cxcr4 et gab1 coopèrent pour contrôler le développement des cellules progénitrices des muscles...

CXCR4 et Gab1 cooprent pour contrler le dveloppement des cellules prognitrices des muscles migrantes Elena Vasyutina Accept le 13 juillet 2005

Bibliographie Dermomyotome = origine des muscles squelettiques dembryon de vertbrs. Cellules ventrales du dermomyotome => perte morphologie pithliale => dlamination => migration. Formation cellules prognitrices => muscles hypaxial des extrmits, la langue et le diaphragme. Nombreux gnes essentiels pour le dveloppement des progniteurs migrants hypaxial : Pax3 requis pour ltablissement correct dun pool de progniteurs dans le dermomyotome ventral. Rcepteurs tyrosine kinase c-Met + ligands essentiels pour dlamination des progniteurs qui sont destins migrer. Gab1 code pour une molcule adaptatrice qui transmet le signal c-Met. Lbx1 code pour un facteur de transcription homdomaine, qui est exprim exclusivement dans les progniteurs migrants qui forment les muscles hypaxial. Inactivation de Lbx1 altrent la migration des progniteurs en migration tandis que les autres populations de cellules musculaires trouvent leur cible. => Les diffrents sous populations de cellules prognitrices de muscles rencontrent et rpondent des slections distinctes durant la migration.

Bibliographie (2) Cellules qui ont trouv leur cible => prolifration => expression des facteurs rgulateurs myogniques (MyoD, Myf5, la myognine et MRF4) => programme de diffrenciation. Rcepteurs aux chimiokines + ligands rgulent la migration des cellules. SDF1 = ligand du rcepteur CXCR4. Mutants CXCR4 ou SDF1 de souris => Problme migration des cellules. Sites prfrentiels dans la mtastase du cancer du sein de la femme corrls avec lexpression de CXCR4 dans les cellules tumorales et avec lexpression de SDF1 dans les organes envahit par les cellules mtastases. => Fonction possible de CXCR4/SDF1 dans les cellules musculaires.

But => Dtermination des gnes impliqus dans la migration des cellules prognitrices des muscles, lors du dveloppement chez lembryon de poussin et souris. Expriences ralises : Dtermination du profil dexpression des gnes Lbx1, CXCR4 et SDF1 dans des embryons de poulet et de souris, diffrents stades de dveloppement. Effets de SDF1 sur les cellules progntrices de muscles. Distribution spatiale de CXCR4 dans les bourgeons musculaires.

Rsultats

Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de muscles par le profil dexpression des gnes. Cration du mutant Lbx1 GFP : Lbx1 exprim durant le dveloppement dune large gamme des cellules migrantes hypaxial, mais non dans les autres types de cellules prognitrices de muscles. Pour isoler des progniteurs de muscles par tri de cellules => gnration dun mutant de lallle Lbx1 fusionn la GFP par recombinaison homologue dans des cellules ES (Fig A). Slection des cellules Lbx1 GFP => Southern blot (Fig B).

Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de muscles par le profil dexpression des gnes (2). Protine GFP produite par lallle Lbx1 GFP localise dans les cellules migrantes prognitrices du muscle au niveau dorsale et ventral des membres (Fig C). Anti-Lbx1 en rouge. Anti-GFP en vert.

Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de muscles par le profil dexpression des gnes (3). Profil dexpression des gnes dans les cellules Lbx1 GFP : Des cellules prognitrices de muscles GFP+ ont t isol au niveau de bourgeons de membres. Membres antrieurs dembryon de stade 10.5 jours ont t dissqu, les cellules ont t dissoci, et les cellules GFP+ ont t isol par cytomtrie de flux. Sondes gnres par de lARN obtenu de ces cellules et utilises pour lhybridation Affymetrix GeneChips. Technique Affymetrix GeneChips Utilisation de micropuces sur lesquelles on dpose des squence dADN qui vont reprsenter lensemble du gnome des cellules que lon tudie. Les sondes gnres permettront de voir directement sur les puces les gnes qui sont actifs ou rprims dans le type cellulaire tudi.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin. Expriences ralises des techniques dhybridation in situ et dimmunohistochimie. CXCR4 exprim dans les bourgeons des membres (Fig A,C,E). Distribution de lexpression de CXCR4 similaire celle de Pax3 ou de Lbx1 mais non identique dans les cellules prognitrices des muscles. Jet de cellules CXCR4+ observ le long de la chorde hypoglossal et dans larc primaire branchial, le long de la route et au niveau de la cible des cellules prognitrices migrantes des muscles qui gnrent le muscle intrinsque de la langue (Fig G). Anti CXCR4 en rouge Anti Lbx1 en vert

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (2). Lexpression de SDF1 peut tre dtect dans les membres en bourgeon du msenchyme, et le schma dexpression est identique au cours du dveloppement (Fig B,D, F). Quand les cellules prognitrices des muscles se dlaminent => SDF1 exprim dans le bourgeon proximal des membres (Fig B,D). Aprs que les cellules soient entres dans les membres, lexpression de SDF1 est aussi observe plus tale dans le msenchyme (Fig F) => Les cellules migrantes prognitrices de muscles, dans les muscles, sont trouves la proximit des cellules exprimant SDF1. Comparaison dun contrle et dembryons Lbx1 -/- => schmas dexpression similaire pour SDF1 => progniteurs de muscles nexpriment pas SDF1.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (3). Analyse de la distribution de Lbx1 et CXCR4 par immunohistochimie, pour identifier si CXCR4 et Lbx1 sont exprims dans les mmes populations de cellules. Cellules CXCR4+ dans les masses de pr- muscles des membres, sont aussi Lbx1+ => CXCR4 est prsent dans les cellules migrantes prognitrices (Fig D). Cependant, pas toutes les cellules Lbx1+ expriment CXCR4 !

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (4). Lbx1 apparat dans les progniteurs prcdant leur dlamination du dermomyotome ventral (Fig A). CXCR4 et Lbx1 co-exprims aprs que les cellules migrantes prognitrices aient migr en dehors du dermomyotome (Fig A). Protine CXCR4 prsente dans les cellules qui sont dj entr dans le membre antrieur au stade 10.0 10.25 jours, mais localise seulement dans une sous-population de cellules Lbx1+ qui sont localises prs de lectoderme (Fig A,B,C). Entre les stades 10.25 et 11, le nombre de cellules CXCR4+ augmentent, mais un nombre signifiant de cellules Lbx1+ restent ngatives pour CXCR4 (Fig B,C).

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (5). Toutes les cellules Pax3+ dans les membres co-expriment Lbx1. Des cellules Pax3+/CXCR4+ et Pax3+/CXCR4- existent dans les membres. Schmas de lhybridation in situ de CXCR4 et Pax3 similaires mais non identiques => toutes les cellules Pax3+ nexpriment pas CXCR4.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (6). Examination de CXCR4 et MyoD par immunohistologie => populations de cellules CXCR4+ et MyoD+ distinctes (Fig E,F). Cellules MyoD+/Lbx1+ ou MyoD+/Pax3+ sont frquemment dtectes. Dans membres dvelopps, cellules CXCR4+ places plus prs de lectoderme que les cellules MyoD+. =>Les progniteurs migrants des muscles nexpriment pas CXCR4 au moment o ils sont dans le dermomyotome. Cellules CXCR4+ co-expriment Lbx1 et Pax3, cest dire, les protines connues pour tre exprimes dans les progniteurs migrants, mais non le facteur de diffrenciation musculaire MyoD. => Ainsi, CXCR4 est rgul ngativement dans les progniteurs de muscle primaires pour leur diffrenciation (Fig 3G).

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (7). Reprsentation de lexpression des gnes dans les cellules prognitrices des muscles durant le dveloppement

Les cellules CXCR4 rpondent-elles SDF1? Western blot Vrifie que les protines SDF1 ont t exprim par le plasmide et non par la cellule Cos1

Accumulation de CXCR4 prs de limplant Application de SDF1 aux positions ectopiques dans le membre de poussin Rvlation par hybridation in situ

Par hybridation in situ avec une sonde Pax3 Redistribution substantielle des cellules prognitrices des muscles

Redistribution plus prononce de CXCR4 par rapport Pax3 Certaines cellules de Pax3 nont pas rpondu SDF1 SDF1 attire les cellules CXCR4

Effet de SDF1 sur la diffrenciation Signaux dhybridation infrieur

conclusion SDF1 attire seulement des cellules CXCR4, cellules prognitrices des muscles. SDF1 supprime leur diffrenciation

Distribution des cellules hypaxiales Les outils ncessaires: -un allle mut de CXCR4, not CXCR4-/- et Gab1, not Gab1-/- -Anticorps anti-Lbx1 et anti-MyoD ( pour visualiser les populations de cellules)

contrle Diminution de Lbx1 et MyoD Hypoglossal cord

Le nombre de Lbx1, MyoD est infrieur du contrle Lbx1, MyoD ne sont pas discernable Dans les cellules doubles mutants, les cellules Lbx1 natteignent pas leur cibles

Il est impossible de compter des cellules quantification Membres diviser en 4 domaines : I = domaine dorsal proximal II = domaine dorsal distal III = domaine ventral proximal IV = domaine ventral distal

Diminution de nombre de Lbx1 Diminution du nombre de MyoD plus importante dans le domaine dorsal distal par rapport au domaine dorsal proximal

Ils ont compt tous les noyaux apoptotique Augmentation significative dapoptosis dans le domaine dorsal proximal dans les cellules mutants Les cellules prognitrices des muscles ne sont pas correctement distribues et leur survie est altre dans le domaine I dans les embryons muts

Analyse de leffet de CXCR4 mutant dans Gab1 Les cellules Lbx1 et de MyoD ont diminu

Analyse de la mort cellulaire Le nombre de cellules apoptotique augmentent dans le domaine I

La gnration dun muscle Comparaison du muscle de la langue et du membre de contrle Anticorps anti-myosine et anti-MyoD Muscle intrinsque Muscle extrinsque

Muscle intrinsque Partie proximal Drive du msenchyme Partie distal Drive des somites occipital

Aucune diffrence

diffrence Le muscle intrinsque est petit mais observable -Un fragment du muscle intrinsque dans le domaine proximal -la taille globale est petite

conclusion Simple mutant CXCR4 Cellules Lbx1 et MyoD Diminution modre Aucune diffrence dans le dveloppement de la langue Double mutant Diminution importante des cellules Lbx1 et MyoD Un fragment du muscle intrinsque et une langue petite

La rduction modre des cellules Lbx1, aux tapes dvloppementales prliminaires a t plus tard compense et na pas affect la taille finale de la langue (CXCR4-/-) La rduction importante du nombre de cellules Lbx1 a affect le dveloppement du muscle de la langue Les mcanismes compensateurs fonctionnent seulement pour un seuil de cellule Lbx1 atteint

Discussion La protine CXCR4 est prsente aprs dlamination du dermomyotome et elles sont observ une fois que les cellules ont atteint le membre antrieur Expression de CXCR4 est observ aprs lexpression de Pax3 et de Lbx1

Souris mutant Lbx1 pas expression de CXCR4 au niveau des membres Lbx1 pourrait participe au contrle dexpression de CXCR4 CXCR4 est exclusivement exprim dans les cellules nexprimant pas MyoD CXCR4 est exprim pendant la migration cellulaire

Lapplication ectopique de SDF1 dmontr que les cellules Pax3+ et de CXCR4+ migrent vers la source de SDF1 (redistribution de CXCR4 + importante que Pax3) Mutation de CXCR4 montre un changement de la distribution des cellules avec une de Lbx1 dans le membre distal alors que dans le membre proximal, les cellules apoptotique sont + importante (membre distal pas dtectable) Hyp: il faudrait plusieurs facteurs simple pour guider la migration

Souris simple mutante Gab1, le nombre de cellules prognitrices des muscles est rduit / WT mais atteignent la 1er vote branchial et le membre antrieur Souris double mutante, les cellules natteignent pas la 1er vote bronchial Consquence: dficit grave du muscle de la langue Souris simple mutante CXCR4, pas de changement reproductible de la langue Simple mutant, la rduction est compense dans les tapes suivantes

Les mcanismes compensatoires pourraient prolonger la phase de prolifration des cellules prognitrices aux tapes suivantes La compensation est possible seulement pour un seuil de cellules atteint Le nombre critique correspondrait environ la moiti du nombre de cellules prognitrices des muscles prsent dans le membre WT

Les rcepteurs tyrosine kinase et chemokine sont des molcules importante dans la migration des cellules et peuvent affecter la mort cellulaire Les deux mutations affectent la distribution et la survie des cellules prognitrices des muscles, avec un degr diffrent On parle dinteraction gntique entre les deux ligne

La signalisation de Gab1 et de CXCR4 contrle la polymrisation dactine et lattachement la matrice La phosphorylation des tyrosines sur Gab1 voie de signalisation qui rgulent la mobilit, la prolifration et la survie des cellules Les rcepteurs chemokine emploient la protine G pour transmettre des signaux Stimulation des cascades de phosphorylation des tyrosines +

Linteraction gntique que nous observons pour Gab1 et CXCR4 pourrait reflter le fait que les cascades de transduction de signal utilis par ces molcules convergent sur des effecteurs identiques la migration de contrle et la survie des cellules prognitrices de muscles

cxcr4 et gab1 coopèrent pour contrôler le développement des cellules progénitrices des muscles...

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