1CHM 3102

COURS CHM 3102Chimie Bioanalytique

Eric Bonneil et Pierre ThibaultLocal: D-659Courriel: eric.bonneil@umontreal.ca

2CHM 3102

Séparation de peptides et de protéinesavec systèmes microfluidiques

3CHM 3102

Systèmes Microfluidiques

Pourquoi utiliser des systèmes microfluidiques?

Réduction des volumes morts. Permet d’obtenir une meilleure efficacite chromatographique et donc une meilleure sensibilitéRéduction de la quantité d’echantillons du fait de la meilleuresensibilité et de la miniaturization.Réduction de la quantité de réactifs. Réduction du nombre de connexions: problèmes instrumentauxplus facilement détectables.Augmentation du débit d’analyse: temps d’analyse plus court.Permet d’effectuer plusieurs réactions ou séparations en parrallèle.Intégration: automatisation de réactions, synthèse sur micropuce.

Systèmes Microfluidiques

4CHM 3102

Micropuces d’ADN

Microréacteurs

Chambre de mélange Chambre de réactionCanaux d’introductiondes réactifs

Micropucespour séparations

5CHM 3102

Microfabrication

Premières micropuces furent faits avec de la silice ou du verre. Gravage des canaux sur verre est relativement coûteuxet le verre est relativement fragile.

Les micropuces sont maintenant faits à partir de polymères: PDMS poly(dimethylsiloxane)

Bon marché.Élastomère.D’autres matériaux peuvent être facilement intégrés.Stabilité thermique pour T: 40-95°C.Transparents, permettant la détection UV et fluorescence.Réduction de l’adsorption de cellules et protéinescomparativement au verre.

6CHM 3102

MicromachiningDesign est crée par ordinateur et est imprimé sur un film transparent qui servira de masque pour la photolithographie

A

LumièreMasque

Si

Photoresist: matériau qui polymérise à la lumière (epoxy)B

Dissolution du matériau non polymérisé: “master”pour la réalisation des puces

Prépolymère PDMS est versé, chauffé à 60-80°C

micropuce avec canaux qui peuvent être remplis ougréffés avec une phase stationnaire.

7CHM 3102

Modes d’utilisation

Préparation d’échantillon

Extraction sur phase solide

Digestion de protéines

Séparation

Électrophorèse sur gel

Électrophorèse capillaire.

Électrophorèse capillaire micellaire.

Électrochromatographie.

Chromatographie en phase inverse.

Séparation bi-dimensionnelle

Électrochromatographie/Électrophorèse capillaire.

Échange d’ions/Chromatographie en phase inverse.

8CHM 3102

Micropuce-Électrophorèse sur gel

gel

SDSBioanalyzer AgilentMulti-fonctions: Préparation de l’échantillon, réaction avec fluorophore, application du gel, séparation et détectionN= 3750 plateaux/s.

Dubrow et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1207-1212

9CHM 3102

Micropuce-Électrophorèse Capillaire

Canal de séparation

Électrodes

B: tamponS: échantillonBW: vidange tamponSW: vidange échantillon

Dimension du canal de séparation: Longueur: 5-7 cm, largeur: 50-90 µmprof.: 20 µmÉlectrodes sont placées dans les 4 puits: injection életrocinétiqueVoltage < 30 kV

Micropuce-Électrophorèse Capillaire

10CHM 3102

S SW

B

BW

B

S SW

BW

+ -

Injection

S SW

B

BW

+

-

B

BW

S SW

+

-

Séparation

Dubrow et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1207-1212

Micropuce-Électrophorèse Capillaire

11CHM 3102

Digestat de protéines

Thibault et al Anal. Chem. 1999, 71, 3036-3045

TM (min.)

Mélange de 5 peptides

W½= 1.5 s.N= 10500 plateaux/s

TM (min.)

TM (min.)

Thibault et al Anal. Chem. 2000, 3, 599-609

Mélange de 4 protéines

Harrison et al. J Chromatogr A. 2002 947(2):277-86

Digestion de protéines sur micropuce

12CHM 3102

Digestion mellitinRéservoir d’enzymeT1: GIGAVLKT2: VLTTGLPALISWIKT2R: VLTTGLPALISWIKR

Mellitin 0.3 µg billes d’enzyme 0.85 unités/g mellitinDigestion faite en 3 minPlus de mellition intacteRapport de pics T1, T2, T2R est le même dans une analyse faite à partir de la

digestion avec l’enzyme liquide. Temps de digestion diminué par 3.Pas de pics d’autolyse de la trypsine.

Thibault et al. RCMS 2000, 14, 1377-1383

Extraction sur phase solide dans un micropuce

13CHM 3102

Temps d’enrichissement

Flu

ore

scen

ce

Parois modifiées avec C18

Injection électrocinétiqueDésorption est faite par pompage d’une solution d’acétonitrile à 60 %Enrichissement de la coumarine à 8.7 nMTemps d’enrichissement de 160 s (facteur de 50 p/r à XXX). Contrainte de sensibilité dûe à la capacité limitée de la surface d’adsorption.

Ramsey et al. J. Microcol. Sep 2000, 12, 93-97

Extraction sur phase solide dans un micropuce

14CHM 3102

micropuce remplie avec des billes de C18

Phénomène d’electro-osmoseoccasionné par la double couchesur les parois et les billes de silice

Harrison et al. Anal. Chem. 2000, 72, 585-590

Extraction sur phase solide dans un micropuce

15CHM 3102

Thibault et al. Mol. Cell. Proteomics 2002, 1, 157-165

Extraction sur phase solide dans un micropuce

16CHM 3102

Injection séquentielle d’un peptide à différentes concentrations (5 µl)

Injection séquentielle de trois peptides (5 µl 0.5 µM)

Injection et séparation electrocinetiquesLimite de détection: 25 fmol.

Préparation de l’échantillon dans un micropuce

17CHM 3102

Digestion de la BSA dérivéeavec FITC, isolation et séparation des peptides contenant des histidines.

Remplissage de la colonnepar les billes de 5 µm de trypsin et de IMAC a été faiteélectrocinétiquement

Tampon d’élution de la colonne IMAC est dans le puitsG.

échantillon

Ref: XXX

Électrophorèse capillaire micellaire

18CHM 3102

Création d’un gradient d’acétonitrile en faisant varier les voltages dans les puits de solvants

Solvant 1: 10 mM SDS, 10 mM borate, 10 % ACN/MeOHSolvant 2: 10 mM SDS, 10 mM borate, 30 % ACN/MeOHMélange de solvants est fait en controllant les voltages dans les puits des solvants 1 et 2: gradient de solvants est possible.

Ramsey et al. Anal. Chem. 1997, 69, 5165-5171

Électrophorèse capillaire micellaire

19CHM 3102

1: C440, 2: C490, 3: C450, 4: C460, 5: C480 Isocratique (a: 14%, b: 22%, c: 30%) gradient (d: linéaire, e: concave, f:convexe)Quel est le mode d’élution permettant une meilleure resolution???

Électrochromatographie sur micropuce

20CHM 3102

Canal modifié avec C18

Augmentation de la surface d’adsorption comparativement a l’approcheutilisant la modification de la paroi du capillaire.

Séparation de peptides de la BSA

Regnier et al. J. Chromatogr. A 2002, 948, 225-233

21CHM 3102

Électrochromatographie sur micropuce

Séparation de peptidesCanal rempli de billes garnies de C18

Singh et al. Anal. Chem. 2002, 74, 784-789

Inconvénients majeurs de cette technique sont la limitation du volume d’échantillon (

LC-micropuce-Spectrométrie de masse

22CHM 3102

micropuce with packed columns

micropuce avec colonneempaquetée

Canal de séparation5 cm × 50 µm

Precolonne

Spray TipOrifice SM

Pivot de l’interface

Contact électrique

Colonne d’enrichissement

Colonne analytique

LC-micropuce-Spectrométrie de masse

23CHM 3102

Lors de l’injection, l’échantillonest retenu sur la phase stationnaire, le solvant estéliminé: pas de limitation quant au volume d’échantilloninjecté.

La valve tourne et l’échantillonest élué avec un gradient d’acétonitrile (pompage).

La séparation se fait dans un canal rempli de billes de C18: plus grande capacité.

Van de Goor et al. soumis à Anal. Chem.

CLHP-micropuce-Spectrométrie de masse

24CHM 3102

Séparation d’un mélange de digestats de 8 protéines (>1000 peptides)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

(b)

26 27 28 29Temps de rétention (min)

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Inte

nsité

(10E

6)

a b

0.34 min

0.74 min

m/z = 501.72 (2+)

b/a (10%) = 1.22

Temps de rétention (min)

Efficacité similaire à celle obtenuepour une colonne capillaire de 75 µm × 12 cm

Élargissement de pics plus faiblequ’avec une colonne

Capacite chromato (n1/2) ~ 150

Wt

n∆

=2/1 où: mt: Gamme de temps d’elutionW1/2: Largeur de pic a mi-hauteur

CLHP-micropuce-Spectrométrie de masse

25CHM 3102

0,5 fmol

40 fmol

20 fmol

10 fmol

4 fmol

2 fmol

1 fmol

100 fmol

200 fmol

0,5 fmol

1 fmol

2 fmol

4 fmol

10 fmol

20 fmol

40 fmol

100 fmol

200 fmol

m/z 724.6 m/z 582.3

~ Limite de détection 1 fmol comparable avec celle obtenue avec une colonne capillairede 75 µm de large

Séparation bi-dimensionelle

26CHM 3102

Pour l’analyse de mélange complexe, une seule technique séparative a une capacité de pics insuffisante. Par exemple, unecapacité, nc ~ 150 est typiquement obtenue par chromatographieC18. Cette capacité limite l’analyse d’echantillons complex tels les digestats de E. Coli ou plus de 80,000 peptides trypsiques peuventêtre présents a différents niveaux d’abondance (en assumant4000 protéines avec en moyenne 20 peptides chacune).

Couplage de deux techniques de séparation pour effectuer uneanalyse devient un avantage significatif.

Capacité bi-dimensionnelle,

Les deux techniques peuvent être couplées en série2

2

1

122/1

Wt

Wt

nc∆

•∆

=

(automatisation, gain de temps, limitation dans le choix des tampons) ou découplées (flexibilité dans le choix des tampons, temps d’analyse plus long).

Séparation bi-dimensionelle

27CHM 3102

Électrochromatographie/Électrophorèse capillaire

Diagramme d’injection

CEC CE

Séparation de peptides de la β-caseine

Ramsey et al. Anal. Chem. 2001, 73, 2669, 2674

Séparation bi-dimensionelle

28CHM 3102

Échange d’ions/Chromatographie en phase inverse

SCX C18 MS

ProtéinesPeptides

Séparation bi-dimensionelle

29CHM 3102

2 µg, 8 fractions de sel

Secreted or extracellular: 28 %

Total: 47 protein clusters

Classic plasma proteins: 36 %

Cellular leakage: 17 %

Unknown: 13 %

Immunoglobulins: 6 %Classic plasma proteins: 29 %

Unknown: 12 %

Immunoglobulins: 7 %

Cellular leakage: 18 %Secreted or extracellular: 34 %

Total: 111 protein clusters

250 ng 1 analyse

Systèmes MicrofluidiquesSystèmes MicrofluidiquesMicrofabricationMicromachiningModes d’utilisationMicropuce-Électrophorèse CapillaireMicropuce-Électrophorèse CapillaireMicropuce-Électrophorèse Capillaire