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De la mutation génétique à la maladie
L’Eprouvette - Laboratoire public de l’Université de Lausanne
Le Syndrome de l’X-fragile ?
Une maladie héréditaire : qui touche l’ADN…
De la mutation génétique à la maladie 2
1. Qu’est ce que l’ADN ?
2. Que se passe-t’il dans l’ADN des patients atteints du Syndrome de l’X-fragile ?
3. Comment le diagnostiquer ?
4. Hérédité du syndrome de l’X fragile ?
5. Les voies pour le traiter
De la mutation génétique à la maladie 3
Ordres de grandeur
ADN
10 à 200 µm 2 nm
2 mètres de long chez l’humain !
bases
L’ADN sous toutes ses formes
De la mutation génétique à la maladie 4
ADN
chromatine
chromosome
Une fois compactées pour former le
chromosome, les molécules d’ADN
sont 50 000 fois plus courtes !
De la mutation génétique à la maladie 5
La double hélice d’ADN
Langue en U
Forme du lobe de l’oreille
Protéine nécessaire
au bon fonctionnement
des neurones
Yeux verts
Hormone de croissance
De la mutation génétique à la maladie 6
Les « gènes »
1 gène = 1 portion d’ADN
Soit 3,4 nm = 0,000 034 mm
2 nm = 0,000 002 mm
Un gène
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promoteur Partie traduite en protéine
protéine
De la mutation génétique à la maladie 8
La séquence d’ADN
Outil des chercheurs
Cas du Syndrome de l’X fragile
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L’étude de familles de patients : anomalie portée par le chromosome X
défaut de fabrication de la protéine FMRP (Fragility Mental Retardation Protein)
Gène responsable FMR1 (Fragility Mental Retardation 1)
Impliquée dans le fonctionnement des neurones FMR1
5’-...TCAGTGTTTACACCCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGCGGGCGGCGGGCCGACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGGCGCTA…-3’
La séquence du gène FMR1
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Chromosome X
FMR1
5’-...TCAGTGTTTACACCCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGCGGGCGGCGGGCCGACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGGCGCTA…-3’
Présente une zone de répétitions de CGG 20 dans la séquence ci-dessus
C’est le nombre de répétitions de CGG qui varie dans le Syndrome de l’X fragile
Les mutations liées au Syndrome de l’X-fragile
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Non muté : n<50
Prémutation 55<n<200
Mutation complète n>200
promoteur hyperméthylé
L’hyperméthylation
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Cytocine (C)
Guanine (G)
Groupe méthyl (CH3)
Empêchent la traduction du gène et la fabrication de la protéine FMRP
Le Syndrome de l’X-fragile ?
Une maladie héréditaire : qui touche l’ADN…
De la mutation génétique à la maladie 13
1. Qu’est ce que l’ADN ?
2. Que se passe-t’il dans l’ADN des patients atteints du Syndrome de l’X-fragile ?
3. Comment le diagnostiquer ?
4. Hérédité du syndrome de l’X fragile ?
5. Les voies pour le traiter
Diagnostic génétique du Syndrome de l’X fragile
De la mutation génétique à la maladie 14
Prémutation
Mutation complète
Repérer une hyperméthylation Compter le nombre de
Comment ?
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Recherche d’hyperméthylation dans l’ADN
La taille des morceaux obtenus nous donnera une estimation
des sites de coupures reconnus par les enzymes dans la séquence étudiée
En coupant les ADN de manière spécifique grâce à des ciseaux moléculaires : Les enzymes de restriction
Comment ?
ADN 1 ADN 2
Hyper méthylation
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Les enzymes de restriction
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La « digestion enzymatique »
De la mutation génétique à la maladie 18
Echantillon Eau ADN Tampon 10X
Enzymes Volume final
1 2 PST I XHO I
A1 8 8 2 2 20 µL
A2 8 8 2 2 20 µL
B1 8 8 2 2 20 µL
B2 8 8 2 2 20 µL
Volumes en µl : 1000 µl = 1 ml
Protocole ADN 1 ADN 2
Lequel des deux est hyperméthylé ?
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Le Syndrome de l’X fragile, membre de la famille des « maladies à triplets »
…liées à des expansions instables de répétitions de 3 bases (ou « trinucléotides »)
---------CTG-CTG-CTG-CTG-CTG-CTG---------- ---------CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-----------------
La biologie moléculaire a permis d’expliquer les effets d’anticipation de ces maladies
augmentation du risque de développer la maladie au fur et à mesure des générations
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La maladie de Steinert (dystrophie myotonique)
Les « maladies à triplets »
gène DMPK Dystrophy Myotonic Protein Kinase
Chr 19
myotonine Rôle ?
nCTG
Wikipedia
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Les « maladies à triplets »
La Chorée de Huntington
gène Huntingtin
Chr 4
Huntingtine de forme différente
Rôle ? nCAG
Wikipedia
Non muté Pas de maladie développée, mais transmission possible Grands risques de développer la maladie La maladie surviendra assurément
nCAG < 26 27 < nCAG < 35
36 < nCAG < 40 nCAG > 40
De la mutation génétique à la maladie 22
Quelques maladies génétiques diagnosticables
Diagnostic génétique du Syndrome de l’X fragile
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Prémutation
Mutation complète
Repérer une hyperméthylation Compter le nombre de
Comment ?
Southern blot PCR
La technique du Southern blot pour le diagnostic du Syndrome de l’X fragile
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Southern blot de l’X fragile
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1 kb = 1000 bases
Southern blot de l’X fragile
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1 kb = 1000 bases
Southern blot de l’X fragile
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1 kb = 1000 bases
Eco RI Eco RI Eag I
Eco RI Eco RI Eag I
Résultats de Southern blot
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1 : h sans mutation, non-méthylé 2 : f sans mutation, X inactivé 3 : h avec mutation, méthylé 4 : f avec prémutation, méthylée5 : f avec mutation, méthylée
Rappel : Inactivation d’un X
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Œuf ou zygote
1ères divisions cellulaires
Inactivation au hasard d’un des chromosomes X dans chaque cellule : ses gènes ne sont plus exprimés
L’inactivation est transmise à toutes les cellules descendantes de chaque cellule
Le tissu obtenu est une mosaïque : - certaines cellules expriment les gènes du chr Xp - d’autres cellules, les gènes du chr Xm
Xp : chr X paternel Xm : chr X maternel
Analyse de résultats de Southern Blot
pour X Fragile
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Hyper-méthylé
Non muté
Pré-mutation
Mutation complète
Homme Femme
oui non
1 X X X
2 X X
3 X X X
4 X X X
5 X X X
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Technique de Polymerase Chain Reaction - PCR
La longueur du morceau amplifié indique le nombre de répétitions de CGG
Chromosome X
FMR1
CGG x 50
CGG x 180
CGG x 300
Syndrome de l’X fragile, analyse par PCR
De la mutation génétique à la maladie 32
Monica J. Basehore1 et al., 2009
1 - h avec prémutation, 115 CGG 2 - h sans mutation, 29 CGG 3 - h sans mutation, 30 CGG 4 - f (mère) avec pré-mutation, 30 et 95 CGG 5 - f (fœtus) avec mutation complète, 31 et > 200 CGG 6 - h (père) sans mutation, 31 CGG 7 - h (père) sans mutation, 30 CGG 8 - f (fœtus) sans mutation, 27 et 30 CGG 9 - f (mère) avec pré-mutation, 27 et 145 CGG 10 - h sans mutation, 33 CGG 11 - h avec mutation complète, > 200 CGG 12 - contrôle négatif sans ADN 13 - marqueur de taille
Famille 1 Famille 2
Nombre de CGG
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Diagnostic génétique du Syndrome de l’X fragile
- Détecter l’hyperméthylation - Estimer le nombre de répétitions
CGG : mutations complètes
couper l’ADN avec deux enzymes de restriction
photocopier une partie du gène en milliers d’exemplaires
- Déterminer précisément le nombre de répétitions CGG : prémutations
Southern Blot PCR
De la mutation génétique à la maladie 34
Recherche d’hyperméthylation dans l’ADN
La taille des morceaux obtenus nous donnera une estimation
des sites de coupures reconnus par les enzymes dans la séquence étudiée
En coupant les ADN de manière spécifique grâce à des ciseaux moléculaires : Les enzymes de restriction
Comment ?
ADN 1 ADN 2
Hyper méthylation
De la mutation génétique à la maladie 35
Dépôt dans le gel
De la mutation génétique à la maladie 36
• Préparation des échantillons pour
l’électrophorèse et le dépôt sur gel d’agarose :
• METTRE DES GANTS !! Attention au BET
contenu dans le gel, CANCERIGENE!!!
• Centrifuger rapidement les échantillons.
• Mettre 5 µL de bleu de dépôt dans chaque
échantillon, bien mélanger.
Protocole
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• Attendre que l’animatrice montre comment déposer avec le marqueur de poids moléculaire.
• Bien mélanger et reprendre les 25 µL d’échantillon. Les déposer doucement dans les puits du gel d’agarose.
• Faire migrer les échantillons à 100V.
Protocole
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Migration dans le gel
+
-
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Résultat après la
migration
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Echantillon Eau ADN Tampon 10X
Enzymes Volume final
1 2 PST I XHO I
A1 8 8 2 2 20 µL
A2 8 8 2 2 20 µL
B1 8 8 2 2 20 µL
B2 8 8 2 2 20 µL
Volumes en µl : 1000 µl = 1 ml
Protocole ADN 1 ADN 2
Lequel des deux est hyperméthylé ?
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Marqueur de taille en paires de bases
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1 000 pb 1 500 pb
4 000 pb 5 000 pb
800 pb 600 pb
B2 A2 B1 A1
Electrophorèse des ADN 1 et 2 digérés
Les chercheurs face aux maladies génétiques
• Identifier la zone touchée dans l’ADN : la recherche a permis de découvrir en 1991 le gène en cause dans le Syndrome de l’X fragile : gène FMR1, situé sur le chromosome X
• Identifier le rôle de la(es) protéine(s) fabriquée(s) par le(es) gène(s) en question : pas encore précisément connu pour X fragile, FMRP impliquée dans le fonctionnement des neurones.
• Mise au point d’un diagnostic génétique : en routine pour le Syndrome de l’X fragile (sensible à 99%)
• Chercher un traitement : en cours…
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Des 10aines d’années
de recherche !
De la mutation génétique à la maladie
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Recherche et maladies génétiques
C’est un processus long !
Il implique de nombreux acteurs : patients et associations de patients, médecins, chercheurs, entreprises pharmaceutiques, pouvoirs publics…
Liens avec d’autres maladies peut donner de nouvelles Informations sur un syndrome donné
L’étude de l’ADN des patients et de leur famille est essentiel !