol (mg)

Glucides totaux (g) Fibres (g) Cendres (g) Minéraux

Calcium (mg) Fer (mg) Magnésium (mg) Phosphore (mg) Potassium (mg) Sodium (mg) Zinc (mg)

Vitamines Acide ascorbique (mg) Thiamine, B 1 (mg) Riboflavine, B2 (mg) Niacine (mg) Acide panthothénique (mg) Vitamine B6 (mg) Folate (mg) Vitamine B 12 (mg) Vitamine A (Uï) Vitamine D (UI) Vitamine E (mg) Vitamine K (mg)

' Tir6 de Miller et al. (2000).

Le lait constitue également une source majeure de vitamines liposolubles et hydrosolubles.

Excepté pour les vitamines K, E et C, dont les teneurs dans le lait sont faibles, le lait

contient des quantites apprkiables de toutes les autres vitamines. Enfin, le lait de vache et

les produits laitiers sont une source importante de min6raux pour l'organisme, en particulier

en calcium. phosphore, magnésium, potassium et en éléments traces comme le zinc. Par

exemple, une étude effectuée en 1994 chez les consommateurs américains a démontré que

les produits laitien contribuaient pour 73% de I'appon en calcium, 33% de celui en

phosphore et 16% de l'apport en magnesium (Miller et al., 2000).

1.2 La fraction protéique du lait de vache

Le lait de vache contient environ 3.5 % de protéines, dont 80 % sont des caséines et 20%

sont des protéines du lactosérum. Le Tableau 2 présente la proportion des principales

protéines du lait de vache de même que certaines de leurs caractéristiques physico-

chimiques. Les caséines se définissent généralement comme la fraction protéique qui

précipite suivant une acidification du lait à pH 4.6, à une température de 20°C. Les

composantes majeures de la fraction caséique sont les caséines Q, a?, P et K . Les

caséines sont des protéines phosphorylées de faible poids moléculaire (19-25 kDa), riches

en rksidus proline, mais pauvre en cystdine. Elles sont peu structurées et fortement

hydrophobes (P > IC > ~1 > G~). Dans le lait, 95 % des caséines se présentent sous la forme

de micelles (50-500 nm) dont la structure véritable n'est toujours pas élucidée. II semble

toutefois que les micelles soient composees de sous-micelles sphériques (10-15 nm), où la

caséine K se trouve en surface. Du phosphate de calcium et des interactions hydrophobes

seraient impliqués dans la liaison des sous-micelles entre elles. La Figure 1 est une

illustration schématique d'une micelle de caséine selon le modèle de Schmidt (1982).

Dans le cas des protéines du lactos6rurn, elles représentent un groupe plus hétérogène de

proteines qui demeurent solubles après la précipitation des caséines (Nakajima er al., 1996).

Tableau 2: Proponion relative des proteines du lait de vache et certaines de leun

caractéristiques physico-chimiquesa.

Protéine Proportion PI Poids moléculaire

(W ( k W

Caséines

OLsl

OLsl

P K

Y

Protéines du Iactosérurn 14-24 - P-lactoglobuline 7- 12 5 ,3

a-lactalbumine 2-5 4,2-4,5 14,4

Albumine sérique bovine 0,7- 1,3 4,7 69

Immunog1obulines 1,3-2,8 - 150-1 000

a Tiré de Miller et al. (2000).

Micelle de caséines Submicelle

Figure 1 : La micelle de caséine selon le modèle de Schmidt (1982).

Les principales protéines du lactos6mm sont la P-lactoglobuline et l'a-lactalbumine, mais

le lactosérum contient tgalement plusieurs autres protéines dont l'albumine sérique bovine

(BSA), les immunoglobulines, la lactofemne, la transfemne, des protéines rnembranaires et

plusieurs enzymes.

La P-lactoglobuline (p-lg) est la plus abondante (> 50%) des protéines du lactosérum. Son

poids moléculaire est de 18,3 kDa, bien qu'au pH du lait (6,8) elle s'associe pour former des

dimères. Cinq résidus cystéine sont présents dans la molécule, dont quatre sous la forme de

2 ponts disulfures et un groupement thiol libre en position 121. La P-lg est une protéine

globulaire qui présente la forme d'un calice hydrophobe, constitué principalement de

feuillets p. L'autre protéine en importance dans le lactosérum est l'a-lactalbumine (ah) .

Cette protéine, de faible poids moléculaire (14 kDa). possède une structure globulaire très

compacte, presque sphérique. L'a-lactalbumine est une metdloprotéine qui présente la

capacité de fixer le ~ a * ' , le ~n'? et d'autres ions métalliques (Fox, 1989). Finalement.

soulignons la présence de la fraction protéose-peptone dans le lactosirum qui est constituée

de fragments peptidiques issus pour la plupart de l'hydrolyse de la caséine B.

1.3 Les composantes bioactives du lait de vache

Le lait n'est pas seulement un aliment riche en nutriments, mais il contient également un

nombre très important de composés bioactifs en mesure de déclencher des réactions

physiologiques dans l'organisme (Xu, 1998). Certains de ces composés et leur effet

physiologique ont été listés au Tableau 3.

Par exemple, les protéines de lactosérum seraient impliquées dans la prévention du cancer

et l'amélioration de l'absorption des minéraux. La P-lactoglobuline, principale protéine du

lactosérum bovin, augmenterait la longévité des souris et serait aussi impliquée dans l'effet

hypocholestérolémique des protéines du lactosérum. Une autre protéine du lactosérum qui

présente plusieurs effets physiologiques est la lactofemne. Cette protéine faciliterait

Tableau 3 : Exemples de composés bioactifs présents dans le lait de vache.

Composé Effet physiologique Référence

Proréines du lactosérum Réduction des turneun mcCreuses Bonous et al.. 199 1 Absorption des mintnux PantiJco et al.. 1994

A u p n u t i o n de la longévité des souris Diminution du cholestérol sanguin

Modulation d a fonctions digestives

Bounous cr al.. 1989 Zhmg et Beynen. 1993

P w z er al.. 1

Inhibition bactéricnnc Rdgulauon du tryispon du fer

Stimulation du systkme immuniraire Rtduction de la hction inflammatoire

PmlifCntion et croiswnce ce1lul;iire Prtbiotique

Dyonysius cf ul.. 1993 Sanchez er ul.. 1992 Ghrerul . . 1991

Hanson et ul.. 1995 Hagiwm er u1.. 1995

Petschow ci: Tdbon. 199 1

hctopcroxydase hctophori nc

Lysosyme a- ci: P-amylases

Lipase

Inhibition b;iciéncnne inhibition bactérienne Inhibition bacicdrirnnc

Digestion d a fibres dimentaires Hydrolyse des yglycérida

Kussendngper. 1993 Mon et Ha, 1993

Stcinhoff ci ul.. 1994 Hmosh er ul.. 1997 Hmosh er dl.. 1997

tmmunoglobulincs Immunisation passive

lmrnunosupprcssion Monna cf al.. 1998

Absorption des mincnux aux niveau de l'intestin

Newburg rr ul.. 1996

Newburg er ul.. 1996 Glycos;uninoglycanes ct Glycolipidcs

Rotcction vinle

IGF- 1 IGF- I I EGF FGF

DCvcloppcment des organes et de leur fonction Bumn er ul.. 1997 Mrifven er ul.. 1987 hcopctta CI ul.. 1992 Hironaka er ul.. 1997

TGF-B TNF-a. L I . L-2. IL-8. Leucornéne B4.

Prostacycline. Prostaglandines E:ct FL,, Thromboxane B4

Développement du sysdme immuniraire Coordinûtion dcs lymphocytes

Rogers cr ul.. 19% Oliver et Calvinho. 1995

MCubolisme du dcium

Libération des hormones lutéiniscintc (LH) et foIliculostirnul~tc (FSH)

Libération dc l'hormone stimulant la thp ïdc (TSH)

ùéveloppcment du systéme immunitaire

Modulation du systtrne digestif

Modulation du systérnc digestif

DCvcloppemcnt du système nerveux

iaw cf al.. 1994

Amamnt er ul.. 1982 Hormone libtnnt I) gorudompint (GnRH)

Hormone libérant 13 thymtropin (TRH) Walsuri et Jenncss. 1984

K w i j m er ul.. 19%

T d c e y m cr ul.. 1990

Lu et al.. 1995

Patton et dl.. 1997

l'absorption du fer et stimulerait plusieurs fonctions biologiques régissant la défense de

l'organisme. Par exemple, elle modulerait la réponse immunitaire, l'activité

antimicrobienne et l'activation de la transcription cellulaire. Toujours dans le domaine de

l'immunité, on a ddmontré que la lactoferrine pouvait activer les cellules NK, les

leucocytes polyrnorphonuléaires, les cellules tueuses activées pas les lymphokines (ADCC)

et qu'elle augmenterait la cytotoxicité des macrophages (Yoo et al.. 1997). En liant le fer,

la lactofemne aurait aussi un effet bactéricide sur les bactéries Bacillus stearothemophilus

et Bacillus subtilis (Walstra et al., 1999). Dans le cas des immunoglobulines du lait (IgG,

IgA. IgM), elles contribueraient à l'immunité passive de l'organisme hôte. Chez l'humain.

on a démontré que ces protéines sont partiellement résistantes à la dégradation dans la

lumière intestinale humaine (Ross et al.. 1995) et qu'elles se lient de façon spécifique aux

antigènes. pouvant ainsi amener une protection au niveau de l'intestin contre certains virus

(Schanbacher et al., 1998).

Le lait contient également des facteurs de croissance (ex. IGF-1, EGF) de nature peptidique

qui peuvent induire une activité mitogénique chez certaines cellules. De même, des

cytokines sont présentes en faible quantité dans le lait et servent de signai chez Les cellules

impliquées dans la réponse immunitaire. On detecte également plusieurs types d'hormone

dans le lait de vache dont les effets physiologiques sont très variés (Tableau 3). Des

enzymes sont aussi présentes dans le lait de vache comme la lysozyme, qui catalyse

l'hydrolyse des liaisons P-1'4 de l'acide N-acétylneurarninique de la paroi des bacténes

gram (+), et la lactoperoxydase qui catalyse des réactions d'oxydation à partir du peroxyde

d'hydrogène. D'autres substances dans le lait, de nature osidique comme le lactose et les

arninoglycanes, possèdent des propriCtés pr6biotiques et favoriseraient le developpement

des bifidobactéries ; ces bacténes peuvent freiner la colonisation de I'intestin par les

bactéries coliformes pathogènes.

D'autre part, plusieurs peptides bioactifs dérivés des caseines ont été ddtectés dans le lait de

vache (Meisel, 1998). Par exemple, on retrouve le fragment 1-25 de la caséine P dans la

fraction proteose-peptone, qui une fois ingéré par l'organisme, pourrait moduler

l'absorption des minéraux au niveau de la lumière intestinale (Berrocal et al., 1989). De

même. des peptides seraient produits à partir des caséines par l'action de la plasmine. et

joueraient un rôle dans la régression des tissus mammaires de la vache A la fin de la période

de lactation (Aslam et Hurley, 1998).

2. Le lait fermenté, un aliment probiotique et fonctionnel

2.1 Historique, définition et diversité

. . L e s !n:s fernentés son: cor.socm~s depuis des rdliers d'at,;;ies. Leur ~;opufaïït6 est

associée non seulement leur goût agréable et légèrement acide, mais également à leur

meilleure durée de conservation comparée au lait non-fermenté. On raconte qu'au XVI

siècle, le roi de France François le' souffrait de diarrhées persistantes et que son problème

prit fin le jour où un médecin du Moyen-Orient lui conseilla de consommer du yogourt. Le

biologiste Elie Metchnikoff, au début du XXe siècle, a été le premier à associer la

neutnlisation des effets putréfiants du métabolisme gastro-intestinal à la consommation de

lait fermenté contenant des lactobacilles. Aujourd'hui, le lait fermenté est considéré comme

un probiotique et un aliment fonctionnel (Sanden, 1998). Selon l'organisme européen

"International Life Science Institute", un probiotique se défini comme:

un microorganisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité

suffiante, exerce un effet positif sur la santé au-delii des effets

nutritionnels traditionnels (Roberfroid, 1999).

Dans le cas d'un aliment fonctionnel, il est défini par Sant6 Canada comme:

un aliment conventionnel consommé dans le cadre d'une diète

nonnale, qui démontre des eflets physiologiques bénéfiques pour k

santé euou qui permet de réduire les Nques de certaines maladies et

ce, au delà de sa fonction nuhitiunnelle (Stephen, 1998).

Parmi les laits fermentés, le yogourt est de loin le plus populaire. Ii est obtenu par la

fermentation du lait par les espèces bactériennes Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus et Streptococcus thennophilus. Le kéfu, consommé depuis des siècles en

Europe de l'Est, est une boisson préparée à partir de lait fermenté par un mélange complexe

de bactéries dont Lactubaciilus, Lactucoccus, Leuconostocs, Acetubacter et des levures.

L'intérêt suscité par les bienfaits potentiels pour la santé des laits fermentés a conduit à

l'extension de la gamme de ces produits offerts sur le marché, et à une augmentation de

leur consommation mondiale (Soloff-Coste, 1997). Ainsi, plusieurs types de laits fermentés

sont maintenant disponibles sur le marché tel qu'en témoigne le Tableau 4.

Dans les laits fermentés, les lactobacilles sont des bactéries fréquemment utilisées. Cette

popularité provient de la croyance historique que ces bactéries sont des constituants

souhaitables de la flore intestinale. Elles sont reconnues comme sécuritaires (GRAS) et les

méthodes de culture et de préservation de ces bacteries sont bien connues (Tannock. 1998).

De plus, ces bactéries ont la capacité de survivre au transit intestinal en quantité suffisante

pour avoir un effet physiologique chez l'humain (Goldin et Gorbach, 1992).

Le groupe 1 du genre bacterien Lactobacil!us comprend les lactobacilles homofermentaires

qui utilisent les hexoses par la voie d'Embden-Meyerhof. Ces bactéries produisent surtout

du lactate (ex. Lactobacillus helveticus et Lb. delbrueckii subsp. bulgariciis) et ne peuvent

fermenter ni les pentoses, ni les gluconates. Les lactobacilles du groupe I sont les plus

acidifiantes et les plus thennophiles. Les températures optimales de croissance pour Lb.

lteiveticiis et Lb. delbriieckii subsp. brilgaricus sont de 42°C (Roy et al.. 1986) et 45°C

(Kandler et Weiss, 1986), respectivement. Lb. helveticus sen de levain dans la fabrication

de plusieurs fromages à pâte cuite comme le Gruyère, Emmenthal, Sbrinz, Grana, Parmesan

et Mozzarella (Mierau et al., 1997). Lorsque cette bactérie est utilisée en CO-culture, elle

serait efficace dans l'amélioration de la saveur des Cheddar réduits en matière grasse

Tableau 4 : Exemples de laits fermentés disponibles sur le marché O.

Nom commercial du produit

Pays Composition du ferment

Nu-Trish alB

AB yogourt

Cultura drink

B ifighurt

Miru-Miru

Lait Calpis

Danemark

Danemark

Ailemagne

Japon

Japon

Lb. acidophilus + Bifidobacterium + culture de

yogourt

B. longitm + S. thennopliilris

Lb. acidophiliis + Lb. casei + B. breve

L8. helrfetictls + S. cerevisiae

a Tiré de Jelen et Lutz (1998).

(Drake et al., 1997). Cette espèce entre également dans la composition de certains laits

fermentés et dans la production de cultures probiotiques (O'Sullivan et al., 1992). Dans le

cas de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, ses usages les mieux connus sont la fabrication du

yogoun et de certains fromages, mais il entre aussi dans la composition de cultures

probiotiques.

23 Propriétés biologiques associées aux laits fermentés

Un des effets physiologiques le mieux connu des cultures probiotiques est l'amélioration de

la digestibilité du lactose. Dans une étude comparant la consommation de yogourt et de

lait, on a démontré que le yogoun facilite la digestion du lactose chez des patients

déficients en lactase. En effet, pour une même quantité. le lactose seraient mieux toléré

dans le yogourt que dans le lait chez ces patients (Kolars et al., 1984).

La flore intestinale compte approximativement 400 espèces bactériennes. dont 30 à 40 de

ces espèces composent 99% de la flore (Tannock 1998). L'altération de la flore intestinale

peut provoquer des diarrhees, des désordres de permdabilité, des inflammations de la

muqueuse intestinale et l'activation d'agents cancérigènes (Salrninen et al., 1998). Chez des

patients ayant subis une radiothérapie pelvienne, laquelle détruit la flore intestinale. il a été

demontré que l'ingestion de lait fermenté réduisait les effets secondaires (diarrhées) causés

par les séances de radiation (Henriksson et al., 1995). Selon Majamaa er al. (1995), un lait

fermenté contenant la souche Lactobacillics GG pourrait réduire la durée des diarrhées

d'origine virale, mais la viabilité de la souche il l'intérieur de la préparation serait

déterminante pour l'obtention de l'effet antiviral.

Mann et Spoerry (1974) ont rapporte que les guemen Massaï d'Afrique consommaient

plusieurs litres de lait fermente par jour et avaient néanmoins de faibles taux de cholestérol

sanguins. Plus récemment, Taranto et al. (1998) ont démontré que l'ingestion de lait

fermenté par la souche Lactobacillus reuteri CRL 1098 abaissait de 38% le taux de

cholestérol sanguin, en plus d'une réduction des triglycérides et d'une augmentation du

ratio H D U D L chez des souris hypercholestérolémiques. Chez des patients souffrant

d'hypercholest~rol&nie modérée, la consommation pendant 8 semaines de 200 g par jour

de lait fermenté Gaio, contenant des souches de Enterococcus faecium et de Streptococcus

thennophilus. conduirait à une légère baisse du taux de cholestérol-DL (Bertolami et al.,

1999).

Les laits fermentes pourraient aussi agir à titre d'agent antibactérien. En effet, une étude a

révélé que contrairement au lait, une fone consommation de lait fermenté serait associée à

une diminution des risques de contracter des ulcères d'estomac (Elmstahl et al., 1998). Ces

résultats concordent avec les effets bactéricides associés aux lactobacilles et aux caséines

contre Helicobacterpylori, la bactérie responsable de certains ulcères d'estomac (Korhonen

et al.. 1995; Midalo et al., 1995). D'autre part. Lrictobacillus f e m e n ~ n GR4 synthétise

des bio-surfactants de nature protéique et empêcherait l'adhésion in vitro des entérocoques.

Selon Reid et al. (1998)' si on obtient un taux de survie acceptable à la suite de la

consommation de lait fermenté contenant ld. fernientuni GR- 1, il serait alors possible

d'éviter les infections uro-génitales causees par les entérocoques.

Chez un humain adulte, la surface de la muqueuse intestinale totalise 300 m', faisant de

cette région la plus grande partie du corps en contact avec l'environnement. Pour assurer la

defense de cette surface, les tissus lymphoïdes des voies intestinales contiennent 80% des

cellules produisant des immunoglobulines dans le corps (Collins et al., 1998), et la

consommation de laits ferment&. contenant des bactéries lactiques, stimulerait le système

immunitaire intestinal (Gill, 1998). Par exemple. cher des sujets humains, l'ingestion

pendant trois semaines de laits fermentés par la souche Lactobacillus rlcidophilus La1

produit une augmentation de l'activité phagocytaire des leucocytes periphénques du sang,

laquelle coïncide avec la colonisation de l'intestin par cette bactérie (Schiffnn et al., 1997).

Toutefois, selon Donnet-Hughes et al. (1999), une ingestion minimale de 10' UFC de Lb.

acidophilus La1 par jour serait nécessaire pour obtenir une augmentation de l'activité

phagocytaire des leucocytes. Précisons que les leucocytes font partie du système

immunitaire non-spécifique et qu'ils constituent la première ligne de défense de

l'organisme. Selon Fiat et al. (1993), I'activation leucocytaire pourrait s'expliquer par la

présence de peptides immunomodulateua dans le lait fermenté, mais ces derniers

pourraient aussi moduler la réponse immunitaire spécifique. En effet, Perdighn et al. (1995)

ont mesuré une augmentation des sécrétions intestinales d'IgA chez des souris alimentées

avec du lait fermenté par Loctobacillus casei. Aussi, Sütas et al. (1996) ont identifié des

peptides ayant une action modulatrice sur la prolifération lymphocytaire dans le lait

fermenté par Lactobacillus GG. Enfin. chez des patients souffrant de la maladie de Crohn et

alimentés pendant 10 jours avec un lait fermente par la souche Lrrctobacillus GG. il semble

que des peptides pourraient jouer un rôle dans le rétablissement des fonctions de la

muqueuse intestinale en augmentant la concentration en IgA (Malin et al., 1996).

Actuellement, on estime qu'un tiers des cancers aurait pour cause l'alimentation (Eddy er

al., 1986) et que le carcinome du colon serait le deuxième plus fréquent (Ziemer et Gibson,

1998). Mata et al. (1997) ont mis en évidence I'effet antimutagène d'une fraction

peptidique isolée d'un lait fermenté par la souche Lactobacilllrs helvericits L89. Selon les

auteurs. les peptides de cette fraction pourraient se lier à l'agent mutagène N'-oxyde+

nitroquinone (4NQO) et empêcheraient ainsi l'initiation tumorale. De même, une étude

rtalisée par Wollowski et al. (1999) a démontré I'effet protecteur de la consommation de

lait fermenté par Lactobacillus bulgaricus 19 1R contre l'agent mutagène 1'2-

diméthylhydrazine au niveau des cellules du colon chez le rat. ln vitro. cette souche

préviendrait aussi l'initiation tumorale provoquee par l'agent mutagène N-méthyl-N'-nitro-

N-nitrosoguanidine (MNNG) dans les cellules du colon de rats. La même équipe a suggéré

que des produits issus de l'action prottolytique de Lb. bulgaricus 191R seraient à l'origine

de I'effet antimutagène des laits fermentes par cette souche. Par ailleurs. les auteurs ont

montré que les autres produits du mdtabolisme bacterien comme le L(+)lactate, le

D(-)lactate, l'acide palmitique et l'acide isopalmitique n'étaient pas responsables de l'effet

antimutagène observé (Wollowski et al., 1999).

Le lait Calpis est un lait fermente préparé en quantité industrielle depuis plus de 80 ans au

Japon. Il est obtenu par la fermentation d'un lait écrémé pasteurisé, à partir d'un ferment

contenant des souches de Lb. helveticus et Saccharomyces cerevisiae. Depuis quelques

années, plusieurs études ont monué l'effet antihypertensif du lait Calpis. En outre, Hata et

al. (1996) ont sélectionné un groupe de 17 patients souffrant d'hypertension qui ont reçu

une dose de 95 miljour de lait Calpis sur une période de 8 semaines. Dans cette étude, un

deuxième groupe placebo, composé de 13 patients hypertendus, ont reçu la même quantité

de lait acidifié non-fermente. Après le traitement, les auteurs ont démontré une baisse

significative de la pression systolique et diastolique chez le premier groupe, alors qu'aucun

changement n'a été observé chez le groupe placebo. L'effet hypotenseur du lait Calpis a

même été maimenu penda~t 4 semahes après !'~rr& de !2 cûnsommation quotidienne de

lait fermenté chez les patients du premier groupe. Pour expliquer l'effet antihypenensif du

lait Caipis, plusieurs travaux ont ét6 réalises afin d'identifier les composantes actives de ce

lait fermente. Ces travaux seront traités plus en détail à la section 3, consacrée à l'activité

antihypertensive des laits fermentés.

2.3 Système protéolytique des bactéries lactiques

Dans le lait, la teneur en acides aminés et en peptides est insuffisante pour une croissance

optimale des bactéries lactiques. Toutefois, les bactéries lactiques possèdent des protéinases

situées sur la face externe de la paroi bactérienne qui hydrolysent les protéines du lait et

libèrent des peptides (Law et Kolstad, 1983). Ces fragments sont alors introduits dans la

cellule par des systèmes de rransport impliquant des gradients de protons et nécessitant de

l'énergie sous forme dTATP (Kungi et al., 1993). La présence d'ions calcium ( ~ a " ) serait

essentielle à l'attachement de la protéinase à la paroi. En effet, des lavages successifs des

bactéries avec un tampon de faible concentration en ions calcium favorisent la libération

des protéinases (Mills et Thomas, 1978). De plus, un traitement par le lysozyme permettrait

de libérer les proteinases de la paroi chez plusieurs souches de Lacrococcris (Thomas et

Pritchard, 1987).

Des travaux de caractérisation mol~culaire ont permis de démontrer que les protéinases de

la paroi des bactéries lactiques font partie de la famille des protéases à sérine. Leur poids

moléculaire est de 140 kDa et leur pH d'activité optimale se situe entre 5.5 et 6.5. Les

protéinases des lactocoques présentent également un fort degré d'homologie avec la

subtilisine, une protéase à sénne produite par certaines souches du genre bactérien Baci~lus

(Kok, 1990; Pritchard et Coolbear, 1993; Tan et al., 1993). Par contre, les protéinases des

lactocoques diffêrent de la subtilisine par la présence d'un domaine protéique situé en

position C-terminale et qui pourrait être impliqué dans la liaison du substrat (Vos et al.,

199 1).

Visser et al. (1986) ont proposé une classification plus précise pour différencier les

protéinases des lactocoques, laquelle est basée sur la spécificité catalytique de ces enzymes

envers les caséines bovines. Un premier type de protéinase, appelé Pl et isolé des souches

Lactoccocits lactis HP et Wg2. s'attaque fortement il la caséine B mais faiblement à la

caséine ~ 1 . Un deuxième type de protéinase, appelé Pm et isolé des souches Lmococccts

lactis AM1 et SKI 1. hydrolyse la caséine B d'une manière différente de la protéinase P 1

tout en s'attaquant à la caseine ~1 et à la caséine K. Finalement. d'autres protéinases ont

été isolées à partir d'autres souches de lactocoques et posséderaient des spécificités

intermédiaires entre les enzymes PI et PI11 (Exterkate et al., 1992).

Suite à l'action de la protéinase PI sur la caséine pl il y a libération d'une centaine

d'oligopeptides dont 20% sont ingérés par la bactérie via ses systèmes de transport actif

(Kunji er ni., 1993; Tynkkynen et al.. 1993). L'étude de la croissance de la souche L. laclis

subsp. cremoris MG 1363 dans une solution de caséine P purifiée a démontré que la partie

C-terminale de cette protéine est hydrolysée de façon préférentielle et qu'aucun peptide

contenant moins de 5 résidus d'acides aminés n'est formé (Kunji et al., 1998).

Des analyses génétiques (Otto et al., 1982; deVos et Davies, 1984) réalisées sur des

souches de L. lactis ont montré que les protéinases PI et Pm sont codées sur des plasmides

et que leur élimination conduit à une perte de l'activité protéinasique (Kok et al., 1985).

Les séquences génétiques codantes pour les 2 types de protéinases démontrent une

homologie de 98% et pour chacune des 2 séquences, il y a production de 2 trancnts que

l'on nomnie prtP et prtM. Le premier transcrit code pour une protéine de 200 kDa qui serait

responsable de l'activité catalytique et dont le domaine C-terminal présente une homologie

avec d'autres protéines connues provenant de la paroi des bactéries gram(+) (Guss et al.,

1984; Vos et al., 1989). Dans le cas du transcrit prtM. il produit une lipoprotéine de 32 kDa

qui ne serait pas impliqude dans le contrôle transcriptionne1 de prtP. De plus, cette protéine

n'apparaîtrait pas à la surface externe de la bactérie puisqu'aucune riponse imrnunologique

ne peut être dirigée contre sa séquence. Elle serait plutôt impliquée dans la conversion de

la protéinase en une forme active (Haandnkman et al., 199 1).

Les lactobacilles possèdent aussi des protéinases. Par exemple, Naes et Nissen-Meyer

( 1992) ont demontré que Lb. paracasei subsp. paracasei NCDO 15 1 produit un transcrit

pnM identique à celui des souches de lactocoques. La séquence peptidique de la protéinase

de la paroi cellulaire des lactobacilles serait à 9 6 8 identique à celles des protéinases des

lactocoques. Toutefois, les séquences génétiques codant les protéinases des lactocoques et

de Lacrobacill~is bulgaricus montrent peu d'homologie. Cette différence pourrait

s'appliquer à d'autres espèces de lactobacilles car aucune réponse immunologique n'a ité

observée enue des extraits de plusieurs espèces de lactobacilles (Lb.bulgaricus. Lb.

helveticus, Lb. buclmeri) et des anticorps monoclonaux dirigés contre les protéinases de L.

crenioris Wg2 ou SKI 1 (Sasaki et al.. 1995). Manin-Hernindez et al. (1994) ont purifié

une protéinase provenant de la souche Lb. helwticus L89. Les résultats de cette étude ont

suggéré que la proteinase de Lb. helveticus L89 est résistante aux réactions

autoprotéolytiques et qu'elle est fortement ancrée dans la paroi bactérienne. L'activité

maximale de la protéinase, qui est de type sérine protéinase. est atteinte à pH 7,O et les

auteurs ont montré que dans un milieu de force ionique élevée, la caséine fl est hydrolysée

plus rapidement que la caséine ~1 bien que sa spécificité soit différente de celle des

protéinases des lactocoques. Chez les souches Lb.casei HN14 et Lb. paracasei subsp.

paracasei NCDOLSL, les gènes codant les protéinases ont été localisés sur les

chromosomes des bactéries et non sur des plasmides comme dans le cas des lactocoques

(Kojic et al., 1991; Holck et Naes, 1992). On peut donc penser que les lactobacilles

pourraient systhétiser les protéinases de façon plus constante que les lactocoques selon le

nombre de générations et ce, étant donné que les plasmides sont souvent éliminés après

plusieurs cycles de division.

Lorsque le lait écrémé est utilisé comme milieu de croissance, Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus et Lcrctobacillus helveticus montrent un plus grand pouvoir protéolytique sur les

caseines que les souches de Lb. delbrueckii subsp. facric, Lb. casei et hcrococcus Zacrir

subsp. lactis. Le pouvoir protéolytique de ces souches peut toutefois varier selon le milieu

de fermentation et dependrait de la composition peptidique initiale du milieu (Gilbert et al.,

1997). Mais pour combler leun besoins en acides aminés, les bactéries ne comptent pas

seulement sur les protéinases dont l'action mène à la production d'ol igopeptides. En effet,

on a démontré la présence d'endopeptidases, d'aminopeptisases, de tri et dipeptidases ainsi

que des peptidases spécifiques à la proline dans des lysats de bactéries lactiques. Toutefois.

ces enzymes seraient localisées ii l'intérieur de la bactene et leur activité serait négligeable

comparée à celle des protéinases de la paroi cellulaire (Kunji et al., 1998). Par ailleurs.

Fortina et al. (1998) ont démontré que le pouvoir protéolytique de souches de Lb. helveticzts

mises en culture dans le lait pourrait varier considérablement. Cette variabilité pourrait

s'expliquer par l'activité des protéinases de la surface mais surtout, par une activité variable

des peptidases cytoplasmiques. La Figure 2 rksume les informations de cette section en

illusuant la localisation des différents enzymes dans les bactéries lactiques et leur

implication dans la libération d'acides aminés partir des caséines du lait.

Paroi membrane

/c y top~umiquc

Peptides

Système de transport des oligopeptides

Peptidases

e0.e ma

Çytoplasme

Acides / aminés -a

Figure 2 : Localisation des enzymes dans les bactéries lactiques et leur mode d'action sur

les c a s h e s du lait,

2.4 Effets physiologiques des peptides bioacüfs issus des protéines laitières.

Plusieurs peptides bioactifs ont été identifiés dans des hydrolysats enzymatiques de

caséines de même que dans les laits fermentés. Par exemple, l'hydrolyse in vitro des

caséines par des enzymes physiologiques, comme la chymotrypsine et la trypsine,

produirait 187 peptides différents (Lemieux et Amiot, 1989). Les caséines sont également

hydrolysées à des sites distincts par la pepsine, la pronase, la carboxypeptidase A, la

themolysine, la papaïne et la protéase du geme de blé (Pélissier. 1984). Dans le lait

fermenté, des peptides sont aussi libérés des protéines du lait suite à l'activité protéolytique

des bactéries lactiques. En autre, Yamamoto er ai. (1994a) ont identifié 25 peptides issus

de l'hydrolyse de lacaséine o;, et de la caséine P par la protéinase purifiée de la souche Lb.

helvericiîs CP790. Bien que l'hydrolyse enzymatique in vitro soit la méthode de choix pour

la production de peptides bioactifs (Gill et al., 1996)' c'est l'action des ferments qui est

responsable de la libérütion de ces peptides dans le lait fermenté (Tomé, 1998).

Les P-casornorphines sont les premiers peptides bioactifs qui ont été identifiés dans un

hydrolysat pepsique de caséines (Brantl et al., 1979). Chez le rat et le chien, ces peptides

moduleraient la vidange gastrique et la motilité intestinale (Daniel et al., 1993; Defilippi er

al., 1995). Les P-casomorphines présentent également des propriétés misécrétoires sur

l'iléon de lapin (Mahé et al., 1989). Ils interviendraient également dans la modulation de

I'insulinémie post-pandriale chez le chien (Schusdziarra et al., 1983) et seraient impliquées

dans le transport des acides aminés au niveau de la paroi intestinale (Brandsch et al., 1994).

Les P-casomorphines et d'autres peptides opioïdes issus des caséines démontrent aussi des

effets sédatifs et analgésiques chez le rat (Brantl et al., 1981). Entre autre, l'injection

intracérébrale de casomorphines modifie le comportement social chez des animaux de

laboratoire (Paroli, 1988). Après ingestion de lait de vache, des p-casomorphines ont été

détectées dans le petit intestin humain et le plasma de veaux nouveaux-nés ce qui indique

leur résistance à l'hydrolyse par les enzymes de la digestion (Umbach et al., 1985;

Svedberg et al., 1985).

Les phosphopeptides sont un deuxième groupe de peptides bioactifs obtenus par hydrolyse

trypsique des caséines. Ces peptides, contenant des rbsidus sénne phosphorylés, sont

résistants A la protéolyse par les enzymes digestives et permettraient d'améliorer

l'absorption du calcium via la formation de complexes solubles. Ces complexes pourraient

influencer le taux d'absorption du calcium et d'autres mineraux présents en quantité de

trace au niveau de l'intestin, tel le cation divalent ~ e + ' (Slimrne et Meisel, 1995).

Plusieurs peptides issus de I'hydrolyse enzymatique des caséines agissent in virro sur la

réponse immunitaire spécifique et sur l'activité phagocytaire (Migliore-Samour, 1988:

Kayser et Meisel, 1996). Dans le cas de ces peptides, la présence d'un résidu arginine dans

leur séquence primaire favoriserait leur liaison avec le récepteur y opioïde des

lymphocytes T et des leucocytes phagocytaires humains (Pagelow et Werner, 1986; Faith er

al*, 1984).

Zucht et al. ( 1995) ont démontré que le peptide ~2 155- 188 (Casocidin-1) pouvait inhiber la

croissance de certaines espèces bactériennes pathogènes telles Escherichia coli et

Stnphylococcus carnosus in vitro. t e peptide cqi 1-23 (Iracidine), isolé d'un hydrolysar de

caséine asi preparé à partir de la chymosine, de même que des peptides isoles d'un

hydrolysat trypsique de la caséine P apporteraient un effet protecteur chez la souris contre

les pathogènes Stapliylococcus arîreus et Klebsiella pneumoniae (Lahov et Regelson, 1996:

Migliore-Samour et al.. 1989). Dans le cas du peptide Iracidine, il a été détecté dans le

plasma sanguin humain. 20 minutes après l'ingestion de lait (Chabance er al., 1998).

Récemment, Recio et Visser (1999) ont isolé les peptides g2 164-179 et ~2 183-207 à

partir d'un hydrolysat pepsique de la caséine ~ 2 . Ces peptides inhiberaient in vitro la

croissance de bactéries Gram-négatif (E. d i ) et Gram-positif (L. innocua, B. cereus, M.

fivw et Sr. themuphilus).

D'autres peptides bioactifs dérivés des caséines sont reconnus pour leur action sur le

système cardiovasculaire et ce, à deux niveaux : sur la réaction d'agrégation plaquettaire et

sur la régulation de la pression sanguine. Par exemple, les casoplatellines sont des peptides

glycosyles obtenus par hydrolyse trypsique de !a caséine r et qui démontrent une analogie

de structure avec le fibrinogène sanguin. On a montré que ces peptides. par effet de

compétition, pouvaient inhiber l'agrégation plaquettaire (JoUès et al., 1986). Dans le cas

des peptides dont l'action se situe au niveau de la régulation de la pression sanguine, ils

seront traités plus en ddtail dans la prochaine section.

3. Activité antihypertensive des laits fermentés

3.1 Hypertension : définition et incidence

L'hypertension se défini comme une pression diastolique égale ou supérieure à 90 mm Hg

et/ou, par une élévation de la pression systolique au-delà de 140 mm Hg. Aux États-unis,

cette maladie affecte environ un quart de la population adulte, soit plus de 50 millions

d'individus (Miller et af., 2000). L'hypertension est plus fréquente chez les hommes et les

femmes d'âge moyen, et la race noire serait quatre fois plus affectée par cette maladie que

la race blanche.

L'hypertension est une maladie silencieuse dont les symptômes sont souvent inexistants.

Toutefois, ses conséquences sont majeures puisqu'elle peut entraîner des défaillances

cardiaques, des infarctus du myocarde, des dommages rénaux et des accidents cérébraux-

vasculaires. La cause exacte de l'hypertension est encore inconnue, mais il semble que les

facteurs génétiques soient fortement impliqués, de même que d'autres facteurs comme le

stress. une alimentation riche en sodium, l'obésité et le tabagisme (Mycek et al., 1992).

3.2 Contrôle physiologique de la pression sanguine

Dans l'organisme, le contrôle de la pression sanguine est sous la dépendance d'un système

biologique cohérent, mettant en oeuvre les reins, le sang et les glandes surrénales par

l'intermédiaire de la renine, de l'angiotensine et de l'aldostérone. La Figure 3 illusue ies

mécanismes physiologiques impliqués dans la régulation de la pression sanguine.

Détection d'une baisse - de pression sanguine

par les reins

Angiotensinogène (forme inactive)

Asp-A--Val-Tyr-Re-His-Pro-Phe-His-Leu-

Angio tensine-1 (forme inactive)

Asp-A rg-Val-Tyr-Re-His-Pro- Phe-H is-

ACE

(forme active) Asp- Arg-Val-Tyr-He-His-Pro-Phe

Sécrétion Vasoconstriction d'aldostérone par les glandes surrénales

.1 Rétention de Na + Pression sanguine

au niveau des reins + + Débit sanguin

Figure 3 : Régulation physiologique de la pression sanguine.

Le rein est le premier organe impliqué dans le contrôle de la pression sanguine. En effet.

lorsqu'une baisse de la pression artérielle est détectée par les barorécepteurs du rein. ce

dernier libère de la renine dans la circulation sanguine. La rénine convertit don

l'angiotensinogène en angiotensine-1, un décapeptide inactif. Par la suite, l'enzyme de

conversion de l'angiotensine-I. communément appelée ACE. hydrolyse un dipeptide (His-

Leu-OH) à l'extrémité C-temiinale de l'angiotensine-1 et libère le plus puissant des

vasoconstricteur, l'angiotensine-Il. La libération de ce! mtapeptide enmine dcrç !a

constriction des artérioles et par conséquent, une remontée rapide de la pression sanguine.

Mais l'action de l'angiotensine-II est double, car elle stimule aussi la sécrétion

d'aldostérone qui entraîne une accumulation de sodium au niveau du rein. Cette

accumulation de sodium s'accompagne alors d'une rétention d'eau qui accroît les volumes

extracellulaires et qui augmente le débit sanguin. On assiste alors à une élévation de la

pression sanguine et à la neutralisation de la sécrétion de rénine.

Une des stratégies adoptée pour le traitement de l'hypertension est l'utilisation d'inhibiteurs

de I'ACE afin de bloquer la production d'angiotensine-II. L'enzyme de conversion de

I'angiotensine-1 (ACE) est une métalloprotéase de 129 ma. dont le site actif contient une

région qui lie un ion ~n", une région pouvant former un pont hydrogène, et une dernière

region contenant un résidu Ar$ (Figure 4). L'ACE présente une homologie de structure

avec la carboxypeptidase A du pancréas et des dérivés de l'acide succinique, qui sont des

inhibiteurs de la carboxypeptidase A, se sont avérés capables d'inhiber I'ACE (Ondetti et

1 . 9 7 En outre, le captopril" est un dérivé succinylproline dont l'activité d'inhibition

de 1'ACE est très efficace, avec une valeur ICJo de 0,004 mM. L'ICso est un indice utilisé

pour quantifier le pouvoir inhibiteur d'un composé ; il se défini comme la concentration

d'un produit qui permet d'inhiber 50% de l'activité enzymatique.

ACE

Figure 4 : Structure du site actif de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-1

(Szisz et Budv&-i-Biirhy, 199 1).

3.3 Peptides inhibiteurs de I'ACE issus de l'hydrolyse des protéines laitières

Les premiers peptides inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-1 (ACE) ont

dté extraits du venin de serpent Bothrops jararaca (Ondetti et al., 1971). Depuis, ce type de

peptides a été détecté dans des hydrolysats enzymatiques de protéines de sources variées

telles la gélatine (Oshima et al., 1979), le thon, la sardine. le maïs, le soja et la zéine

(Yamamoto, 1997). Toutefois, c'est dans le lait et les produits laitiers que la production de

peptides inhibiteurs de I'ACE a et6 la plus étudiée.

Les premiers travaux ayant menés 5 l'identification de peptides inhibiteurs de 1'ACE à partir

des protéines laitières ont poné sur des hydrolysats enzymatiques de caséines. En 1982,

Mamyama et Suzuki ont observé qu'un hydrolysat trypsique de caséines bovines inhibait

l'activité de 1'ACE de fa~on marquée. Suivant le fractionnement de cet hydrolysat par

chromatographie, les auteurs ont identifié le peptide a,, 23-34, dont la valeur IC,, était de

77 pm. L'hydrolyse de ce peptide par une endopeptidase spécifique à la proline a conduit à

la libération du peptide as, 23-27 dont l'activité d'inhibition de I'ACE (IC,,= 6 ph4) a it6

fortement augmentée (Maruyama et al., 1985). Dans le même type d'hydrolysat, Mamyama

et ai. ( 1985) ont par la suite identifié un deuxième peptide correspondant à la séquence 177-

183 de la caséine P, et dont la valeur IC,,était de 15 W. puis le peptide ai 194-199 ayant

une valeur ICso de 16 pM (Maruyama et al. 1987b). L'activité antihypenensive de ces

peptides a par la suite été évaluée in vivo chez des rats Winstar SHR (Spontaneouly

hypertensive rats) (Maruyama et al., 1987a). Les auteurs ont montré que l'injection du

peptide a,, 23-34 (14,2 mgkg de poids corporel) permettait d'inhiber plus de 50% de la

production d'angiotensine-II suite à une injection d'angiotensine-1 (10 nglkg de poids

corporel). Par contre, aucun effet n'a été observé suite à l'injection du peptide 4, 23-27

(17,9mg/kg de poids corporel). In vivo, le peptide as, 23-27 serait donc inefficace pour

diminuer la pression sanguine alors qu'in vitro, son activité d'inhibition de 1'ACE était 13

fois plus élevée que celle du peptide g, 23-34. Dans le cas du peptide ~1 194-199,

Mmyama et al. (1987b) ont observe que son injection intraveineuse (3 1 .€?mgkg de poids

corporel) pouvait limiter l'effet sur la pression sanguine induit par des injections

d'angiotensine-1 (30 ou 100 ng/kg).

Karaki et al. (1990) ont évalué l'effet antihypertensif in vivo d'un hydrolysat trypsique de

casdine chez des rats S m . Les auteun ont montré qu'une ingestion orale répétée

d'hydrolysats de casdine (1.8-2.0 g/kg poids corporeVjour) diminuait la pression artérielle

des rats SHR, d o n qu'aucun effet n'était observé chez des rats normaux. La diminution de

la pression sanguine a été mesurée deux semaines apr& le début de l'expérimentation et

cette baisse s'est maintenue jusqu'à la fin de l'étude (4 semaines). Par HPLC et à l'aide de

peptides de synthèse. les auteurs ont estimé la teneur en trois peptides inhibiteurs de I'ACE

dans cet hydrolysat. La concentration des peptides a, 23-34 et j3 177-183 a été évaluée à

2% (plp) chacune, alon que celle du peptide ai 194-199 a été estimée à 1% (plp). Les

résultats de cette étude suggéraient donc que I'ingestion orale d'un hydrolysat de caséine

contenant des peptides inhibiteurs de I'ACE pouvait permettre d'al~aisser la pression

artérielle.

Une étude sur l'ingestion orale d'un hydrolysat trypsique de caséine chez des volontaires

humains normaux et hypertendus a eté réalisée par Sekiya et al. (1992). Chez les sujets

hypertendus, il a ét6 démontré qu'une ingestion orale de 10 g d'hydrolysat de caséine deux

fois par jour sur une période de 4 semaines réduit la pression anénelle de façon

significative et ne provoque aucun effet secondaire. Selon les auteurs, les résultats de cette

étude montrent l'intérêt de ce type d'hydrolysats comme ingrédient pour la formulation

d'aliments fonctionnels destinés à la prévention de l'hypertension.

D'autre part, des peptides inhibiteurs de I'ACE ont également été identifiés dans des

hydrolysats de protéines de lactosérum. Une des premières études sur le sujet est celle de

Abubakar et al. (1996) qui ont mesuré l'activité d'inhibition de I'ACE dans des hydrolysats

de protéines de lactosérum obtenus à partir de sept protéases différentes: trypsine.

protéinase-K, actinase-E, thermolysine, papaïne, pepsine et chymotrypsine. Les résultats

de cette étude ont montré que les hydrolysats obtenus avec la thermolysine, la papaïne. la

pepsine et la protéinase-K étaient les plus efficaces en terme d'activité d'inhibition de

I'ACE. En 1998, Abubakar et al. ont étudie l'effet antihypertensif in vivo des mêmes

hydrolysats après leur ingestion en dose unique (8 mglkg poids corporel) chez des rats

SHR. Les auteurs ont montré que seuls les hydrolysats obtenus avec I'actinase E, la

protéinase-K et la trypsine provoquaient des baisses significatives (- 50 à -55 mm Hg) de la

pression artérielle, laquelle était maintenue jusqu'à 12 heures après l'ingestion des

échantillons. Suivant ces résultats, I'hydrolysat préparé à partir de la protéinase-K a été

sélectionné pour l'isolement de la fraction peptidique par chromatographie (RP-HPLC et

HPSEC) et l'identification des peptides responsables de l'activité antihypertensive de cet

hydrolysat. Après plusieurs étapes de purification, cinq sCquences peptidiques ont été

identifiées: ne-Pro-Ala (P-lg 78-80), Phe-Pro (BSA 221-222; Caséine 62-63, 157-158 et

205-206), Gly-Lys-Pro (p-Globuline 18-20), Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly (Caséine 59-

64) et Val-Tyr-Pro (Caséine P 59-61). Suite à leur évaluation par les tests in vitro et in

vivo. ces peptides se sont avérés efficaces à réduire la pression systolique (-21 à -31 mg

Hg) chez des rats SHR et les valeurs ICso de ces peptides ont varié de 141 352 PM.

Mullally et al. (1996, 1997a, 1997b) ont également démontré la présence de peptides

inhibiteurs de I'ACE dans des hydrolysats de protéines du lactosérum. En outre, les peptides

P-lg 142-148 et P-Ig 102-105 ont été identifiés comme les plus efficaces à inhiber l'activité

de I'ACE avec des valeurs ICso de 42.6 FM et 172.1 PM. respectivement. Enfin, Pihlanto-

Leppala er al. (1998) ont identifié des peptides inhibiteurs de I'ACE dans des hydrolysats de

protéines de lactosérum et de caséines qui ont ensuite été fermenté à l'aide de quatre

ferments mésophiles et un ferment thermophile. Les auteurs ont montré que les

fermentations permettaient d'obtenir des taux de protéolyse de 1 à 3%. mais que l'activité

d'inhibition de 1' ACE n'était pas augmentée par la fermentation. Par contre, l'hydrolyse

pepsique et trypsique des milieux fermentés permettait d'augmenter le taux de protéolyse à

708, de même que leur activité d'inhibition de I'ACE (35 à 87%). Par la suite. les milieux

fermentés et hydrolyses par la pepsine et la trypsine ont été fractionnés par

chromatographie (RP-HPLC, SEC) afin d'identifier les peptides responsables des effets

observés. Ainsi, plusieurs peptides inhibiteurs de I'ACE ont eté mis en évidence dans la p- lactoglobuline, l'a-lactalbumine, la caséine o;, et la casdine P, en outre les peptides cqi

194-199 et P 177-133 dont les valeurs d'inhibition de l'AC€ (ICJo= 5 1 et 274 pM) se sont

révélées supérieures à celles mesurées préalablement par d'autres auteurs (Mamyarna et ai.,

1987b). Enfin, deux nouveaux peptides inhibiteurs de I'ACE ont kt6 identifiés dans cette

étude, soit les peptides ~1 157-164 ( I C 5 ~ 98 pM) et P 108-1 13 ( I C 4 2 3 pg/rnL).

3.4 Peptides inhibiteurs de I'ACE dans les laits fermentés

Plusieurs Ctudes ont été réalisées sur le lait fermente Calpis, une boisson japonnaise

préparée par fermentation (37°C. 24 heures) d'un lait écrémé à partir des souches de Lb.

helvericus et de S. cerevisiae. Ce lait offre plusieurs effets physiologiques, dont une baisse

de la pression artérielle chez des rats SHR après son ingestion à long terme (Takano et al..

1985).

Nakamura et al. (1995a) ont mesuré I'activitk d'inhibition de 1' ACE lors de la fabrication

du lait Calpis. Les auteurs ont montré que cette activité augmentait de façon importante à la

fin de la phase logarithmique de croissance des ferments, et que cette augmentation était

maintenue jusqu'à la fin de la phase stationnaire; ces résultats indiquaient donc que des

substances inhibitrices de I'ACE sont produites en cours de fermentation. À l'aide d'une

procédure complexe de purification par HPLC, les auteurs ont isolé et identifié deux

peptides inhibiteurs de I'ACE dans le lait Calpis: Val-Pro-Pro (Caséine P 84-86 et 71-76) et

Ile-Pro-Pro (Caséine r 108-1 10) dont les valeurs ICso étaient de 9 et 5 PM. respectivement.

Par la suite. Nakamura et al. (1995b) ont démontré l'efficacité du lait Calpis à réduire la

pression systolique chez des rats SHR. Suite à l'ingestion orale d'une dose unique (5d

iait/kg poids corporel) de lait Calpis . une baisse significative de la pression systolique a été

mesurée (-17 à -21.8 mm Hg) après 4, 6 et 8 heures. alors que la pression systolique

revenait à sa valeur initiale après 24 heures. Par contre, aucun effet sur la pression

systolique n'était observé chez les rats SHR ayant ingéré la même dose de lait non

fermenté. Par la suite, les auteurs ont mesuré l'effet de l'ingestion du peptide Val-Pro-Pro

(0.6 mgkg poids corporel) ou du peptide Ile-Pro-Pro (0.3 mgkg poids corporel) à des

doses équivalentes à celles mesurées pour ces deux peptides dans le lair Calpis. Pour les

deux peptides, les auteurs ont démontré une baisse significative de la pression systolique 2,

4,6 et 8 heures après leur ingestion; un retour à la pression initiale était également observé

après 24 heures.

Dans une autre étude, Nakamura et al. (1996) ont mesuré l'effet sur la pression systolique

de rats SKR, d'une période d'alimentation de 16 semaines avec un régime contenant 0.25,

1.25 et 2,50% de lait Calpis en poudre. Après 6 semaines d'expérimentation. une baisse de

la pression systolique a tté observee pour les trois régimes à l'étude. Toutefois, seul le

groupe alimenté avec le régime contenant 2.5% de lait Calpis a permis d'obtenir une baisse

significative de la pression systolique et ce, uniquement après la 14' semaine

d'alimentation. Enfin, les auteurs ont mesuré l'activité d'inhibition de I'ACE dans différents

organes isolés en fin d'expérimentation chez le groupe témoin et celui ayant reçu le régime

le plus riche (2.5%) en lait Calpis. Ils ont démontré une baisse significative de l'activité de

I'ACE dans l'aorte, alors que cette activité etait comparable dans les autres organes entre le

groupe témoin et le groupe expérimental. De plus, aucune différence significative n'a été

observée entre le groupe témoin et le groupe expérimental pour les indices suivants: ryihme

cardiaque, poids corporel, poids des organes et la mesure de 18 marqueurs sdriques

(protéine, ratio NG, BUN, créatine, acide urique, cholestérol total. HDL, P-lipoprotéine,

triglycérides. ZTT, bilirubine totale, GOT, GPT, LDH. AL-P, y-GPT, amylase. fer).

Pour compléter ces travaux. Masuda er al. (1996) ont mesuré la présence dans différents

organes, des deux peptides antihypenensifs précédemment identifiés dans le lait Calpis

(Nakamura et al., 1995a). Après une procédure de purification relativement simple, les

auteurs ont démontré la présence des peptides Val-Pm-Pro (4.3 mg/@ et He-Pro-Pro (3.5

mg/@ uniquement dans l'aorte abdominale des rats SHR ayant ingérés une dose unique de

lait Calpis (1OmUkg poids corporel). Ces quantités représentaient 4% à 5% de la quantité de

ces peptides contenus dans la dose de lait Calpis ingérée. Selon les auteurs. ces résultats

suggèrent que l'inhibition de I'ACE dans l'aune joue un rôle important dans l'activité

antihypertensive du lait Calpis.

Yamamoto et al. (1994b) ont mesuré chez des rats SHR, l'effet antihypertensif d'une dose

unique (5 mUkg poids corporel) de laits fermentés par 16 souches de bactéries lactiques.

Les auteurs ont montré que seuls les laits fermentés par les souches de Lb. hefveticus

CP790, CP6 11, CP6 15 et JCM 1004 permettaient d'obtenir une baisse significative de 1.1

pression systolique, 6 et 8 heures après leur ingestion. Par contre, aucun effet sur la

pression systolique n'a été observé chez le groupe ternoin (lait non fermenté) ou les groupes

noums des laits fermentes par les souches de Lb delbrueckii subsp. bulgaricus. Lb. casei.

Lb. acidopliilus, Lb. delbrueckii subsp. Zactis. Streptococcus thennopliilus, L. lactis subsp.

lactis et L. lactis subsp. cremoris.

Par la suite, les auteurs ont mesuré l'activité d'inhibition de I'ACE dans le lactosérum de ces

laits fermentés. Ils ont observé que les laits fermentés dont l'activité antihypenensive chez

les rats &ait significative, montraient également une forte activité d'inhibition de I'ACE.

Pour expliquer I'activité antihypertensive des laits fermentés par certaines souches, ils ont

mesuré la concentration en peptides des laits fermentés (OPA), de même que l'activité

protéolytique associée à la paroi cellulaire (Caséine FITC) des différents ferments. Les

auteurs ont montré que Lb. helveticus et Lb. delbnteckii subsp. hulgaricrts présentaient une

forte activité protéolytique et que la teneur en peptides des laits fermentés par ces souches

était kgalement très &levée. Ces rksultats permettaient donc d'expliquer l'activité

antihypertensive des souches de Lb. helveticus par leur forte activité protéolytique.

Toutefois, la faible activité antihypenensive des laits fermentes par Lb. deibrueckii subsp.

bi<!garicus, malgré leur forte activité protéolytique, pouvait être liee à la spécificité

différente des protéinases de la paroi cellulaire chez les différentes espèces de bactéries

lactiques.

Yamamoto et al. (1993) ont donc purifié une protéinase extracellulaire à partir de la souche

Luctobacillus helveticus CP 790, dont I'activité antihypenensive avait été une des plus

fortes dans l'étude précédente (Yammoto et ai., 1993). Dans cette étude, les 25 principaux

peptides issus des caséines P (15 peptides) et ~1 (10 peptides) ont été isolés et identifiés.

Bien que la spécificité exacte de la protéinase n'a pas été déterminée. les auteurs ont

observe l'apparition fréquente des sequenczs peptidiques suivanres: Leu-X, Phe-X. Ser-X,

L y s 4 et Gln-X. Les peptides identifiés dans cette étude ont par la suite été utilisés dans

d'autres travaux réalisés par la même équipe de chercheurs.

Yamamoto et al. (1994a) ont par la suite étudié l'activité antihypertensive d'hydrolysats des

caséine et 041 prépares à partir de la protdinase extracelluIaire de Lb. helveticus CP 790,

de même que l'activité d'inhibition de I'ACE des principaux peptides isolés de ces

hydrolysats. Ils ont montré que I'hydrolysat de caséine Q présentait la capacité d'inhiber

I'ACE (IC5& 1 pg/ml), mais que les 10 peptides isolés de cet hydrolysat avaient une

activité d'inhibition beaucoup plus faible. Dans le cas de I'hydrolysat de caséine p, son

activite d'inhibition de I'ACE était aussi très dlevée (24 pghl ) , de même que celle du

melange des 15 peptides isolés de cet hydrolysat (135 &rd). Au niveau des peptides

individuels de cet hydrolysat, neuf séquences peptidiques de la caséine B (16-97,43-69,70-

97, 1 13-127, 158-175, 168-175, 183-190, 191-209, 193-209) ont montré une fone activité

d'inhibition de L'ACE, avec des valeurs ICso variant de 4 à 290 p g / d .

Dans une deuxième étape, les auteurs ont mesuré l'activité antihypertensive chez des rats

SHR. d'une dose unique des laits fermentés par Lb. helveticus CP 790 et des hydrolysats de

caséines préparés avec la protéinase de cette souche. Ils ont montré une baisse importante

de la pression systolique (-29 mm Hg), 4 heures après l'ingestion (75 mgkg poids corporel)

de I'hydrolysat de caséine. De plus. ils ont démontré que la réponse était fonction de la dose

administrée. Dans le cas des laits fermentés par la même souche, des résultats similaires ont

été obtenus alors que l'ingestion d'un lait fermenté par la souche Lac~obacillits helveticus

CP 791, un mutant déficient en protéinase extracellulaire, n'a produit aucun effet sur la

pression systolique des rats SHR. Les auteurs ont également montré que I'activité

antihypenensive des laits était présente dans le lactosérum et par conséquent, que les

peptides libérés par l'action des protéinases bactériennes pouvaient être responsables de

leur activité antihypenensive.

En 1996. Maeno et al. ont fractionné par chromatographie (RP-HPLC), un hydrolysat de

caséine entière préparé avec la protéinase de Lb. helvericus CP 790. Ces auteurs ont montré

qu'une seule des fractions isolées par RP-HPLC démontrait une forte activité

antihypenensive chez des rats SHR. Le contenu de cette fraction a donc été caractérisé et

10 peptides ont été identifiés dans la séquence des caséines (104-109. 143-147), ~2

(189-197, 189-192. 190-197, 198-202) et P (1-6. 140-143, 169-175, 191-197). Chacun de

ces peptides a été synthétise par voie chimique, puis administré par voie orale ( 1 mgkg

poids corporel) à des rats SHR. Dans cet essai, seul le peptide P 169-175 a induit une baisse

significative de la pression systolique (-24.1 mm Hg) 6 heures après son ingestion, bien que

sa capacité d'inhibition de I'ACE était relativement faible ( IC5~1000 pM). De plus, l'effet

antihypertensif de ce peptide était fonction de la dose pour des concentrations variant de 0,2

à 2 mg/kg poids corporel. En contraste, le peptide ~1 104-109, dont l'activité d'inhibition

de I'ACE était très élevée ( I C 5 ~ 22 pM), n'a induit aucune baisse de la pression systolique.

Finalement, les auteurs ont vérifié la résistance du peptide P 169-175 à une digestion

enzymatique à l'aide de la pepsine, de la pancréatine et de la carboxypeptidase A. Ils ont

montré une forte augmentation de l'activité d'inhibition de 1'ACE suite à la digestion du

peptide P 169- 175 par la pancréatine et la carboxypeptidase A. Suivant l'analyse des

digestats par chromatographie (RP-HPLC, C-18)' les auteurs ont montré la présence d'un

peptide dont le résidu Gln en position C-terminale du peptide P 169-175 avait été éliminé.

La séquence p 169-174 a donc été synthétisee et son activité antihypertensive a été mesurce

in vitro et in vivo. Pour ce peptide, une forte activitt d'inhibition de I'ACE (ICp 5 jN) a

&é mesursa at l';-*a t:n- .'a 1 -- A.. - -+:A ,& A L A A , ~ S L A U L A ,, 1 ,,*, ,, P 159- 174 C ~ C Z des iân SHR a p r ~ ü q ~ 6 une

baisse importante de la pression systolique (-32,2 mm Hg) 6 heures après son ingestion.

Récemment, Yamamoto et al. (1999) ont purifié et caractdnsé un peptide antihypenensif à

partir d'un produit de type yogourt, préparé avec la souche Lb. Iielveticus CPN1, un variant

de la souche Lb. helveticus CP 790 qui est sensible à l'acide. Après un protocole assez

complexe de purification par chromatographie (RP-HPLC). les auteurs ont montré la

présence du peptide Tyr-Pro qui permettait d'expliquer la majorité de l'effet antihypertensif

du produit fermenté chez des rats SHR. Ce peptide est trouvé dans la séquence des caséines

o;l ( 146- 147. 159- 160). P (1 14- 1 15) et K (58-59) et son activité d'inhibition de I'ACE de ce

dipeptide s'est révélée relativement faible (IC50= 720 pl), d o n que son ingestion en dose

unique (1 mgkg poids corporel) chez des rats SHR a mené à une baisse significative de la

pression systolique après 4 (-23.2 mm Hg), 6 (-27.4 mm Hg) et 8 heures (-19.4 mm Hg).

Par la suite, les auteurs ont démontre que la concentration de ce peptide dans le lait

fermente était de 10 p g h i après 10 heures de fermentation (pH= 4,1), et que sa

concentration dans le produit fermenté final (pH 4.3) était d'environ 8.1 pg/ml.

L'ensemble de ces travaux indique donc que les laits fermentés par l'espèce bactérienne Lb.

helveticus peuvent contenir des peptides inhibiteurs de ltACE en mesure d'induire une

baisse de pression artérielle chez des organismes hypertendus (humain, rat). Les résultats de

l'ensemble des travaux présentes dans cette section ont été résumés aux Tableaux 5 et 6.

Tableau 5: Peptides inhibiteurs de I'ACE identifies dans les protéines laitières.

Ics Effet Protéine Séquence Mode d'o btentioa @hl) antihypertensif in Référence

peptidique vivo Caséine &l Hydrolyse aypsiquc > 1000 Y m o t o er ul.. 1994

P2-27 Hydrolyse uypsique + 6 (CS 1 asokinine-5) cndopcptidase & prniine

1=?3-33 Hydrolyse uypsique 77 1 SSP M m v m er al.. 1983 (as 1 -casokinine- l O)

f193-199 Hydrolyse trypsiquc 16 1 SBP M m y m t r ul.. l987b f24-27 Synthtsc 1 O M m y m et dl.. 1987a f-25-27 Synthèse - 7 M m y m er dl.. 1987a f27-30 S ynthése >IO00 M m y m cr ul.. 1987a

S yn t h b e Synthèse

Synthèse ProtCinasc CP 790 Rot6in;w CP 790 Prottin;lse CP 790

Proidinse CP 790

Pmrdiniue Cf 790 Prordinwe CP 790 Prortinase CP 790 RotCinase CP 790 Proidinse C P 790 Prat&inse CP 790 Protdinase CP 790 ProrCin;lx CP 790 Prottin;ise CP 790

Mmyrima et dl.. 19873 M m y a m a rr dl.. 1987b

M m y a m a rr 01.. 1987b Yammoro er ul.. 1994 Y m m o t u et ul.. 1994 Y a m m o t o er dl.. 1994

Yammoro er ul.. 1994 Maeno rr ul.. 1996 Marno er dl. . 1996

Y m o i o er ul.. 1994 Yamamoto et al.. 1994 Y m m o t o er ul.. 1994 Y m m o t o et ul.. 1994 Yamamoto erul.. 1994 Yamamoio t r ul.. 1994 Yamamoto er dl.. 1994

Caséine-% f189-191 Prottinase CP 790 580 Macno et 4.. 1996 f189-197 h o t t i n a c CP 790 600 M x n o et ul.. 1996 fl90-197 Pro tCinu CP 790 300 Macno ci al.. 1996 fi 98-20? ProtCinmc C P 790 40 Maeno er u1.. 1996

Caséine p Hydrolysctrypsiquc Y m m o t o er ul.. 1994 fin- i 83 Hydrol)re aypsiquc 15 ~ m y a m c i ~ ' r ui.. 198s

P-crisokinine-7

160-66 Peptone cadique 500 0-casomorphinc-7

Bmt l er al.. t 979

f193-202 Hydrolyse uypsiquc 300 Mcisel et S c h i i m . 1994 Bcaokinint- i O

fin-179 Synthèse 340 M m y m cr ul.. 19873

f ~ n - 1 8 1 s ynthtx 80 ,~aniy;im3. et ai.. 198%

4 ~ 8 ~ : induction d'une Msx de prrssion systolique significative chez des nrs spontuiCmnt hymendus

Tableau 5 (suite): Peptides inhibiteurs de I'ACE identifiés dans les protéines laitières.

~CJO Effet Protéine Peptide Mode d' obtention (JM) antihypertensif in Référence

vivo Caséine p

f59M f59-6 1 f62-63 f80-90

fl57- 158 EO5-206

Peptide B fl-6

f 16-69 f 16-97 f43-69 f70-97

f106-119 f113-127 f123-127 fls0-143 f157-175 fl68-175

f169-174

f169-175 f 176- 182 f177-182 f183- 189 flWX9 €791-197 f 193-209 f 199-206

Hydrolyse protéinax K Hydrolyse prodinase K Hydrolyse protéinasc K Hydmlyoe prntCinnce K Hydrolyse protdinue K Hydrolyse protéinse K

Prortin;tsc CP 790 Prottinasc CP 790 Prottinasc CP 790 ProtCinue CP 790 Pratéinllsc CP 790 Prordinrisc CP 790 Prottinase CP 790 RotCinase CP 790 Prottinrise CP 790 Prothin= CP 790 Protdinase CP 790 Protdinasc CP 790

S SBP -l SBP SBP

L SBP S SBP

1 SBP

l SEP

Abubakar er al.. 1998 Abubdcar er ul.. 1998 A b u b h er 01.. 1998 A huh;Lb3r rr r ~ l 1

Abubakar er dl.. 1998 Abubaku er ul.. 1998

Y m o t o ci ul.. 1994 Mîcno cr dl.. 1996

Ymmoto ci ul.. 1994 Y m o t o n dl., 1994 Yamamoto rr ul.. 1994 Ymmoto cr ul.. 19% Yamamoto ri ul.. 1994 Y mumoto cr d . . 1994 Yamamoto cr ul., 1994

Macno rr ul.. 1996 Y m m o i o er dl.. 1994 Yamamoto cr 111.. 1994

Maeno Cr ul.. 1996 Y m o t o er cil.. 1994 Yamamoto ur cil.. 1994 Y m o t o cr dl.. 1994 Ymmoto cr ul.. 1994

h4îeno rr dl.. 1996 î 'îmmoto et 111.. 1994 Ycinurnoro cr ul.. 1994

Caséine K E5-34 Hydrolyse uypsique Yoshikriwa tlr dl.. 1991

~ B P : Induction d'une baisse de pression systolique significative chez des nts sponimimcnt hgpcnendus.

Tableau 6: Peptides inhibiteur de I'ACE identifiés dans les produits fermentés.

- - --

ICm Effet Protéine Peptide Mode d'obtention (PM) antihypertensit in Référence

vivo Caséine G~ C d i n e s hydro~ysks par

fl42-147 f m t (ropy ) et 65 PihImto-Leppdilr et al.. pepsinettrypsine 1 998

f136- 147 Lait f m n t t p u h souche 720 pfbî SBP Yamamoto er al., 1999 Lb. hclvericus CPNJ

Caséines hydrolysées par f194-199 ferment (mpy ) ct

pcpsinettrypsine SI FM

Caséine p f60-66 Suspension de Cheddar 500 pM Hailcscl;issie rr dl. . 1999 hydrolysCc par Ncumscs

f/4-76 Lait cal pis 5 f l L SBP iVakamum er ai.. I 99% f8J-86 Ut Caipis 9 phi L SBP Ndcarnun er al.. 19953

Caséines hydrolysées p u fl08-1 13 f c m n t (ropy) er 423 p@rnL. Pi hlmto- Leppiilil rr ul..

pcpsine+trypsine 1998

flI4- 115 Lait fermenrd par la souche 720 PM 4 SB? Yamamoto er al.. 1999 Lb.hclrericus CPN4

Caséines hydrolystts par Augmentation f177- 183 ferment (ropy) et 274 pM conmcuon iidum et Pihlmto-Leppalil rr uf..

pcpsine+uypsinc U I ~ N S rat W ~ S W 1998

C;rsCincs hydrol ystcs par fl93-198 ferment (nipy) et 280 PM Pihtmto-leppdii er ut..

pcpsine+rrypsine 1998

Caséine K Yamamoto et al.. 1 999

flO8-1 IO Lait Calpis 5 PM L SBP Nakamura er al.. 19953

LSBP: Induction d'une baisse de pression systolique significative chez des rats spontanement hypertendus.

Les connaissances actuelles portant sur l'activité antihypertensive des laits fermentés

suggèrent que des peptides, dérivés des caséines suite à l'action des protéinases

bactériennes, sont responsables de la baisse de pression artérielle observée chez des rats

hypertendus SHR (Nakamura er al., 1995b). De plus, il semble que l'effet de ces peptides

soit lié à leur activité d'inhibition de I'ACE, une enzyme impliquée dans le contrôle de la

pression sanguine. Jusqu'i maintenant, seuls les laits fermentés par les souches

Lb.he1veriars CP 790 et CPN4 (Yamamoto et OZ.. 1994a. Yamamoto er al.. 1999), et le

ferment du lait Calpis, Lb. Iielveticus/S. cerevisiae (Nakamura et al.. 1995a)' ont démontré

une fone activité d'inhibition de I'ACE et/ou une activité antihypenensive chez des rats

hypertendus. LncrobacilZ~ts helvericus serait donc la bactérie la plus efficace pour la

libération de peptides inhibiteurs de I'ACE. probablement en raison de sa fone activité

protéolytique et de la spécificité des protéinases de sa paroi cellulaire.

Afin d'évaluer le potentiel de cette bactérie pour la fabrication d'un aliment fonctionnel

et/ou d'un ingrédient nutraceutique destiné aux individus souffrant d'hypertension, cette

recherche avait pour but d'idenrifer et de quantifier des peptides inhibiteurs de l'enzyme

de conversion de l'angiotensine-l (ACE) dans des kifs fermentés par 6 souches de Lo.

h elveticus.

L'hypothèse à la base de ce travail etait la suivante :

La fermentation anaérobie d'un lait écrémé par des souches de Lb.

helveticus permettra de libérer des peptides inhibiteurs de I'ACE à

partir des caséines.

Afin de vérifier cette hypothèse et d'atteindre le but de ce travail, les objectifs suivants ont

été définis :

1) Préparation de laits fermentes à partir de 6 souches de Lb. helvericus (R-211, R-204, R-

23 1, R-235, ATCC 12046, ATCC 10797) et une souche de Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus (ATCC 1 1842).

2) Évaluation de la croissance. de la production d'acide lactique et du taux de protéolyse en

cours de fermentation pour les six souches de Lb. helveticus et la souche de Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus.

3) Isolement de la fraction lactosérum des laits fermentés et mesure de son activité

d'inhibition de 1'ACE.

4) Purification des peptides contenus dans la fraction lactosérum des laits fermentés et

identification des peptides inhibiteurs de I'ACE à l'aide de six standards peptidiques

issus des caséines ~1 et B (obtenus par synthèse chimique) et reconnus pour leur activité

d'inhibition de I'ACE : 23-34, ai 28-34, 23-27, P 60-66, P 177-183 et P 193-

202.

Le prochain chapitre du mémoire est consacré à la présentation des résultats obtenus dans le

cadre de ce projet de recherche. Ce chapitre sera soumis ultérieurement i un Journal

scientifique pour fin de publication. Les réfkrences citees dans ce chapitre sont listées à la

fin du mémoire dans la section "Bibliographie générale". Finalement, le mémoire se tennine

par une conclusion générale où sont résumés les principaux résultats obtenus dans le cadre

de ce travail et où sont exposés des perspectives d'avenir dans ce domaine de recherche.

CHAPITRE II

1. INTRODUCTION

Plusieurs travaux de la littérature ont démontré l'effet antihypertensif de laits fermentés par

Lactobacillus helveticus. Entre autre, Yamamoto et al. (1994b) ont démontré que des laits

fermentés avec différentes souches de Lb. helveticus, donnés par voie orale, abaissaient la

tension artérielle chez des rats spontanément hypertendus (SHR). Le lait Calpis,

co~~iercia l is2 21 J a p depüis de numbreuses années. tsr un autre excnipk de iait

fermenté par les souches Lb. helveticus et Saccharomyces cerevisiae et dont l'ingestion

d'une dose unique chez des rats SHR produit une baisse significative de la pression

artérielle (Nakamura et al., 199%). Le même effet du lait Calpis a égaiement été observé

chez des sujets humains hypenendus suite à sa consommation sur une période de 8

semaines.

L'activité antihypertensive des laits fermentés par Lb. helvericus serait liée à la libération

dans le milieu de fermentation. de peptides inhibiteurs de L'enzyme de conversion de

l'angiotensine-1 (ACE). En fait, cette enzyme est une métalloprotéase qui transforme

l'angiotensine-I en angiotensine-II. un puissant vasoconstricteor. L'inhibition de I'ACE

empêche donc cette transformation et par conséquent, la vasoconstriction des artérioles qui

mène à une augmentation de la pression sanguine. Plusieurs peptides inhibiteurs de I'ACE

ont 6té isolés à partir d'hydrolysats enzymatiques de caséines tels les peptides : ~1 23-34.

cq, 23-27, ai 28-34, B 60-66, B 177-183 et B 193-202 (Mamyama et al., 1982, Maruyama

et al., 1985, Maruyama et al., l987a, Brant1 et al., 1979 et Meisel et Schlirnrne, 1994).

Parmi les bactéries lactiques, Lb. helveticiis démontre la plus forte activité protéolytique

(Gilbert et al., 1997), laquelle varie toutefois selon les souches (Fortina er al., 1998). Cette

activité pourrait donc expliquer l'efficacité de cette bactérie à produire des peptides

inhibiteurs de I'ACE, mais la spécificité des protéinases de sa paroi serait un autre facteur

très important. Par exemple, Yamamoto et al. (1994b) ont démontré que des laits fermentés

par les souches Lb. helveticus CP790, CP611 et CP615 inhibaient fortement I'ACE. Les

mêmes auteurs (Yamamoto et al., 1994b) ont ensliite démontré qu'un hydrolysat de caséine

Q, préparé à partir de la protéinase isolée de la souche CP790, permemit d'inhiber

fortement I'ACE ( I C s ~ 1 1 pg/rnl) (Yamamoto et al.. 1994a). En 1996, Maeno et al. ont

isolé une fraction peptidique antihypertensive à partir d'un hydrolysat de caséine entitre

prdparé avec la protéinase de Lb. helveticus CP790. Les auteurs ont démontré que parmi les

10 peptides contenus dans cette fraction, seul le peptide caséine B 169-175 induisait une

baisse significative de la pression systolique chez des rats SHR, bien que sa capacité

d'inliibition de i'ACE était reiarivement Ïaiibie (IC* IOOOjM). Après hydrolyse de ce

peptide avec la carboxypeptidase A, les auteurs ont toutefois obsemé une augmentation

importante de son activité d'inhibition de 1'ACE ( I C 5 ~ 5w): le processus de digestion des

peptides in vivo serait donc important pour leur activité antihypertensive. Dans le lait

Calpis, Nakamura et al. (1995a) ont identifié deux peptides inhibiteurs de I'ACE, soit Val-

Pro-Pro (caséine 84-86) et ne-Pro-Pro (caséine 74-76, caséine K 108-1 10), dont les

valeurs ICso étaient de 9 et 5 pM. respectivement. Ces peptides, donnés par voie orale à des

rats SRH. ont également induit des baisses significatives de la pression artérielle. Masuda et

al. (1996) ont montré que ces peptides étaient résistants au processus de digestion et qu'une

forte proportion de ces peptides se retrouvait dans l'aorte abdominale des rats SRH ayant

ingéré du lait Calpis. Rkcernment, Yamamoto et al. (1999) ont identifié un autre peptide

antihypertensif dans un produit de type yogourt, fabrique par la fermentation d'un lait avec

la souche Lb. helveticus CPN4. Ce peptide, Tyr-Pro, a été trouvé dans la séquence des

caséines %,( 146- 147). B (1 14-1 15) et K (58-59). L'activite d'inhibition de I'ACE du peptide

Tyr-Pro s'est avéré relativement faible ( I C 5 ~ 720 pM), mais son ingestion en dose unique

chez des rats SHR a mené à une baisse significative de la pression systolique.

L'objectif de la présente étude était d'identifier des peptides inhibiteurs de I'ACE dans des

laits fermentés par 6 souches de Lb. helveticus et une souche de Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus. L'identification et la quantification de ce type de peptides a été réalisée par

chromatographie de phase inverse en utilisant des standards peptidiques déjà reconnus pour

leur activite d'inhibition de I'ACE: cqi 23-34, Q 23-27, ~1 28-34, P 60-66, 177-183 et P 193-202.

2.1 Matériel

Les souches de Lb. he~veticus (R-204, R-211, R-23 1, R-235, ATCC 10797, ATCC

12046) provennaient de collections bactériennes commerciales (Institut Rosell, Montreal

QC; American type culture collection, Rockville MD), alon que la souche Lb. delbrueckii

subsp. bulgaricus (ATCC 11842) a Cté fournie par le Centre de recherche et de

développement sur les aliments, (Saint-Hyacinthe QC). La peptone, le milieu MRS et le

Bacto-Agar provenaient de Difco Laboratones (Detroit MI) et le lait écrémé en poudre

(low heat), utilisé dans les milieux de fermentation, a été obtenu de la compagnie

Agropur (Granby, QC). Les peptides ai 23-34, cqi 28-34, &l 23-27, P 60-66. P 177-

183 P 193-202, P 176- 182 et P 176-18 1 ont été synthétisés par le Service de séquence de

peptides de l'est du Québec (Québec QC). L'o-phtaldialdehyde (OP4), la Norleucine, les

standards d'acides aminés, la carboxypeptidase A de type4 PMSF (50 Ulmg). I'hippuryl-

L-histidyl-L-leucine (0,3%'0. p h ) et l'enzyme de conversion de l'angiotensine4 (0.33

U h l , Rabbit Lung Acetone Powder) ont été obtenus de la compagnie Siema Chemical

(St-Louis MO). Le phenylisothicyanate (PITC) et la trousse de dosage protéique

(Bicinchoninic acid protein assay reagent kit) ont été obtenus de la compagnie Pierce

(Rockford IL).

2.2 Culture des souches

Un total de 6 souches de Luctobaci~lus Iielveticus (R-204, R-211. R-23 1. R-235, ATCC

10797, ATCC 12@46) ont été sélectionnées pour leur activité protéolytique alors que Lb.

delbruekii subsp. brdgaricus ATCC 11842 a été choisi comme bactérie témoin non-

probiotique. La diversité génétique des différentes souches a été confirmée par la

méthode de Roy et al. (2000). Pour chacune des souches, des stocks d'ensemencement

ont été préparés en réactivant les souches lyophilisées dans 1 ml d'eau peptonée (0,98,

ph) additionnée de NaCl (0.18, ph) . Par la suite, la suspension a &té utilisée pour

inoculer (5,5%, p h ) un milieu MRS, lequel a et6 incubé pendant 24 heures à 37°C. Cette

pré-culture a été utilisée pour l'inoculation (12, v/v) d'un lait Ccrémé reconstitué à 12%

(p/p). Après une incubation de 20 heures à 37°C. cette culture a été utilisée pour

l'inoculation (1%, v/v) d'un tube contenant 25 ml de lait écrémé reconstitué (12%, p/p) et

25 ml d'une solution de glycérol stérile (?O%, ph). Le contenu du tube a été mélangé par

inversion et des volumes de 1,5 ml ont été transfert% dans des vials qui ont été entreposés

à -80°C.

2.3 Fermentation

Les fermentations ont été réalisées dans un fermenteur (BioFlo model C30, New-

Brunswick Co., New-Jersey NJ) d'une capacité de 600 ml. Pour chacune des souches

étudiées, une pré-culture ( 1 %, v/v) a tté propagée dans du lait écrémé reconstitué ( 12%.

p/p) en efitctuant un transfert après chaque 12 heures d'incubation à 37°C. Cette pré-

culture a eté utilisée pour I'inoculation (1%, v/v), sous conditions stériles, de 600 ml de

lait écrémé reconstitué. Pour chacune des souches, les fermentations ont été réaiisées en

tripkata, sous agitation (70 rpm) à 42°C. pour une durée de 24 heures et dans une

atmosphère anaérobie créée par la circulation de CO2 (1SOmVmin) dans l'enceinte du

fermenteur. En cours de fermentation, le milieu a été maintenu à pH 6,O par l'ajout

automatique de NaOH 5N (Radiorneter-copenhagen, model ETS8 1 1, Radiometer A/S,

Danemark) et des échantillons de milieu (10 à 15 ml) ont été prélevés à toutes les 3

heures à l'aide d'un bec collecteur situé sur la paroi du fermenteur. À la fin de la

fermentation, du glycérol a été ajoute au volume restant de lait fermenté (IO%, v/v),

lequel a dté stocké à -2S°C.

2.4 Caractérisation des laits fermentés

Les échantillons prélevés en cours de fermentation ont été analysés pour leur compte

bactérien, la production d'acide lactique et leur taux de protéolyse. Dans le cas du compte

bactérien, 1 ml de lait fermenté a 6té dilué dans 100 ml d'eau peptonée (0,9%, ph)

additionnée de NaCl (O,l%, ph). Cette solution a été utilisée pour l'ensemencement de

plats de Pétri contenant du milieu MRS (5,5%, pfv) et 1,5 9% (ph) de Bacto-Agar. Après

un entreposage à 37°C pendant 48 heures, les colonies visibles ont été dénombrées

(UFC/rnl).

La production d'acide lactique a été déterminée à partir du volume total de NaOH 5N

îdditionnd ez cûüis de fsmeniatisn, iéquei a d é transformé en gramme d'acide

lactique/lûû ml de lait fermenté. Dans le cas du taux de protéolyse, il a été mesuré à partir

de la méthode spectrophotométrique de Church et al. (1983), basée sur la réaction de 1'0-

phtaldialdehyde (réactif OPA) avec les groupements a-aminés libres du milieu. Pour cette

analyse. 5 ml d'acide trichloroacétique (0,755) ont ét6 ajoutés à un aliquote (10 ml) de

lait fermenté, puis ia suspension a été filtrée par gravité sur un filtre Whatman 40

(Whatman International, Midstone, Angleterre}. Dans une cuvette de plastique, 150 /LI de

filtrat ont été additionnés à 3 ml de réactif OPA. Après 2 minutes à température ambiante,

l'absorption des solutions a été mesurée à 340 nm, puis transformée en valeiir de

protéolyse (mÉq NH2/L) à partir d'une courbe de calibration préparée avec des

2.5 Isolement de la fraction lactosérum des laits fermentés

Des échantillons de lait fermenté (40 ml) ont été chauffés à 40°C sor

concentrations croissantes (50 à 250 mM) de L-leucine solubilisées dans du SDS (1%).

1s agitation constant

puis acidifiés avec 4 ml d'acide acttique (6055, vlv) selon la procédure proposte par

Fogliano et al. (1998). La suspension a été centrifuge (8000 g, 10 min), suivi de la

filtration du surnageant sur un filue Whatman 41 (Whatman International, Midstone,

Angleterre). Par la suite, le filtrat a été ajusté à pH 8,3 avec une solution de NKOH

(30%). puis centrifugé pendant 10 minutes à 8000 g. Les lactosérums ainsi obtenus ont

été utilisés pour la mesure de leur activitd d'inhibition de I'ACE et pour la procédure

d'isolement de la fraction peptidique.

2.6 Isolement de la fraction peptidique des lactosérums

Le lactosérum (15 ml) isolé des laits fermentés a été filtré sur un module Centricon PL-20

(10 000 Da, Millipore Corp., Milford, MA) par centrifugation à 4000 g pendant 90

minutes. L'blimination du lactose et des sels du filtrat a été réalisée à l'aide d'une

cartouche Cl8 (Waters Corp., Milford MA). La cartouche a d'abord été activée

paï 1; ciiîü:aUon de 3 In: de m&hanoi, suiri de 5 mi d'eau déionisée ( i û Mn). Par la

suite, le filtrat ( h l ) a été injecté sur la cartouche, laquelle a été rincée avec 5 ml d'eau

(18 MR). L'élution des peptides a &té obtenue par injection de 2 ml d'une solution

acétonitri1elTFA 0.18. À noter que le premier et le dernier 0,s ml d'éluat ont été éliminés

et que l'échantillon récolté ( I d ) a été évaporé dans un Speed-Vac (Savant, Farmingdale

NY). Pour éliminer une partie des peptides hydrophiles, le culot a été suspendu dans 100

pl de tampon citrate (100 mM, pH 6.2) et traité sur un Microcon-SCX muni d'une

membrane d'échanges cationiques (Microcon-SCX absorptive microcencentrator,

Millipore Corp., Milford MA). Le Microcon-SCX a d'abord 6té activé en injectant 2

volumes (500 jA) de méthanol et 1 volume (500 pl) d'eau (18 MR), suivi à chaque étape

d'une centrifugation de 15 secondes à 7000 g. L'échantillon a finalement été injecte sur le

Microcon-SCX, puis centrifugé à 1200 g pendant 1 minute. Le Microcon-SCX a été lavé

en injectant 2 volumes (500 pi) d'une solution HCl O,OlM/lO% méthanol suivi d'une

centrifugation ( 1200 g, 1 min), puis l'élution des peptides a &té obtenue par injection de 3

volumes (50 pl) d'une solution NKOH 1.4 Nlméthanol 108. L'éluat total ( 150 pl) a été

recueilli par centrifugation à 14 000 g pendant 15 secondes, lequel a Cté Çvaporé au

Speed-Vac. Enfin, le culot a été suspendu dans 60 @ de la phase A (TFA 0,01% préparé

dans l'eau 18 MR) utilisée pour l'analyse chromatographique.

2.7 Analyse et purification des peptides inhibiteurs de I'ACE par RP-HPLC

Les analyses chrornatognphiques ont été effectuées à l'aide d'un système HPLC Waters

(Waters Corp., Milford MA), muni d'un contrôleur modèle 6WE, d'un détecteur à

longueur d'onde variable modèle 486 et d'un injecteur automatique modèle 717.

L'acquisition et le traitement des données ont été réalisés à l'aide du logiciel Waten

Milleniun@ 2010. Toutes les phases mobiles utilisées pour ces analyses ont été préparées

avec de l'eau 18 MR et filtrées sur des filtres de nylon (0,2 pm) Dans le cas des

échantillons, ils ont été filtrés sur des membranes PVDF (0,2 pm). Les analyses ont été

réalisées à l'aide d'une colonne Waten ?!c~~r?z!!@ Cl8 (Waters Corp., Milford MA)

maintenue à une température de 39°C' avec un débit de 1 d m i n et une longueur d'onde

de détection à 2 14 nm.

Les fractions peptidiques isolées des lactosérums provenant des différents laits fermentés

ont été injectées (15 pl) sur la colonne, et les peptides ont été élués à l'aide d'un gradient

d'une durée de 90 minutes, obtenu par la combinaison de quatre phases mobiles : phase

A, TFA 0,1% (v/v); phase B, ACN 15% (v/v) + TFA O,l% (vlv); phase C, ACN 306

(vlv) + TFA 0,l% (vlv); phase D, ACN 100% (v/v) + TFA O. 1% (v/v). Pour le gradient

de 90 minutes, il a été obtenu de la façon suivante : 100% phase A à 70% phase B de O à

10 minutes; 70 à 100% phase B de 10 à 25 minutes; 100% phase B à 100% phase C de

25 à 75 minutes: 100% de phase C de 75 à 80 minutes; 1008 de phase C à lm% phase D

de 80 à 85 minutes; 100% phase D de 85 à 90 minutes.

Une fois l'analyse RP-HPLC complétée pour chacune des fractions peptidiques isolées

des laits fermentés, la présence de peptides inhibiteurs de I'ACE dans ces fractions a ét6

détectée à l'aide de six peptides trouves dans la sdquence des caséines bovines. Ces

peptides "standards" ont et6 sdectionnés sur la base de travaux de la littérature ayant

démontrés leur activitk d'inhibition (ICso) de I'ACE : caséine P f60-66 (ICso=500 PM,

Meisel, 1998), f177-183 ( I C s ~ 1 5 PM, Maniyarna et aL, 1985) et f193-202 (IC5~300

PM, Meisel et Schlimme, 1994); caséine o;~ f23-34 (ICM=77 PM, Maruyama et al..

1982), f23-27 (IC50=6 PM' Maniyama et al., 1985) et f28-34 ( I C s ~ 1 4 0 PM. Maruyama

et al.. 1987a). Pour leur analyse, ces peptides ont été solubilisés individuellement dans la

phase A ( F A 0,146) à des concentrations de 0,47,0,63,0,54,0,41 et 0,33 mg/rnl pour les

peptides P 177-183, P 193-202, ~1 28-34, 05, 23-34 et P 60-66, respectivement. Dans le

cas du peptide o;, 23-27, 0'40 mg a été solubilisé dans du TFA (50%). Les solutions

peptidiques ont ensuite été injectées (15 pl) sur la colonne et les peptides ont été élues

dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. L'analyse de ces standards

a donc permis d'identifier leur zone d'élution sur les chromatogrammes des fractions

peptidiques isolées des laits fermentés. et de procéder à la collecte des pics peptidiques

apparaissant dans la zone d'élution de chacun des standards. Afin de récolter

suffisamment de matériel peptidique pour la prochaine étape de purification, la collecte

des pics a été réalisée en triplicata.

Le maténel peptidique collecté à I'éiape précédente a été évaporé au Speed Vac, puis les

culots ont été suspendus dans 1 ml d'un mélange ACNKFA 0,1%. Ces solutions ont été

transférées dans des tubes (1'5 ml) siliconisés (FisherBrand, Fisher Scientific, Nepean.

On). évaporées à nouveau au Speed Vac, puis les culots ont été suspendus dans 30 pl

d'acétate d'ammonium 25 rnM (pH 6,O). L'analyse chromatographique de ce maténel

peptidique consistait à utiliser un système de phases mobiles assurant la séparation des

pics peptidiques et ce, de manière à identifier plus précisément les peptides inhibiteurs de

I'ACE à l'aide des standards peptidiques. Ainsi, le maténel peptidique a ité injecté (15

pl) sur la colonne et les peptides ont été élués à l'aide d'un gradient de 37 minutes,

obtenu par l'utilisation de deux phases mobiles: phase A, acétate d'ammonium 25 rnM

(pH 6.0); phase B, acétate d'ammonium 50 mM/ACN 60% (pH 6,O). Dans le cas du

gradient de 37 minutes, il a été obtenu de la façon suivante: 1008 phase A à 60% phase B

de O à 30 minutes; 60 à 100% phase B de 30 à 35 minutes; 100% phase B de 35 à 37

minutes. La zone d'élution des six peptides inhibiteurs de I'ACE a été déterminée en

injectant chacun de ces peptides (15 pl) de façon individuelle, puis en appliquant les

mêmes conditions d'élution. Ainsi, les pics peptidiques apparaissant dans la zone

d'elution des standards ont été collectés et ce, lors de deux analyses du même échantillon

de manière à récolter suffisamment de matériel peptidique pour procéder à la

confirmation de leur séquence par l'analyse de leur composition en acides aminés.

2.8 Analyse de la composition en acides aminés des peptides

La confirmation de la séquence des peptides récoltés à l'étape précédente a été réalisée

par I'analyse de leur composition en acides aminés par la méthode Pico-Tag (Waters

Corp., Milford MA). Les peptides collectés ont d'abord été évaporés au Speed Vac, puis

suspendus dans 50 pl d'eau (18 MR). Les solutions ont été transférées dans des cupules

de verre. évaporées sous vide (65 milliton) dans la station Pico-Tag, puis 200 pl du

réactif HCYPhénol ont et6 ajoutés aux cupules pour la dissolution des culots. Enfin,

l'hydrolyse acide des peptides a été réalisée sous vide (station Pico-Tag) à 110°C et pour

une durée de 20 à 24 heures. Une fois l'hydrolyse complétée, chacun des tubes a été

additionné de 10 pl d'une solution éthanol/eau/uiéthylamine (22: 1) et de 5 pI d'une

solution de Norleucine (2,5 pmolelml) à titre de standard interne. Dans le cas du standard

d'acides aminés. il a été préparé avec 5 pl d'une solution contenant 0,25 pmolelrnl de

cystéine et 0.5 pmole/rnl de tous les autres acides aminés.

L'hydrolyse acide des échantillons a été suivie de la dérivation des acides aminés à l'aide

du réactif PïïC (phenylisothiocyanate). Ainsi. 20 pl d'une solution

éthanoWeau/triéthylarnine/PITC (7:l:l:l) ont éte ajout& aux cupules, suivi de leur

evaporation sous vide. Par la suite, les culots ont éte suspendus dans 100 pl d'un mélange

NazHPOJ (5mM pH 7,4)/ACN 5 8 , puis 5 pl de ces solutions ont été injectés sur une

colonne Pico-Tag (Wat088 13 1 3,9 i.d X 150 mm, Waters Corp., Milford MA) maintenue

à 41°C. La sdparation des acides aminés a été obtenue avec le gradient suivant: 100%

phase A (CH3COONa 0,033Mhiéthylamine 2.5 pM/EDTA 0,235 mM/ACN 6%, pH 6,4)

à 30% phase B (ACN 60%) de O à 4 minutes; 30 à 45% phase B de 4 à 12 minutes; 45 ti

100% phase B de 12 à 12.5 minutes; lm% phase B de 12,s à 14 minutes. Les phases

mobiles ont circulé dans la colonne à un débit de 1 mVmin et la détection des acides

aminés dérivés a été obtenue à 254 m.

2.9 Hydrolyse du peptide /3 176-182 par la carboxypeptidase A

L'hydrolyse enzymatique du peptide 176-182 a été réalisée à l'aide de la

carboxypeptidase A selon la procédure proposde par Maeno et al. (1996). Dans un tube à

essai, le peptide (1 mg) a été solubilisé dans 1 ml d'un tampon Tris-KI40 mM (pH 7,s)

additionné de 0,35 M de KCl. Par la suite, la solution a été incubée à 37°C suivi de

i'ajout de LW unités d'enzyme af5n de démarrer la réaction enzymatique. Après 10 heures

d'incubation, la réaction a &té stoppée par immersion du tube dans un bain d'eau

bouillante pour une duree de 10 minute. Finalement, le matériel hydrolyse a été recueilli

après une centrifugation (9500 g, 1 min).

2.10 Mesure de l'activité d'inhibition de I'enzyme de conversion de l'angiotensine-1

L'activité d'inhibition de I'ACE des différents peptides et des lactosérums isolés des laits

fermentés a été mesurée à l'aide d'une procedure modifiee, basée sur la méthode de

Cushman et Cheug (1971). Dans des tubes essai, 20 pl d'eau distillée sont ajoutés, puis

200 pl d'une solution d'hippuryl-L-histidyl-L-leucine (0,3%, p h ) préparée dans un

tampon HEPES 50 mM (pH 8'3) additionné de NaCl (300 mM). Par la suite, 50 pl

d'échantillon (lactosérum ou solution de peptide) sont additionnis aux tubes. suivi de

l'ajout de 30 pl d'une solution dTACE contenant 0'33 Unitésfml. Après une incubation

des tubes à 37°C pendant 20 minutes, 300 pl d'HC1 1 N sont ajoutés afin de stopper la

réaction enzymatique, puis 2,1 ml d'acétate d'éthyle en vue d'extraire l'acide hippurique

libéré lors de la réaction. La phase organique est ensuite séparée de la phase aqueuse par

centrifugation (10 5 0 0 g, 2 min), puis un aliquote (1 ml) de la phase organique est

recupéré et évaporé dans un bain d'eau bouillante. Le culot est suspendu dans 3 ml d'eau

distillée et la solution est tranférée dans une cuvette de quartz pour la mesure de son

absomon a 228 nm l'aide d'un spectrophotomètre W-visible (UV-visible

Spectroscopy Systern, HP 8453, Hewlett-Packard Ailemagne).

ensuite déterminée A L'aide d'une courbe standard, préparée dans les mêmes conditions

avec des concentrations croissantes (0,020 à 7 mg/ml) d'albumine sérique bovine (BSA).

3. &ULTATS ET DISCUSSION

La comparaison des différentes souches de Lb. helveticus et de la souche Lb. delbrueckii

subsp. bulgaricus a été réalisée suite à la fermentation d'un lait écrémé reconstitué (12%,

p/p), à 42"C, sous atmosphère de CO?, avec contrôle du pH à 6,O et pour une durée de 24

heures. Ces conditions de fermentation ont été sélectionnées en se basant sur les travaux de

S1ata.r e: UL (1996) pmr la mmpusition dü rîiiiieu de Bmentation ci i~ eonu6k du pH,

ceux de Roy et al. (1986) pour la température de croissance des lactobacilles, et les travaux

de Espie (1998) pour l'atmosphère de COz. En cours de fermentation, des échantillons de

milieu ont été prélevés afin de déterminer. pour chacune des souches à l'étude, le compte

bactérien (log UFCfrnl), la production d'acide lactique (g/100 ml) et le taux de protéolyse

(mÉq N H A ) .

La Figure 1 illustre le compte bacténen (log UFC/rnl) en cours de fermentation pour les six

souches de Lb. helveticus et 1û souche Lb. delbrueckii subsp. bulgaricrts. Selon l'aspect des

courbes de croissance, les souches peuvent Sue divisées en trois groupes distincts. Le

premier groupe est composé des souches R-211, R-235 et R-204 dont la croissance est

rapide entre 3 et 9 heures, suivie d'une phase de mortalité jusqu'à 24 heures laquelle est

plus prononcée dans le cas de la souche R-204. Le deuxième groupe montre une croissance

inverse au premier groupe, avec une phase de mortalité entre 3 et 9 heures suivie d'une

croissance rapide jusqu'à 24 heures. Ce groupe est compose des souches R-13 1. ATCC

10797 et ATCC 12046. La souche Lb. delbrueckii subsp. bulgatfcus ATCC 11842 est seule

dans le troisième groupe et se caractérise par une population qui diminue légèrement tout au

long des 24 heures de fermentation.

La production d'acide lactique en coun de fermentation pour les six souches de Lb.

helveticus et la souche Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus est illustrée à la Figure 2. Comme

pour la croissance, les souches peuvent être divisées en trois groupes selon la quantité

d'acide lactique qu'elles libèrent dans le milieu en coun de fermentation. Le premier

groupe, composé des souches R-204, R-235 et R-211, est celui dont la production d'acide

Durée de fermentation (heures)

Figure 1 : Compte bactérien (log UFC/ml) en fonction de la durée de fermenration (pH

6,O) d'un lait écrémd reconstitué (12%, p/p) par six souches de Lb. heiveticus

(* R-2 1 1, . R-235, A R-204, O R-23 1, x ATCC 12046, ATCC 10797)

et une souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricics ( ATCC 1 1842).

O 3 6 9 12 15 18 21 24


Figure 2 : Production d'acide lactique (g/lOû ml) en fonction de la durée de

fermentation (pH 6,O) d'un lait écrémé reconstini6 (12%, p/p) par six souches

ATCC 10797) et une souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus

(0 ATCC 1 1 842).

lactique est presque linéaire en fonction de la dude de fermentation et dont les quantités

sont les plus élevées après 24 heures (>5 g/100 ml). Dans le cas des souches R-231, ATCC

10797 et 12046, la libération d'acide lactique se fait surtout après 12 heures de

fermentation. Panni ces trois souches, R-231 se démarque toutefois par une production

d'acide lactique (4,50g/lûOml) plus importante que celle des souches ATCC 10797 (1,79

g/100ml) et 12046 (1,05 g/Lûûml). Finalement, le troisième groupe comprend la souche Lb.

cieibrueckii subsp. bitigaricus (ATCC 11842) dont la production d'acide lactique est

inférieure à 2 g100 ml après 24 heures de fermentation.

La Figure 3 illustre le taux de protéolyse dans les laits fermentés par les 6 souches de Lb.

helveticits et la souche de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricits, mesuré par la méthode OPA

basée sur le dssaye des groupements a-aminés libres (Church et al., 1983). Pour ce

paramètre, les souches peuvent aussi être divisées en trois groupes distincts. Le premier

groupe est composé des souches R-211, R-235 et R-204 dont les taux de protéolyse

augmentent linéairement en fonction du temps de fermentation et qui atteignent des valeurs

de 10 à 12 mÉqL Les souches R-231, ATCC 10797 et 12046 présentent un taux de

protéolyse linéaire jusqu'à 12 heures, suivi d'une très fone diminution de leur activité

protéolytique. Dans ce groupe, la souche R-231 est celle qui atteint la plus fone valeur de

protéolyse (8,501 mÉq/L) après 12 heures de fermentation. Enfin Lb. delbrueckii subsp.

biilgnrictts ATCC 1 1842 est la moins protéolytique des souches avec un taux de protéolyse

de seulement 4 7 mÉq/L après 24 heures de fermentation. Dans des conditions similaires de

fermentation, Matar er al. ( 1996) ont 6tudié la souche Lb helveiicus L89. Pour cette souche,

les auteurs ont obtenu une croissance bactérienne de 8.7 log UFCIrnl et une production

d'acide lactique de = 4g/lûûml après 24 heures de fermentation. Pour la même durée de

fermentation, ces valeurs correspondent à celles (8,2-8.8 log UFC/ml, 4,2-5.5% d'acide

lactique/1001ni) obtenues dans noue étude pour les souches R-211, R-235 et R-231.

Toutefois, dans l'étude de Matar et al. (1996), la croissance de la souche L89 a évolué selon

une courbe semi-lin6aire alors que les courbes de croissance des souches R-211, R-235 et

R-23 1 sont très différentes. Une autre différence importante entre les deux études est

O 3 6 9 12 15 18 21 24


Figure 3 : Taux de protéolyse (mÉq MI2/'). mesuré par la méthode OPA, en fonction

de la durée de fermentation (pH 6,O) d'un lait écrém6 reconstitué (12%, p/p)

par six souches de Lb. helveticus (+ R-2 1 1, W R-235, A R-204, O R-23 1, x

ATCC 12046, 0 ATCC 10797) et une souche de Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus (O ATCC 1 1 842).

notée au niveau des taux de protéolyse. En effet, la souche Lû9 atteint un taux de protéolyse

de 30 mÉq/L après 24 heures de fermentation ce qui est nettement supérieur à tous les taux

de protéolyse mesurés (c l2 mÉqL) dans notre étude. Par contre, cet écart pourrait

s'expliquer par le fait que Matar et al. (1996) n'ont pas soustrait la valeur OPA mesurée

dans le lait non-fermenté (témoin) de celle obtenu en fm de fermentation pour la souche

L89.

Les travaux de Roy et ai. (1986) pourraient permettre d'expliquer la mortalité obsentée

entre 9 à 24 heures de fermentation pour les souches R-2 11, R-235 et R-204 (Figure 1). En

effet, ces auteurs ont démontré une phase de mortalité après 8 heures de fermentation pour

la souche Lb. helveticus milano, laquelle a été attribuée à une concentration en acide

lactique supérieure à 2gAûûml dans le milieu de fermentation. Selon les auteurs, le contrôle

du pH en cours de fermentation favorise la production d'acide lactique ce qui mène à une

mortalité plus importante de la souche Lb. helvericus milano. Dans notre étude, on observe

qu'effectivement. les souches (R-20.1, R-235. R-211) qui produisent les plus grandes

quantités d'acide lactique après 12 heures de fermentation (> 3g/lûûml, Figure 2) sont

celles dont la croissance est la plus affectée après la même durée de fermentation.

Pour expliquer la phase de mortalité observée au début (3 heures) de la croissance des

souches R-231, ATCC 10797 et 12036 (Figure l), il faut se référer aux protéinases de la

paroi des lactobacilles. En effet, Stefanitsi et Gare1 (1997) ont isolé de la souche Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus ACA DC235, une protéinase à sérine et une protéinase à

zinc. La protéinase à sérine assurerait la production de peptides pour des fermentations

réalisées à pH supérieur à 6,5. En effet, en milieu acide, l'activité des protéinases à sérine

est diminuée due à la protonation du résidu histidine à l'intérieur du site actif. Par contre,

les proieinases à zinc seraient responsables de la majorite de l'activité protéolytique

observée à des pH inférieures à 6,5. Un tel couple de protéinases poumit bien exister chez

Lactobacillus helveticus. En effet, Pedersen et al. (1999) ont identifié un gène de protéinase

( p H ) chez la souche Lb. helveticus -2, mais les auteurs ont montré que ce gène

n'est pas présent chez toutes les souches de Lb. helveticus. Par exemple, une sonde

genetique dirigée vers le gène prtH a permis l'hybridation avec la souche L89, laquelle n'a

pas été observee avec les souches ATCC 10797 et 12046. Si on suppose que la protéinase

prtH est une protéinase à zinc, son absence chez les souches ATCC 10797 et 12046 pourrait

expliquer leur phase de monalite précoce (Figure 1) due à l'incapacité des souches à

produire rapidement les peptides nécessaires à leur croissance au pH de la fermentation (pH

6.0). Cependant. les protéinases serine, quoique réduites dans leur activité à pH 6,0,

poumient f u u ~ i i üne qüantk5 de ppüdes suffisam â :'initiaiion ilé Li p h a x enponcntieife

de croissance après 12 heures de fermentation (Figure 1). Dans le cas de la souche R-23 1, la

phase de mortalité précoce observée après 3 heures de fermentation ne peut être expliquée

par une faible activité protéolytique à pH 6,O. En effet, parmi toutes les souches étudiées, R-

23 1 presente les plus hauts taux de protéolyse entre 3 et 12 heures de fermentation (Figure

3). La souche R-23 1 pourrait être apparentée à la souche Lb. helveticus ILC18 isolée par

Fortina et ai., 1998 et qui est caractérisée par une activité protéolytique élevée et une

activité peptidasique faible. Ainsi. lors de la croissance dans le lait, la souche R-231

pourrait produire des peptides sans toutefois les transformer rapidement en acides aminés.

ce qui expliquerait sa mortalité précoce et l'initiation tardive de la phase exponentielle de

croissance après 9 heures de fermentations. Finalement, les faibles valeurs obtenues pour

les comptes bactériens, la production d'acide lactique et les taux de protéolyse dans le lait

fermenté par la souche Lb. delbrueckii subsp. bulgariais ATCC 1 1842 pourraient être dues

à une autolyse bactérienne importante. En effet, Kang et al. (1998) ont observé qu'on

pouvait atteindre un degré d'autolyse allant jusqu'à 78% pour une population de Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus UL12 incubée pendant 3 heures dans un tampon contenant

0'2 M NaCl à pH 5 3 .

Les comptes sur plaques ne semblent pas la methode idéale pour évaluer la croissance de

Lb. helveticus pour des fermentations réalisées en contrôle de pH. En effet, Norton et al.

(1993) ont observé qu'il était impossible, pour des zones de pH comprises entre 5.1 et 6-3,

d'évaluer avec précision la population de Lb. helveticus L89 par des comptes sur plaques.

étant donné que les valeurs mesurées en début et en fin de fermentation étaient comparables

et ce, maigre une biomasse 50 fois plus importante en fin de fermentation. Selon ces

auteurs, cette sous-évaluation de la population bactérienne serait attribuable à une

diminution de !a synthèse d'enzymes autolytiques impliquées dans la division cellulaire

menant à l'allongement cellulaire au détriment de la division cellulaire en cours de

fermentation. Les auteurs ont d'ailleurs confirmé cette hypothèse par des observations

microscopiques. Dans notre étude, ce phénomène a été observé pour les souches de Lb.

helvericus (résultats non illustrés), mais non pour la souche Lb. delbrueckii subsp.

bdgarr'rris ! B41. Selon Rhee et Pack (1980), !e phénîm6i.e d'rl!ongerr.ri.t ce!li?lrire chez

l'espèce Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus serait obsenable seulement à des valeun de

contrôle de pH supérieurs h 6,s.

Le Tableau 1 présente les valeurs d'inhibition de I'ACE (I&) mesurées dans les

lactosénims isolés des laits fermentés par les six souches de Lb. helvericus et la souche Lb.

delbrueckii subsp. bltlgaricris. La valeur ICso indique la quantité du produit, en rnglml,

permettant d'inhiber 50% de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-1 (ACE). Pour

faciliter l'interprétation des résultats, les taux de protéolyse après 24 heures de fermentation

obtenus pour chacune des souches (Figure 3) ont été ajoutés au Tableau 1. Les résultats de

ce tableau démontrent que le lait fermente par la souche Lb. delbrueckii subsp. bulgarictts

11842 ne permet pas d'inhiber I'ACE. sa valeur ICso (2.54 rnglrni) étant équivaiente à celle

obtenue pour le lait non fermente (2,60 mglml). Par contre, tous les laits fermentés par les

souches de Lb. helvericus donnent des valeurs iCso inférieures à celle du témoin (lait non

fermenté). indiquant que des composantes inhibitrices de l'enzyme de conversion de

l'angiotensine-1 sont libérées Ion de la fermentation du lait. Parmi les six souches de Lb.

helvericits étudiées, R-211 est la plus efficace à inhiber I'ACE avec une v4eur ICso de

seulement 0,65 mg/ml, suivie de près par la souche R-23 1 dont la valeur d'inhibition est de

0'82 mg/rnl. Pour les autres souches de Lb. Iielvericus, les valeurs ICso varient de 1.31 A

1.88 mgml. Ces résultats sont en accord avec ceux de Yamamoto et al. (1994b) qui ont

comparé I'activite d'inhibition de laits fermentés, sans contrôle de pH, par 16 souches de

bactéries lactiques. En effet, les auteurs ont démontré que les lactosérums provenant des

laits fermentés par les souches de Lb. helvericus permettaient d'inhiber fortement l'enzyme

de conversion de l'angiotensine4 (activité d'inhibition de I'ACE entre 5 1 et 70 Ulrni).

Tableau 1: Valeurs d'inhibition de I'ACE (ICSO)' et taux de proteolyse (mÉq/~)b mesur6s

dans les lactosérums isolés des laits fermentés par les différentes souches de

lactobacilles.

Souches Ic50 Taux de protéolyse (Wd) (mEq/L)

Aucune (Lait non-fermenté) 2,60 -

Lb. delbrueckii subsp. bulgnrieus, ATCC 2,54 11842

Lb. helveticus, R-211 065 11.9

Lb. helveticus, R-23 1 0,82 9,2

Lb. ireiveticus, R-204 L,3 1 10.1

Lb. helveticus, R-235 1,55 10,6

Lb. helveticus, ATCC 10797 1 ,O7 6-7

Lb. helveticus, ATCC 12046 I ,88 7,4

a La valeur ICSo représente la quantité du produit qui permet d'inhiber 50% de l'activité de l'enzyme de conversion de l'angiotensine4 (ACE). Taux de protéolyse mesurés après 24 heures de fermentations selon la méthode de Church et al. 1983: les valeurs ont été tirées de la Figure 3.

D'autre part, si les valeurs ICso sont comparées aux taux de protéolyse obtenus pour

chacune des souches à l'étude, on note qu'il existe une relation imparfaite entre ces deux

paramètres. En effet, bien que la forte activité d'inhibition de I'ACE pour la souche R-2 1 1

puisse s'expliquer par son taux de protéolyse élevé après 24 heures de fermentation, cette

relation ne s'applique pas dans le cas des autres souches, en particulier pour la souche R-

23 1 Uonr le :aüx dc piûdolyse est ïeIati~mznr faible (9,; n&tj, dors que sa vdeur iCso

(032 rnglml) est proche de celle de la souche R-2 1 1 (0.65 mghl ) . Il semble donc que la

quantité de peptides libérés lors de la fermentation du lait ne soit pas le seul critère

responsable de l'activité d'inhibition de 1'ACE mesurée dans un lait fermenté et que la

nature des peptides libérés doit être considérée pour expliquer ce type d'activité.

La prochaine étape de cette étude consistait à analyser le matériel peptidique dans les laits

fermentés par les différentes souches de lactobacilles et d'identifier, à l'aide de peptides de

synthèse, des séquences peptidiques reconnues pour leur activité d'inhibition de I'ACE. Les

Figures 4, 5. 6 et 7 présentent les profils RP-HPLC obtenus pour le lait non-fermenté

(Figure 4a), le lait fermenté par la souche Lb. delbrueckii subsp. bdgaricus ATCC 1 1842

(Figure 4b), de même que les laits fermentés par les six souches de Lb. helvericus (Figures 5

à 7). Le lait non-fermenté et celui préparé avec la souche Lb. delbrueckii subsp. bdgaricus.

qui est aussi la moins protéolytique des souches à l'étude, montrent une très faible teneur en

peptides. La nature des peptides présents dans ces laits es1 également diffërente. avec une

plus forte proportion de peptides hydrophiles (temps de rétention: O à 40 min) dans le lait

fermenté par Lb. delbrueckii subsp. bulgnricus ATCC 11842, alors que les peptides

hydrophobes (temps de rétention > 40 min) sont en plus grande quantité dans de lait non-

fermenté. Dans le cas des souches de Lb. helveticus, les profils RP-HPLC montrent un

nombre important de peptides dans les milieux après 24 heures de fermentation. Comme

pour l'activité d'inhibition de I'ACE, il existe une relation imparfaite entre le taux de

proteolyse et la quantité de peptides mesurée dans les milieux de fermentation. En effet, le

profil RP-HPLC de la souche ATCC 10797 est comparable à celui de la souche R-2 1 1, bien

que le taux de protéolyse mesuré pour la souche ATCC 10797 (6,7 mÉq/L) soit presque

a) Lait non-fermenté

a O f -

091 - O 20 40 60 80

Minutes

b) Lait fermenté par Lb. bulgaricus subsp. bulgrrricus, ATCC 11M2

O 20 40 60 80

Minu tes

Figure 4 : Profil RP-HPLC de a) lait non- fermenté et b) lait fermenté par

la souche Lb. delbmeckii subsp. bulgancus ATCC 11842.

L'analyse a été réalisée sur les milieux après 24 heures de

fermentation dans les conditions décrites à la section matériel et

méthodes.

a) Lait fermenté par Lb. helveticus, R-211

I I I 1 1

O 20 40 60 80

Minutes

b) Lait fermenté par Lb. helveticus, R-235

1 1 t I O 20 40 60 80

Minutes

Figure 5: Profil RP-HPLC des laits fermentés par les souches Lb.

hefveticus a) R-211 et b) R-235. L'analyse a été réalisée sur

les milieux après 24 heures de fermentation dans les

conditions décrites à la section matériel et méthodes.

8) Lait fermenté par Lb. heiveticus, R-204

O 20 40 60 80

Minutes

b) Lait fermenté par Lb. helveticus, R-231

O 20 40 60 80 Minutes

Figure 6: Profil RF-HPLC des laits fermentés par les souches Lb.

helveticus a) R-204 et b) R-231. L'analyse a été réalisée sur

les milieux après 24 heures de fermentation dans les

conditions décrites à la section matériel et méthodes.

a) Lait fermenti! par U. helveficus, ATCC CO797

1 1 1 1 I O 20 40 60 80

Minutes

b) Lait fermenté par Lb. helveticus, ATCC 12046

A

E 5:

2 N 3 e

Figure 7:

1 I I I I O 20 40 60 80

Minutes

Profil RP-HPLC des laits fermentés par les souches Lb.

hefveticus a) ATCC 10797 et b) ATCC 12046. L'analyse a été

réalisée sur les milieux après 24 heures de fermentation dans

les conditions dbcrites à Ia section matdriel et méthodes.

deux fois plus faible que celui de la souche R-2 1 1 ( 1 1.9 mÉq/L). Un autre exemple est la

souche R-231 dont le profil peptidique est trés chargé alors que sa valeur de protéolyse est

faible (9.2 rnÉq/ml). À nouveau, ces résultats indiquent que la nature des peptides libérés

lors de la fermentation pourrait être un critère plus important que leur nombre pour

expliquer I'activité d'inhibition de I'ACE des différents milieux de fermentation.

L'étude a donc et6 poursuivie par la collecte des pics élués dans la zcne der stmdards

inhibiteurs de ItACE (G, 23-34, G~ 28-34. ai 23-27, P 60-66, 177-183 et P 193-202),

leur purification par RP-HPLC à l'aide d'un deuxième système de solvants, suivi de leur

analyse par Pico-Tag@ afin de confirmer leur séquence par la mesure de leur composition

en acides aminés. Les résultats de cette étude sont présentés au Tableau 2. Ces résultats

moment qu'aucun des six peptides inhibiteurs de I'ACE, recherchés dans les milieux de

fermentation, n'a Çté identifié. Par contre, le fragment 176- 182 de la caséine P a été mesuré

à une concentration de 0,29 et 0,63 pg/ml dans les lactosémms des laits fermentés par les

souches Lb. helirticus R-2 11 et R-294. Ce peptide est également présent dans les milieux

fermentés par les souches R-235. ATCC 10797 et 12046, mais la contamination du pic

peptidique par d'autres peptides a empêché sa quantification. Le peptide P 176-182 est

apparenté à la séquence P 177-183 dont l'activité d'inhibition de I'ACE (15 @4) a été

démontré par Maniyama et al. (1985). Pour expliquer l'activité d'inhibition de I'ACE

mesurée dans les laits fermentés par les souches de Lb. helveticus, malgré l'absence des six

peptides inhibiteurs à l'étude. le peptide P 176-182 a donc été synthétisé et sa valeur ICso a

été mesurée et comparée celle du peptide standard P 177-183, aussi obtenu par synthèse

chimique. Les résultats de cette analyse sont présentés au Tableau 3. Les données de ce

tableau confirment la capacité d'inhibition de I'ACE du peptide P 177- 183. avec une valeur

ICso de 0,12 m g h i (145 pM) Le peptide P 176-182, dont la séquence diffère du peptide P 177-183 par 2 acides aminés seulement (Arg, Lys), ne permet pas d'inhiber l'enzyme de

conversion de l'angiotensine-1 avec une valeur ICso supérieure à 30 m m . Ce résultat est

en accord avec ceux de Yamamoto et al. (1994a) qui ont également démentré I'inefficacité

du peptide P 176-182 à inhiber I'ACE (IC+ 1 0 pM). Toutefois, Maeno et

Tableau 2: Dktection et quüntificütion (pg/ml) des peptides inhibiteurs de I'ACE et du peptide P 176-182 dans les laits fermentés par

les différentes souches de laciobacillcs.

Souches ~ 1 2 3 - 2 7 4, 23-34 28-34 P 60-66 P 177-183 p 193-202 176-182

Aucune (Lait non-fermenté)

lb. delbrueckii subsp bulgaricus, ATCC 11842

Lb. helveticus, R-2 1 1

Lb. helveticus, R-23 1

Lb. helveticus, R-204

Lb. helveticus, R-235

Lb. helveticus, ATCC 30797

Lb. helveticus, ATCC 1 2 M

A: Absent. P: Peptide présent mais non quantifiable en raison d'une contamination par d'au trcs pe j~tides.

Tableau 3: Valeurs d'inhibition de I'ACE (&) des peptides P 17% 183, P 176-1 82 et P 176-181 obtenus par synthèse chimiquea et du peptide P 176-18 1 issu de hydrolyse du peptide 176- 182 par la carboxypeptidase A ~ .

Peptides Séquences en acides aminés Ic50

(mg/mi)

p 176-182' Lys- Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln 32.24

p 176-181a Lys- Ala-Val-Pro-Tyr-Pro 0,11

p 176-181b Lys- Ma-Val-Pro-Tyr-Pro 0,22

al. (1996) ont démontré que l'action des enzymes digestives peut modifier fortement

l'activité d'inhibition de I'ACE d'un peptide. En effet, ces auteurs ont observé une

augmentation de plus de 100% de l'activité d'inhibition du peptide 169-175 suite à son

hydrolyse par la carboxypeptidase A. Lors de cette réaction, la glutamine en position C-

terminale du peptide P 169- 175 (Lys-Val-Lu-Pro-Val-Pro-Gln) est éliminé et le peptide

169- 174 est libéré puisque l'enzyme est incapable d'hydrolyser le résidu proline en position

C-temhr le . C'csr d o ~ c c:. se Vasm: su; ces ti;-aw ei eii issûii de la sixiiliride ck :a

région C-terminale des peptides P 169- 175 et B 176- 182, que ce dernier a été soumis à une

hydrolyse par la carboxypeptidase A selon la procédure proposée par Maeno et al. (1996).

Comme dans l'étude de ces auteurs, l'activité d'inhibition de 1'ACE du peptide 176-1 82 est

passé de 32,24 à 0.22 m g / d après son hydrolyse à l'aide de la carboxypeptidase A, soit une

augmentation de sa capacité d'inhibition de plus de 145 fois. Pour confirmer ce résultat. la

séquence p 176-181 a été synthétisée par voie chimique et sa valeur IC50 a été mesurée à

0.1 1 rnghl, indiquant un rendement d'hydrolyse inférieur à 100% lors de la digestion du

peptide P 176- 182 par la peptidase.

Ces résultats indiquent donc que la fermentation du lait par Lb. helveticus mène à la

libération de peptides précurseurs, peu actifs dans le mécanisme d'inhibition de I'ACE, mais

que leur hydrolyse par les enzymes de la digestion libère des séquences peptidiques en

mesure d'inhiber fonement I'ACE. Ces résultats confirment également la controverse

existant dans la littérature où à plusieurs reprises. des peptides fonement inhibiteurs de

I'ACE se sont révélés inefficaces in vivo à réduire la pression systolique chez des rats

hypertendus SRH (Maeno et al., 1996). Ces résultats soulèvent donc l'importance des

études in vivo pour l'évaluation de l'activité biologique de cenaines séquences peptidiques

étant donné l'impact des enzymes de la digestion sur l'hydrolyse de ces peptides et leur

bioactivi té.

CONCLUSION GÉNÉRALE

Cette étude avait pour but d'identifier et de quantifier des peptides inhibiteurs de l'enzyme

de conversion de I'angiotensin-1 (ACE) dans des laits fermentés par six souches de Lb.

helveticus (R-204. R-211, R-23 1. R-235, ATCC 10797 et 12046) et une souche de Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus (ATCC 11842). Dans une première étape, des fermentations

d'un lait écrémé reconstitué (12% ST) ont été réaliqees à 42"C, avec conrrele du pH Ii 6,0,

sous atmosphère anaerobie et pour une durie de 24 heures. Ces conditions de fermentation

ont été sélectionnées afin de favoriser la croissance et l'activité protéolytique de Lb.

helveticirs, une espèce bacterienne thermophile, anaérobie facultative et dont l'activité

optimale des protéinases se situe près de pH 6.0.

Des mesures de croissance, de production d'acide lactique et du taux de protéolyse en cours

de fermentation ont montré que les souches de Lb. helvericus étaient différentes et

pouvaient être divisées en deux groupes distincts. En effet, les souches R-211, R-235 et R-

204 appartiennent A un groupe dont la croissance est rapide jusqu'à 9 heures de

fermentation. suivi d'une phase de mortalité causée probablement par une forte production

d'acide lactique dans le milieu (>5 g1100 ml après 24 hn). Ces trois souches sont aussi les

plus protéolytiques des souches étudiées, avec une augmentation linéaire des taux de

protéolyse en cours de fermentation et l'atteinte de valeurs supérieures 3 10 mÉq NH2/L

après 24 heures. Le deuxième groupe est composé des souches R-231. ATCC 10797 et

12046. La croissance de ces souches est inverse à celle du premier groupe et se caractérise

par une phase de mortalité en début de fermentation (3-9 hn), suivi d'une augmentation

importante de la croissance jusqu'à 24 heures. Pour ces souches, la phase de mortalité en

début de fermentation pourrait s'expliquer par leur bagage enzymatique. En effet, bien que

ces souches soient fortement protéolytiques (3-5 mÉq NH&) jusqu'à 12 heures de

fermentation, il est possible que leur activité peptidasique soit faible et n'assure pas la

liberation d'une quantité suffisante d'acides amines nécessaires à leur croissance. Enfin. la

souche non probiotique, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (ATCC 1 1 842), se différencie

des souches de Lb. helveficus par une faible croissance en cours de fermentation, une faible

production d'acide lactique et le taux de protéolyse le moins élevé (4 mÉq NHA) de toutes

les souches étudiées après 24 heures de fermentation.

La mesure de l'activité d'inhibition de 1'ACE (ICjo) des différents milieux de fermentation

a révélé qu'à l'exception de la souche non probiotique, dont la valeur ICso est équivalente à

celle du lait non fermente (2,60 mglml). les laits fermentés par les six souches de Lb.

helveticus contiennent tous des composantes en mesure d'inhiber I'ACE. Parmi les six

souches étudiées, R-2 1 1 et R-23 1 se sont avérées les plus inhibitrices, avec des valeurs ICso

de 0,65 et 0.82 mg/ml, respectivement. Pour les autres souches de Lb. he/veticus, les

valeurs ICSo variaient de 1'31 à 1'88 mglrnl. D'autre part, il a été démontré que l'activité

d'inhibition de I'ACE, mesurée dans les milieux de fermentation, n'était pas

nécessairement liée aux taux de protéolyse dans ces milieux, et que la quantité de peptides

libérés en cours de fermentation n'était donc pas le seul critère responsable de l'activité

d'inhibition de I'ACE mesurée dans les laits fermentés.

Pour expliquer l'activité inhibition de I'ACE dans les laits fermentés, la fraction peptidique

de ces milieux a été isolée afin d'y détecter par chromatographie de phase inverse. la

présence de six peptides reconnus dans la litterature pour leur activité d'inhibition de

1'ACE : & 1 23-27. ~1 23-34, 28-34, 60-66, P 177- 183 et 13 193-202. Cette analyse a

révelé qu'aucun des six peptides étudiés n'était présent dans les laits fermentés. L'activité

d'inhibition de I'ACE, mesurée dans les laits fermentés, ne peut donc pas être associée à la

présence de ces peptides, mais plutôt à la libération de d'autres peptides inhibiteurs, non

étudiés dans ce travail. D'autre part, lors de l'analyse des peptides contenus dans les

milieux fermentation. la séquence 176-182 de la caséine P a été détectée dans les

lactosérums de certains laits fermentés. Bien que la séquence de ce peptide s'apparente A

celle du pep:ide inhibiteur P 177-183, il a été démontre que ce peptide n'est pas un

inhibiteur de I'ACE (IC50 = 30 mg/ml). Par contre, l'hydrolyse du peptide P 176-182 par la

carboxypeptidase A a permis de libérer la séquence P 176-18 1 qui s'est révélée être un

puissant inhibiteur de I'ACE (ICso = 0'11 mghi). Cette partie du travaii a donc permis de

démontrer l'importance du processus de digestion sur l'activité d'inhibition de I'ACE, de

mélanges peptidiques obtenus par la fennentation du lait.

Les résultats obtenus dans le cadre de ce travail ont donc permis de demontrer que la

fermentation du lait par Lb. helveticus mène à la libération de composantes en mesure

d'inhiber l'activité de l'enzyme de conversion de 1' angiotensin-1 (ACE). Par contre, ces

résultats n'ont pas permis de confirmer notre hypothèse de départ et de démontrer que ces

composantes étaient des séquences peptidiques issues des caséines du lait. En effet, aucun

des six peptides inhibiteurs dtudiés n'a été detecté dans les laits fermentés par Lb.

helveticus. Ce travail de recherche aura toutefois permis de démontrer I ' irnp~rmce des

enzymes de la digestion sur l'activité biologique d'un mélange peptidique et la nécessité

des études in vivo pour confirmer le potentiel de ce type de produit à titre d'aliment

fonctionnel ou d'ingrédient nutraceutique.

Pour la suite de cette étude, des travaux pourraient être réalisés afin d'identifier les peptides

responsables de l'activité d'inhibition de I'ACE mesurée dans les laits fermentés. De plus,

il serait intéressant de suivre les variations de cette activité après modification des

conditions de fermentation (pH, température, etc) ou encore en enrichissant les milieux de

fermentations en casehates en vue d'augmenter la production de peptides inhibiteurs de

I'ACE. Finalement, une étude in vivo chez des rats SHR de l'activité antihypenensive des

laits fermentés par les souches R-204 et R-211 permettrait de confirmer le potentiel de ces

laits fermentés à titre d'aliment fonctionnel etlou d'ingrédient nutraceutique.

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