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INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DES COMPOSANTES DU MILIEU AU DÉBUT. DE LA PHASE D'INDUCTION EN CULTURE IN WTRO D ' ~ R E S
D'ORGE
Mémoire
présenté à la
Faculté des études supérieures de 1 'Université Lavai
pour l'obtention
du grade de Maître ès Sciences (M-Sc.)
Département de Phytologie
FAcULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION UNIVERS~~É LAVAL
O Liette Laroche, 1998
National Library 191 ,,a, Bibliothèque nationale du Canada
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La culture d'anthères est une technique d'haplodiploïdisation permettant de simplifier
et de raccourcir les délais nécessaires à la production de nouveaux cultivars d'orge.
Cependant, les faibles taux d'embryogenèse et de régénération de plantes vertes limitent
encore l'utilisation de cette technique dans le secteur privé de l'amélioration des céréaies.
ïi semble que les conditions de culture des anthères, dès les premiers jours de mise en
culture, sont déterminantes. La concentration des ingrédients du milieu d'induction FHGL semi-liquide au de'but de la phase d'induction de la culture des anthères affecte la production
moyenne d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos obtenues à partir de LOO anthères.
La composition du milieu d'induction est donc critique et de très grande importance en
androgenèse, puisqu'eile permet d'améliorer la production de plantes chiorophyiiiemes.
Les travaux réalisés corroborent cette hypothèse et démontrent qu'un doublement de
tous les ingrédients du milieu d'induction FHGL, durant les quatre ou les six premiers jours de
Ia période d'induction, stimule l'androgenèse. Chez le cultivar Léger, ce prétraitement
multiplie par sept le nombre moyen de plantes vertes obtenues pour 100 anthères. Chez le
cultivar Cadette, il permet de doubler la production moyenne de plantes vertes obtenues pour
100 anthères, Les premiers jours de l'induction sont donc une étape clé de la culture in vitro
des anthères d'orge. Les modifications alors apportées au milieu de culture ont un impact
direct sur l'androgenèse et par conséquent sur le t a u de production de lignées HD.
TABLE DES MATIÈES
Page .......................................... Résumé ................... ......... 1
Avant-propos ....................................................................................................................... II .. Table des rnatieres ............................................................................................................... III
............................................................................................................. Liste des tableaux VI
Liste des annexes ................................................................................................................ ViI
CHAPITRE I
...................... Introduction Générale ... ........................................................................ 3
CHAPITRE II REWE DE L ~ É R A T U R E
.......................................................................................................................... 2.1. L'orge ............................................................................................. 2.2. La formation du pollen
2.2.1. Les changements cytoplasmiques au cours de la méiose ................................. ............................... 2.2.2. Les changements cytoplasmiques au cours de la mitose
................................................................................... 2.2.3. La maturation du polIen 2.2.4. Le tapétum ........................................................................................................ 2.2.5. Le dimorphisme pollinique ..............................................................................
...................................................................... 22.6. Le contenu en amidon du pollen 2 3 . L ' haplodiploïdisation ....................... .. .....................................................................
2.3.1. La culture d'anthères ........................................................................................ .................................... 2.3.1.1. La paroi de l'anthère en androgenèse in vino
2.3.1.2. Les plastes en androgenèse in viro .................................................... 2.3.1.3. L'induction du dimorphisme poUinique par la culture in vitro des
.............................................................................................. anthères 2.3.2. La stimulation de l'androgenèse par des prétraitements des anthères ou du
matériel végétal ................................................................................................ ............................... 2.3.2.1. Les prétraitements au froid du matériel végétal
.......................................................... 2.3.2.2. Les prétraitements au mannitol ................ . 2.3 2.3. Les prétraitements impliquant des doses variées de sucres
2.3.2.4. Autres prétraitements des anthères ou du matériel végétal ................ 2.3.3. Les milieux de culture in vitro .........................................................................
2.3.3.1. Les milieux solides ............................................................................. 2.3 .3.2. Les milieux liquides ........................................................................... 2.3.3.3. Les d e u x semi-liquides ..................................................................
. 2.3 -3 .4 Les milieux solidifiés à 1' amidon ............................................... 2.3.3.5. Le potentiel osmotique des milieux de culture in vitro ......................
. 2.3 .4 La vanation garnétoclonale .............................................................................. 2.3.5. L'albinisme .....................................................................................................
........................................................................................... 2.4. L'hypothèse de recherche
CFIAPITRE III MATÉRDEL ET &THODES
...................................................................................................... 3.1. Le matériel végétal
3.1.1. Le génotype des plantes-mères ........................ ..., ......................................... 3.1.2. L'environnement et les conditions de croissance des plantes-mères ................
....... ......................... 3.1.3. Le prélèvement du matériel végétal ...................... ,. .. .............................. 3.1.4. L'évaluation du stade de développement des microspores
........................................................................................................ 3.2. La culture in vitro
3.2.1. Les milieux de prétraitement. le milieu d'induction et le milieu de
..................................................................................................... régénération
3.2.2. La mise en culture des anthères, leur prétraitement et le transfert des
.......................................................................................................... embryons
.......................................................................................... 3.3. Le dispositif expérimental
CHAPITRE IV WSULTATS ET DISCUSSION
................................................................................................................. 4.1. Introduction 50 . . 4.2. Essais sur l'orge possédant une bonne réponse androgen~que, cv . Léger ................... 52
4.2.1. Effets d'un pdtraitement des anthères impliquant un changement global de
la concentration des ingédienrs du milieu FHGL semi-liquide ...................... 52
Page 4.2.2 . Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la
concentration du maltose du milieu FHGL semi-liquide .............................. .. 56 4.2.3. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la
concentration des sels du miiieu RIGL serni-liquide ...................................... 57
4 3 . Essais sur l'orge possédant une mauvaise réponse androgénique, cv . Cadette .......... 57
4.3.1. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement global de
la concentration des ingrédients du milieu FHGL semi-liquide ................... ... 57
4.3.2. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la
................................ concentration du maltose du milieu FHGL semi-Liquide 58 4.3.3. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la
....... ...*.................... concentration des sels du milieu FHGL semi-liquide .. 61
4.4. Les interactions entre la durée du prétraitement et la dose des in,& dents dans le
........................ ..............................*................................ milieu de prétraitement ... 62
4.5. Discussion concernant les effets des prétraitements des anthères sur la réponse
............................................................................................... androgénique de l'orge 62
5.1. Retour sur l'hypothèse de recherche .......................................................................... 68
5.2. Essais d'application du prétraitement «Tous 2x» en production de lignées ID d'orge de printemps ................................................................................................... 69
5.2.1. Première tentative d'application du prétraitement «TOUS 2x» ii Ia production
............................... .......................... de Lignées HD d'orge de printemps ... 69
5.22. Deuxième tentative d'appiication du prétraitement «Tous 2x2 à Ia production .................................................................. de lignées HD d'orge de printemps 70
5.3. Perspectives d'optimisation du prétraitement des anthères ...................................... 70
5.4. impacts de la culture des anthères en amélioration des céréales ................... ...... 7 1
Références bibïiographiques ............................................................................................... 73 ......................................... .....*................................ Annexes .... 81
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 3.1. Liste des composantes du milieu FHGL semi-liquide et solide, à la
concentration « I x» des composantes ......................... .. ............................ 47
Tableau 3.2. Milieux et volumes de prétraitement et de remplissage utilisés pour une
.................................................. phase d'induction effectuée en deux étapes 48
CHAPITRE IV
Tableau 4.1. Analyse de la variance et des contrastes pour le nombre d'embryons, de
................... plantes vertes et de plantes albinos par LOO anthères, cv. Léger 53
Tableau 4.2. Analyse de la variance et des contrastes pour le nombre d'embryons, de
plantes vertes et de plantes albinos par 100 anthères. cv. Cadette ................ 54
Tableau 4.3. Production moyenne d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos
par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients.
................. du maltose ou des sels du milieu RIGL semi-liquide. cv. Léger 55
Tableau 4.4. Pourcentage d'albinisme (%) obtenu pour quatre doses de l'ensemble de
tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide,
........................................................................................................ cv. Léger 56
Tableau 4.5. Production moyenne d'embryons. de plantes vertes et de plantes albinos
par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients, .............. du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, cv. Cadette 59
Tableau 4.6. Pourcentage d'albinisme (%) obtenu pour quatre doses de l'ensemble de
tous les ingredients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide,
CV. Cadette ..................................................................................................... 60
LISTlE DES ANNEXES
Annexe A
Annexe B
Annexe C. 1
Annexe C.2
Annexe D
Annexe E
Annexe F. 1
Annexe F.2
Annexe F.3
Stades de dévetoppement des microspores uninucléées utilisées en culture
in vizro d'anthères chez l'orge ....................................................................
................. ................... Numérotarion déatoire des prétraitements ....
.......................................... Plan des répétitions et des sous-blocs, cv. Léger
...................................... Plan des répétitions et des sous-blocs, cv. Cadette
Protocole de préparation d'un litre de milieu d'induction FHGL
................ semi-liquide et d'un Litre de adieu de régénération FHGL solide
Mesure de ta pression osmotique des milieux utilisés pour les
...................... prétraitements des anthères au début de la phase d'induction
Production d'embryons par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble
de tous les in,+dients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-
liquide. appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les
six premiers jours de la phase d'induction, cv. Léger et Cadette ..................
Production de plantes vertes par 100 anthères pour quatre doses de
l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre
ou Les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Cadette .....................
Production de plantes aibinos par 100 anthères pour quatre doses de
l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu RIGL
semi-liquide. appliquées en préfraitement des anthères, pendant les quatre ..................... ou les SLY premiers jours de la phase d'induction, cv. Cadette
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paae Annexe F.4 Production de plantes vertes par 100 anthères pour quatre doses de
l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des seis du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Léger ........................ 92
Annexe F.5 Production de plantes albinos par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de cous les ingrédients, du mdtose ou des seis du milieu FHGL
semi-Liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre
ou les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Léger ............-......,.. 93
Annexe G Tableau des coefficients attribués aux traitements ................... .... ........ 94
La production de nouveaux cultivafs de céréales à l'aide des techniques
d'haplodiploïdisation est en pleine expansion. En effet, ces techniques ont une répercussion
importante dans le secteur agricole. Elles offrent Ia possibilité d'accélérer les programmes de
sélection (Bonjean, 1995). Chez l'orge, la production rapide d'un matériel homogène dont les
caractères génétiques sont fixés et stables caractérise les techniques d'haplodiptoïdisation.
Cette caractéristique offre de très grands espoirs, car les délais nécessaires à la production de
nouveaux cultivars de céréales Fiés ou de nouvelles lignées fixées peuvent être raccourcis de
deux à quatre années par rapport aux délais requis par les techniques conventionneiies. Les
cultivars générés avec les techniques d'amélioration conventionnelles sont des descendants
d'hybrides F 1 issus de croisements intraspécifiques dont les caractéristiques génétiques sont
fixées et sélectionnées en même temps au cours d'une dizaine d'autofécondations successives
(Bonjean, 1995).
Les techniques d'hapIodip1oïdisation permettent de créer de nouvelles variétés fixées
directement à partir d'hybrides Fi ou F2, ou à tout autre stade de sélection d'un programme
d'amélioration (Xu, 1990). Une population de plantes haploïdes doublées (HD) homozygotes,
représentative de la variabilité des gamètes parentaux, peut étre régénérée en un cycle
seulement à partir des gamètes d'un individu hétérozygote {Bonjean, 1995). La sélection du
nouveau matériel est plus f a d e et plus fiable, car les plantes haploïdes doublées sont
homozygotes et elles sont facilement caractérisables. Les gènes dominants, partiellement
dominants ou récessifs sont exprimés; il y a absence de masquage ou d'hédrosis dans le
génome des lignées d'orge HD. Lorsqu'une évaiuation ou une sélection est réalisée dans une
population de lignees HD d'orge pour des caractères comme Le rendement, la qualité du grain
ou la résistance à une maladie, les caractères sélectionnés sont obligatoirement présents et
transmis à la descendance Iors de la multiplication de la semence, car l'orge est une espèce autogame.
Les techniques d'haplodiploïdisation offrent aussi de nombreux avantages en
phytogénétique. Les plantes obtenues via I'haplodiploïdisation permettent d'ktudier les gènes
et les relations qui existent entre eux. Les HD sont un excellent matériel pour la cartographie
génétique et l'identification de marqueurs moléculaires liés à des traits phénotypiques, à un
gène ou à une région d'un chromosome.
La culture d'anthères est une technique d'haplodiploïdisation réalisée depuis pIus de
vingt ans. Cependant, des dificultés subsistent quant à la production B grande échelie de
nouveaux g6notypes furés par cette technique d'androgenèse Ur virro. k s problèmes majeurs
se manifestent surtout au niveau de la régénération de plantes vertes, en raison d'une mauvaise
aptitude de certains ghotypes à I'androgenèse in vitro (Pickering et Devaux, f 992). Chez
I'orge, le taux de production de plantes haploïdes et haploïdes doublées chiorophylliennes est
souvent faible et, Iorsqu'il y a formation de plantes, elles sont souvent déficientes en
chlorophylle, c'est à dire albinos. Ces problèmes limitent l'utilisation de cette technique
d'haplodiploïdisation dans le secteur de l'amélioration de l'orge. Des recherches pour
améliorer la technique de culture in vitro des anthères, ainsi que les milieux de culture in virro
sont impératives.
Dans le cadre de cette maîtrise en biologie végétale, on a donc réalise des travaux de
recherche consacrés à la stimulation de l'androgenèse in vitro et de la régénération de plantes
vertes en culture d'anthères chez l'orge de printemps.
II- REVUE DE LITTÉRATURE
2.1. L'orge
L'orge fait partie des cultures ciréalières les plus anciennes. Elle appartient à la grande
familie des Poaceae, à Ia tribu des Triticeae, au genre Hordeurn et à l'espèce vulgare (Man et
Ullrich, 1993). Cene céréale possède une grande adaptation écologique et seul le blé possède
une adaptation aussi vaste. A l'échelle mondiale. la production d'orge se divise en trois grands
secteurs: l'alimentation humaine et animale, l'industrie brassicole et d t i f e r e , ainsi que le
secteur de [a semence (Poehlman, 1985).
L'orge est une espèce autogame qui se reproduit par autofécondation
(autopollinisation). La majorité des espèces d'orge est diploïde (2n = 14)- bien qu'il existe des
espèces tétraploïdes (2n = 28) et des espèces hexaploïdes (2x1 = 42) (Nilan et UIlrich, 1993).
Le pool génétique le plus couramment utilisé se limite à deux espèces: Hordeurn vulgare et
Hordeurn sponraneum (ancêtre sauvage, 2n = 14). L'information génétique de l'orge est
répartie dans trois génomes différents: le génome nucléaire, le génome mitochondrial et le
génome ckloroplastique. Le génome principal est le génome nucléaire. Il est constitué de
5'5x109 paires de bases, constituant 50 000 gènes fonctionnels. Environ 75 pour-cent de ce
génome nucléaire est consutu6 de séquences répétées et 25 pour-cent de séquences non
répétées (Nilan et Wrich, 1993).
2.2. La formation du poiien
Chez les plantes sup&ieures, la reproduction sexuée débute par la formation de
gamètes haploïdes à partir de cellules somatiques diploïdes. La transition de la phase
sporophytique (2n) vers la phase gamétophytique (n) se fait par une division méiotique de
cellules siniées au niveau des organes de reproduction (Stanley et Linskens, 1974). Chez
l'orge, les deux partenaires de la reproduction sexuée sont les ovaires, qui contiennent les
gamètes femelles, et les anthères, qui contiennent les gamètes mâies (Malik et Sanjeev, 1992).
L'anthère est formée de plusieurs couches de cellules. Dans l'ordre de l'extérieur vers
l'intérieur, ces couches sont: l'épiderme, I'endothécium, les assises transitoires, le tapétum et
le tissu sporogène (Chapman, 1987). Le tissu sporogène est constitué d'un seul type de
cellules qui se développent de façon synchrone et identique (Stern et Hotta, 1968). Au cours
du développement de i'anthère, les cellules du tissu sporogène cessent toute division mitotique
au profit de la division méiotique, qui est essentielle à la formation des gamètes mâles
haploïdes: le pollen (Chaprnan, 1987; Malik et Sanjeev, 1992; Shivana et al., 1979; Stanley et
Linskens, 1974).
2.2.1. Les changements cytoplasmiques au cours de la méiose
La méiose, qui d o ~ e naissance à des tétrades de cellules haploïdes, est composée de
quatre phases principales: la prophase, la métaphase, l'anaphase et la télophase (Dickinson,
1987).
La prophase se divise en cinq stades. Le premier est le stade leproténe et le deuxième
est le zygotène. Pendant ces deux stades, la chromatine se condense et des chromosomes bien
définis sont visibles. Ces chromosomes s'apparient avec leurs homologues. Le troisième stade
est le stade pachytène. Les enjambements entre les chromatides de%utent pendant ce stade. Les quatrième et cinquième stades de la prophase sont respectivement le stade diplotène et le stade
diakinèse. où les chromosomes homologues se condensent encore plus et où les chiasmas
(sites d'enjambement) deviennent visibles (Dickinson, 1987).
Lorsque la prophase est complétée, la cellule entre en métaphase. Pendant cette
deuxième phase, les chromosomes homologues s'alignent au centre de la cellule pour former
la plaque équatoriale. Ensuite, pendant l'anaphase, les chromosomes migrent vers les pôles de
la cellule. Finalement, lors de la télophase, les chromosomes se concentrent aux pôles de la
cellule et il y a formation de noyaux distincts délimités par une enveloppe nucléaire
(Dickinson, 1 987).
Chez les angiospermes, chaque fois qu'une cellule ou un groupe de cellules s'engage
dans un nouveau sentier morphogénétique, il y a isolation de ces cellules. Dans les anthères, le
de%ut de la méiose se caractérise par une déposition de cailose (paroi de polysaccharides)
autour des cellules-mères du pollen, contrairement aux cellules somatiques qui s'entourent
d'une paroi de ceiIulose (Stem et Hotta, 1968). Ce dépôt de callose isole sélectivement les
méiocytes et, dans ces cehies, l'entrée de certaines classes de molécules est facilitée, bloquée
ou retardée (Shivana et al., 1979). L'isolation des méiocytes joue un rôle important dans le
déroulement normal de la méiose. La transition de la phase sporophytique vers la phase
gamétophytique de'bute après l'isolation des méiocytes (Shivana et al., 1979; Dickinson et
Heslop-Harrison, 1977).
Pendant la méiose, les cellules méiotiques subissent de nombreux changements
stmcturaux, physiologiques et biochimiques, spécialement pendant la prophase méiotique
(Dickinson et HeslopHarrison, 1977; Sangwan, 1986). Les ARNr (acides ribonucléiques
ribosomiques), les ARNm (acides ribonucléiques messagers) et une partie de la population
ribosornique disparaissent pendant le stade leptotène et le stade tygotène de la prophase
méiotique. Au même moment, ii y a un arrêt de la synthèse de I'ARNn (acide ribonucléique
nucléaire). Dickinson (1987) suggère que la dégradation des ARN du cytoplasme soit plus
rapide pendant les stades leptorène et zygutène, car un niveau élevé d'enzymes hydrolytiques a
été observé dans le cytopIasme des celiules à ces stades de la division méiotique. L'arrêt de la
synthèse de I'ARN nucIéaire et l'augmentation de son taux de dégradation seraient à l'origine
de Ia diminution du nombre de molécules d'ARN observées dans le cytoplasme. Cette
diminution a pour fonction l'élimination des molécules porteuses de l'information
sporophytique. Les gènes codant pour les caractères sporophytiques cessent alors de
s'exprimer et Ie processus de différenciation gamétophytique s'accélère, car le génome
gamétophytique haploïde commence à s'exprimer (Dickinson et Heslop-Harrison, 1977;
Dickinson, 1987). Cette phase de grand nettoyage permet donc de passer aux étapes suivantes
de la formation du pollen.
Les mitochondries et les plastes sont conservés au cours de la méiose, mais sous une
forme très dédifférenciée. Les plastes sont les organites à l'origine des chloroplastes, des
chromoplastes et des leucoplastes dont les arnyIoplastes (Arms et Camp, 1987). Les
mitochondries et les plastes subissent une réorganisation interne importante pendant la
prophase. Au cours de Ia prophase, les mitochondries perdent progressivement leur structure
interne et se dédifférencient rapidement (Dickinson et Heslop-Harrison, 197 1; 1977). En plus,
la réplication des plastes cesse au début de la prophase méiotique. Pendant la leptotène, les
plastes perdent progressivement leur contenu en amidon. Iis subissent une simplification
structurale dont une regression du système lamellaire (Dickinson et Heslop-Harrison. 1977;
Shivana et al., 1979) et la perte d'une partie de Ipur contenu nbosomique (Dickinson et
Heslop-Harrison, 1977). Pendant le stade zygutène, les mitochondries et les plastes ne sont
plus que de petites inclusions isodiam6triques très dédifférenciées (Dickinson, 1987;
Dickinson et Heslop-Harrison, 1971; 1977; Shivana et al., 1979). Les plastes atteignent ur
maximum de simplification au stade pachytène (Shivana et al., 1979).
À la fm du stade tétrade et au début du stade microspore du poilen, les rnitochondriez
et les plastes se redifférencient pour retrouver leur forme d'origine (Dickinson, 1987; Shivam
et ai., 1979). À ce moment, les ribosomes réapparaissent dans le cytoplasme et les
amyloplastes accumulent de nouveau de l'amidon. Au terme de la méiose, Ies quatre
microspores haploïdes formées contiennent des amylopIastes, des mitochondries, des
dictyosomes, des ribosomes, un réticulum endoplasmique, des gouttelettes de Lipide et des
vacuoles. Ces organites sont distribués au hasard dans le cytoplasme de la microspore
(Schroder, 1985).
2.2.2. Les changements cytoplasmiques au cours de la mitose
En générai, après la méiose, on observe une, deux ou trois divisions mitotiques dans la
microspore. Après la ou les divisions mitotiques (le nombre de division est propre à l'espèce),
la microspore mature est appelée «grain de pollen» (Stanley et Linskens, 1974). La première
division mitotique marque le remplacement définitif de la phase sporophytique par la phase
gamétophytique. Cette mitose haploïde indique la fin du stade dédifférencié réversible et le
début du stade différencié irréversible du grain de pollen (Sangwan et Sangwan-Norreel,
19876).
La microspore fraîchement libérée de la tétrade contient un gros noyau cenaal entouré
d'un cytoplasme normalement constitué (Shivana et John. 1979). Pendant Ie processus de
maturation, la microspore gonfle, son noyau migre d'un côté de la cellule et il y a formation
d'une grande vacuole à l'opposé du noyau (Shivana et John, 1979). Avant la première mitose,
la microspore possède une vacuole centrale et un cytoplasme qui, distribué en périphérie,
contient les organites (Sangwan et Sangwan-Norreel, 198%). Après la migration du noyau,
une réorganisation cytoplasmique provoque une redistribution polarisée des organites du
cytoplasme. Les plastes et les mitochondries s'éloignent du noyau (Shivana et Job, 1979).
Les plastes migrent vers Ia partie proximale du cytoplasme où ils se regroupent. Le cytoplasme
entourant le noyau en division contient uniquement des mitochondries (Schroder, 1985).
La réorganisation cytopIasmique est suivie d'une division nucléaire asymétrique qui
provoque la formation d'une celïule végétative et d'une cellule générative. Le noyau génératif
apparaît sous une forme condensée. Il d o ~ e naissance aux deux noyaux impliqués dans la
fertilisation de l'ovule. Le noyau végétatif demeure relativement gros et il est impliqué dans 1:
formation et la croissance du tube pollinique lors du processus de fertilisation (Stem et Hotta
1968).
De façon générale, les plastes sont absents de la cellule générative (Stiivana et Johri.
1979; Schroder, 1985). Par contre, le cytoplasme de la cellule végétative contient des plastes
(Shivana et Johri, 1979). L'absence de plastes dans la cellule g6nérative n'est pas seulement Ie résultat de la réorganisation polaire du cytoplasme, mais aussi l'effet d'un mécanisme
provoquant Ieur destruction (Shivana et John, 1979). La destruction des plastes de la ceUule
générative a pour conséquence génétique la transmission uniparentde maternelle des plastes à
la descendance (Schroder, 1985).
2.2.3. La maturation du pollen
À la suite de la division asymétrique de son noyau, le pollen entre en phase de
maturation. Pendant cette phase, des réserves nutritives s'accumulent, surtout sous forme
d'amidon et de Lipides, dans le grain de pollen. Le nombre d'organites augmente dans le
cytoplasme. Des plastes se différencient en amyioplastes et les parois du grain de pollen se
complètent (Sangwan et Sangwan-Norreel, t 987b). À la fin de cette période de maturation, les
grains de pollen sont prêts à assurer leur fonction de gamète mâle.
Le terme «grain de pollenn désigne la stnicture, qui provenant d'une division mitotique
du noyau de la microspore, contient un noyau végétatif et un noyau génératif. Ainsi, les termes
«microspore» ou «poIlen immature- devraient être attribués uniquement aux structures
haploïdes uninucléées libérées des tétrades après la méiose, et le terme «pollen» devrait être
utilisé uniquement pour identifier les structures haploïdes binucléées ou trinucléées.
Pendant la formation et Ia maturation du polien, une température trop élevée ou des
facteurs externes comme une exposition aux rayons X, une irradiation des gamètes ou une
application de produits chimiques peuvent engendrer la stérilité poilinique (Stanley et
Linskens, 1974). Le pollen est particulièrement sensible à la température pendant la période
précédant la première division mitotique (Koller, 2943).
Le tapénim, qui entoure le tissu sporogène, joue un rôle important dans le
développement du pollen. Le tapétum sécrète, dans le locule de l'anthère, les substrats servant
à la formation des réserves nutritives et des parois des cellules sporogènes, puis des gamètes
mâles. Les cellules du tissu tapétai hydrolysent et relâchent également les désoxyribosides
nécessaires à la synthèse de l'ADN des microspores (Stem et Hotta, 1968). Le tapétum est
donc considéré comme le tissu noumcier et tout métabolite doit passer par les cellules
tapétales pour atteindre le tissu sporogène (Shivana et John, 1979).
Après la dissoIution de la callose qui entoure la tétrade, les microspores libres sont
relâchées dans le fluide tapétal du locuie de l'anthère. Les microspores dépendent entièrement
des substances nutritives contenues dans ce fluide pour compléter leur croissance et leur
développement (Stanley et Linskens, 1974). À la fin de la phase tétrade et au début de la phase
microspore. le locule de l'anthère est donc utilisé pour le stockage temporaire de l'amidon et
de certaines autres formes de sucres (Pacini et Franchi, 1983). Les sucres synthétisés par les
tissus photosynthétiques de la plante-mère sont transloqués dans les anthères via le tapétum
(Pacini et al., 1986). Ce transfert est direct ou indirect. Les sucres transloqués indirectement
dans l'anthère, via le fluide rapétal, sont accumulés temporairement dans les cellules du
tapénim. Les cellules du tapétum accumulent aussi des substances provenant de l'hydrolyse de
la paroi de cdlose, qui entourait les tétrades, et de la dissolution de la paroi tapétale.
Pendant la phase de maturation, les tissus sporogènes de L'anthére accumulent
l'amidon et les autres sucres solubles, maintenant le pollen en condition de famine relative.
Cette privation de sucre est nécessaire au développement normal du pollen. Chez L i l i m , des
microspores isolées au stade uninucléé vacuolisé et placées sur un milieu contenant du sucrose
synthetisent beaucoup d'amidon et ce. de façon incontrôlée (Clément et Audran, 1995). Les
microspores uninucléées vacuolisées, cultivées in vitro dans leur anthère sur un milieu
contenant du sucrose, se développent normalement et atteignent la maturité sans accumuler
d' amidon dans leur cellule végétative.
L'activité de synthèse et de dégradation du tapétum évolue parallèlement au
développement du pollen (Vasil, 1967). Les changements dans l'activité du tapétum contrôlent
probablement la séquence des événements biochimiques du développement pollinique
(Stanley et Linskens, 1974). Pendant la phase post-méiotique. c'est-à-dire après la libération
des microspores des tétrades et avant l'anthèse, l'activité du tapttum est critique. À ce
moment, des facteurs externes peuvent influencer le métabolisme des cellules du tapétum et, si
le bouleversement métabolique est trop important, il en résulte un développement anormal de:
microspores (Stanley et Linskens, 1974).
L'accumulation des sucres dans le locule de l'anthère cesse vers la fui de la phase
microspore. Pendant les dernières phases du développement pollinique, le tapétum entre en
dégénérescence et cesse de transmettre les substances provenant du sporophyte (Pacini el
Franchi, 1983). Les microspores ont alors déjà absorbé une grande partie des sucres
disponibles. Le moment de la dégénérescence du tapétum varie d'une espèce à l'autre (Stem ei
Hotta, 1968). Dans l'anthère mature, le tapétum est totalement désorganisé (Malik et Sanjeew,
1992).
Les parois de l'anthère protègent le poIZen contre toute variation nuisible de la
composition chimique de son environnement immédiat (CIément et Audran, 1995). Pendant le
développement du pollen in vivo ou in vitro dans les anthères, tous les éléments nutritifs
passent au travers du tapétum ou sont métabolisés par celui-ci avant d'atteindre les
microspores. Les cellules de I'épiderme de l'anthère et de la paroi de la microspore servent
donc à filtrer les é1Crnents nutritifs avant leur absorption par les microspores (Dunwell, 1978).
2.25. Le dimorphisme pollinique
L'aptitude des microspores à l'androgenèse semble liée au dimorphisme pollinique. Il existe des formes polliniques hapioïdes dont te développement dévie du patron de
développement normal. Ce phénomène est appelé dimorphisme pollinique. Il réfère à la
présence, dans une anthère, de microspores présentant deux morphologies différentes et qui
ont le potentiel de se développer en deux générations différentes: Ia génération
gamétophytique et la génération sporophytique (Rashid, 1983; Prakash et Giles, 1987).
La cytomorphologie des microspores capables d'embryogenèse haploïde peut différer
entre les espèces avec lesqueIIes I'androgenèse est possible. Généralement, le pollen anormal
est plus petit et il ne contient pas d'amidon (Sunderland et Huang, 1987). Chez l'orge, le maïs
et le riz, des microspores d'une taiUe supérieure à celle des grains de pollen normaux seraient
aussi embryogéniques. Chez N. tubacum cv. Burley, les microspores normales se caractérisent
par une fréquence de formation élevie, un cytoplasme fortement color6 par I'acétocarrnin
acétique et un contenu élevé en amidon. De leur côté, les microspores anomales sont petites,
elles ont un cytoplasme faiblement coIoré par l'acétocarmin acétique, elles sont dépourvues
d'amidon et, en générai, elles ont une faible fréquence de formation. Cependant, la fréquence
de formation du pollen aberrant differe beaucoup d'une anthère à l'autre et entre les deux
locules d'une même anthère (Horner et Street, 1978). DunweIl(1978) mentionne que le pollen
anormal a un faible contenu en ARN et en protdines.
Le d6veloppernent des grains de pollen anormaux est retardé, car leur division
mitotique débute à un stade beaucoup plus tarw que celui de la population pollinique
normale. Le développement post-rnéiotique des microspores anormales est différent du
développement gamétophytique typique; il semble arrêté à la mitose. Une désynchronisation
du développement de microspores individuelles ou de groupes de microspores est donc i l'origine du dimorphisme pollinique. Si cette désyncbronisatioa n'est pas Iétaie, les spores
continuent de se développer selon leur propre programme interne et peuvent se diviser
(Sunderland et Huang, f 987).
Bien que le dimorphisme pollinique soit sous contrôle génétique, le nombre de
microspores dimorpbiques formées dans une anthère dépend des conditions de culture des
plantes-mères et des conditions environnementales auxquelles les microspores sont soumises
avant, pendant et après la méiose (Sunderland et Huang, 1987). Des conditions de culture
particulières peuvent donc induire un dimozphisme poliinique.
2.2.6. Le contenu en amidon du pollen
Les grains de pollen matures d'un grand nombre d'espèces végétaies contiennent de
deux à trois pour-cent d'amidon sur une base de matière sèche (Khattra et Malik, 1992). Le
contenu en amidon du pollen est affecté par Ies conditions d'humidité relative lors du
développement des plantes-meres. Par exemple, le pollen de Corylus avellana, Cornus m m et
Poa annua, provenant de plantes-mères maintenues en conditions d'humiditk relative élevée, a un contenu plus faible en amidon que celui de plantes-mères maintenues en conditions de
faibIe humidité relative (Kaufman, 1920).
La formation des grains de pollen est donc un processus complexe composé de
plusieurs dtapes. Des facteurs agissants sur les ktapes clefs du développement poilinique
entraînent une déviation du développement gamdtophytique. Peu de ces facteurs sont
clairement identif~ks il l'heure actuelle. Leurs effets sont cependant es importants au niveau
de l'expression des gènes des cellules-mères du pollen ou des microspores, et de la sécrétion
ou de la translocation de certains produits par la paroi de l'anthère. Ces modifications, si eues
ne sont pas létales, permettent à certaines microspores de retourner à un stade potentieilement
sporophytique. La totipotence de telles cellules haploïdes est exploitée en haploCiploïdisation
avec les techniques d' androgenèse in vitro pour générer des plantes haploïdes ou haploïdes
doublées homozygotes.
En 1934, Johansen rapporte pour la première fois l'existence de plantes d'orge
haploïdes. La fréquence d'apparition naturelle de telles plantes est très faible et, par
conséquent, leur étude est limitée. Plusieurs tentatives infmctueuses sont réalisées pour
reproduire artificiellement de telles plantes. Cependant, quarante ans plus tard, cela devient
enfin possible grâce aux travaux de Clapham (1973). De façon simplifiée,
I'haplodiploïdisation est la production de lignées haploïdes doublées (HD) suite à un
doublement spontané ou artificiel des chromosomes de plantes haploïdes.
Les techniques d'haplodiploidisation nécessitent la production de plantes haploïdes.
Les plantes haploïdes possèdent le nombre gamétique de chromosomes. Dans le cas de l'orge
diploïde (2n = 14), le génome haploïde possède 7 chromosomes (n = 7) (Simmonds, 1988).
Les plantes haploïdes sont parfaitement viables, mais elles sont stériles et plus petites que les
plantes diploïdes (Picard et al., 1994). Le doublement spontané ou &iciel de la garniture chromosomique des plantes haploïdes permet de générer des plantes diploïdes fertiles
(Simmonds, 1988) et homozygotes, car leun deux jeux de chromosomes sont identiques.
Il existe diverses méthodes de production d'orges haploïdes: la méthode bulbosum qui
implique le phénomène de l'élimination chromosomique (Thom, 1992; Pickering et Devaux,
1992), I'androgenèse in vitro impliquant la culture des anthères ou des microspores isolées
(Pickering et Devaux. 1992; Kasha et al., 1990; Ziauddin et al., 1 WO), la culture d'ovaires non
fécondés ou de sacs embryonnaires, ou fuialement celle impliquant la présence du gène «hap» (Prakash et Giles, 1987). L'androgenèse in vitro est la méthode la plus répandue.
Les plantes régénérées via I'androgenèse sont un mélange de plantes haploïdes,
haploïdes doublées, tétraploïdes, aneuploïdes et mixoploïdes (Foroughi-Wehr et Wenzel,
1993). Chez l'orge, certains rapportent que 70 pour-cent des plantes régénérées, soit la
majorité, sont des plantes haploTdes doublkes de façon spontanée (Foroughi-Wehr et Wenzel,
1993), alors que d'autres rapportent qu'un doublement spontané des chromosomes se manifeste
dans une proportion de 30 à 100 pour-cent chez les plantes régénérées (Picard et al., 1994;
Ziauddin et al., 1990). Le niveau de ploïdie des plantes régénérées par androgenèse est
influencé par plusieurs facteurs, comme le stade des microspores, les hormones présentes dans
le milieu et les conditions de culture (Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993). Chez l'orge et le riz, il est possible de sélectionner une composition du milieu nutritif et des conditions de cultures Ui
vitro permettant de stimuler la production spontanée de plantes haploïdes doublées. Dans ces
cas, le doublement artificiel de la garniture chromosomique n'est plus obligatoire (Foroughi-
Wehr et Wenzel. 1993).
23.1. La culture d'anthères
La cuimre des anthères est la plus ancienne et la plus répandue des techniques
d'androgenèse in vino. En 1973, Clapham obtient les premières plantes d'orge haploïdes par
la culture d'anthères. À ITUniversité Laval, Brissette obtient les premières plantes d'orge
haploïdes en 1980. En 1990, Xu a réalisé une revue très détaillée de la littérature concernant la
culture in vitro des anthères d'orge. Essentiellement, cette technique consiste à prélever des
anthères sur des épis d'orge et à les placer sur un milieu nutritif artificiel où quelques unes des
microspores des anthères se divisent pour former des cals ou des embryons. Ces structures se
differencient ensuite pour former des plantes haploïdes ou haploïdes doublées.
Le potentiel ernbryogénique des microspores est affecté par I'état de maturité des
microspores. La microspore répond aux traitements en culture in vitro pendant un intervalle de
temps limité. La période favorable à l'induction de l'androgenèse varie selon l'espèce végétale
utilisée (Sangwan et Sangwan-Norreel, 198Tb). Chez la plupart des espèces, les microspores
dont le développement est arrivé au début ou à la moitié du stade uninucléé offrent de
meilleurs résultats en androgenèse in vino. Les microspores qui accumulent de l'amidon ou
dont le développement n'est pas assez avancé, c'est-à-dire au stade tétrade ou au stade situé
immédiatement après ie stade tétrade, ne suivent pas le sentier sporophytique in vitro
(Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993). Chez les céréales, il existe un différentiel de maturation des
anthères d'un même épi. Les microspores provenant d'anthères situdes dans les fleurs des
épillets centraux de l'épi sont à un stade de développement plus avanck que celles des anthères
des fieun des épillets du tiers supérieur ou inférieur de l'épi (Foroughi-Wehr et Wenzel,
1993). Chez l'orge, les microspores des trois anthères de la fleur centrale de l'épillet sont à un
stade de développement plus avancé que les microspores des trois anthères des fleurs latérales.
L'androgenèse in vitro comporte trois ttapes (Picard er al. 1994): induction,
embryogenèse et régénération des plantes. La phase d'induction implique une bifurcation
morphogénétique de la microspore à un stade précis, et un retour à la totipotence de cettc
cellule qui devient embryogénique. Pendant le passage in vitro des anthères, Ia population dc
microspores se divise en deux groupes, un premier dont les microspores dégénèrent et ui
deuxième formé de la faible portion des microspores qui se réorientent vers I'embryogenèst
(Demarly, 1986).
Deux patrons principaux d'androgenèse sont reconnus: l'androgenèse directe e
l'androgenèse indirecte. Dans le cas de l'androgenèse directe, la microspore se comportt
comme un zygote et les étapes du dbveloppement embryogénique sont similaires aux étages di
développement zygotique. Cependant, au début de son développement, I'embryor
androgénique est entouré de la paroi pollinique (Sangwan et Sangwan-Norreel, 1987b). Dan: le cas de l'androgenèse indirecte, la microspore se divise de façon anarchique principalemen
au deout du stade globulaire, ce qui provoque la formation d'un cal ne possédant aucune
symétrie. Des tiges et des racines, parfois des embryons secondaires (chez certaines espèces:
se différencient sur le cd (Sangwan et Sangwan-Norreel, 1987b).
Chez l'orge, on observe la formation de cals suite à une première mitose symétrique dc
noyau de la microspore (Wilson et al., 1978). Par la suite, chez la même espèce, on observe
trois patrons d'embryogenèse (Zhou et Yang,1980). L'embryogenèse peut se faire via des
divisions du noyau végétatif, des divisions du noyau végétatif et du noyau génératif, ou pai:
une division symétrique du noyau de la microspore uninucléée. On observe aussi, pour chacun
des patrons d'embryogenèse, différents types de cellules dont des cellules anucléées, des
cellules qui restent méristématiques pendant une longue période et des cellules qui se
vacuoIisent tôt. Les cellules anucléées ou vacuoIisées ne se développent pas au-delà de ce
stade (Zhou et Yang, 1980). Plus récemment, Huang (1984) observe que les microspores
d'orge deviennent binucléées suite à une division égale ou inégale du noyau de la microspore
et que la division inégale du noyau est prédominante.
En culture d'anthères d'orge, les microspores embryogéniques se divisent d'abord à
l'intérieur de l'exine pour former des microspores multicellulaires (MPG: multi cellular pollen
grain). Après leur formation, les MPG sont libérées dans le sac pollinique de l'anthère suite à
une rupture de l'exine. Ils y poursuivent leur déveIoppement de façon organisée ou de façon
désorganisée. Les structures formées de plus de cent cellules organisées de façon asymétrique
sont des cals (Shannon et al., 1985). Ces masses cellulaires sont indifférenciées, elles ne
possèdent aucune structure et elles sont amorphes dans leur organisation. Les structures
organisées de façon symétrique sont des embryons. Les embryons ont un méristème racinaire
et un méristème caulinaire. Ceux qui possèdent une structure organisée développent
rapidement un axe tige-racines, des vaisseaux conducteurs, le phloème et le xylème, et ils se
développent pour former directement des plantes.
Les embryons peuvent avorter pendant les différentes étapes de l'embryogenèse. La
plupart des avortements se produisent au cours des premiers stades (Heberle-Bors, 1985).
Dans la majorité des cas, cet avortement est associe à la formation de cellules vacuoIisées,
c'est-à-dire des types celiulaires que l'on retrouve dans les cals. Pendant les premiers stades,
toutes les cellules de l'embryon peuvent se vacuoliser. Aux étapes plus avancées de
l'embryogenèse, seulement les cellules situées en surface de l'embryon peuvent se vacuoliser.
Des embryons au stade globulaire ou à des stades plus avancés de I'embryogenèse in vitro
peuvent cesser de se développer. Chez les céréales, les embryons qui ont commencé à avorter
peuvent être sauvés en modifiant la balance hormonale du milieu. Il y a alors formation de cds
embryogéniques qui peuvent développer une tige et des racines (Heberle-Bors, 1985). La
germination des embryons viables est aussi influencée par la compétition entre eux pour les
éléments nutritifs du milieu (Roberts-Oehlschlager et Dunwell, 1990).
Le taux de succès de l'androgenèse in v i m dépend donc de nombreux facteurs. Le
génotype, la variabilité génétique des mitochondries et des chloroplastes, l'état physiologique
et de santé des plantes-mères, les conditions de croissance des plantes-mères (tempkranire,
photopériode, spectre lumineux, nutrition minérale, conditions hydriques et humidité relative),
le stade de maturité et la viabilité des microspores affectent de façon importante la réussite de
I'androgenèse in vitro. Les conditions de culture in vitro jouent aussi un rôle très important.
Ces conditions sont la composition. l'état physique (liquide, semi-liquide o u solide) et le pH
du milieu nutritif (Kao et Hom, 1982). la composition de l'environnement gazeux dans les
cuvettes de culture où sont les anthères, ainsi que la température d'incubation et le degé
d'humidité relative à l'intérieur de la chambre de croissance au cours de Ia période d'induction
et d'embryogenèse (Picard et al. 1994). La densité des anthères, par rapport au voIume de
milieu d'induction utilisé, affecte également la réussite androgénique. Roberts-OehIschiager et
Dunweii (1990) ont étudié l'effet de la densité des anthères en culture in vitro. Une densité de
60 à 120 anthères par millilitre de milieu d'induction, ce qui est assez élevé, est recommandée.
Chez l'orge, le blé et le riz, I'androgenèse peut être induite avant ou après la mise en
culture des anthères. Les caractéristiques ultrastructurales du poilen androgénique ne diffèrent
pas dans les deux cas (Huang, 1984). L'induction de I'androgenèse irnpiique une dktection par
la microspore d'un certain stimulus causé par des changements dans son environnement
(Dunwell, 1978). Par exemple, chez la microspore un stimulus chimique peut lever une
dormance hormonale. Un changement dans l'environnement gazeux, comme le passage d'un
environnement anaérobie il un environnement aérobie, peut également stimuler le processus
d'audrogenèse in vitra.
Le temps nécessaire A l'apparition des embryons en culture in vitro d'anthères dépend
du stade de maturité des anthères au moment de la culture (Horner et Street, 1978). Plus Ic poilen est mature, plus les embryons apparaissent tôt. Chez N. tabacum cv. Burley, les délais
de production de plantules diminuent avec une augmentation du degré de maturation des
anthères. De façon générale chez l'orge, du début de la mise en culture des anthères à la
régénération de plantes sevrables, il s'écoule de six à dix semaines.
23.1.1. La paroi de l'anthère en androgenèse in vitro
Les tissus de la paroi de I'anthère sont importants pour la production de cds et de
plantes vertes en culture in vitro (Wei, 1982). Le taux d'albinisme est plus élevé en cuIture de
microspores isolées qu'en culture d'anthères (Hu et Huang, 1987). On postule depuis
longtemps qu'il existe un facteur, émis par les tissus de l'anthère, nécessaire à l'androgenèse.
Ce facteur varierait en quantité ou en activité au cours du développement des anthères et serait
un facteur limitant à certains des stades de déveioppement des anthères chez différentes
espèces (Sunderland, 1974). Par contre, les succès récents obtenus en culture de microspores
isolées chez l'orge par Ziauddin et al. (1992) démontrent que les parois de l'anthère ne sont
pas irremplaçables en androgenèse in vitro.
2.3.1.2. Les plastes en androgenèse in viîro
La dédifférenciation et la redifférenciation des plastes ont un effet significatif sur
l'induction de I'androgenèse. Les plastes juvéniles, ou proplastes, sont spécifiques aux espèces
androgéniques alors que les plastes différenciés ou les arnyloplastes sont spécifiques aux
espèces non androgéniques, c'est-à-dire aux espèces peu aptes à l'androgenèse in vin-O
(Sangwan et Sangwan-Norreel, 1986; 1987a).
2.3.1.3. L'induction du dimorphisme pollinique par la culture in vitro des anthères
Certaines des microspores dimorphiques peuvent être stimulées à se diviser in virro
(Sunderland, 1974). Les microspores dimorphiques, aussi qualifiées de «poilen anormal ou
variant>,, sont donc potentiellement embryogéniques. Mis en culture à un stade immature, le
pollen variant peut se diviser et former des embryoïdes, des cals ou d'autres formes
morphogthiques (Horner et Street, 1978). Le pollen embryogénique possède de rares
ribosomes et des mitochondries condensées. li est incapable de germination et présente le
même profil que des cellules inactives au point de vue métabolique (Rashid, 1983). De ces
constatations, on infere que le pollen embryogénique est une structure dormante in vivo qui
peut être stimulée à se diviser et à former des embryons in vitro. Indépendamment du stade de
développement des microspores au début de la culture, tous les grains de pollen
embryogéniques possèdent un noyau clairement visible et ne contiennent pas de grains
d'amidon (Horner et Street, 1978). Pendant la culture des anthères, plusieurs des microspores
uninucléées dégénèrent. Les grains de pollen variants ne sont donc pas tous embryogéniques
Plusieurs chercheurs rapportent que la culture in vitro d'anthères induit un
dimorphisme pollinique chez les microspores (Horner et Street, 1978; Rashid 1983;
Sunderland et Huang, 1987). En milieu de culture artificiel, le cytoplasme, de quelques unes
des microspores qui ne dégénèrent pas, perd graduellement la capacité de se colorer au contact
de I'acétocarmin acétique (Sunderland et Huang, 1987). Le nombre de grains de pollen
variants formés à partir de microspores uninucléées pendant la culture in vitro des anthères est
plus élevé que celui naturellement présent dans les anthères de la plante (Horner et Street,
1978). Les jeunes grains de pollen dirnorphiques produits par la culture in vitra ont les mêmes
caractéristiques de coloration et les mêmes patrons initiaux de division que les variants
naturels. Cela suggère qu'il y ait une origine commune au dimorphisme pollinique observé in
vivo et in vitro (Sunderland et Huang, 1987). Il serait également possible que les microspores
adoptent un comportement complètement gamétophytique seulement à la fin de la mitose, car
elles peuvent être déviées de cette route par la culture in vitro effectuée avant ou au début de
la phase mitotique.
Des prétraitements, sous forme de stress de différentes natures, permettent de modifier
le développement normal des microspores. Par exemple, en soumettant des épis ou des
bourgeons floraux dont les microspores sont uninucléées à des prétïaitements particuliers, il
est possible d'augmenter de façon substantielle le nombre de microspores embryogéniques par
rapport à celui déjà présent naturellement dans les anthères matures (Dunwell, 1978). La
culnue in vitro joue donc un rôle critique dans l'expression du potentiel sporophytique.
Chez l'orge, le blé et le tabac, les microspores capables de générer des plantes
haploïdes sont en fréquence faible et leur taille est inférieure à celle des microspores
gamétophytiques (Rashid, 1983). La fréquence d'apparition de ce pollen dimorphique peut
être augmentée en altérant les conditions de croissance des plantes-mères. Chez le tabac, la
fréquence du pollen potentieIIernent embryogénique est faible chez les plantes-mères cultivées
à une température de 24°C. Les plantes-mères qui poussent il une température plus froide
(15°C) présentent une fréquence plus élevée de poiien préconditionné vers l'embryogen&se. Le
taux d'embryons f o n d s en culture d'anthères peut aussi être augmenté en prétraitant le
materiel végétal à une température de 10°C pendant dix jours. De ces phénomènes, Rashid (1983) tire la conclusion que la diffdrenciation du polIen embryogénique est un processus en
deux étapes d'abord initié sur la plante-mère, puis complété en culture in vitro. La
différenciation initiée sur la plante cause Ie dimorphisme pollinique et la différenciation qui se
fait en culture in vitro conduit à fa fonnation d'embryons.
Les variants produits en culture in vitro possèdent un potentiel de développement
embryogénique supérieur a celui des variants naturellement formés (Sunderland et Huang,
1987). Par exemple, l'avoine, une espèce peu apte à l'androgenèse, produit un taux élevé de
pollen dimorphique in vivo (Sunderland et Huang, 1987). L'orge, une espèce possédant
généralement une bonne aptitude à I'androgenèse, présente un taux de formation in vivo de
poiien dimorphique moins élevé (Sunderland, 1974).
Certains ne croient pas que la culture in vitro provoque la formation de structures
polliniques embryogéniques. On rapporte que ce potentiel est déjà déterminé à une étape
antérieure du processus de développement du pollen (Horner et Street, 1978). Le rôle de
l'excision et de la culture du pollen immature est de fournir un environnement permettant
l'expression de ce potentiel sporophytique prédéterminé. Les travaux à l'origine de cette
&marion ont été réalisés pendant ies premières années de l'androgenèse in vitro. Depuis, les
milieux et les conditions de culture in vitro ont beaucoup évolué; ils sont devenus beaucoup
plus performants ec surtout mieux adaptés aux espèces étudiées. La mise au point de
techniques d'androgenèse plus performantes peut donc expliquer la fonnation du pollen
dimorphique maintenant observée en culture in vitro d'anthères ou de microspores isolées.
Le dimorphisme pollinique est donc le phénomène qui, exploite en androgenèse in
vitro, permet de régénérer des embryons haploïdes puis des plantes haploïdes ou HD à partir
de simples grains de poilen immatures.
23.2. La stimulation de l'androgenèse par des prétraitements des anthères ou du matériel végétal
La réponse androgénique est un caractère héritable. Toutefois, la réponse des
genotypes peu aptes à I'androgenèse peut être stimulée en modifiant les conditions, physiques
et chimiques, de culture in vitro (Prakash et Giles, 1987). Des conditions de culture pius
appropriées aux besoins du matériel vég6tal utilisé favorisent la formation de microspores
multiceIluIaires (MPG). Particulièrement, plusieurs facteurs stimulent l'induction de
l'androgenèse en cultiire d'anthères. Par exemple, chez certaines espèces, une température de
pré-culture faible ou, pour d'autres espèces, une température de pré-culture éIevée peuvent
stimuler la division des microspores dans les anthères. La proportion entre certains éléments
du milieu de cuiture in vitro, de même que l'absence ou la présence d'une substance inhibitrice
affectent la réponse androgénique (de Fossard, 1974). Le milieu de culture artificiel possède
une composition définie lors de sa fabrication. Cependant, les anthères peuvent sécréter des
inhibiteurs ou des inducteurs d'androgenèse dans le milieu nutritif (de Fossard, 1974). La
composition exacte du milieu nutritif devient donc inconnue dès l'ajout du matériel végétal.
2.3.2.1. Les prétraitements au froid du matériel végétal
Les avis sont partagés quant à la nécessité de prétraiter le matériel végétal au froid
avant son passage in virro. Le prétraitement au froid peut, dans certains cas, stimuler, inhiber
ou n'avoir aucun effet sur l'androgenèse et la production de plantes vertes. Certains auteurs
jugent donc Ie prétraitement au froid du matériel végétal essentiel, tandis que d'autres le
croient facultatif ou nuisible. L'efficacité du froid varie énormément selon la durée du
traitement et Ia température à laquelle il est effectué. L'efficacité du traitement varie aussi
selon l'espèce, le génotype et la qualité des plantes-mères.
Les stress de température affectent la réplication de l'ADN des microspores. À des
températures froides, Ia synthèse de l'ADN est lente. Par contre, après le passage au froid, les
microspores se divisent rapidement de façon assez synchrone, ce qui favorise leur
développement sporophytique en culture in vitro (Xu et Sunderland, 1984).
La formation de plantes à partir de grains de pollen immatures nécessite une phase de
maturation pendant laquelle on induit des changements progressifs et régressifs chez la
microspore. Certains changements régressifs induisent la dégénérescence des grains de polien
immatures, mais un prétraitement au froid du matériel empêche ce phénomène (Duncan et
Heberle-Bors, 1976: Sunderland et Roberts, 1979). Le froid a pour effets d'augmenter la
perméabilité de la paroi pollinique, de retarder le développement pollinique (Sangwan et
Sangwan-Norreel, 1987b), et de permettre la survie d'une plus grande proportion de
microspores androgéniques (Sunderland et Roberts, 1979; Sangwan et Sangwan-Norreel,
1987b). Cette survie est différentielle, car les individus faibles et non viables sont tués au
cours du passage au froid et ils prennent une coloration brune (Foroughi-Wehr et Wenzel,
1993). Après le traitement au froid, les microspores viables sont plus vigoureuses, ce qui
augmente Ies possibilités qu'elles s'orientent vers l'embryogenèse (Forouglu-Wehr et Wenzel,
1993).
Le traitement au froid du matériel végétai retarde Ie vieillissement des parois des
anthères, la détérioration de l'anthère et particulièrement la dégradation de la matrice du
tapétum. Une plus grande proportion de microspores peut dévier du patron gamétophytique
vers le patron sporophytique (Sunderland et Roberts, 1979). Cependant, avant la mise en
culture des anthères, un prétraitement au froid de plusieurs semaines, appliqué sur des épis
excises, provoque une dégénérescence du tapétum suivie de la division des microspores. Une
dégénérescence prématurée du tapétum peut donc aussi être rdiée à l'initiation de la division
des microspores (Sunderland et al., 1984).
Le préuaitement au froid du matériel végétal diminue ou arrête la production et
l'accumulation d'amidon dans les microspores (Wilson et al., 1978; Foroughi-Wehr et
Wenzel, 1993). Une exposition au froid de deux à trois jours provoque aussi une réduction
drastique de l'activité métabolique des anthères, ce qui bloque Ie développement d'un plus
grand nombre de microspores à la première mitose haploïde. Lors de la culture des anthères,
ce retardement de la première mitose provoque une division atypique des microspores et
l'induction de l'embryogenèse haploïde (Vasil, 1980).
La température affecte grandement l'intégrité des microtubules, les organites
protéiques responsables de la migration des chromosomes vers les pôles de la cellule après la
formation de la plaque équatoriale (Dustin, 1978). Les microtubules ont une strucrure tubulaire
allongée et sont constitués d'un assemblage de sous-unités protéiques: la tubuline. La longueur
des microtubules varie rapidement par l'assemblage ou le désassemblage de la tubuhe. La température affecte le taux de liaison et de séparation de la tubuiine. Chez Lilium longiJ?on<m
et d'autres espèces, le froid provoque un désassemblage de la tubuline, ce qui empêche fa
migration n o d e des chromosomes vers les pôles de la cellule en division (Dustin, 1978).
En androgenèse in vitro, les prétraitements au froid ont un effet bénéfique sur certains
gknotypes, neutre ou nuisible sur d'autres génotypes (Marsolais et aL, 1984). Si Les
plantes-mères se développent en conditions de croissance optimales, l'effet promoteur du
prétraitement est minimisé et le prétraitement est inutile (Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993).
En culture d'anthères chez N. tabacum, le stade des microspores lors du traitement au froid et
la durée du prétraitement au fioid sont cmciaux (Sunderland et Roberts, 1979). Chez certains
cultivars de blé, le froid a un effet négatif sur l'androgenèse (Marsolais et al., 1984). Chez le
riz, le prétraitement au froid des anthères n'a aucun effet stimuiateur sur la formation des cals
(Satish et al., 1995). Chez l'orge, plus précisément avec les génotypes Uger, Cadette et Igri, le passage au froid d'épis excisés ne stimule pas I'androgenèse. Chacun des génotypes se
comporte de façon similaire, avec ou sans prétraitement au froid des anthères (Ouédraogo,
1995).
2.33.2. Les prétraitements au mannitol
Chez l'orge, un prétraitement des anthères au mannitol quelques jours avant leur mise
en culture peut stimuler I'androgenèse. ll existe une relation linéaire positive entre la
concentration en mannitol du milieu de prétraitement et le nombre de plantes vertes haploïdes
doublées régénérées en androgenèse in vitro (Cistué er al., 2994). Le prétraitement au mannitol
permet d'augmenter Ie ratio plantes vertes/plantes albinos. La durée optimale du prétraitement
au mannitol est influencée par le génotype des plantes-mères. Cistué (1994) rapporte que le
rneiileur prétraitement consiste à placer les anthères trois jours sur un milieu contenant une
concentration de 0,7 M de mannitol. Les milieux de prétraitement liquides et solides ont une
efficacité s idaire .
Chez l'orge, Roberts-Oehlschlager et Dunwell ( 1990) ont démontré qu'un
prétraitement du matériel végétal de 4 jours à 25°C sur un milieu contenant 32 g/L de mannitol
est supérieur à un prétraitement de 14 jours à 4°C sur le même milieu. Le mannitol affecte
I'absorption du sucre; une grande concentration de glucose s'accumule dans les tissus de
I'anthére pendant le prétraitement au mannitol (Roberts-Oehlschlager et Dunwell, 1990). En
androgen&e in vitro chez N. tabacum, un prétraitement de deux jours au mannitol (0'5 M) provoque un stress hydrique qui stimule la formation de plantes (Harada et Imamura, 1982).
Les effets stimulateurs du prétraitement au mannitol ont donc des origines différentes. En plus,
les effets du mannitol varient en fonction de l'espèce végétale utilisée, de la durée et de la
température auxquelles le prétraitement est rédisé, et de la concentration en mannitol dans le
milieu de prétraitement.
2323. Les préîraitements impliquant des doses variées de sucre
L'absence totale, ou à l'opposé des doses élevées, de certains sucres dans le milieu
d'incuction stimulent la division des microspores en culture d'anthères ou de microspores
isolées.
L'absence de sucre dans le milieu nutritif, pour une durée déterminée, stimule la
réplication de l'ADN et la division de la ceiIuIe végétative de la microspore, pendant ou après
la période de prétraitement. Après un transfert sur un milieu nutritif riche, des divisions de la
cellule végétative initient la formation d'un embryon (Zarsky et al., 1992). La préculture des
microspores isolées en absence de sucre permet donc de lever une barrière qui, in vivo,
empêche la réplication de l'ADN de la ceIIule végétative. Par exemple, en culture de
microspores isolées de N. tabacum, une préculture des microspores, pendant quatre à huit
jours, sur un milieu1 nutritif sans sucre stimule I'embryogenèse (Zarsky et al., 1992). De
même, un prétraitement des microspores isolées de N. tabacum avec un milieu de culture sans
sucre combiné à une température élevée (33 ou 37°C) stimule l'embryogenèse (Touraev et al.,
1996). Des microspores placées sur un milieu de culture sans sucrose pendant six jours à une
température de 25'C s'orientent aussi vers l'embryogenèse (Touraev et al., 1996). Chez le riz,
les microspores isolées, cultivées directement dans un milieu contenant du sucrose,
accumulent des grains d'amidon puis meurent un ou deux jours après leur isolation. Par
contre, la division des microspores de riz est stimulée quand elles sont préalablement
cultivées, pendant trois jours, dans un milieu exempt de sucrose (Ogawa et al., 1994).
D'un autre côté, chez Coix Eacryma, un traitement de dix minutes des anthères avec
une solution hypertonique de sucrose (0,8 M) stimule la production de cals et d'embryons.
Lorsque les anthères sont placées dans la solution hypertonique, on observe une plasmolyse
des cellules de la paroi de l'anthère de trois à cinq minutes après le début du traitement. On
observe une plasmolyse des microspores seulement cinq heures après le début du traitement.
Le traitement de dix minutes, à l'aide d'une solution contenant une forte dose de sucrose,
stimule donc l'androgenèse en provoquant des changements bénéfiques dans les tissus de
l'anthère (Wang et al., 1980). Les concentrations élevées de sucre provoquent aussi des
changement bénéfiques dans les microspores isolées de leur anthère. En effet, en culture de
microspores isolées d'orge, une augmentation de la dose de maltose, dans le milieu
d'extraction (0,250 M) et dans le milieu d'induction (0,325 M), double la production de
plantes vertes (Salmenkallio-MarttiIa et al., 1995).
23.2.4. Autres prétraitements des anthères ou du matériel végétal
Plusieurs rypes de prétraitements des anthères et du matériel végétai sont rapportés
dans la littérature concernant l'androgenèse in vitro. Par exemple, un prétraitement des
anthères au Ficoii 400 inhibe le développement des microspores et diminue le taux de division
des microspores et la production de plantes vertes par anthère (Cistué et al., 1994). En culture
d'anthères de N. tabacum, les conditions quasi-anaérobies, obtenues Iorsque les anthères sont
placées de 30 à 60 minutes dans un enviro~ement gazeux composé de 2,5 à 5% d'oxygène et
de 95 à 973% d'azote (IV2), stimule la production de plantes (Harada et Imamura, 1982).
Placer des anthères de N. tabacum en conditions de faible pression atmosphérique, pour des
durées variant entre dix et soixante minutes, stimule aussi la formation de plantes dors qu'un
traitement de vingt-quatre heures l'inhibe (Harada et Imamura, 1982). Chez le riz, une
dessiccation lente, réalisée en plaçant des tiges coupées dans de I'eau déionisée pendant vingt-
quatre heures, ou un stress thermique de 32°C appliqué avant l'excision des anthères, stimule
la formation des cals (Saùsh et a1.,1995). Une centrifugation, des microspores de Datura
innoxia ou des épis du riz, stimule la formation de cals en culture de microspores isolées
(Sangwan-Norreel, 1977). Des inhibiteurs de la synthèse de I'ARN, comme l'actinomycine D, et des inhibiteurs du métabolisme des hydrates de carbone et des glycoprotéines, comme le
2-désoxyglucose, permettent de stimuler la formation de cals chez le blé et le riz (Md& et
Sanjeev, 1992).
Il existe donc une diversité de prétraitement des anthères ou des microspores isolées
permettant de stimuler l'androgenèse in vitro. Cependant, il est encore difficile de dégager les
grandes tendances ou les mécanismes d'action des prétraitements. Dans la littérature, les
observations rapportées, suite à l'application des différents prétraitements. sont très variées et
elles sont souvent contradictoires. On constate que les effets des prétraiternents varient selon
l'espèce, le génotype et l'âge du matériel vkgétal utilisé, selon la composition du milieu de
prétraitement et du milieu de culture et selon les conditions de cdture in vitro.
23.3. Les milieux de culture in viao
Plusieurs facteurs influencent le taux de succès en androgenèse in vitro. La
composition des milieux a une importance toute particulière. Les premiers milieux de culture
in vitro, apparus dans les années soixante pour la production de plantes haploïdes de Damra
innoxia, étaient composés de Iait de noix de coco, de miel et de quelques éléments minéraux
(Picard et al. 1994). Cependant, la composition du lait de coco et du miel varie énormément
d'une source à l'autre. La répétabilité et le succès des expériences varient donc beaucoup.
Divers travaux de recherche ont permis de remplacer ces substances par des produits connus et
exactement dos& Chez Darura et Nicoriana, une simple solution de sucrose et de sels
minéraux est suffisante pour permettre le développement de plantes par androgenèse. Le
sucrose et le fer sont les plus importantes composantes du miIieu de culture et les sels
minéraux sont requis seulement à faible concentration (Vasil, 1980).
En 1990, Xu a réalisé une vaste revue de la littérature concernant la culture d'anthères
chez I'orge. II y mentionne qu'aucune étude systématique n'a été réalisée pour connaître les
effets des composantes du milieu de culture in vitro en androgenèse chez I'orge. Cependant,
plusieurs milieux nutritifs artificiels existent pour la culture d'anthères chez I'orge. Ils sont le
résultat de plusieurs améliorations apportées au milieu «MS» mis au point par Murashige et
Skoog en 1962 pour la culture de tissus chez k tabac. Plusieurs chercheurs ont modifié
successivement le milieu de Murashige et Skoog pour l'adapter à la culture in vitro d'anthères
et de microspores isolées chez I'orge. Linsmaier et Skoog (1965)' Clapham (1973), Foroughi- Wehr et al. (1976)' qui ont ajouté la glutamine au milieu et Kao (198 1)' qui introduit le milieu
à base de Ficoil. ont été les premiers à adapter le milieu pour I'androgenèse in vitro chez
I'orge. En 1987. Olsen améliore la réponse androgénique par une diminution du nitrate
d'ammonium et une augmentation de la glutamine dans le milieu MS modifié. En 1988,
Hunter obtient une amélioration très marquée de la production de plantes d'orge par la culture
in vitro d'anthères en remplaçant le sucrose par du maltose dans le milieu MS déjà modifié par
Olsen. Ce nouveau milieu est connu sous Ie nom &HG».
2.3.3.1. Les milieux solides
En androgenèse, l'état physique du milieu de culture in vimo est très important. II influence l'embryogenèse, la différenciation et la régénération des plantes vertes. Le premier
milieu de culture d'anthères, tel que décrit par Murashige et Skoog (1962). est un milieu de
type solide. Les agents de solidification les plus utilisés sont l'agar, I'agarose, I'agar noble et
le «Gelrite>) (GeUan Gum).
L'utilisation des miLieux solides présente plusieurs inconvénients. La solidification des
milieux ralentit le phénomène de diffusion, ce qui limite le mouvement des éléments nutritif
vers les anthères et les embryons. Les agents gélifiants se lient aux divers cations (~a2+, Mg2+, K+, ...) et à d'autres composantes du milieu numtif qu'ils immobilisent. Les embryons, qui se
développent dans. ou autour des anthères, restent étroitement groupés sur le milieu solide. 11 se
crée dors une compétition entre les embryons pour les éléments nutritifs du milieu et l'espace
(Johansson, 1986). En plus, I'agar, l'agent gélifiant le plus couramment utilisé, contient des
substances qui inhibent I'androgenèse (Sorvari, 1986a). Ces substances provoquent un
avortement prématuré des embryons en culture d'anthères chez Nicotiana tabacum.
L'utilisation de milieu solides entraîne aussi une accumulation et une concentration de
substances inhibitrices autour des anthères. Ces substances proviennent du tissu végétai en
dégénérescence sur le milieu (Johansson, 1986).
Certains effets inhibiteurs rencontds lors de l'utilisation des milieux solides peuvent
être e?iminés ou réduits par Ia présence de charbon activé dans le milieu d'induction. Plusieurs
laboratoires de culture de tissus végétaux utilisent couramment le charbon activé (Ébert er aL,1993). Le charbon activé adsorbe plusieurs composés des milieux de culture in vitro. Il adsorbe le 6-benzyiaminopu~e (BAP) et l'acide 2'4-dichlorophénoxyacétique (2.4-D) et en
diminue la concentration dans le milieu de culture (Ébert et al., 1993). En culture d'anthères
d'Anemona canadensis L., le charbon activé adsorbe I'ABA présent dans les anthères. Le rôle
du charbon dans ce cas est semblable B celui d'un traitement au froid du matériel vegétal,
puisqu'ïl réduit Ie contenu en ABA des tissus de 70 pour-cent (Johansson et al., 1982). Le charbon activé adsorbe aussi les composés phénoliques produits par les tissus de l'anthère, les
microspores, les embryoïdes ou les cals en dégénérescence. Cependant, le charbon activé
n'adsorbe pas certaines substances, qui &mises par les tissus en culture, sont favorabks à
I'androgenèse (Johansson, 1986).
Le positionnement des anthères
Le positionnement des anthères en surface des milieux de culture solides peut affecter
I'androgenèse. Shannon et al. (1985) suggèrent que l'orientation des anthères en surface du
milieu solide est importante chez les espèces possédant de petites anthères comme les céréales.
Chez les céréales, le film de liquide formé autour des antheres par la tension de surface est très
volumineux en comparaison avec la taille des anthères. Les anthères posées a plat, c'est-à-dire
les anthères dont les deux lobes sont en contact direct avec le milieu, absorbent beaucoup de
liquide et deviennent translucides. Le pollen immature est relâché dans le F i de liquide
entourant les anthères et son développement en MPG est lent. Les anthères placées de façon à
ce que leurs deux lobes soient en contact avec le milieu de culture répondent très faiblement en
androgenèse in vitro (Hunter, 1985). Il n'y a pas ou peu de production de cals lorsque les deux
lobes des anthères d'orge, prétraitées à 4°C pendant 28 jours, sont en contact avec le rnilieu de
culture soIide (Shannon et al-, 1985). Lorsque Ies anthères sont posées sur le côté, c'est à dire
de façon à ce qu'un seul de leurs deux lobes soit en contact avec le milieu, les microspores
situées dans le lobe inférieur se développent de façon similaire à celles des anthères dont les
deux lobes sont en contact avec le milieu solide. Cependant, les microspores situées dans le
lobe supérieur de I'anthère forment des cals (Shannon et al., 1985) et des embryoïdes (Hunter,
1985). Donc, en culture in vitro d'anthères de céréales sur des milieux de type solide, le
positionnement de l'anthére est important, car il influence la réponse androgénique.
23.3.2. Les milieux liquides
Pour éviter les effets négatifs des d e u x solides, plusieurs chercheurs se sont tournés
vers des milieux de type liquide comme ceux utilisés en culture de cellules. Les milieux
liquides sont plus efficaces que les milieux soiidif~és à I'agar pour la formation de cals en
cuiture d'anthères chez l'orge (Sorvari, 1986a). Par contre, ies embryons produits en milieux
d'induction liquides ont une aptitude à la régénération plus faible et ils forment plus de plantes
albinos que ceux produits sur des milieux solidifiés à I'agar (Zhou et al., 199 1).
Le faible taux de régénération obtenu avec les d e u x liquides provient des conditions
anaérobies auxquelles les embryons sont soumis en se développant sous la surface du milieu
(Zhou et al.. 199 1). Les milieux de culture liquides génèrent un taux élevé de cals ou de MPG.
Cependant, une grande partie de cais ou des MPG produits cesse de se développer puis meurt.
Les causes principales de la mort de ces structures sont aussi les conditions anaérobies dans
lesquelles les cals et les MPG se retrouvent après leur noyade dans Ie milieu liquide (Xu,
1990). En conditions anairobies, les cellules des cals produisent du lactate et des alcools
déhydrogénases. L'accumulation d'acide lactique et d'autres acides organiques dans les
cellules peut endommager les organites et conduire à la formation de plantes albinos (Kao et
al., 1991). Le faible taux de différenciation et la noyade des embryons limitent donc
l'utilisation des milieux liquides en culture d'anthères (Kao, 198 1).
D'un autre côté, les conditions anaérobies provoquées en milieu liquide ne nuisent pas
à la régénération des plantes d'orge vertes (Zhou et al., 1991). L'effet d'un manque
d'oxygène, s'il est prdsent, est compensé par d'autres qualités du milieu liquide. Par exemple,
les milieux liquides offrent une plus grande accessibilité aux éléments nutritifs par rapport aux
milieux solides (Johansson, 1986; Zhou et aL, 1991).
L'utilisation d'un milieu de culture ih vitro liquide nécessite un ajustement du nombre
d'anthères par unité de volume (Johansson, 1986). En effet, si le nombre d'anthères par unité
de volume de miiieu utilisé dans les cuvettes de culture est trop élevé, il y a une inhibition de
l'androgenèse suite à l'épuisement des éléments nutritifs et à l'accumulation de substances
inhibitrices dans le milieu. Si le nombre d'anthères par rapport au volume de milieu utilisé est
trop faible, il y a inhibition de I'androgenèse par diiution, dans un trop grand volume, des
substances conditionnates produites par les tissus vivants en culture.
Les milieux liquides, tout comme les milieux solides, présentent donc une série
d'avantages et d'inconvénients en androgenèse in vitro. Dans la Iittérature, les opinions sont
donc très variées et peuvent être influencées par plusieurs facteurs dont l'espèce végétale.
2333. Les milieux semi-liquides
En 1981, Kao introduit un nouveau type de milieu pour la culture des anthères d'orge.
Au miiieu d'induction liquide, il ajoute du Ficoll, un polymère neutre. Cet ingrédient
augmente la pression osmotique et la densité du milieu, le rendant plus visqueux. Cela
empêche la noyade des anthères, des microspores, des embryons ou des cals. Les structures ne
sombrent plus sous la surface du milieu, ce qui permet un meilleur échange gazeux entre les
cellules en division active et leur environnement. En culture d'anthères de blé, l'addition de
200gL de Ficoli au milieu d'induction augmente la densité du milieu, le pourcentage de cais
flottants et le ratio plantes verteslplanrcs albinos. Toutefois, la présence du FicoU diminue de
façon significative la production de cals et le nombre total de plantes vertes régénérées. En
plus, l'addition de Ficoll au milieu de cuIture augmente significativement le coût de
fabrication des milieux, ce qui rend l'utilisation de ce produit peu souhaitable (Zhou et al..
1992).
Les avis sont donc partagés quant à I'eficacité du Ficoll comme support physique dans
les milieux d'androgenèse in vitro. La technique utilisée pour la stérilisation du FicoIl en
solution pourrait être en partie responsable de ces observations contradictoires, mais cela est
difficile affirmer. Dans la plupart des cas, les auteurs ne précisent pas la technique utilisée
pour st6riliser les solutions de Ficoli. Les compagnies qui commercialIsent ce produit précisent
de ne pas autoclaver le Ficoli. Les effets bénéfiques du Ficoll peuvent être perdus lorsque ce
polymère est stériiisé à I'autodave. La chaleur affecte la stabilité de la molécule et des sous-
produits nuisibles à I'androgenèse peuvent être génkrés. La stérilisation du FicoU par filtration
n'affecte pas Ia molécule et n'entraîne pas la formation de sous-produits nuisibles. Donc, la
méthode utilisée pour stériliser les milieux contenant du Ficoll influence directement
l'efficacité du milieu d'induction en androgenèse in vitro.
La composition des milieux de culture semi-liquides et les génotypes de céréales
utilisés peuvent aussi expliquer en partie la réussite ou l'échec en androgenèse in vitro.
Récemment, Luckett et Smithard (1995) ont comparé cinq méthodes et milieux de culture
couramment utilisés en culture d'anthères d'orge. Ils ont observé une interaction entre les
milieux et les génotypes des anthères mises en culture. Cela implique que différentes
techniques et différents types de milieux de culture sont nécessaires à la réalisation de
l'androgenèse in vitro avec diffdrents génotypes d'une même espèce.
233.4. Les milieux solidiflés à l'amidon
L'agar peut être totalement remplacé par I'amidon d'orge et de blé dans tes milieux
d'induction et de régénération solides en culture d'anthères chez l'orge (Sorvari, 1986a).
L'amidon est naturellement l'un des composés numtifs majeurs de l'endosperme du grain. Il constitue de 60 à 70 pour-cent de son poids sec. L'amidon, utilisé comme agent solidifiant.
procure au milieu la simplicité et la facilité de manipulation de l'agir, et ce sans ses effets
inhibiteurs.
L'utilisation d'amidon d'orge ou de blé dans les milieux de culture in vitro augmente
le nombre d'embryons, de cals, de plantes vertes produits par anthère, ainsi que le ratio plantes
vertedplantes albinos par rapport aux milieux solidifiés à l'agar. L'amidon d'orge est souvent
plus performant que l'amidon de blé. Un des effets les plus remarquables de I'utilisation de
l'amidon chez I'orge concerne la qualité morphogénétique des embryons. En effet, ceux-ci ont
une structure globulaire dense et, s'ils ne sont pas dormants. ils ont la capacité de se
différencier et de se régénérer en une plante, même si leur diamètre ne dépasse pas un
millimètre (Sorvari, 1986a).
Les milieux soiidifiés à l'amidon sont fermes en début de culture, mais ils ramollissent
progressivement sous l'effet de l'activité enzymatique des tissus vivants posés sur leur surface.
Sous l'effet des amylases, l'amidon est dégradé en hydrates de carbones et du maltose est
produit. L'hydrolyse de I'amidon se visualise sous la forme d'un halo plus clair apparaissant
autour des anthères (Kuhlmann et Foroughi-Wehr, 1989). Cette hydrolyse provoque une liquéfaction du milieu d'induction localisée d'abord sous et autour des anthères. Pour éviter la
noyade des cultures, Sorvari (1986a) place des filets de polyester en surface du milieu et
Kuhlmann et Foroughi-Wehr (1989) augmentent la dose d'amidon.
En androgenèse chez l'orge, le milieu N6 solidifié à l'amidon possedant une forte
concentration en sucrase (120-140 g L ) stimule l'embryogenèse directe. Ce même miheu en
absence de sucrose stimule l'embryogenèse indirecte, c'est-à-dire la formation de cals
possédant une bonne aptitude à la régénération. D'un autre côté, une faible concentration de
sucrose (20-40 g/L) inhibe l'androgenèse. Lorsque le mélibiose (120 g/L), un sucre inerte
utilisé pour maintenir le potentiel osmotique du milieu, remplace le sucrose, i l y a une
stimulation importante de Ia formation de cals, d'embryons et de plantes vertes. Le maintien
d'une pression osmotique élevée dans le milieu solidifié à l'amidon est donc nécessaire à la
différenciation et à la régénération de plantes vertes, contrairement au sucrose qui est facultatif
(Sorvari et Schierder, 1987).
Sorvari (1986b) a démontré que le milieu à base d'amidon est supérieur en
androgenèse aux milieux soiidifiés à l'agar. D'un autre côté, Kuhlmann et Foroughi-Wehr
(1989) ont démontré que le milieu semi-liquide à base de Ficoll est plus efficace que le milieu
à base d'amidon de Sorvarï (1986a) en culture d'anthères chez l'orge. Cependant, les mêmes
nombres d'embryons ou de cals sont obtenus avec les deux types de milieux. Dans les deux
cas, on observe, chez les plantes vertes régénérées, un taux de doublement spontané des
chromosomes de 80 pour-cent. Les embryons produits sur les milieux à base d'amidon
possèdent cependant une plus faible capacité de différenciation. Toutefois, il est important de
noter que les milieux comparés par Kuhlmann et Foroughi-Wehr (1989) different aussi entre
eux quant à leur composition en sels minéraux, en sucres et en vitamines. Des facteurs autres
que la solidification du milieu à l'aide d'amidon peuvent donc être responsables de la plus
faibIe capacité de diff'éîenciation des embryons en plantes.
23.35. Le potentiel osmotique des milieux de culture in vitro
Le potentiel osmotique des milieux d'induction et de régknération influence le taux de
réussite en androgeaèse in virro. Dès les premières étapes de la culture des anthères, le
potentiel osmotique du milieu conditionne le succès de l'induction.
Sur un milieu de culture in virro, la déhiscence des anthères est plus explosive que la
déhiscence qui a lieu naturellement sur la plante lorsque le pollen est mature. In vitro, la
pression hydrostatique augmente rapidement dans les anthères à cause de l'absorption des
composantes du f i e u de culture, de leur accumulation dans les locules de l'anthère et du
gonfiement des microspores. Cette pression fait éclater les anthères là où les tissus sont les
moins résistants, c'est-à-dire le long des lignes de déhiscence naturelles. Après l'éclatement
des anthères, le pollen immature est relâché directement dans le milieu nutritif (Sunderland et
De fortes doses de sucre sont souvent nécessaires dans les milieux de culture
d'anthères pour stimuler l'aadrogenèse. Un niveau élevt5 de sucrose confêre un potentiel
osmotique relativement élevé au milieu de culture. Un potentiel osmotique élevé empêche la
lyse des microspores pendant leur division et, par la suite, leur germination précoce pendant
les premiers stades de I'embryogenhe (Collins et Genovesi, 1982).
En culture de microspores isolées chez l'orge, l'utilisation d'un milieu de prétraitement
ayant une pression osmotique encore plus élevée que celle du milieu d'induction stimule la
réponse des microspores et la formation de plantes vertes. Le mannitol est l'agent osmotique
utilisé et les pressions osmotiques optimum sont de 1,04 MPa (440 mOsms kg-[) pour le
milieu de prémitement et de 0,83 MPa (350 mOsm kg-1) pour le milieu d'induction (Hoekstra
et al., 1993).
II est donc nécessaire de maintenir une pression osmotique relativement élevée dans les
milieux de culture in vin-o. Le produit utilisé pour augmenter la pression osmotique du milieu
infiuence aussi grandement le taux de succès en androgenèse in vino.
2.3.4. La variation gamétoclonale
La recombinaison interchromosomique et intrachromosomique, qui apparaît à la
méiose au cours de la formation des gamètes parentaux, est la principale source de diversité
génétiqire pour le sélectionneur. La cuiture in vitro peut aussi être une source de biodiversitk
pour le sélectionneur. De façon générale, les variations produites en culture de cellules se
nomment «variations somaclonales», et les variations produites en culture de cellules de tissus
gamétiques se nomment «variations gamétoclonales» (Evans et al., 1984). Dans le cas de
I'hapIodiploïdisation androgénique, les variations induites in virro sont de type
gamétoclondes. Les plantes issues de l'haplodiploïdisation ont fait l'objet d'études
cytogénétiques et d'études au niveau moléculaire, car I'androgenèse directe ou indirecte
correspond à une déviation du développement normal de la microspore. Cette modification du
développement engendre différents problèmes morphogénétiques (Sangwan et Sangwan-
NorreeI, 1987%). En cuIture in vitro d'anthères chez l'orge, les plantes régénérées sont un
milange de plantes haploïdes, haploïdes doublées, haploïdes possédant des secteurs diploïdes,
aneuploïdes ou tétraploïdes. Ces variations du génome de la plante peuvent se manifester
phénotypiquement par une pigmentation anormale (albinisme) ou par des variations des
caractéristiques morphologiques. Les plantes régénérées peuvent aussi présenter une réduction
de la fertilité ou une altération de la transmission des caractères génétiques (Evans et al.,
1984).
Les variations gamétoclonales peuvent provenir de changements dans le nombre et la
structure des chromosomes (Evans er al., 1984). Il peut y avoir, dans le génome des plantes
aberrantes, des inversions, des délétions d'une copie d'un gène, une duplication d'un gène ou
des crossing-over méiotiques. Des mutations nuclkaires peuvent dgalemeat affecter les gènes.
Il peut aussi y avoir des changements au niveau de l'ADN cytoplasmique suite des mutations
ou à un tri des organites (Evans et aL, 1984). La stimulation d'un élément transposable dans le
génome de la plante-mère peut aussi causer une variabilité gamétoclonale (Evans et al., 1984).
Chez les plantes issues de I'androgenèse, la variabilité gamétoclonale est
principalement causée par des variations nucléaires et cytoplasmiques déjà présentes dans les
microspores (Chaleff, 1983; Sangwan et Sangwan-Norreel, 1987b). Elle est aussi induite le
patron d'androgenèse suivi, l'andrognèse directe ou I'androgenèse indirecte (Sangwan et
Sangwan-Norreel, 1987b).
Les mutations garn6tocIonales dominantes ou récessives sont exprimées directement
chez les plantes haploïdes, car une seule copie de chacun des gènes est présente (Evans et al.,
1984). Les mutations gamétoclonales dominantes ou récessives sont aussi exprimées
directement chez les plantes haploïdes doublées, car deux copies identiques de chaque gène
sont présentes. Les mutations récessives sont donc plus facilement observables chez les
plantes haploïdes ou haploïdes doublées que chez les plantes diploïdes hétérozygotes.
Cependant, l'altération du phénotypique, observée chez les plantes issues de
I'androgenèse in vitro, n'est pas seulement le fruit d'événements génétiques, comme des
changements nucléotidiques ou des changements dans la structure et dans le nombre des
chromosomes; l'altération du phdnotype peut aussi être d'origine physiologique. Dans ce cas,
la variabilité phénotypique observée est m e réponse physiologique des cellules à un
environnement de développement anormai et à des changements épigénetiques qui affectent le
degré d'expression des gènes. Seuls les variations phhotypiques provoquées par une
altération du génrime (variations garnétoclonales) sont héréditaires et transmissiblent A la
descendance.
En androgenèse, le prolongement du passage in vitro peut augmenter la variabilité
gamétoclonale et le taux de doublement spontané de la garniture chromosomique des plante:
regénérées. La fréquence d'apparition des individus aberrants augmente avec la duree dc
passage in vitro des cals (Chaleff, 1983; Evans et al., 1984). Par contre, plus I'étape de
croissance et de développement in vitro est longue, plus il y a de possibilités qu'uc
doublement spontané des chromosomes survienne dans les cellules en division (Thompson ei
ai., 1991). Un dilemme existe donc: toute prolongation de la durée du passage in vitro es1
indésirable car elle augmente l'apparition de la variation gamétoclonale, mais une
prolongation du passage in vitro est souhaitable quand elle stimule la formation spontanée de
plantes haploïdes doublées. L'obtention directe de plantes haploïdes doublées permet d'évite1
l'étape de diploïdisation artificielle, ce qui représente un gain de temps et une diminution de Ia
perte de matériel végétai plus ou moins importants selon la technique de doublement et I'agenr
chimique utilisés.
Les plantes haploïdes sont typiquement stériles. Dans ces plantes, la méiose ne se
déroule pas normalement, car les chromosomes ne trouvent pas de partenaires avec qui
s'apparier (Suzuki et al., 1991). La colchicine est l'agent chimique le plus couramment utilisé
pour doubler la garniture chromosomique des régénérants haploïdes et en restaurer la fertilité.
La coIchcine est un composé alcaloïde qui bloque la division cellulaire à la métaphase. Ce
blocage est provoqué par l'action destructrice spécifique de la colchicine sur Ie fuseau
mitotique. La colchicine bloque aussi la formation des microtubules en se liant à la tubuline.
Cela entraine un arrêt de l'activité du fuseau, sans toutefois endommager le cyde cellulaire. La
colchicine n'a aucun effet sur la réplication de l'ADN ou sur la division des chromosomes, et
son action est rdversible si les cellules sont traitées avec une faible concentration de colchicine
et si le traitement n'est pas trop prolongé. La colchicine inhibe donc Ia formation du fuseau
mitotique et provoque la formation de cellules possédant deux garnitures chromosomiques.
Ces cellules se multiplient ensuite pour former un secteur de tissu diploïde (Dustin, 1978).
Cependant, la colchicine peut, à l'occasion, induire des mutations génétiques. Les variations
observées chez les plantes ETD, obtenues suite au traitement & la colchicine de plantes
haploïdes, peuvent être induites en partie par la colchicine (Evans et al., 1984).
Les plantes régénérées par l'androgenèse peuvent donc présenter, en plus de la
diversité d'origine mendélienne, des variations gamétoclonales phènotypiques, physiologiques
et génétiques qui peuvent être utiles d'un point de vue agronomique si eues sont intégrées à un
programme d'am6Iioration (Chaleff, 1983). Les variations somaclonales et gamétoclonales
peuvent être exploitées comme une source potentielle de nouveaux génotypes (Evans et al.,
1984). Cependant, la variabilité générée est en général jugée indésirable, car elle engendre une
instabilité génétique chez Ia descendance (De Paepe, 1985). La variabilité gamétoclonde
devient totalement indésirable quand elle affecte le nombre de chromosomes, car des
anomalies d'appariement à la méiose provoquent la stérilité de la plante (Suzuki et al., 1991).
Les variants peuvent aussi présenter des anomalies liées au déséquilibre génique et se
caractérisent par des rapports anormaux de ségrégation pour les gènes du chromosome mai représenté (Suzuki et ai., 1991).
L'objectif initial de I'androgenèse in vitro est de redonner un comportement
sporophytique à des cellules gamétophytiques, tout en conservant leur caractère haploïde.
L'objectif suivant est de stimuler ces celIules à se diviser pour former un cal ou un embryon
capable de se différencier en une plante verte haploïde. L'objectif fuial est d'obtenir des plants
haploïdes doublées homozygotes, viables, stables et fertiles, afin de les intégrer directement
dans les programmes d'amélioration ou d'étude des végétaux. La diversité mendélienne
engendrée par la méiose chez les plantes hybrides demeure donc, en ce qui concerne les
programmes d'amélioration des céréales, le type de diversité génétique le plus exploité.
L'amélioration des techniques d'haplodiploïdisation pour limiter l'apparition de la variation
somaclonaie et garnétoclonale est donc souhaitable dans le cas de la production de lignées HD.
23.5. L'albinisme
Contrairement à la gynogentse où les plantes albinos apparaissent seulement
occasionnellement, I'androgenèse produit un taux élevé de régénérants aibinos (Foroughi-
Wehr et Wenzel, 1993). Les plantes d'orges albinos sont inutiles et difficiles à étudier car elles
demeurent dans un état végétatif et ne survivent qu'une courte période en culture in vitro
(Dunford et Walden 1991). Différentes formes d'albinisme ont été observées chez I'orge
(Clapham, 1973). Certaines des plantes présentent une coloration variant du blanc au vert pâle
et au jaune. D'autres plantes présentent des rayures longitudinales blanches ou jaunes sur les
feuilles.
Plusieurs facteurs influencent l'apparition de plantes déficientes en chlorophylle. Chez
l'orge, le génotype de la plantemère influence la fréquence d'apparition des plantes dbinos
(Foroughi-Wehr et ai., 1982). Également, les conditions de culture in vitro (Kasha er al., 1990;
Pickering et Devaux 1992; Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993)' l'état physiologique des plantes-
mères (Kasha et al., 1990; Pickering et Devaux 1992) et le stade des microspores (Kasha et al.,
1990; Pickering et Devaux 1992; Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993) influencent le taux
d'albinisme en androgenèse. Le taux d'albinisme est aussi affecté par la composition du milieu
de culture in vitro de régénération (Dunford et Walden, 199 l), et par les prétraitements que les
anthères reçoivent avant leur culture.
L'albinisme observé en culture d'antheres est d'origine genktique et implique
principalement I'ADN de certains organites cellulaires: les plastes. L'ADN double-brin des
plastes, les structures à l'origine des chloroplastes, est circulaire. Cet ADN circulaire se divise
en trois rggions comprenant une petite région simple copie (short singie copy: SSC) et une
Iongue région simple copie (Long single copy: LSC) séparées par deux régions identiques
mais inversées (inversed repeats: IR) (Eilis et Day, 1986). Le génome des plastes des pIantes
d'orge et de blé albinos est aitéré. Des délétions ou des réarrangements de Leur ADN circulaire
sont à l'origine de différentes altérations @ay et Ellis, 1984 et 1985; Ellis et Day, 1986). Chez
des orges aibinos, on observe que l'ADN des plastes n'est plus circulaire; il a la forme d'une
épingle h cheveux (ElIis et Day, 1986). On a égaiement observé des délétions dans ['ADN
chloroplastique de cals d'orge provenant de Ia culture d'anthères (Day et Eus , 1984). Les
plastes des plantes albinos obtenues par embryogenèse directe contiennent des populations
mixtes d'ADN modifiés, qui dans la majorité des cas présentent une déIétion de la partie LSC
du génome (Dunford et Wdden, 1991). On a observé que les patrons des fragments de
restriction, obtenus par une andyse Southem de l'ADN total de plantes albinos, sont différents
de ceux obtenus par une analyse de l'ADN total de plantes chlorophyiiiennes. Les orges
albinos présentent des délétions complètes ou partielles de fragments de restriction spécifiques
à l'ADN des plastes. Il existe aussi des différences entre les patrons des fragments de
restriction observés chez les plants d'orge albinos produits par embryogenèse directe et celles
régénérées à partir de cals. Les fragments de restriction utilisés pour cartographier les régions
du génome des plastes contenant Les deux IR et la SSC sont absents chez les plantes albinos
dérivées de cals, mais présents chez celles obtenues par embryogenèse directe (Dunford et
Wdden, 199 1).
L'albinisme n'est pas toujours provoqué par une altération au niveau de l'ADN des
plastes. Les rayures longitudinales bIanches ou jaunes observables chez certaines plantes
régénérées en androgenèse in vitro sont une forme d'albinisme trop fréquente pour être
attribuable à une mutation des cellules. m e s sont induites par les conditions de culture in virro
(Clapham, 1973). Egalernent, les plants d'orges albinos présentent une détérioration des
structures mernbranaires, ainsi que différents blocages dans le développement des plastes
(Foroughi-Wehr et Wenzel, 1993). L'ADN des plastes est moins abondant chez les plantes
dbinos que chez les pIantes chlorophyliiennes (Dunford et Walden 199 1). Des observations au microscope 4Iectronique ont révélé la présence de proplastes dans les cellules foliaires des
plantes albinos. Cependant, un manque de ribosomes a empêché les proplastes de se
développer en chloroplastes normaux (Sun et al., 1979).
Parmi les nombreuses tentatives réalisees pour limiter le développement des plants
d'orge albinos en androgenèse in vitro, les travaux de Clapham (1973), bien que réalisés il y a
déjà 25 ans, demeurent très instructifs. Ii a été observé qu'une exposition des anthères à la
lumière des fluorescents pendant la phase d'induction ou une exposition des cals à la lumière
solaire pendant Ia phase de régénération ne diminue pas le taux d'albinisme en culture
d'anthères chez l'orge. L'ajout de substances connues pour leur effet stimulateur sur la
synthèse de la chlorophylle, comme les cytokinines (kinétine ou 6-benzylaminopurine), la
glycine, le succinate, l'alanine, le lait de noix de coco, les sources d'acides aminés (caséine
hydroIysée ou extraits de levure), la leucine, l'acide aspartique et les auxines (NAA, AIA ou
2,4-D) dans le milieu nutritif ne diminuent également pas le taux de formation des plantes
dbinos. Une augmentation de la teneur en fer, en magnésium ou en cuivre du milieu nutritif
est inefficace contre la régénération de plantes déficientes en chlorophylle. Depuis les travaux
de Clapham, les techniques et les milieux de cuiture ont énormément évolués, mais l'albinisme
demeure un problème très présent. Si on reprenait les travaux de Clapham (1973) à l'aide de
nos connaissances actuelles de l'androgenèse in vitro chez l'orge, peut-être obtiendrait-on
d'autres résultats plus satisfaisants.
Les plantes régénérées par les techniques de culture in vitro sont donc un mélange de
plantes haplo'ides, haploïdes doublées ou chimériques. Elles sont chlorophylliennes ou albinos.
Une meilleure connaissance des phénomènes à l'origine de telles plantes doit être acquise afin de comprendre et de contrôler leur apparition, car les plantes albinos ou chimériques sont
nuisibles en production de lignées HD.
2.4. L'hypothèse de recherche
Plusieurs facteurs influencent l'androgenèse in vitro en culture d'anthères. Panni ces
facteurs, la composition du milieu d'induction ainsi que le génotype des plantesmère sont
déterminants. Cependant, il est ficile de caractériser précisément les besoins de chacun des
génotypes utilisés. En 1988, Hunter rapporte la mise au point du milieu nommé &HG semi- liquide, pouvant répondre aux besoins nutritifs d'un grand nombre de génotypes d'orge. Nous
avons apporté queIques modifications à ce milieu et on s'y réfère sous le nom dTIGL» (tableau 3.1 et annexe D) .
Nous postulons qu'il est possible d'amdliorer davantage les résultats offerts par le
&eu FHGL, en modifiant la concentration de certains groupes d'ingrédients pendant les
premiers jours de la période d'induction avant de les ramener à la concentration décrite pour le
milieu FHGL semi-liquide d'induction (tableau 3.1).
Des mvaux préliminaires à ce mémoire ont permis d'obtenir de façon fortuite un granc
nombre d'embryons en culture d'anthères d'orges de printemps. Au cours d'une manipulation
des anthères d'orges de printemps provenant d'hybrides Fi, dont les parents sont inconnus, on1
été placées sur des d e u x d'induction FHGL semi-liquide à demi séchés. Une certaine partit
de leur contenu en eau s'était évaporée pendant un entreposage de quelques mois dans un tiroii
à la température de la pièce. Les cuvettes de culture étaient scellées avec du ~arafilrn@ <<Mx (American National CanTM, Greenwhich). il a été observé que le milieu séché avait la viscosit€
du sirop de mais. Quatre jours après la mise en culrure des anthères, 1 ml de milieu FHGL liquide a ét4 rajouté dans les cuvettes de culture, car le milieu d'induction avait séché
davantage Lorsque placé dans l'incubateur ii 25°C. La mise en culmre des anthères sur les
d i e u x à haute viscosité, puis l'ajout inhabituel de d i e u liquide au milieu d'induction séché
pour le ramener à une consistance plus acceptable, ont stimulé l'induction d'un nombre plus
élevé d'embryons que le milieu d'induction FHGL semi-liquide normal. Cependant, les
embryons générés n'ont pas pu être récupérés, car l'ajout du milieu FHGL liquide a trop
diminué la viscosité du milieu dans la cuvette de culture et les embryons se sont noyés.
Pour reproduire le phénomène d'évaporation de façon controlée, des cuvettes de
culture contenant du milieu FHGL semi-liquide ont été placées ouvertes dans la hotte à flux
laminaire horizontal pendant différentes périodes de temps. Des anthères des cultivars d'orge
Cadette, Coms, Acca, Shannon, Sterling, Kitchen, Abee et BQCB-IO, cultivés dans une serre
tunnel, ont été déposées à la surface des nouveaux mifieux séchés. Après quatre jours
d'incubation à 2S°C, le rajustement inhabituel de la viscosité du milieu de culture a été répété-
Contrairement à nos attentes, il n'y pas eu d'embryogenèse pour l'ensemble des cultivars
testés.
Quand l'eau s'évapore du milieu d'induction FHGL semi-liquide, tous les ingrédients
du milieu sont concentrés dans un plus petit volume. A partir de ce principe, il a été estimé,
suite aux essais de séchage contrôlé, qu'environ la moitié du contenu en eau du miiieu
d'induction semi-liquide s'était évaporée lors de l'entreposage prolongé. Par conséquent, tous
les ingrédients du milieu d'induction ont été concentrés dans la moitié du volume de liquide
initial. D'autres essais ont été réalisés en doublant la concentration des groupes d'ingrédients
principaux du milieu d'induction: le maltose, les sels et I'ensemble de tous les ingrédients. À
cause de problèmes de stkriiisation par filtration du milieu de culture, la dose de FicoU 400 n'a
pu être augmentde. La concentration des groupes d'ingrédients du milieu d'induction a donc
été doublée à l'exception de celle du FicoU 400, qui est demeuré à 200 g/L. Des anthères
d'orge ont été placées pendant quatre jours dans 1'5 ml d'un milieu FHGL semi-liquide don
tous les ingrédients, le maltose ou les sels ont été doublés. Suite à cette période dc
prétraitement des anthères, 1,s ml de milieu FHGL semi-liquide modifié pour que 1;
concentration en sels, en maltose ou en tous les ingrédients soit ramenée à la concentratiol
décrite dans la recette du milieu FHGL semi-liquide (tableau 3. 1)' ont été rajoutés dans le:
cuvettes correspondantes. Le volume final dans les boîtes après le rajustement de 1;
concentration était de 3 ml.
Ces essais préliminaires (données non présentées) ont donc permis d'observer que lei
variations de la concentration en maltose, en sek et en tous les éléments du milieu d'inductioi
FHGL semi-liquide influencent la production de plantes vertes et de plantes albinos en cultun
d'anthères chez l'orge. il a aussi été observé qu'en doublant la concentration de tous lei
éléments du milieu d'induction FHGL semi-liquide pendant les quatre premiers jours dr
l'induction, le nombre de plantes vertes régénérées augmente par rapport A un témoin FHGI semi-liquide. il a en plus été observé qu'en doublmt seulement la concentration des sels (le:
rnacrosels et les rnicrosels), il y a augmentation du nombre de plantes vertes régénérées. Il 2
égaiement été observé qu'en doublant la dose de maltose on obtient plus de plantes vertes et de
plantes albinos qu'avec le traitement témoin. En raison de différents problèmes de
manipulation et de contamination des milieux d'induction au cours de ces essais, aucune
analyse statistique n'a pu être réalisée sur les données recueillies.
Le but de cette recherche est donc de démontrer que Ies microspores d'orge en culture
d'anthères in vitro sont très sensibles à la concentration de diverses composantes du milieu
d'induction FHGL semi-liquide pendant les premiers jours de l'induction. Ces travaux oni
aussi pour objectif de démontrer qu'il est possible de stimuler l'androgenèse en culture in vina
d'anthères chez l'orge par des prétraitements des anthères avec un milieu FHGL serni-liquide
dont Ia concentration en certains groupes d'ingrédients est modifiie.
L'hypothèse de recherche suivante a donc Cté émise:
«Les microspores d'orge en culture d'anthères in vitro sont îrès sensibles à la concentration
des composantes du milieu d'induction FHGL semi-liquide pendant k s premiers jours de la
p h e d'induction».
Pour vérifier cette hypothèse, les objectifs suivant ont &é fxés:
*observer l'effet d'une modification de la concentration de tous les ingrédients du milieu
d'induction FJ3GL semi-liquide pendant les premiers jours de l'étape d'induction sur la
production des embryons et la rég6ndration des plantes vertes et albinos;
-obsewer l'effet d'une modification de la concentration du maitose du milieu d'induction
FHGL semi-liquide pendant les premiers jours de l'étape d'induction sur la production des
embryons et la régénération des plantes vertes et albinos;
.obse~er l'effet d'une modification de la concentration des sels du milieu d'induction FHGL
semi-liquide pendant les premiers jours de l'étape d'induction sur ia production des embryons
et la régénération des plantes vertes et albinos.
III- MATÉRIEL ET HODES DES
3.1. Le matériel végétal
3.1.1. Le génotype des plantes-mères
Les cultivars d'orge de printemps utilisés sont 1 .es génotype :s Léger et Cadette. Lc cultivar Léger possède une meilleure aptitude à I'androgenèse in vitro que le cuItivar Cadette
En effet, Ouédraogo (1995) rapporte un taux d'albinisme élevé et une faible régénération dc
plantes vertes en culture d'anthères du cultivar Cadette.
3.1.2. L'environnement et les conditions de croissance des plantes-mères
Les plantes-mères croissent dans des pots de 15 cm de diamètre contenant un substrai
composé de 60 pour-cent de compost (Les composts du Québec, s t - H e ~ de Lévis, Qué.,
Can.), 15 pour-cent de Pro-Mix (Premier Horticulture LTÉE., Rivière-du-Loup, Qué.. Can.), 15
pour-cent de Perlite (Premier Horticulture LTÉE, Rivièredu-Loup, Qué., Can.) et 10 pour-ceni
de Vermiculite (Vil Vermiculite Inc. Montréal, Qué., Can.). Elles sont semées à une densité de
deux plantes par pot en cabinet de croissance (modèie PGWIO8, Fercival, Boone, Iowa,
U.S.A.). Les plantes-mères reçoivent une fertilisation (N-P-K) au 20-20-20 soluble ( 5 a ) une
fois par semaine ainsi qu'un arrosage quotidien. La température de croissance varie de 13 à
15°C le jour et de IO à 13°C la nuit. Les plantes poussent sous une photopériode de 16 heures
de lumière et de 8 heures d'obscurité. L'intensité Iumineuse au niveau des pots est de
350 pEm-2s-1. Le spectre lumineux est créé par 12 ampoules électriques (Specrro 40W) et 28
néons (F72T12 CW VHO, Sylvania, Can.). L'humidité relative dans le cabinet de croissance
varie entre 65 et 85 9% selon la période de la journée et la saison.
3.13. Le prélèvement du matériel végétal
Les épis sont récoltés quand le développement des microspores à l'intérieur des
anthères correspond aux stades «mi-uninucléés» (Annexe A). Les talles contenant les épis sont
conservées à une température de l0C, la base des tiges trempant dans un bain d'eau et d,
glace. Seules Ia tige p ~ c i p a l e et les cinq premières talles d'une plante-mère sont récoltées-
3.1.4. L'évaiuation du stade de développement des microspores
Le stade de développement des microspores est determiné précisément en prélevant le
trois anthères d'une fleur centrale d'un côté de l'épi. Les anthères sont placées sur une lame dc
verre dans une goutte de colorant d'Alexander modifié par Kol(1996) puis recouvertes d'unc lamelle de verre. De petites pressions appliquées sur la lamelle écrasent les anthères et libèren
les microspores dans le colorant. Seuls les épis dont la population de microspores est UI
mélange des stades uninucléés ND», «En et aF» (Annexe A) sont conservés, Les épis son
e%arbés, identifiés à l'aide d'un morceau de ruban collant fixé à la base du rachis et placé:
dans des flacons contenant quelques gouttes d'eau. Ces flacons sont scellés avec un boucho1
mousse imbibé d'eau distillée de type «Dispo PIugs» (No. T1384, Baxter Corporation divisior
Canlab, Ont., Can.) et sont placés à une température de 4°C. Le bouchon mousse imbibé d'ea~
évite une perte de turgescence du matériel végétal par évaporation d'eau et se comportr
comme une éponge, empêchant le matériel de baigner directement dans l'eau.
Les anthères sont mises en culture le jour même de la récolte ou au plus tard le
lendemain. Le matériel végétal qui n'est pas évalué le jour de sa récolte est conservé à 1°C le
bas de la tige trempant dans un bain d'eau et de glace.
3.2. La culture in vitro
3.2.1. Les milieux de prétraitement, le milieu d'induction et le milieu de régénération
Les milieux de prétraitement sont des variations du milieu d'induction FHGL semi-
liquide (milieu témoin et milieu utilisé en production de lignées HD). Le milieu FHGL est le
milieu FHG semi-liquide de Hunter (1988) dans lequel le NaFe-diethylène-triamine-
pentaacétate (No. FL-95 1 109, Sprint, Ciba-Geigy corporation, Greenshoro, Caroline du Nord,
U.S.A.) remplace le FeNaEDTA du milieu FHG originel. Le milieu FHGL contient en plus un mélange d'acides aminés mis au point par Trottier et al. (1993). Le tableau 3.1 présente la
composition détaillée du milieu FHGL semi-liquide qui correspond à la dose «lx» de tous les
ingrédients.
Les milieux de prétraitements sont des combinaisons d'ingrédients (tous les ingrédients
«Tous», seulement les sels «Selsu, ou seulement le maltose «Maltose») et de concenuations
(0, 1, 2 ou 3 fois la dose d'un groupe d'ingrédient ou des ingrédients du milieu FHGL semi-
liquide). Pour des raisons techniques, la dose de Ficoll4ûû (No. F-4375, SIGMA Chemical
Co., St-Louis, U.S.A.) n'a pas été modifiée dans les milieux de prétraitement. L'annexe B
présente la liste complète des milieux de prétraitement qui ont été évalués.
À chacun des milieux de prétraitement est associé un milieu complémentaire. Les
milieux complémentaires sont aussi des milieux FHGL modifiés. Par exemple, pour fabriquer
le milieu de prétraitement «Maltose 2x», la dose de maltose du milieu FHGL semi-liquide est
doublée. Alors, le milieu complémentaire est composé de tous les ingrédients du milieu FHGL
semi-liquide à I'exception du maltose. L'ajout de miiieu complémentaire au miiieu de
prétraitement permet de ramener la concentration des éléments du mélange à la dose « lx» de
tous les ingrédients, ce qui correspond au milieu RfGL semi-liquide décrit au tableau 3.1.
La préparation du milieu FHGL semi-liquide, des milieux de prétraitement et des
milieux complémentaires s'effectue en une seule étape; le protocole de préparation du miiieu
FHGL semi-liquide est présenté à l'annexe D. Le pH de tous les milieux est de 5,6. Les
milieux semi-liquides sont conservés à 4'C à I'obscurité dans des bouteilles hermétiques
(PYREX Brand Laboratory bottles). Ils sont agités avant chaque utilisation. Les milieux de
prétraitement sont versés dans les cuvettes de culture uniquement au moment de leur
utilisation d'éviter toute évaporation d'eau, ce qui affecterait la concentration des
différentes composantes des milieux.
Le milieu de régénération est le milieu FHGL semi-liquide dans lequel l'agiu noble
(No. 0142-17-0. DIFCO Laboratory, Detroit, U.S.A.) remplace Ie Ficoll 400 (No. F-4375,
SIGMA Chemicai Co.. St-Louis, U.S.A.) et où la dose de BAP est réduite à 0,4 g/L et la dose
de maltose est diminuée de moitié. La composition détaillée du milieu FHGL solide est
présentée au tableau 3.1, et le protocole de préparation de ce milieu est présenté à l'annexe D. Le volume de milieu de régenération versé dans une cuvette de culture de 60 x 20 mm (No.
4036, Lab-Tek Petri ~ ishes@, Nunc Nc., Naperviüe, U.S.A.) est de 12 ml.
33.2. La mise en culture des anthères, leur prétraitement et le transfert des embryons
Avant de prélever les anthères sur les fleurs centrales des épis et de les déposer en
surface des milieux de prétraitement semi-liquides, les épis sont stérilisés dans une solution à
2% d7hypochlorite de calcium pendant quatre minutes. Trois rinçages successifs d'une minute
à l'eau distillée stérile permettent d'enlever I'hypochiorite de calcium.
Le prétraitement des anthères et la phase d'induction sont réalisés dans la même
cuvette (35 x 10 mm Falcon. No. 3001, Becton Dickinson Labware, Lincon Park, U.S.A.).
Pour tous les prétraiternents, à l'exception du témoin « 1'2 mb, qui représente la procédure
conventionnelle, 0,4 ml de milieu de prétraitement sont utilisés. Après la période de
prétraitement, soit quatre ou six jours plus tard, 0'8 ml de milieu complémentaire est rajouté
dans les cuvettes. Dans cenains cas, l'addition des 0-8 ml de milieu complémentaire se fait en utilisant un seul type de milieu de remplissage, tandis que dans d'autres cas, deux types de
milieux de remplissage sont nécessaires (Tableau 3.2). Après la période de prétraitement,
toutes les cuvettes con t ie~en t un volume total de 1,2 ml de milieu d'induction dont la
composition fiale correspond à ceile du milieu FHGL semi-liquide (concentration «lx»).
Entre chacune des manipulations, toutes les cuvettes sont scellées avec du araf fi@
«MD (American National Can TM, Greenwhich). Après le rajustement de la concentration des
ingrédients et du volume de milieu d'induction, les cuvettes sont soumises individuellement à
un lent mouvement de rotation pour homogénéiser le milieu. Les mouvements brusques
doivent être évités, car ils peuvent entraîner la noyade des anthères et des microspores.
Les cuvettes scellées sont placées dans des boîtes de Nylon non totalement
hermétiques contenant un bouchon mousse de type «Dispo Plugs» (No. Tl384, Baxter
Corporation division Canlab, Ont., Cm.) complètement imbibé d'eau distillée (environ 5 ml).
Le rôle du bouchon est d'empêcher le liquide de se répandre lors de la manipulation des boîtes.
Les boîtes sont placées à l'obscurité dans un incubateur (modèle I23L, Conviron. Conuolled Environment Ltd-, Winnipeg, Manitoba, Cm.) a une teinpérature constante de 25'C. De façon
à maintenir une humidité reiative assez élevée dans l'incubateur, un contenant d'eau distillée
est placé sous le ventilateur responsable de la circulation d'air dans I'appareil.
Les embryons produits en milieu d'induction dont le diamètre est égal ou supérieur à
0,s mm sont msférés sur le milieu FHGL de régénération solide pour un maximum de 22
embryons par cuvette. La p6riode de préPvernent prend fin au soixantième jour suivant la
mise en culture des anthères. Les cuvettes de régénération contenant des embryons sont
scellées sur la moitié de leur circonférence à l'aide d'un ruban poreux MicroporeTM, c'est à
dire un sparadrap chirurgical de 12,s mm de largeur (No. 1530-0, 3M Canada NC., London,
Ont., Can.) et à l'aide de ~ara f ih@ «Mm (American National Can M, Greenwhich) sur la
deuxième moitié de leur circonférence. Ces cuvettes sont placées sur une tablette éclairée par
deux néons Cool-White (Econo-Watt F40CW/RS/EW-II, Philips, U.S.A.) alternant avec deux
néons Gro-Lux (F40T12-Gro-WS, Sylvania, Canada) et ventilée en permanence. La distance
entre les néons et la tablette où sont placées les cuvettes contenant les embryons est de 24 cm.
Les embryons reçoivent une pbotopériode de 16 heures de lumière et de 8 heures d'obscurité.
Pendant les heures de Lumière, la température est de 24 à 26°C au niveau des cuvettes et elle
est de 20 à 22'C pendant la période d'obscurité.
33. Le dispositif expérimental
Les traitements sont des combinaisons de trois groupes d'ingrédients (tous les
ingrédients «Tous», seulement les sels «Sels», ou seulement le maltose «Maltose»), d'une
concentration (O, 1.2 ou 3 fois la dose d'un groupe d'ingrédient ou des ingrédients du milieu
FHGL serni-liquide) et de deux durées (4 ou 6 jours). Les annexes C. 1 et C.2 présentent la
randomisation des traitements évalués pour les génotypes Léger et Cadette respectivement, et
l'annexe B présente la numérotation aléatoire des traitements.
11 y a 24 traitements et un témoin « 1,2 ml». Le volume de milieu d'induction du témoin
est constant à 1'2 ml pendant toute la période d'induction. Ce témoin représente la procédure
conventionnelle de culture d'anthères d'orge sans prétraitement des anthères. Parmi les 24
traitements, il y a deux groupes de trois traitements témoins identiques. Le premier groupe de
témoins est: «Tous lx durant 4 jours», «Maltose lx durant 4 jours» et «Sels lx durant 4
jours», et le deuxième groupe de témoins est: «Tous lx durant 6 jours), «Maltose lx durant 6
jours» et «Sels lx durant 6 jours». Ces témoins correspondent tous au milieu FHGL semi-
liquide et leur volume initiai est de 0,4 ml. Les coefficients attribués aux trois membres
équivalents d'un groupe permettent de les pondérer de façon à ce que les trois traitements
identiques aient le même poids qu'un seul traitement (Annexe G). Les témoins «0,4 ml » et le
témoin ~ 1 . 2 ml» permettront de vérifier si le volume de milieu présent dans les cuvettes
pendant les quatre ou les six premiers jours de la période d'induction influence Ia réponse
androgénique des génotypes Léger et Cadette.
Le nombre élevé de traitements rend impossible la réalisation d'une répétition en une
seule étape et la combinaison des deux génotypes dans une même expérience. La disponibilité
du matériel végétai et la durée de chacune des manipulations limitent la somme de travail
pouvant être accomplie en une journée. Les deux génotypes sélectionnés pour leur aptitude
cIBérente à I'androgenèse sont donc étudiés séparément, mais de façon identique. Le dispositif
expérimental pour chacun des deux génotypes d'orge est un plan en blocs complets soumis
aux contraintes de randomisation d'un plan en lattice équilibré 5x5 comprenant six dpétition:
composées chacune de cinq blocs incomplets (sous-blocs). Les blocs incomplets SOL
composés de cinq traitements diswibués aléatoirement et de façon à ce que deux traitement
n'apparaissent jamais deux fois ensemble dans un bloc incomplet des six répétitions. L
dispositif expérimental en lattice permet donc de réaliser de façon séparée les cinq sous-bloc
d'une répétition (Annexes C.1 et C.2), ce qui élimine une partie des contraintes lides 1
manipulation du materiel végktal.
Cinq épis sont attribués au hasard à chacun des sous-blocs des répétitions. Douze fleur
par épis sont sélectionnées, soit les six fleurs centrales de chacun des côtés d'un épi. Les troi
anthères de ces fleurs sont distribuées ensemble dans un même traitement. Le prélèvement de
trios d'anthères s'effectue du bas vers le haut de l'épi et ceux-ci sont distribués alternativemen
à chacun des traitements. Puisque six fleurs par côté d'épi sont utilisées, et qu'il n'y a que cinc
traitements par sous-bloc, chacun des traitements reçoit la même proportion d'anthère
provenant des fleurs du bas, du centre et du haut des épis. Au total, chacun des traitement
reçoit 36 anthères, ce qui correspond à 12 fleurs provenant de cinq épis différents. Les unité
expérimentales sont donc constituées chacune d'une cuvette de culture contenant 36 anthères.
Les variables dépendantes mesurées sont le nombre d'embryons, de plantes verte:
possédant une tige et des racines, et de plantes albinos possédant une tige et des racines pa
100 anthères. Ces données sont analysées à l'aide de la procédure GLM du progiciel SA2
(version 6.0 SAS institute Inc., Cary, N.C., U.S.A.). Des contrastes polynomiaux et de:
contrastes d'interaction sont utilisés pour décrire les effets des concentrations des composante!
du milieu de culture sur la production d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos.
Tableau 3.1. Liste des composantes du milieu FHGL semi-liquide et solide, à la concentration « 1 x» des composantes
Semi- Solide Semi- Solide Composantes liquide Composantes liquide
( m a ) (ma) ( m a ) ( m a )
Micro-sels Fer (Sequestrene 330)
MnS04.H20 NazMo04.2HzO CoC12.6H20
H3Bo3 %SO4.7H20 CuS04.5H20
Vitamines Thiamine Inositol
Sacre Maltose
Hormone BAP (Bbenzylaminopurine)
Agent osmotique Ficoll400
Agent gélifiant Agar noble
Acides aminés Glutamine Caséine hydrolysée Tyrosine
Mélange d'acides' aminés Acide Garninobutyrique
Aianine Arginine Asparagine Caséine hydrolysée Cystéine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Méthionine Phénylalanine Proline Sérine Thréonine Tryptophane Valine
Tableau 3.2. Milieux et volumes de prétraitement et de remplissage d'induction effectuée en deux étapes
4
utilisés pour une phase
Première étape Deuxième étape
Milieu de prétraitement Milieu de remplissage 1 Milieu de remplissage 2
Concentration Volume Concentration Volume Concentration (m0 (ml)
Ox Tous7 l x TOUS* 2x Tous 3x Tous
Ox Sels lx Sels* 2x Sels 3x Seis
Ox Maltose lx Maltose 2x Maltose 3x Maitose
2x Tous Ix Tous Ox Tous Ox Tous
2x Sels lx Seis Ox Sels Ox Sels
2x Maltose l x Maltose Ox Maltose Ox Maitose
lx Tous -
Ix Tous -
Ix Sels -
lx Sels -
lx Maltose -
Ix Maitose -
Volume (ml)
Volume
Milieu d'induction FHGL semi-liquide à la concenûation témoin des composantes, tel que décrit au tableau 3.1. f Milieu contenant uniquement 200-en de Ficoll400.
Après rajustement du volume des milieux de prétraitement à 1.2 ml, la concentration finale des ingrédients du melange (milieu d'induction + milieu(x) de remplissage) correspond il celle du milieu d'induction FHGL semi- liquide à Ia concentration «lx», quel que soit Ie milieu de prétraitement utilisé au départ.
CPJAP3TEE IV
R É S U L T A T S E T D I S C U S S I O N
4.1. Introduction
Les essais d'ajustement préliminaires ont pennis de constater que les microspores
uninucléées répondent plus ou moins bien en culture in vitro d'anthères selon leur stade de
développement. Les microspores du génotype Cadette mises en culture à un stade uninucléé
trop jeune, soit le stade «C», soit une combinaison des stades CC» et (CD», ont une mauvaise
aptitude à I'androgenèse (Annexe A). La réponse optimale est observée aux stades <<Il» et «E». La réponse des microspores uninucléées du génotype Léger semble moins affectée par le stade
de maturité de l'anthère, bien que les microspores aux stades «CD ou MF» semblent répondre
plus faiblement en cuiture d'anthères. Pour cette raison, seulement les épis des génotypes
Léger et Cadette dont les microspores uninucléées sont au stade «D» ou contiennent un
mélange de microspores aux stades «Dm, «EN et «F» (mélange «D-E», «D-E-F» ou NE-FM) sont sélectionnés. En général, les microspores du génotype Cadette sont aux stades appropriés
lorsque la ligule de la feuille étendard est située de un à deux centimètres au-dessus de la
ligule de l'avant-dernière feuille d'une talle. Pour le génotype Léger, la ligule de la feuille
étendard doit se situer de un à deux centimètres au-dessous de la ligule de l'avant dernière
feuille d'une talle.
Un problème de vibrations dans l'incubateur (modèle 123 1, Conviron, Conuolled
environment Ltd.) a provoqué, lors des essais préliminaires d'ajustement, une noyade des
anthères, des microspores et des embryons dans le milieu semi-liquide. Ces vibrations
parasites ont été diminuées à un taux acceptable à l'aide d'une plaque de plomb de 22,68 Kg
(50 1b) préalablement montée sur sept bouchons de ikge coniques, dont le plus grand diamètre
est de 1,5 cm, et déposke sur la tablette de l'incubateur. Cette plaque de plomb offre une
surface où les vibrations sont très atténuées, ce qui élimine, pour les boîtes placées dessus, les
vibrations indksirables et donc la noyade des structures dans les milieux semi-liquides.
Au cours des essais préliminaires d'ajustement, on a observé que les cuvettes de
rég6nkration scellées uniquement avec le araf film@ KM?, (American National Can
Greenwhich) présentent une grande accumulation d'eau, résultat d'un phénomène de
condensation à l'intérieur du couvercle, et la formation d'un film liquide indésirable A la
surface du milieu. Ce nIm de liquide. quand il recouvre partiellement les embryons, est très
nuisible à leur croissance et à leur développement. D'un autre côté, si les cuvettes sont scellées
uniquement à l'aide du ruban poreux, il y a un séchage trop rapide du milieu de régénération
sous les conditions de ventilation et de température effectives au laboratoire. L'utilisation d'un
ruban poreux pour sceller uniquement la moitié de la circonférence permet d'éviter
l'accumulation d'un film de liquide en surface des milieux solides sans en causer un
assèchement excessif. Ces observations sont corroborées par les travaux de Salmenkallio-
Maaila er al. (1995)' parus après le début des essais d'ajustement. Les chercheurs ont observé
que les plantes se développent plus rapidement, ont une meilleure apparence et présentent un
meilleur enracinement dans les boîtes scellées avec un ruban poreux (Scotch Brand Tape, 3M);
il y a aussi une diminution de la condensation d'eau.
Il a été noté que les embryons transférés plus de 30 jours après la mise en culture des
anthères ont une faible capacité de régénération en plantes. Ils forment généralement des cals
ou se régénèrent en plantes albinos.
L'analyse de la variance (ANOVA) et les contrastes concernant le nombre d'embryons,
de plantes vertes et de plantes albinos produits par 100 anthères sont présentés au tableau 4.1
pour le génotype Léger et au tableau 4.2 pour le génotype Cadette. De façon à améliorer
l'homogénéité de la variance, les nombres de plantes vertes et de plantes albinos par 100
anthères des génotypes Léger et Cadette ont été transformés à l'aide d'une transformation
logarithmique (log [x+ 11).
Le volume de milieu semi-liquide, utilisé au début de l'induction, n'influence pas
l'androgenèse. Pour les génotypes Léger et Cadette, le volume de milieu d'induction FHGL serni-liquide utilisé pendant les quatre ou les six jours de la période de prétraitement des
anthères n'affecte pas la production d'embryons, de piantes vertes ou de plantes albinos par
100 anthères pour les deux volumes initiaux comparés (0,4 et 1'2 ml). Les modifications
apportées à l'environnement physique (pH, substances sécrétées ou absorbées) ou gazeux dans
la cuvette par l'addition des anthères en surface du milieu ne sont pas assez importantes pour
entraîner une modification de la réponse androgénique.
La durée du prktraitement des anthères n'affecte pas la dponse androgénique. Il n'y a
aucun effet significatif de la durée des prétraitements sur la réponse des génotypes Léger et
Cadette en culture d'anthères. Les prétraitements de quatre et de six jours ont un effet similaire
sur la production d'embryons, de plantes vertes ou de pIantes albinos. Par conséquent, pour les
deux génotypes, on a combiné les données en confondant les effets non significatifs (durées de
prétraitement) pour générer les tableaux 4.3'4.4.4.5 et 4.6. Les données non confondues sont
présentées aux annexes F. 1. F.2, F.3, F.4 et F.5.
42- Essais sur l'orge possédant une bonne réponse androgénique, cv. Léger
43.1. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement global de la concentration des ingrédients du milieu FHGL semi-üquide
Chez le génotype Léger, les productions d'embryons et de plantes vertes suivent une
courbe de type quadratique (P < 0,001) en fonction des doses utilisées pour tous les
ingrédients. Elles suivent égaiement une courbe de type cubique pour les embqons (P c 0,O 1)
et pour les plantes vertes (P < 0,001). La production de plantes albinos par 100 anthères suit
une courbe de type quadratique (P < 0'0 1) (Tableau 4.1).
En prétraitement des anthères, la concentration de l'ensemble de tous les ingrédients du
milieu FHGL semi-liquide influence I'ernbryogenèse. La production maximale d'embryons est
atteinte lorsque la dose de tous les ingrédients du milieu d'induction est doublée «Tous 2x»
pendant la période de prétraitement des anthères (Tableau 4.3). Cela représente une
multiplication par un facteur de 1'6 du nombre d'embryons produits comparativement au
traitement «Témoin lx». L'absence totale d'éléments (Tous Ox) ou la présence de leur triple
dose (Tous 3x) dans le milieu d'induction, pendant les quatre ou les six premiers jours de la
période d'induction, a un effet assez négatif sur l'embryogenèse.
La production de plantes vertes est très stimulée par le traitement «Tous 2x» pendant
les quatre ou les six premiers jours de la période d'induction (Tableau 4.3). Le prétraitement
«Tous 2x» permet d'obtenir sept fois plus (calcul effectué à partir des données
détransformées) de plantes vertes que le traitement «Témoin lx». Une omission de tous les
ingrédients (Tous Ox) a un effet négatif sur la production de plantes vertes par rapport au
nombre de plantes vertes obtenues à l'aide du traitement <<Témoin lx». La dose de tous les
ingrédients présents dans le milieu de prétraitement influence donc beaucoup la production de
plantes vertes chez le génotype L6ger.
La production de plantes albinos augmente lorsque la dose des ingrédients du milieu
d'induction est doublée (Tous 2x) pendant le prétraitement des anthères (Tableau 4.3). Le
Tableau 4.1. Analyse de la variance et des contrastes pour le nombre d'embryons. de plante: vertes et de plantes albinos par 100 anthères, cv. Léger
Moyennes des carrés des écarts Sources d.1. Embryons Plantes vertes Plantes albinos
- /IO0 anhères 1100 anthères* /IO0 anthères*
Blocs 5
Traitements 24 Erreur 120
Contrastes
Témoin 0,4 ml vs témoin I,2 ml
Durée (4 jours vs 6 jours)
Maltose Linéaire
Maltose Quadratique
Maltose Cubique
Sels Linéaire
Sels Quadratique
Sels Cubique
Tous Linéaire
Tous Quadratique
Tous Cubique
Durée x Maitose Linéaire
Durée x Maltose Quadratique
Durée x -Maltose Cubique
Durée x Sels Linéaire
Durée x Sels Quadratique
Durée x Sels Cubique
Durée x Tous Linéaire
Durée x Tous Quadratique
Durée x Tous Cubique
Maitose 2x vs Tous 2x
Sels 2x vs Tous 2x Maltose 3x vs Tous 3x
Sels 3x vs Tous 3x * ** *** . , Significatif aux niveaux 0.05,0,0 1 et 0,001
Donnt?es msformées (Iog [x+l])
Tableau 4.2. Analyse de la variance et des contrastes pour le nombre d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos par 100 anthères, cv. Cadette
Moyennes des canés des écarts Sources d.1. Embryons Plantes vertes Plantes albinos
- 1100 anthères 1100 anthères' /1ûû anthères'
Blocs
Traitements
Erreur
Contrastes
Témoin 0-4 ml vs témoin 1-2 ml
Durée (4 jours vs 6 jours)
Maltose Linkaire
Maltose Quadratique
Maltose Cubique
Sels Linéaire
Sels Quadratique
Sels Cubique
Tous Linéaire
Tous Quadratique
Tous Cubique
Durée x Maltose Linéaire
Durée x Maltose Quadratique
Durée x Maltose Cubique
Durée x Sels Linéaire
Durée x Sels Quadratique
Durée x SeIs Cubique
Durée x Tous Linéaire
Durée x Tous Quadratique
Durée x Tous Cubique
Maltose 2x vs Tous 2x
Sels 2x vs Tous 2x Maltose 3x vs Tous 3x
Sels 3x vs Tous 3x * ** *** , , Significatif aux niveaux 0,05,0,0 1 et 0.00 1 Données transformées (log [x+l])
nombre élevé de plantes albinos, obtenues suite à ce prétraitement, peut s'expliquer par la
production plus élevée d'embryons du génotype Léger, par rapport au nombre d'embryons
obtenus avec les autres types de prétraitements (Tous Ox, Témoin Ix et Tous 3x). On constate
cependant une diminution assez importante de la fraction du nombre total de plantes
régénérées sous la fome albinos lorsque la dose de tous Les ingrédients du milieu FHGL semi-
liquide est multipliée par deux (Tous 2x1 ou par trois (Tous 3x) (Tableau 4.4). Le
Tableau 4.3. Production moyenne d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos par
100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients, du
maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, cv. Léger
Embryons+
par 100 anthères
Ingrédients;
Concentrations Tous Maltose Sels
Plantes vertes* 1 par 100 anthères
par 100 anthères
Milieu d'induction FHGL semi-liquide à la concentration témoin des composantes. tel que decrit au tableau 3.1. ~rreur type = 91-14 Données ddtransform&s prbentées; erreur type = 0.40 pour les données ansformées
+ Données détransformées présentdes; erreur type = 0.38 pour les données transfom6es Moyenne des prétraitements de quatre et de six jours * ** ***
, Significatif aux niveaux 0,05,0,0 1 et 0,00 1 nS Non significatif
prétraitement «Tous 2x» ne favorise donc pas l'albinisme. L'augmentation du nombre de
plantes albinos par rapport au nombre de plantes albinos obtenues avec le traitement témoin
(Témoin lx) provient principalement de l'augmentation de la production d'embryons.
Les prétraitements de quatre ou de six jours des anthères au début de la période
d'induction à l'aide du milieu FHGL semi-liquide dans lequel la dose de tous les ingrédients
est doubiée (Tous 2x) constituent donc une amélioration technique très appréciable pour la
production de lignées HD en culture d'anthères. Toutefois, cette amélioration sera réellement
efficace si elle offre un effet stimulateur similaire avec d'autres cultivars et hybrides d'orge de
p ~ t e m p s .
Tableau 4.4. Pourcentage d'albinisme (%) obtenu pour quatre doses de
l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du
milieu FHGL semi-liquide, cv. Léger
- - - -
Concentrations Tous Maltose Sels
Milieu d'induction FHGL semi-liquide à la concentration témoin des composantes. tel que décrit au tableau 3.1.
7 Les donnees démsforrnées sont utilisées pour effectuer le calcul: [(plt, albinos / plt. total)* 1001
4.2.2. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la concentration du maltose du milieu FHGL semi-liquide
La production moyenne de plantes albinos par 100 anthères forme une courbe de type
quadratique (P c 0'05) en fonction des doses de maltose étudiées (Tableau 4.1). La
concentration de maltose présente dans le milieu de prétraitement influence donc la production
de plantes albinos du genotype Léger. La plus faible dgénération de plantes albinos est
obtenue en doublant la dose de maltose (Maltose 2x) (Tableau 4.3). Par contre, le pourcentage
de plantes albinos régénérées diminue lorsque la dose de maltose du milieu FHGL semi-
liquide est doublée (Maltose 2x) en comparaison avec les résultats obtenus pour le traitement
«Témoin 1 x» (Tableau 4.4).
4.2.3. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la concentration des seIs du milieu FaGL semi-liquide
La production moyenne d'embryons par 100 anthères du génotype Léger forme une
courbe quadratique pour l'intervalle formé par les quatre concentrations des sels étudiées
(P c 0,05) (Tableau 4.1).
La teneur en sels du milieu FHGL de prétraitement influence l'embryogenèse (Tableau
4.3). L'absence totale des sels (Sels Ox) ou la présence de leur triple dose (Sels 3x) a un effet
négatif sur l'embryogenèse par rapport au traitement témoin et au prétraitement «Sels 2x».
4.3. Essais sur l'orge possédant une mauvaise réponse androgénique , cv. Cadette
4.3.1. Effets d'un prétraiternent des anthères impliquant un changement global de la concentration des ingrédients du milieu FHGL semi-liquide
Pour les quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients du miiieu FHGL semi-
liquide étudiées en prétraitement des anthères, la production moyenne d'embryons et de
plantes albinos par 100 anthères forme une courbe de type quadratique (P c 0,001) (Tableau
4.2).
Pour le gknotype Cadette, il est donc possible d'améliorer, par rapport au traitement
témoin «Témoin lx», le taux de production d'embryons en doublant tous les ingrédients du
milieu d'induction FHGL semi-Iiquide (Tous 2x) pendant les quatre ou les six premiers jours
de la période d'induction en culture d'anthères. On observe une forte diminution de
I'embryogenèse quand on omet tous les ingrédients (Tous Ox) ou quand on les triple (Tous 3x)
par rapport au traitement témoin (Témoin lx) (Tableau 4.5).
Les prétraitements de quatre et de six jours des anthères avec le milieu FHGL semi-
liquide dans lequel la concentration des ingrédients est modifiée n'ont aucun effet significatif
sur la production de plantes vertes par 100 anthères du gdnotype Cadette. Cependant, des
tendances, refldtant un effet bénefique d'une dose élevée de tous les ingrédients (Tous 2x).
sont observées (Tableau 4.5).
La concentration initiale de tous les ingrkdients du milieu d'induction influence la
régénération de plantes albinos en culture d'anthères du génotype Cadette (Tableau 4.5). La production maximale de plantes albinos par 100 anthères est obtenue en utilisant le milieu
FHGL d'induction (Témoin Ix). La régénération des pIantes albinos par 100 anthères (Tableau
4.5) et le taux d'albinisme (Tableau 4.6) diminuent lorsque tous Les ingrédients du milieu
d'induction FHGL sont omis (Tous Ox) ou triplés (Tous 3x). Bien que ces prétraitemeni
permettent de diminuer l'albinisme, iIs ne stimulent pas efficacement la régénération de
plantes vertes. Dans le cas particulier de Ia production de lignees HD, les traitements qui stimuient la production d'embryons et surtout de plantes verzes, mêmes s'ils offrent un taux
d'albinisme élevé, doivent être favorisés. L'application des prétraitements <<Tous Ox» et «Tous
3x» en culture d'anthères In vitro apparaît donc inutile.
L'objectif de la production de lignées HD est d'obtenir le plus grand nombre possible
de plantes vertes par 100 anthères mises en culture. En culture d'anthères des génotypes Léger
et Cadette, doubler la dose de tous les ingrédients du milieu d'induction FHGL semi-iiquide
pendant les quatre ou les six premiers jours de l'induction a un effet positif sur la production
de pIantes vertes. Il serait donc souhaitable d'introduire le prétraitement (<Tous 2x» dans le
protocole de production de lignées HD. Dans le cas du génotype Cadette, les données
recueillies ne permettent pas de démontrer que c'est une amélioration technique très marquée,
mais elles démontrent clairement que ce n'est pas une régression technique. Tout prétraitement
qui affecte à la hausse la production des plantes vertes et qui s'effectue facilement est
souhaitable en production de lignées HD, surtout s'il permet d'abaisser les coûts de production
de teiies Lignées.
4.3.2. Effets d'un prétraitement des anthères impliquant un changement de la concentration du maltose du milieu FHGL semi-liquide
L'intervalle comprenant les concentrations «Ox», «lx», <<2x» et «3x» de maitose dans
le miLieu FHGL semi-liquide forme une courbe de type quadratique (P c 0,001) pour la
production d'embryons et de plantes albinos par 100 anthères, et de type linéaire (P < 0.05)
pour la production de plantes vertes par 100 anthères (Tableau 4.2).
La quantité de mdtose présente dans le milieu FHGL de prétraitement influence le
taux de formation des embryons (Tableau 4.5). Le nombre maximal d'embryons par 100
anthères est obtenu avec la dose témoin (Témoin lx) de maitose. L'absence totale de maltose
(Maltose Ox) pendant les quatre ou six premiers jours de l'induction provoque une diminution
de la formation des embryons chez le génotype Cadette. La présence de la double (Maltose 2x)
ou de la triple (Maltose 3x) dose de maltose dans le milieu d'induction pendant le
prémitement des anthères a aussi un effet négatif sur la production d'embryons par rapport à
la concentration témoin (Témoin lx).
La dose de mdtose présente dans le milieu de prétraitement influence la régénération
des embryons en plantes wxtes en culture d'anthères du génotype Cadette (Tableau 4.5). Le
Tableau 4.5. Production moyenne d'embryons, de plantes vertes et de plantes albinos par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients, du
maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, cv. Cadette
Concentrations Tous Maltose Sels
par 100 anthères I
Plantes vertes* 1 par 100 anthères I
L
Planter albinos+ 1 par 100 anthères I
Milieu d'induction FHGL semi-liquide à la concentration témoin des composantes, tel que dkcxit au tableau 3.1. Erreur îype = 85.32 Données denaasformkes présentées; erreur type = 0.43 pour les donnees nansformées
+ Données détransforxndes présentées; erreur type = 055 pour les données aansformées f Moyenne des prétraitements de quatre et de six jours * ** *** , , Significatif aux niveaux O,OS,O,O 1 et 0.00 1 nS Non significatif
Tableau 4.6. Pourcentage d'albinisme (%) obtenu pour quatre doses de
l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du
milieu FHGL semi-Iiquide, cv. Cadette
Ingrédients
Concentrations Tous Maltose Sels
ox lx* 2x 3x
Milieu d'induction FHGL serni-Iiquide à la concentration témoin des composantes. tel que décrit au tableau 3.1. Les données détransformées sont utiIisées pour effectuer le calcul: [(plt albinos / ph. total)* 1001
traitement «Maltose 3x» stimule la production de plantes vertes en comparaison avec le
traitement «Témoin lx», même si la plus forte production d'embryons est obtenue avec le
traitement témoin. La production de plantes vertes diminue drastiquement en absence de
maltose (Maltose Ox) dans le milieu de prétraitement par rapport au traitement témoin (Témoin
lx).
La dose de maltose présente dans le milieu FHGL de prétraitement influence la
régénération des embryons en plantes albinos (Tableau 4.5). Le nombre de plantes albinos par
100 anthères est maximai pour la dose dmoin de maltose (Témoin lx) et il est minima1 en
absence tocaie de maltose (Maltose Ox). Ceci présente un parallèle évident avec la production
des embryons. Le nombre de pIantes albinos produites diminue lorsque la dose de maltose est
doublée (Maltose 2x) ou hiplée (Maitose 3x). Le pourcentage du nombre de plantes albinos
régénérées par rapport au nombre totai de plantes obtenues, pour les quatre doses de maltose,
est plus élevé pour le traitement «Témoin lx» que pour le traitement «Maltose 3 x ~ (Tableau
4.6).
En pratique. ces essais sur les doses de maltose avec le génotype Cadette démontrent la
nécessité de la présence du maltose dans le milieu d'induction pendant les quatre ou les six
premiers jours suivant la mise en culture des anthères. La dose optimale de maltose à utiliser
est cependant difficile à préciser sur la base de Ia série de résultats obtenus pour le génotype
Cadette, mais il semble qu'une haute concentration en maltose dans le milieu d'induction
pendant les premiers jours de i'androgenèse stimule la production de plantes vertes et rkduise
l'albinisme. Toutefois, doubler la dose de tous les ingrédients du milieu EHGL semi-liquide en
prétraitement des anthères stimule encore plus efficacement la production de plantes vertes
qu'une simple augmentation de Ia dose de maltose.
4.3.3. Effets d'un prétraiternent des anthères impliquant un changement de la concentration des sels du miiieu FHGL semi-liquide
L'intervalle délimité par les quatre concentrations des sels (Ox, lx, 2x et 3 x ) forme une
courbe de type quadratique (P c 0'0 1) pour Ia production moyenne d'embryons et de plantes
albinos par 100 anthères (Tableau 4.2).
La dose des sels présents dans le milieu de prétraitement pendant les premiers jours de
l'induction influence l'embryogenèse. Une augmentation (Sels 3x) ou une diminution de la
dose des sels (Sels Ox) dans le miiieu d'induction a un effet négatif sur l'embryogenèse en
culture d'anthères du génotype Cadette (Tableau 4.5). On constate cependant que
l'embryogenèse est plus affectée par une absence totale de tous les ingrédients ou du maltose
que par une absence totale des sels pendant les premiers jours de la période d'induction. Ceci
est en accord avec les travaux de Vasil (1980) où on rapporte que la source de sucre et le fer
sont les plus importantes composantes du milieu de culture, et que Ies sels minéraux sont
requis seulement à faible concentration.
Le nombre de plantes albinos régénérées varie en fonction de la dose des sels dans le
milieu de prétraitement. Chez le ggnotype Cadette, la régénération des plantes aibinos diminue
quand on augmente la dose des sels dans le milieu de prétraitement par un facteur deux (Sels
2x) ou un facteur trois (Sels 3x) en comparaison avec les résultats obtenus pour la dose témoin
(Témoin lx) (Tableau 4.5). Cependant, lorsqu'on calcule le pourcentage des plantes totales
régénérées sous la forme albinos, pour les quatre concentrations étudiées, on constate que la
dose des sels présents dans Ie milieu de prétraitement n'influence pas réellement le taux
d'albinisme (Tableau 4.6). Les variations du nombre de plantes albinos observées proviennent
d'une variation du nombre d'embryons produits.
4.4. Les interactions entre la durée du prétraitement et la dose des ingrédients dans le milieu de prétraitement.
Chez le génotype Cadette, il n'existe mcune interaction entre la durée du prétraitement
et la dose des ingrédients en ce qui concerne la production moyenne d'embryons, de plantes
vertes ou de plantes albinos par 100 anthères.
Chez le génotype Léger, il existe une interaction significative (P < 0-05) entre la durée
du prétraitement et la dose de tous les ingrédients dans le milieu d'induction pendant la
période de prétraitement, en ce qui concerne [a production moyenne de plantes vertes par 100
anthères (Tableau 4.1). il existe donc un effet différentiel de la durée du prétraitement des
anthères selon la dose de tous les ingrédients dans le milieu de prétraitement. Cependant, les
données recueillies ne sont pas assez nombreuses pour permeme d'identifier la combinaison
optimale, entre une durée de prétraitement et une dose de tous les ingrédients du milieu FHGL, qui permettlait de régénérer le maximum de plantes vertes. Ceci est d'autant plus difficile que
les analyses statistiques n'ont fait ressortir aucune différence significative entre les
prétraitements de quatre ou de six jours sur la production d'embryons, de plantes vertes ou de
plantes albinos par 100 anthères chez le génotype Léger.
4.5. Discussion concernant les effets des prétraitements des anthères sur la réponse androgénique de l'orge
Les résultats obtenus démontrent clairement l'existence de nouveaux types de
prétraitements des anthères permettant de stimuler efficacement l'androgenèse in vitro. Ii s'agit
d'une amélioration technique appréciable pour la production de lignées HD par la culture
d'anthères. La principale amélioration obtenue concerne le nombre d'embryons et de plantes
vertes par 100 anthères, quand la dose de tous les ingrédients du milieu FHGL est doublée
(Tous 2x). L'effet de ce prétraitement est présent à un degré différent chez les génotypes Léger
et Cadette, lesquels different dans leur aptitude à l'androgenèse. Puisque cet effet est présent à
la fois chez un cultivar ayant une bonne réponse androgénique et chez un cultivar présentant
une mauvaise réponse androgénique, ce prétraiternent peut donc être appliqué à la production
de lignées HD d'orge sans crainte qu'il provoque une diminution de la régénération des
plantes vertes.
Contrairement aux espèces comme N. tabacum (Zarsky et al., 1992; Touraev er al.,
1996) et le riz (Ogawa et al., 1994), l'orge présente une dponse variable à l'absence d'une
source de sucre pendant les premiers jours de la période d'induction. Une dose de maltose plus
élevée dans le milieu FHGL semi-liquide pendant Ies premiers jours de l'induction permet de
stimuler la production de plantes vertes. Il y a donc une similarité avec les travaux récents de
Salmenkallio-Mamila et a1.(1995), où i1 a été démontré que la production de plantes vertes en
culture de microspores isolées est stimulée par une augmentation de la dose de maltose dans le
milieu d'extraction des microspores et le milieu de cultue des anthères d'orge.
Chez les génotypes Léger et Cadette, le prétraitement des anthères avec le milieu ne
contenant que 200 g/L de Ficoll400 «Tous Ox» a un effet négatif sur la production moyenne
d'embryons et de plantes vertes par 100 anthères. Cette observation corrobore les résultats
rapportés par Cistué et al. (1994) démontrant qu'un pr6traitement des anthères au FicoiI 400
inhibe le développement des microspores et induit un faible taux de division des microspores
et de production de plantes vertes par anthère. Cependant, il demeure étonnant de constater, en
absence de tout élément nutritif pendant les premiers jours de I'induction. que les microspores
puissent se diviser, former des embryons et se régénérer en plantes vertes. L'absence de tout
élément à l'exception de l'agent osmotique a un effet négatif beaucoup plus marqué dans le
cas du génotype Cadette. Les réserves nutritives emmagasinées dans les locules des anthères
des génotypes Léger et Cadette diffêrent peut-être des points de vue quantitatif et qualitatif.
Ces travaux de recherche démontrent que la compositiori du milieu d'induction
pendant les premiers jours de Ia période d'induction influence le succès de l'androgenèse Ni
vitro en culture d'anthères chez I'orge. Quels peuvent être les effets des prétraitements sur
l'initiation et le développement des grains de pollen multicellulaires? Quels peuvent être les
mécanismes d'action de ces prétraitements? Quelques hypothèses appuyées par la littérature
peuvent être émises.
Sangwan et Sangwan-Norreel (1987b) mentionnent que le pollen répond aux
traitements en culture in vitro pendant un intervalle de temps limité, et que la période
favorable à l'induction de l'androgenèse in vitro varie en fonction de l'espèce végétale enidiée.
On a démontre que les microspores d'orges. en culture d'anthères, sont très sensibles à la
composition du milieu d'induction pendant les quatre ou les six premiers jours suivant la
dissection des anthères. Il est possible que ce soit pendant cette période que les microspores
développent I'aptitude à l'embryogenèse et à la régénération en plantes vertes. Cela pourrait
expliquer les faibles ou les meilleures réponses androgéniques obtenues avec certains types de
prétraitements des anthères.
Une explication possible il la stimulation de l'embryogenèse suite à l'utilisation du
milieu FHGL dans lequel la dose de certains ingrédients est modifiée, serait la stimulation dr
développement atypique du pollen (dimorphisme pollinique) favorisant l'embryogenèse des
des microspores uninucléées. Cette hypothèse s'appuie sur les travaux de Rashid (1983).
Prakash et Giles (1987) et Dunweii (1978). Les formes polliniques dont le développemeni
dévie du développement normal (dimorphisme pollinique) ont le potentiel de suivre uc
développement sporophytique (Rashid, 1983; Prakash et Giies 1987). 11 est possible
d'augmenter de façon substantielle le nombre de microspores embryogkniques en soumettani
des épis ou des bourgeons floraux, dont les microspores sont uninucléées, à des prétraitementi
particuliers (Dunweli, 1978). Donc, certains des prétraitements des anthères peuvent stimule1
le dimorphisme pollinique et favoriser le développement de microspores embryogéniques.
En culture d'anthères, la paroi de l'anthère joue un rôle de filtre pour l'importation des
éléments nutritifs du milieu d'induction aux microspores. Tous les éléments nutritifs doivent
passer au travers du tapétum ou être métabolisés par celui-ci avant d'atteindre les microspores.
L'induction de I'androgenèse in vitro implique une détection par la microspore de stimuli
causés par des changements dans son environnement immédiat (Dunwell, 1978), c'est à dire,
dans le cas de la culture d'anthères, un changement dans la composition du fluide contenu
dans les locules de l'anthère. Par exemple, le traitement à l'aide d'une concentration élevée de
sucrose stimule I'androgenèse en provoquant des changements dans les tissus de la paroi de
l'anthère (Wang et al., 1980). Ainsi, il est possible que la présence, en grande ou en faible
quantité, des ingrédients du milieu FHGL semi-liquide, pendant les premiers jours de la phase
d'induction, ait une influence indirecte sur la nature et la quantité des éléments nutritifs qui
atteignent les microspores. Une variation de l'environnement nutritif entourant Les microspores
uninucléées peut donc stimuler une plus grande ou une plus faible proportion de celles-ci à
dévier de la voie gamétophytique vers la voie sporophytique. Ceci pourrait expliquer la
variation de la réponse androgénique observée suite aux différents prétraitements des anthères.
Le potentiel osmotique des milieux de culture in vitro d'induction et de régénération
influence le taux de réussite en androgenèse in vitro. Le potentiel osmotique des différents
milieux de prétraitement testés au cours de ces travaux de recherche varie énormément en
fonction de la dose et des ingrédients présents (Annexe E). Par exemple, Ia pression osmotique
du milieu FHGL semi-liquide (témoin lx) est de 275 mOsm Kg'. La pression osmotique du
milieu de prétraitement le plus efficace (Tous 2x) est de 98 1 mOsm Kg-' et celle de la solution
d'eau et de Ficoll (Tous Ox) est de 110 mOsm Kg'. Dès les premières étapes de la culture des
anthères, le potentiel osmotique du milieu conditionne le succès de l'induction. Dunwell
(1978) mentionne que le détachement des anthères du reste de la fleur provoque un
changement osmotique dans celles-ci. Dans les anthères placées sur un milieu d'induction, la
pression hydrostatique augmente rapidement, résultat de l'absorption du miLieu de culture, de
son accumulation dans les locules des mthères et du gonflement des microspores. Cette
pression fait Mater tes anthères là où les tissus sont les moins résistants. c'est-à-dire le long
des lignes de déhiscence natureDes. Après l'éclatement des anthères, le pollen est relâch6
directement dans le milieu (Sunderland et al., 1984). Un potentiel osmotique relativement
étevé du miiieu de culture empêche la lyse des microspores pendant leur division et empêche
par Ia suite leur germination précoce pendant les premiers stades de l'embryogenèse (Collins
et Genovesi, 1982). II est possible que les éléments du adieu d'induction soient pius ou moins
absorbés et à des vitesses variées par les anthères et les microspores selon leur concentration
dans le milieu de prétraitement. De cette façon, les microspores seraient Iibérées plus ou moins rapidement dans Ie milieu d'induction. La Libération plus rapide des microspores dans le
miiieu d'induction suite aux prétraitements avec des pressions osmotiques éIevées peut
expliquer en partie la stimulation de l'embryogenèse observée par rapport au témoin (Tt5moin
lx).
Ces travaux ont donc permis de démontrer qu'une réponse androgénique supérieure est
obtenue lorsque la dose de tous ies ingrédients du milieu FHGL est muhipliée par deux (Tous
2x). Un tel effet n'est pas provoqué par le doublement de la dose du maltose (Maltose 2x) ou des sels (SeIs 2x). En effet, pour le génotype Léger, le nombre d'embryons obtenus lorsque la
dose de tous les ingrédients du d i e u d'induction FHGL semi-liquide est doublée (Tous 2x)
est significativement plus éievé que Ie nombre d'embryons produits avec tout autre traitement.
De &me, le nombre de plantes vertes produites par 100 anthères, quand la dose de tous les
ingrédients est doublée dans le milieu FEGL (Tous 2x1, est sigmfkativement plus élevé que
celui de tous les autres traitements. Le doublement de la dose de maltose ou des sels ne peut
donc pas expliquer la muItiplication du nombre de plantes vertes observt lorsque La dose de
tous les ingrédients du milieu FKGL est doublée «Tous 2x». Il est possible que certains
ingrédients dont la concentration est doublée puissent provoquer l'effet bénéfique observé sur
l'embryogenèse et la régénération des embryons en plantes vertes. Les travaux rt5alids dans le
cadre de ce projet de recherche ne permettent pas de cibler queiles autres composantes du
milieu d'induction FHGL semi-liquide auraient un effet stimulateur sur I'androgenèse en
culture d'anthères. Ces travaux ne permettent également pas de vérifier l'existence d'une
synergie entre les composantes du rniIieu d'induction, ni de savoir si les proportions entre ks
composantes du milieu doivent être respectées pour b6nèficier de l'effet stimulateur du
prémitement <<Tous 2 x ~ .
La phytohormone, les acides aminés ou les vitamines présents dans te milieu FHGL d'induction semi-liquide pourraient participer à l'effet stimulateur du prétraitement (<Tous 2x»
sur I'androgenèse. D'un autre côté, l'effet du prétraitement <Tous 2xr pourrait Erre osmotique. Seuls des travaux de recherche complémentaires permettront de déterminer I'origine et le mode d'action du prétraitement «Tous 2x».
5.1. Retour sur l'hypothèse de recherche
Une hypothèse de recherche a été émise au début de ces travaux: d e s microspores
d'orge en culture d'anthères in vitro sont très sensibles à la concentrution des composantes du milieu d'induction FHGL semi-liquide pendant les premiers jours de la phase
d'induction *.
On a effectivement démontré que les microspores, en culture d'anthères in vitro, sont
très sensibles à la composition du milieu d'induction dès les premiers jours suivant la
dissection et la mise en culture des anthères. On a aussi démontré que la concentration des
ingrédients du milieu d'induction FHGL semi-liquide, au début de la phase d'induction en
culnue d'anthères, affecte la production moyenne d'embryons, de plantes vertes et de plantes
albinos par 100 anthères. La composition du milieu d'induction pendant les premiers jours de
la phase d'induction a donc une grande importance sur l'initiation de l'androgenèse et la
régénération de plantes vertes.
La réalisation des objectifs de recherche a permis de démontrer qu'un doublement de la
quantité de tous les ingrédients dans le milieu d'induction FHGL semi-liquide (traitement
«Tous 2x») pendant les quatre ou les six premiers jours de la période d'induction en culture
d'anthères, stimule l'androgenèse, septuple la production de plantes vertes chez le cultivar
Léger et double la production de plantes vertes chez le cultivar Cadette.
À la lumière de ces résultats, obtenus lors de l'utilisation de différents milieux de
prétraitement des anthères, il apparaît très bénéfique de doubler la dose «Tous 2x» de tous les
ingrkdients du milieu FHGL semi-liquide pour améliorer la production de lignées HD d'orge
en culture d'anthères. Les effets du prétraitement des anthères, avec le milieu <<Tous 2x», sur
la production d'embryons, de plantes vertes ou de plantes albinos par 100 anthères, sont très
satisfaisants. Le prétraitement stimule l'androgenèse chez les génotypes Léger et Cadette et
permet egalement, chez ces deux ghotypes, de diminuer le taux d'ûibinisme. Ceci indique que
ce prétraitement pourrait être utilisé de façon générale sur des génotypes dont la réponsc
androgénique est moins connue. sans crainte d'un effet négatif sur la production de lignées H I
d'orge de printemps.
Ces travaux démontrent donc qu'il est possible d'améliorer le taux de production dr
lignées HD par 100 anthères. L'amélioration du taux de production des plantes vertes aura LU
impact direct sur les coûts de production des lignées HD. Ces travaux exploratoires sont donc
importants, car ils ont permis de cibler une des étapes clefs de la culture in vitro des anthères.
5.2. Essais d'application du prétraitement «Tous 2x» en production de lignées HI: d'orge de printemps.
Les travaux de recherche effectués ont permis de développer des outils pour améliore1
la production de plantes vertes en culture d'anthères. Dans l'optique d'un transfert des
techniques de production de lignées HD au secteur de l'amélioration privée de l'orge.
l'augmentation du taux de production de plantes vertes obtenues par l'application d'un
prétraitement aux anthères au début de la phase d'induction est très rentable.
5.2.1. Première tentative d'application du prétraitement «Tous 2x» à la production de lignées HD d'orge de printemps
Une première tentative d'application du protocole de prétraitement «Tous 2x» à la
production à grande échelle de lignées HD a été réalisée. Au cours de cette première tentative,
il y a eu des problèmes élevés de contamination dans les milieux de prétraitement où étaient
déposées des anthères d'orges provenant d'hybrides Fi. Ces contaminations semblaient être
d'origine bactérienne. Le contenu élevé en acides aminés du milieu de prétraitement «Tous
2x» peut favoriser le développement des bactéries endogènes présentes dans les tissus mis en
culture. 11 n'existe actuellement pas de solution miracle pour remédier à ce problème
technique, découlant des conditions de culture des plantes-mères. L'amélioration de la qualité
de I'environnement et des conditions de croissances des plantes-mères demeure pour l'instant
un des éléments clefs de la réussite de I'androgenèse in vitro. Cependant, des solutions
pourraient être apportées bientôt. Par exemple, Eudes et al. (1995) rapportent que l'addition de
lysozyme dans le milieu de culture in vitro permet de contrôler le développement indésirable
de bactéries Gram-positives comme Baccillus subtilis.
5.2.2. Deuxième tentative d'application du prétraitement «Tous 2 m à la production de
lignées HD d'orge de printemps
Une seconde tentative d'application du protocole de prétraitement des anthères «Tous
2x» à la production à grande échelle de lignées HD a été réalisée. Au cours de cette seconde
tentative, il n'y a eu aucun problème de contamination du milieu de prétraitement et le
prétraitement a été comparé avec la procédure conventioanelle de production de Iignées HD d'orge de printemps en vigueur au laboratoire de phytogénétique du département de
phytoiogie de l'université Laval. Le génotype Léger et des hybrides «Cadette X Accan,
MBQCB-IO X Bedford» et «Acca X Bedford» ont été utilisés comme plantes-mères.
GIobalement, Ie traitement «Tous 2x» a permis de doubler la production de plantes vertes par
rapport à la technique conventionnelle (données non présentées).
Cependant, le degré de stimulation de la production de plantes vertes varie selon le
génotype traité. Les génotypes qui présentent une faible réponse androgénique avec le
traitement témoin ont aussi une faible réponse androgénique avec le traitement <<Tous 2x»; Ia
Fi ((BQCB-10 X Bedford» présente une très faible réponse androgénique, avec ou sans
prétraitement des anthères (D. Chénard, cornm. pers.).
Par conue? la variabilité de la réponse androgénique observée d'un épi à I'auue à
l'intérieur d'un même génotype est beaucoup moins exprimée lorsque le prétraitement «Tous
2x» est appliqué aux anthères. Ce prétraitement permet donc de compenser, en partie, l'effet
d'un matériel végétai de moins bonne qualité, d'uniformiser la réponse androgénique à
l'intérieur d'un même génotype et de stimuler le taux de régénération des plantes vertes.
Les résultats obtenus lors de la deuxième tentative d'application à grande échelle du
prétraiternent confirment donc que le prétraitement des anthères «Tous 2x», appliqué dès le
début de la phase d'induction, a un effet positif sur l'androgenèse, qu'il peut être utilisé pour
diminuer la variabilité de la réponse androgénique à l'intérieur d'un même génotype, et qu'il
améliore la production globale de plantes vertes par 100 anthères en production de lignées HD d'orge de printemps.
53. Perspectives d'optimisation du prétraitement des anth&res
Une suite à ce projet de recherche est impérative. U est important de cibler quelles sont
les composantes du miIieu FHGL semi-liquide qui, deux fois plus concentrees pendant les
premiers jours de la phase d'induction, provoquent une stimulation de la régénération des
plantes vertes. Une meilleure connaissance des relations entre les composantes du milieu de
prétraitement et ses effets physiologiques sur l'initiation de l'embryogenèse et Ia formation
d'embryons plus aptes à se régénérer en plantes vertes permettra de transférer cette
technologie Zt la culture des microspores isolées pour la production de lignées HD d'orge. Ces
connaissances pourraient aussi être transférées à la production de lignées d'autres cérédes
comme le blé.
Des études concernant la durée de prétraitement des anthères et la concentration des
ingrédients du milieu FHGL semi-liquide sont également ndcessaires pour compléter les travaux rapportés dans ce mémoire. Seuls des travaux de recherche supplémentaires
permettront de déterminer l'origine et le mode d'action de I'effet stimulateur du prétraitement
«Tous 2x». Pour mieux généraliser I'effet des pr6traitements appliqués aux anthères, un pIus
grand nombre de génotypes et d'hybrides (Fi, F2, RC1, etc.) devrait être utilisé.
5.4. Impacts de la culture des anthères en amélioration des céréales
Pour demeurer compétitifs, les améliorateurs, Ies obtenteurs ou Ies sélectionneurs de
variétés végétales doivent adopter de nouvelles stratégies pour accélérer et mieux cibler leur
programmes de sélection. Cela doit être fait en coopération avec le biologiste végéral
(Bonjean, 1995). L'intégration des techniques d'haplodiploïdisation dans les programmes
privés d'amélioration de l'orge semble très prometteuse. Chez l'orge de printemps, Bonjean
(1995) rapporte que la production de semences à partir d'haploïdes doublés est possible en un an. Ce temps inclut la culmre des parents hybrides FI. Les techniques d'haplodiploïdisation
permenent aussi de créer de nouvelles variétés fixées directement à partir d'hybrides F2 ou à
tout autre stade de sélection d'un programme d'amélioration (Xu, 1990). La sélection au
champ du matériel intéressant est facilitée par le caractère totalement homozygote des lignées
HD, car le phénotype, exprimé en absence d'un effet environnemental majeur, correspond au
génotype de la plante. En plus, l'expression des gènes n'est pas affectée par Ie caractère
dominant, partiellement dominant ou récessif de ces gènes, et il y a absence de masquage ou
d'hétérosis dans le génome des lignées d'orge HD. Les lignées HD sont donc plus facilement
caractérisables et les caractères sélectionnés sont stables et présents chez la descendance issue
de la reproduction autogame.
L'adoption et l'utilisation efficace et rentable des lignées HD en amélioration des
céréales nécessite: 1) que la technique d'haplodiplo'idisation utilisée permette Ia production en
grand nombre de lignées HD, et ce avec la plus grande diversité de génotypes parentaux
possibles, 2) que Ia population de lignées HD issue d'un parent hybride soit représentative de
la diversité des gamètes parentaux produits, et 3) que les lignées HD produites soient
génétiquement stables (Snape et al., 1986).
À l'heure actuelle, la production de lignées HD en grand nombre avec une plus grande
diversité de génotypes parentaux est le facteur qui limite le plus l'adoption de
I'haplodiploïdisation dans le secteur de l'amélioration privée. Les progrès réalisés dans le
domaine de l'androgenèse in virro en cuiture d'anthères et de microspores isolées offrent
l'espoir d'éliminer prochainement ce problème majeur. La poursuite plus détaillée des travaux
présentés dans ce mémoire doit inclure Ieur adaptation à la culture des microspores isolées.
Cette technique d'haplodiploïdisation permet de produire plus de plantes vertes par 100
anthères que la culture d'anthères selon certains laboratoires. Nous avons démontré que les
premiers jours de la culture in vitro des anthères sont une étape clef en androgenèse in vitro; il
pourrait en être de même pour la culture des microspores isolées.
En attendant de nouveaux développements techniques majeurs, les techniques
d'haplodiploïdisation demeurent complémentaires aux techniques d'amélioration
conventionnelles, mais leur contribution dans ce domaine est certes non négligeable. Des
efforts de recherche supplémentaires doivent donc être fournis afin de rentabiliser
l'investissement que reprksente l'intégration des Lignées HD dans le secteur privé de
t'amélioration des céréales.
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A N N E X E S
Stades de développement des microspores uninucléées utilisées en culture in
vitro d'anthères chez l'orge
P
noy
nuc
int
exi
P Pore poiiinique noy Noyau nuc Nucléole int Paroi pollinique interne: intine ext Paroi poUinique externe: exine
ANNEXE B
Numérotation aléatoire des traitements
No. - .. -
Traitement No. Traitement
Tous Ox; 6 jours
Maitose 2x; 4 jours
Maltose Ox; 6 jours
Sels 3x; 4 jours
Sels 3x; 6 jours
Seb 2x; 4 jours
Tous 3x; 4jours
Témoin i x; 4 jours
Sels Ox; 6 jours
SeIs 2x; 6 jours
Tous 3x; 6 jours
Tous Ox; 4 jours
Maitose Ox; 4 jours
Maitose 3x; 6 jours
Témoin f x; 6 jours Maltose 3x; 4 jours
Témoin lx 6 jours
Témoin lx: 6 jours
T6moin 1 x; 4 jours
SeIs Ox; 4jours
Tous 2x; 6 jours
Maltose 2x; 6 jours
Témoin lx; 4 jours
Tous 2x; 4 jours
Témoin 1,2 ml
ANNEXE C.1
Plan des répétitions et des sous-blocs, cv. Léger
RepIt [419 17* 19 16 20 18 Repu [8] 3 23 13 18 8 [SI 23 25 21 24 22 [6] 16 21 1 6 1 1 [ i l 1 2 4 5 3 173 17 22 12 2 7 131 12 14 13 15 1 1 [9] 14 24 4 19 9
[21 6 9 7 8 1 0 [IO] 5 10 25 20 15 7 Numkro de la répétition
Numéro du bloc l Numéro du naitement
Rep ïïï [14] 23 10 4 17 1 1 Rep TV [17] 16 24 2 10 13 [12] 2 21 8 14 20 [ZO] 8 22 5 1 1 19 [Il] 19 13 25 7 1 [19] 21 15 7 4 18 [15] 18 24 5 12 6 [16] 20 12 23 9 1 [13] 9 15 22 3 16 1181 6 25 3 14 17
Rep V [23] 19 12 10 21 3 Rep Vi [26] 18 14 1 22 10 [25] 5 7 23 14 16 [28] 20 24 3 7 11 [21] 24 1 8 15 17 [30] 5 17 21 13 9 [22] 2 1 1 25 9 18 [29] 12 25 4 16 8 [24] 13 20 6 22 4 [27] 23 6 15 19 2
Plan des répétitions et des sous-blocs, cv. Cadette
RepIt [219 9' 8 7 10 6 Rep II [8] 23 18 3 8 13 [SI 21 23 25 22 24 [IO] 25 10 15 20 5
- -
Numéro de la répétition " Numtro du bloc Numéro du maitement
Repm 1121 2 21 20 8 14 R e p N [17] 24 13 2 16 10
RepV [22] 18 9 25 2 11 RepVI[30] 21 5 9 17 13 [25] 23 5 7 14 16 [28] 3 24 20 11 7
ANNEXE D
Protocole de préparation d'un litre de milieu d'induction FHGL semi-liquide et d'un litre de
milieu de régénération FHGL solide
Tous les milieux sont préparés avec de l'eau déionisée (18 Mi2 - cm; NANOpure,
ultrapure water system, Bamstead, Iowa). La liste des composantes des milieux FHGL semi-
liquide et solide est présentée au tableau 3.1 (chap. III).
Miïieu d'induction FHGL semi-liquide
Le milieu FHGL semi-liquide témoin (milieu de base) ainsi que les différents milieux
de prétraitement sont préparés en une seule phase pour éviter les conditions de filtration
difficiies quand la dose de maltose et de tous les ingrédients est doublée ou triplée.
- Tarer un bécher de lL et y peser directement Ie Ficoll.
- Ajouter 600 ml d'eau déionisée dans le bécher et amener le mélange à ébullition légère en agitant constamment.
- Lorsque le FicolI est complètement dissous. laisser tiédir un peu la solution en l'agitant constamment, puis ajouter le maltose.
- Lorsque la température de la solution de Ficoll et de maltose est environ de 24-26°C incorporer les autres ingrédients, un par un selon l'ordre donné au tableau 3.1, à l'exception du CaC12 et du Fer qui doivent être ajoutés en dernier lieu,
- Quand torrs les ingrédients sont intégrés, ajuster le volume de la solution à 975 ml à l'aide d'eau déionisée.
- Ajuster le pH de la solution à 5,6 à l'aide d'une solution de KOH ou de HCI (1 ou 0'1 N).
- Compléter le volume de la solution à 1000 ml (IL) avec de l'eau déionisée. Bien agiter la solution pour obtenir un milieu homogène.
- Filtrer stérilement le milieu sous une hotte à flux laminaire à l'aide d'un filtre (VacuCapTM 90 Filter Unit 0,2 pm, Gelman Sciences, Michigan, U.S.A.) installé sur une bouteille (PYREX Brand Laboratory bottles) de 1L.
- Conserver Ies milieux qui ne sont pas immédiatement utilisés à 4°C.
Milieu de régénération FHGL Soüde
Le milieu FHGL solide de régénhtion est préparé en deux phases: une phase autodav& et une phase filtrée.
1) Phase autoclavée
- Porter à ébullition 500 ml d'eau déionisée dans un erlenmeyer de 2L. Ajouter I'agar par petites quantités. Boucher I'erlenmeyer à I'aide d'un bouchon mousse de type «Dispo Plugs» (No. T1387, Baxter Corporation division Canlab, Ont. Can.). Recouvrir le goulot de I'erlenmeyer et le bouchon mousse d'une double couche de papier d'aluminium. Autoclaver la solution 20 minutes à 12 1 OC.
- Lorsque la stérilisation est complétée, laisser tiédir Ia solution d'eau et d'agar en l'agitant constamment. La température de la solution ne doit pas diminuer audessous de 30°C. sinon le mélange poumit se solidifier lorsqu'on y incorpore la phase filtrée. D'un autre côté, la tempékature de la phase autoclavée ne doit pas être supérieure à 40°C. Une température trop chaude entraînerait une dénaturation des composantes thermolabiies de La phase filrrée.
2) Phase filtrée
- Dissoudre le maltose dans 300 ml d'eau déionisée.
- Lorsque le maltose est complètement dissous, incorporer les autres ingrédients, un par un, selon l'ordre d'apparition des ingrédients au tableau 3.1, à l'exception du CaCb et du Fer qui doivent êrre ajoutés en dernier lieu.
- Compléter le volume de la solution à 450 ml.
- Ajuster le pH de cette solution à 5,6 avec des solutions de KOH (1 ou O, 1 N) ou de HCl (1 ou 0.1 N).
- Compléter le volume de la solution à 500 mi avec de l'eau déionisée. Bien agiter pour homogén6iser Ia phase filtrée.
- Filtrer stérilement la solution sous une hotte à flux laminaire à l'aide d'un filtre (VacuCapTM 90 Filter Unit 0,2 pm, Gelman Sciences, Michigari, U.S.A.) installé sur une bouteille (PYREX Brand Laboratory botties) de 500 ml .
3) Intégration de la phase filtrée à la phase autoclavée
- Lorsque la phase autoclavée est assez refroidie, y ajouter la phase fdtrée.
- Une agitation constante est nécessaire lors du mélange des deux phases. Distribuer immédiatement le &eu dans les cuvettes de culture.
- Laisser le milieu refroidir au moins Z heure sous la hotte avant de l'utiliser ou de sceller les cuvettes à l'aide de ~arafüm@ *M> (Arnerican National Can TM, Greenwbich). Entreposer le d i e u à 4°C s'il n'est pas utilisé au cours de la semaine suivant sa fabrication.
Mesure de la pression osmotique des milieux utilisés pour le prétraitement des anthères au
début de la phase d'induction
Milieux Mesure 1 Mesure 2 Mesure 3 Mesure 4
FHGL liquide
FHGL semi-liquide (Témoin Ix et 1,2 mi)
Tous Ox Tous 2x Tous 3x
Maitose Ox Maltose 2x Maltose 3x
Sels Ox Sels 2x Sels 3x
Pressions osmotiques mOsm K g 1 H20+t
t Détermination de la pression osmotique par osmomérrie a congélation (Advanced Wviicro4 modèle 3M0, Advanced Instruments. hc.. Massachusetts) Facteur de convesion de mOsm Kg' HzO à MPa = 423.9
O Plus grand que 2000 mOsm Kg' H20 Icapacid de mesure maximale de l'appareil)
Moyenne
275
463
110 98 1
> 2000
198 650
> 2000
429 5 10 577
ANNEXE Fm1
Production d'embryons par LOO anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu RiGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les six premiers jours de la phase
d'induction, cv. Léger et Cadette
Cadette Léger
Traitements Données Brutes
Témoin 1,2 ml' 484 532
Tous Ox TOUS lx' Tous 2x
Tous 3x
Maltose Ox Mdtose l x '
Maltose 2x
Maltose 3x
Sels Ox
Sels lx' Sels 2x
Sels 3x
4 jours 6 jours 4 jours 6 jours
' Milieu d'induction FHGL semi-liquide à la concentration témoin des composantes. tel que dCcnt au tableau 3.1.
Production de plantes vertes par 100 anthbres pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrbdients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les six premiers jours de Ia phase d'induction, cv. Cadette
Traitements Données Données Données TransfomCes+ Détrünsformées Brutes
Témoin 1,2 ml' 1,40 3 ,O6 5,56 Données Donn6es Données Transformées" Détransfornit5es Brutes
4 jaurs 6 jours
Tous Ox 0,64 0,89 2.32 0,22 0,25 0,46
TOUS lx4 1 ,O4 1,83 4,32 0,66 0,93 2,47 Tous 2x 1,20 2,33 6,48 1,48 $40 9,26
Tous 3x 1,77 4,89 6,95 0,22 0,25 0,46
Maltose Ox 0,Oo 0,Oo 0.00 0,22 O,25 0,46
Maltose 1 x ' 1 ,O4 1,83 4,32 0,66 0,93 2,47
Maltose 2x 0,69 0,99 2,32 0,92 1,50 11,11
Maltose 3x 1.35 2,86 5,56 0.76 1,15 3.24
Sels Ox 0,79 1,20 3,24 0,67 0,96 2,78
Sels lx' lm 1,83 4,32 0,66 0,93 2,47
Sels 2x 0,89 1,44 3,24 0.83 1,30 3,70
Sels 3x (lm w)o 0,OO 0,67 0,96 2,78
* Milieu d'induclion FHGL senii-liquide h la conceniraiion idinoin des coinpsanlcs, le1 que ddcrit au tableau 3.1. * DonnCes transfonnees (log Ix+l])
Production de plantes albinos par 100 anthhres pour quatre doses de I'ensenible de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Cadette
Traitements Donndes Donnies Données Transfom6es+ DQransforinées Brutes
Témoin 1,2 ml' 3,36 27 ,66 36,ll Données Données Données Transformkes* Détransformées Brutes
4 jouis 6 jours
Tous Ox 0,92 1,5 1 5 ,O9 0,45 0,57 2,32 Tous lx* 2,98 18,65 25,77 2,56 1 1,97 24,85 Tous 2x 2,59 12,38 19,45 2,76 14,8 1 18.52 Tous 3x 1,98 6,26 12,97 0,OO 0,OO
Maltose Ox 0,Oo 0,Oo 0,44 0,56 0,93 Maltose lx' 2,98 18,65 25,77 2,56 1 1,97 24,85 Maltose 2x 2,44 1 0,47 15,28 1,72 439 28,24 Maltose 3x 1,60 3,97 7,4 1 1,22 2,40 5.56
Sels Ox 2,54 1 1,67 28,24 1,37 2,93 20,37
Sels 1 x' 2,98 18,65 25,77 2,56 1 1,97 24,85 Sels 2x 2,18 7,86 17,13 2,47 10,77 19,91 Sels 3x 0,97 1,65 6,02 1,16 2,19 12,96
' Mitieu d'induclion FHGL semi-liquide ?I la concentration ifnioin des coinpanles, I C I que décrit au tableau 3.1. * Donnks transformCes (log [x+l])
Production de plantes vertes par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrédients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prétraitement des anthères, pendant les quatre ou les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Léger
Traitements Données Données Données Transformées+ Détransformées Brutes
TCmoin 1,2 ml' 1,45 3,28 6,48 Données Donndes Données Transformées+ D6transformées Brutes
4 jours 6 jours
Tous Ox 1,lO 2,O 1 4,17 0,22 0,25 0,46 TOUS lx' 0,97 1,63 3 ,O9 1,22 2,40 3,86 Tous 2x 2,56 1 1,93 16,20 2,85 16,32 23,15
Tous 3x 1,36 2,89 5 ,O9 0,70 1,OI 3,24
Maltose Ox 1,11 2,04 6,48 2,O 1 6,42 1 0,65 Maltose 1 x' 0,97 1,63 3 ,O9 1,22 2,40 3,86
Maltose 2x 0,59 0,8 1 1,85 1,22 2,40 6,95
Maltose 3x lm 1,84 3,7 1 1,78 4,9 1 7,4 1
Sels Ox 0,37 0,45 1,39 0,86 1,36 2,78 Sels lx' 0,97 1,63 3 ,O9 1,22 2,40 3,86 Sels 2x 0,95 1,59 3,24 t ,26 2,52 5 ,O9 Sels 3x 1,40 3 ,O4 6,48 0,67 0,96 2,78
Milieu d'induction FHGL semi-liquide B la conceniration itnioin des composantes, tel que décrit uu (ahleau 3.1. + Donntes iransformtes (log lx+ I l )
Production de plantes albinos par 100 anthères pour quatre doses de l'ensemble de tous les ingrddients, du maltose ou des sels du milieu FHGL semi-liquide, appliquées en prét raitement des antheres, pendant les quatre ou les six premiers jours de la phase d'induction, cv. Uger
Traitements Données Données Dondes Transfomides* Détransform&s Brutes
Tbmoin 1,2 ml' 1,78 4,95 1 0,65 Données Donn6es Donndes Trunsformées+ Détransformées Brutes
4 jours 6 jours
Tous Ox 1 ,O4 1,84 3,7 1 0,37 0,45 1,39
TOUS l x ' 0,92 1,52 3 ,O9 1,lO 1,99 4,32 Tous 2x 1,27 2,57 6,95 I,42 3,12 5 ,O9 Tous 3x 0,22 0,25 0,46 0,22 0,25 0,46
Maltose Ox 1,21 2,35 6,02 135 3,69 6,95
Maltose lx' 0,92 1,52 3 ,O9 1,lO 1,99 4,32 Maltose 2x 0,OO 0,OO (),O0 0,85 1,34 2,32
Maltose 3x 0,44 0,56 0,93 1,65 4,22 5,56
Sels Ox 0,67 0,94 1,39 0,54 0,7 1 1,39
Sels lx' 0,92 1,52 3 ,O9 1,lO 1,99 4,32
Sels 2x O() 0,OO 0,Oo 1,42 3,12 $56 Sels 3x 0,67 0,96 2,78 0,59 0,8 1 1,85
' Milieu d'iiiduciion FHGL semi-liquide h la concentraiion témoin des cornposiinies, iel que décrii au iuhlcaii 3.1. * Donnees transfomees (log 10 [x+ l 1)
Tableau des coefficients iittribubs aux traitements (suite)
Coefficients
Traitements 3x 1 x 3x L X I x 1 x ox 2x 2x 1 x 2x 1,2 ml Maltose ldmoin Maliose tdmoin iénioin tdnioin Sels Tous Maltose temoin Tous ternoin
Durées 6jours 6 jours 4 jours 6 jours 6 jours 4 jours 4 jours 6 jours 6jours 4 jours 4 jours
Contrastes
0,4 ml vs 1.2 ml Durée Maltose Linéaire Maltose Quadratique Maltose Cubique Sels Lindaire Scls Quadratique Sels Cubique Tous Lintaire Tous Quadratique Tous Cubique Durée X Maltose Lin Durée X Mallose Qua Durde X Maltose Cub Durée X Sels Lin Durte X Sels Quo Dur& X Sels Cub Durde X Tous Lin Durée X Tous Qua Durée X Tous Cub 2 Maltose X 2 Tous 2 Sels X 2 tous 3 Maltose X 3 Tous 3 Sels X 3 Tous
* Une pondCraiion égale es1 accordée aux traitements «Tdinoin 1 x» pour les préirnitements de quatre jours et pour les prdtraitcinents dc six jours
f MAI; t LVALUATION TEST TARGET (QA-3)
APPLIED IMAGE. lnc - = 1653 East Main Street - -. -, Rochester. NY 14609 USA -- -- - , Phone: 71 6/482-O3GU -- -- - - Fax: 71 61288-5989
O 1993. Applied Image. 1%. All Rigins Resewed