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UNIVERSITE CADI AYYAD, FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

BIOLOGIE MOLECULAIRE COURS S4 (DEUXIEME PARTIE)

CONSTANCE ET VARIATION DU DNA

[ MUTATION, RECOMBINAISON ET MOBILITE ]

PROFESSEUR A. A. BENSLIMANE

2006

CONSTANCE ET VARIATION DU DNA [ MUTATION, RECOMBINAISON ET MOBILITE ]

SOMMAIRE

B. VARIATION DU DNA 2 I. LES MUTATIONS PONCTUELLES

(revoir cours de génétique SV3) 2

II. LA RECOMBINAISON 3 1. CHEZ LES PROCARYOTES (E. coli) 3

α- RECOMBINAISON HOMOLOGUE 3 β- RECOMBINAISON SPECIFIQUE DU SITE 6

2. CHEZ LES EUCARYOTES 7 α- RECOMBINAISON HOMOLOGUE 7 β- RECOMBINAISON SPECIFIQUE DU SITE 8

III. ELEMENTS MOBILES : (‘Recombinaison illégitime’) 12 1. TRANSPOSITION 12 2. RETROPOSITION 15

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CONSTANCE ET VARIATION DU DNA

A. VARIATION DU DNA Une série de phénomènes (qui ont pour nom : mutation, délétion, insertion, recombinaison, conversion génique, transposition) font que le contenu en information des cellules est loin d’être constant. Ces variations peuvent survenir aussi bien dans les cellules somatiques que dans les cellules germinales. Dans ce dernier cas, les modifications informationnelles seront héréditairement transmises.

I. LES MUTATIONS PONCTUELLES (revoir cours de génétique SV3) Si les systèmes de sauvegarde du contenu informatif sont d’une étonnante efficacité, il leur arrive quand même de faillir ou d’être impuissants comme dans le cas des ‘5-méthyl cytosines’ désaminées. Les mutations sont des altérations permanentes et héréditaires touchant la séquence de base du DNA. Elles résultent soit des erreurs spontanées dans la réplication du DNA ou de la recombinaison méiotique ou comme conséquence des effets d’altérations des agents physiques et chimiques sur le DNA. La plus simple des mutations est la mutation ponctuelle : changement d’une seule base. Ce phénomène peut être :

- une transition : (purine → purine ou pyrimidine → pyrimidine) ou - une transversion : (purine → pyrimidine ou pyrimidine → purine)

Les effets phénotypiques d’une telle mutation peuvent être variés :

mutation silencieuse : si elle a lieu au niveau du DNA non codant, du DNA non régulateur ou à la troisième position d’un codon qui ne produit souvent aucun effet sur la nature de l’acide aminé incorporé dans une protéine.

mutation faux-sens : si elle donne naissance à un acide aminé altéré dans le produit génique. Selon l’acide aminé affecté, la mutation peut produirez des effets variés allant jusqu’à la létalité.

mutation non-sens : si elle crée de nouveaux codons d’arrêt donnant naissance à des produits protéiques tronqués.

Les insertions ou les suppressions impliquent l’addition ou la perte d’une ou de plusieurs nucléotides donnant naissance à des mutations à trame décalée (‘frame-shift’) ou la séquence d’une protéine traduite est complètement changée du côté C-terminal de la mutation. Lorsqu’elles n’engendrent pas de pathologie, l’intérêt de ces mutations réside dans le fait qu’elles créent des polymorphismes génomiques qui sont à la base des diagnostics et des tests DNA. Les méthodes modernes de génie génétique permettent de créer des mutations spécifiques sur des segments de DNA in vitro puis de réintroduire ces molécules dans le génome d’une cellule appropriée afin d’en étudier les conséquences. C’est ce qui s’appelle : « la mutagénèse dirigée ».

II. LA RECOMBINAISON

1. CHEZ LES PROCARYOTES (E. coli) α- RECOMBINAISON HOMOLOGUE Egalement appelée « recombinaison générale », ce processus implique l’échange de régions homologues entre deux molécules de DNA.

Deux DNA bicaténaires homologues

Deux DNA recombinés Par enjambement

Bien que ne possédant qu’un seul chromosome et donc peu prédisposée à offrir les homologies de séquences nécessaires, la bactérie possède un système de recombinaison très efficace dont le modèle est vraisemblablement proche de celui de l’homme. Les deux DNA bicaténaires homologues s’alignent l’un à côté de l’autre. Les protéines RecB et RecC (gènes recB et recC du système SOS) forment un complexe. Ce complexe se fixe sur le DNA (1). Il se déplace sur la double hélice en la déroulant, puis avec un certain retard en l’enroulant de nouveau. Comme le débobinage est plus rapide que le rembobinage, une large portion de DNA se trouve constamment sous forme simple brin (2).

Le complexe se déplace ainsi sur le DNA jusqu’à ce qu’il reconnaisse la « séquence chi » (5’GCTGGTGG3’), une séquence presque symétrique, très fréquente chez E. coli (chaque 4 Kb environ). La reconnaissance de cette séquence (3) induit l’activité endonucléasique du complexe RecBC, la coupure s’effectuant sur le brin possédant la séquence chi quelques bases plus loin du côté 3’ (4).

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L’extrémité 3’ du DNA coupé est passée sous forme simple brin. Celui-ci s’associe à des molécules de protéine RecA à raison d’une molécule de RecA par 5 bases (4). La recombinaison est alors amorcée (5+6). La formation du complexe « RecA-DNA simple brin » favorise la reconnaissance de la séquence homologue (5) ainsi que sa déstabilisation : « invasion » (6). Ceci permet la formation d’une structure combinée entre les deux séquences homologues. La protéine RecA est libérée.

RecA chez E. coli Rad51p chez S. cerivisiae Rad51 chez H. sapiens

Une nouvelle coupure et deux soudures aboutissent à la formation d’une structure croisée entre un brin de chaque DNA (7). Le croisement se déplace en créant derrière lui deux segments hétéroduplex (8).

7 8

10

11 12

6

9

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Une première rotation de 180° produit une structure appelée « jonction de Holliday » (9). Après une nouvelle rotation de 90° (10), les brins se désenlacent par coupure-ligation (11+12). Suivant les brins où s’effectuent les coupures-ligations, deux résultats seront possibles :

pas de recombinaison mais une structure de type hétéroduplex sur toute la zone de migration (11). [probabilité p = 0,5].

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Une recombinaison entre les deux séquences homologues (12). [p = 0,5].

Hétéroduplexe de jonction

La recombinaison est un processus qui peut avoir lieu soit entre deux molécules différentes de DNA (recombinaison intermoléculaire) soit entre deux régions d’une même molécule de DNA (recombinaison intramoléculaire). Les produit recombinés obtenus dépendront du nombre d’enjambement et de l’orientation des séquences homologues.

β- RECOMBINAISON SPECIFIQUE DU SITE Ce type de recombinaison requiert l’échange spécifique de segments non homologues de DNA. Elle a lieu par l’intermédiaire de protéines qui reconnaissent les séquences de DNA spécifiques. Elle ne nécessite pas de produits Rec ou de DNA simple brin. Par exemple, l’insertion d’un génome phagique dans un chromosome bactérien peut se faire par crossing-over (enjambement). C’est le cas du couple (phage λ – E.coli) dans le cas d’un cycle lysogénique.

CYCLE LYSOGENIQUE CYCLE LYTIQUE

Le DNA du bactériophage λ, après circularisation, est capable de s’insérer dans un site spécifique sur le chromosome d’E.coli. Le site d’attachement sur le DNA du phage partage la même séquence (15 pb) du site d’attachement sur le DNA bactérien. L’ « intégrase » encodée par le phage produit des coupures au niveau de ces séquences avec des surplombs de 7 nucléotides. En combinaison avec un facteur d’intégration bactérien favorise la recombinaison entre ces sites et par conséquent l’insertion du DNA phagique. Cette forme intégrée est appelée : « prophage » lequel est hérité de façon stable à chaque

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division cellulaire jusqu’à l’activation de « l’excisionase » et induction du cycle lytique. En fait, le DNA phagique n’est que rarement intégré.

2. CHEZ LES EUCARYOTES α- RECOMBINAISON HOMOLOGUE Chez les eucaryotes, ce phénomène a lieu fréquemment durant la méiose où les chromosomes homologues dupliqués s’alignent en parallèle à la « métaphase I » en formant des « synapses ». Il est vraisemblable que les échanges entre séquences homologues qui s’effectuent au niveau du « complexe synaptonémal » utilisent un mécanisme proche de celui décrit chez E. coli.

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Les recombinaisons sont indispensables au bon déroulement de la méiose. Il s’en produit une soixantaine par méiose chez l’homme. Il en résulte un large brassage de l’information génétique, puisque des portions de plusieurs millions de paires de bases sont échangées entre les chromosomes homologues. Le point de départ de la recombinaison est l’appariement de deux séquences homologues. Or, le génome des eucaryotes est constellé de séquences répétitives donc homologues. Deux copies en de ces séquences en deux points différents du génome peuvent donc s’associer et

Avant recombinaison Après recombinaison

initier une recombinaison. Suivant les points de recombinaison choisis, il peut en résulter des délétions, des insertions, des conversions géniques ou des remaniements chromosomiques. De telles modifications peuvent, très souvent, se traduire par des pathologies

Mécanisme de la conversion géniquepar correction d’hétéroduplex

Des recombinaisons inégales au sein des séquences homologues répétées en tandem entraînent l’expansion ou

la contraction du nombre de leurs copies

β- RECOMBINAISON SPECIFIQUE DU SITE Chez l’homme et l’ensemble des vertébrés, La recombinaison spécifique du site est responsable de la très grande diversité des anticorps du système immunitaire.

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Les « immunoglobulines » sont constituées de deux chaînes lourdes glycosylées identiques (chaînes H) et de deux chaînes légères identiques (chaînes L) reliées par des ponts disulfures et liaisons hydrogènes. Les deux types de chaînes contiennent une partie constante (C) et une partie variable (V). Les régions variables de ces régions sont codées par trois gènes En fait, les gènes codant pour les protéines du système immunitaire appartiennent tous à une même famille de gènes : « la superfamille des gènes de l’immunité ». Tous les gènes dérivent d’un même motif ancestral dupliqué de nombreuses fois.

Le nombre élevé des duplications (quelques centaines) n’explique pas à lui seul l’extrême diversité des molécules impliquées dans les réactions immunitaires, humorales et cellulaires (quelques millions). Pendant longtemps, cette diversité est restée un mystère. La vérité fut entrevue par W. Dryer et C. Bennet [1965]. Ces derniers ont postulé que le génome possède une série de gènes codant pour les parties variables et un gène pour chaque partie constante. Indémontrable à l’époque, cette théorie a été vérifiée dès l’introduction des techniques de la génétique moléculaire.

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La première preuve de sa validité fut apportée en [1976] par l’équipe de Tonegawa qui a montré que les séquences de DNA codant pour les parties variables et celles codant pour les parties constantes étaient plus éloignées les unes des autres dans les « cellules germinales » que dans les cellules productrices d’anticorps. (En immunologie, ‘cellules geminales’ veut dire cellules indifférenciées n’exprimant pas les gènes de l’immunité et non pas gamètes). Le rapprochement entre les séquences en question a lieu nécessairement avant le stade de production d’anticorps. Le processus fait intervenir respectivement une ou deux recombinaisons spécifiques du site pour les chaînes variables ou les chaînes lourdes.

En exemple Maturation du DNA correspondant à une chaîne courte d’un anticorps :

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Malgré la présence du système héptamère-nonamère, la précision de la recombinaison V-J n’est pas parfaite. L’imprécision porte sur trois bases ce qui permet d’obtenir jusqu’à 4 chaînes différentes à partir de deux gènes V et J identiques.

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III. ELEMENTS MOBILES : (‘Recombinaison illégitime’) 1. TRANSPOSITION

Les transposons sont des segments de DNA doués de la capacité de se déplacer d’un endroit à un autre à l’intérieur du génome cellulaire. Les transposons peuvent atteindre toute position du génome de la cellule. Chez les bactéries, un transposon peut sauter d’un locus chromosomique à l’autre ; d’un plasmide au chromosome ou vice-versa ; ou d’un plasmide au chromosome. En fait, les transposons ont été retrouvés aussi bien chez les bactéries que chez les végétaux ou les animaux. La première preuve de l’existence de tels DNA errants a été apportée grâce aux expériences de croisements du Maïs effectués par la généticienne McClintock B [1947]. Des variations de la couleur des grains Maïs ont été détectées et ne pouvaient s’expliquer que si on supposait la présence d’éléments génétiques mobiles capables d’atteindre d’autres endroits du génome. (Prix Nobel 1983). Dans la transposition, tout se passe sans que jamais la séquence à transposer n’apparaisse sous forme libre et individualisée dans la cellule. Les mécanismes sont multiples et le résultat final dépend du moyen de transposition qui a été employé. Le phénomène de transposition reste un événement rare. Certaines transpositions sont stables alors que d’autres ne le sont pas et disparaissent assez rapidement. Le transposon possède dans sa structure les gènes codant pour les protéines nécessaires à son insertion (transposase, résolvase,…). Cependant, dans certains cas, l’insertion nécessitera des protéines cellulaires. C’est le cas, le plus souvent, quand l’insertion doit être effectuée de manière régulée en un point précis du génome (voir l’encadré dans le cas du « mating type » chez la levure : changement du type sexuel)

En plus des gènes codant pour les protéines nécessaires à leur insertion, les séries de transposon peuvent porter d’autres gènes (gènes conférant la résistance à des antibiotiques par exemple).

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Le gène dans lequel le transposon est inséré est généralement inactivé ; les gènes entre deux copies de transposon peuvent être supprimés par recombinaison homologue entre eux ; des inversions et d’autres réarrangements des séquences de DNA de l’hôte peuvent également se produire. Lorsque le DNA cible est coupé, des bouts cohésifs sont crées entre lesquels le transposon est positionné. Cette première étape est réalisée grâce à l’action de la « transposase ». Il s’offre alors deux possibilités:

- Transposition non réplicative (ou conservative): le transposon ne subit pas de réplication avant son déplacement. Il est transféré dans le DNA cible. Le site donneur en est donc délété.

- Transposition réplicative : le transposon positionné est répliqué. La nouvelle copie est donnée au DNA cible. L’ancienne restant en place

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De très nombreux transposons sont maintenant connus chez de multiples organismes. Leur structure et leur mécanisme de fonctionnement sont variés et complexes. Les plus simples sont les éléments « IS » (séquences d’insertion) d’E. coli dont il peut exister une dizaine par génome. Le tableau suivant donne quelques autres exemples parmi les transposons les plus étudiés.

cours

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2. RETROPOSITION

Certaines séquences de DNA eucaryotes, homme compris, possèdent des caractéristiques proches de celles des transposons. Ces séquences possèdent aussi des caractéristiques qui les rapprochent de certains virus : les « rétrovirus ». Ces séquences ont une structure qui permet de penser qu’elles résultent d’une « rétrotranscription » d’un RNA. Ces données suggèrent l’existence d’une autre catégorie d’éléments mobiles : les « rétroposons » ou « rétrotransposons ».

Le mécanisme de transposition de ces éléments suppose que le rétroposon est d’abord transcrit en un RNA dont la structure est analogue à celle d’un rétrovirus, puis ce RNA est rétrotranscrit en cDNA par la transcriptase inverse. La copie cDNA s’intègre ensuite dans le génome comme le ferait un rétrovirus.

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L’analyse de séquence de certains de ces rétroposons montre qu’ils pourraient posséder des séquences codant pour la transcriptase inverse, indispensable à la rétroposition

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