les escherichia coli producteurs de shiga-toxines (stec) méthodes de détection disponibles

LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC)

Méthodes de détection disponibles

Dr. Estelle LOUKIADIS

Laboratoire d’étude des microorganismes alimentaires pathogènes (LMAP)/ LNR STEC

UR CALITYSS Equipe Ecologie microbienne et sécurité sanitaire des aliments 1

6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012

Tous les STEC ne sont pas tous pathogènes !!Tous les STEC ne sont pas tous pathogènes !!


Complexité génétique des STECComplexité génétique des STEC


E. coli potentiellement

pathogènes

E. coli pathogènes

stx + and eae + E. coli

Caractéristiques Caractéristiques phénotypiques et phénotypiques et

génotypiquesgénotypiques

En terme de santé publique, comment définir une souche STEC pathogène?


Définition des souches STECconsidérées comme pathogènes

5

Avis AFSSA du 15 juillet 2008précisé dans l’avis AFSSA du 27 mai 2010


6

Escherichia coli

STEC(gènes stx)

EHEC = STEC isolé desmalades

E. coli O157, O26, O103, O111 et O145

AEEC(gène eae)

EHEC typiques majeures

!

EAEC = isolés chez les malades

2011: STEC O104:H4

épidémique?


Dans les aliments

• des E. coli O157: NF EN ISO 16654:2001 et méthodes alternatives

Prise d’essai :25 g Enrichissement à 41,5°C

Billes magnétiques recouvertes d’Ac anti-O157

Milieu CT-SMAC

ne dégrade ni le sorbitol, ni le rhamnose

n’excrète pas de β-glucuronidase

Résistance au céfixime et au tellurite


Pas de caractéristique biochimique commune pour les distinguer des autres E. coli !

Détection des STEC non-O157 VTEC dans les aliments?

??


Dans les aliments

10

TS ISO 13136

• des STEC O26, O103, O111, O145 et O157: ISO TS 13136

Publication en 2012


11

http://www.vetagro-sup.fr/services/espace-entreprises/équipements-scientifiques/plateaux-techniques/lmap


ISO TS 13136

12

Si stx+ et eae+

DEPISTAGE

CONFIRMATION

Si un des 5 marqueurs

somatiques +

Détection des 5 antigènes de Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et somatiques O157, O26, O103, O111 et

O145O145

Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne

Isolement sur gélosesIsolement sur géloses

Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation

Prise d’essaiPrise d’essai

Enrichissement Enrichissement Dilution au 1/10Dilution au 1/10ème ème 18-24h 37°C18-24h 37°C

Détection des gènes Détection des gènes stx stx et et eae eae par par RT-PCRRT-PCR

Echantillons négatifs en 26h

Echantillons suspects en 30h

Echantillons confirmés en 48h


Complexité de la détection des STEC


La présence des gènes stx ne signifie pas systématiquement qu’il y ait une souche STEC dans l’échantillon(valeur prédictive positive dans les aliments faible voire nulle)

La présence du gène eae en combinaison avec les gènes stx est importante mais non suffisante = les marqueurs somatiques doivent être recherchés

Complexité de la détection des STEC


Screening PCR de plusieurs marqueurs= Les différents marqueurs recherchés (virulence/sérogroupes) peuvent être présents dans des bactéries différentes et il existe des phages Stx à l’état libre dans les aliments

La confirmation par isolement est nécessaire pour démontrer que tous les marqueurs détectés sont associés à une seule et même

souche d’E. coli viable.

ISO TS 13136

15

Si stx+ et eae+

DEPISTAGE

CONFIRMATION

Si un des 5 marqueurs

somatiques +

Détection des 5 antigènes de Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et somatiques O157, O26, O103, O111 et

O145O145





Enrichissement Enrichissement Dilution au 1/10Dilution au 1/10ème ème 18-24h 37°C18-24h 37°C

Détection des gènes Détection des gènes stx stx et et eae eae par par RT-PCRRT-PCR

Echantillons négatifs en 26h

Echantillons suspects en 30h

Echantillons confirmés en 48h


16


17





Enrichissement Enrichissement

Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux

EHECEHEC


18

Exemple: Taille de la prise d’essai

Classiquement 25 g

Augmentation de la taille de la prise d’essai?


19







EHECEHEC


20

Etude de plusieurs paramètres: t°, durée, nature du milieu , nature et concentration en antibiotiques, effet matrice

Inoculation expérimentale de matrices (> cultures pures!)

Etude de plusieurs souches STEC différentes (effet sérogroupe, effet souches)

Exemple: Enrichissement des STEC O26 dans les fromages au lait cru


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EHECEHEC


22

EHEC O157:H7/H- rfbE-O157 fliC-H7 stx1 et/ou stx2 eae γ1 (OI-122)*

EHEC O26:H11/H-

EHEC O103:H2/H-

EHEC O111:H8/H-

EHEC O145:H28/H-

wzx-O26

ihp1-O145

wzx-O103

wbdI-O111

fliC-H11

fliC-H2

fliC-H8

fliC-H28

stx1 et/ou stx2

stx1 et/ou stx2

stx1 et/ou stx2

stx1 et/ou stx2

eae β

eae γ1

eae θ

eae ε

(OI-122)*

(OI-122)*

(OI-122)*

(OI-122)*

Avis afssa 2008: critères génétiques principaux EHEC

Développement d’outils PCR en temps réel multiplex

Madic et al. JAM 2010. 109:1696-1705.Madic et al. AEM 2011. 77:2035-2041.Mazuy-Cruchaudet et al. Zoonoses and Public Health 2012

Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence


Prevalence of the 7 major serogroups of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)

in fresh minced beef in France:A novel real-time PCR strategy for their early

detection in food

C.Mazuy-Cruchaudet1, C. Bavai1, P. Fach2, E. Loukiadis1

1- Lyon University, VetAgro Sup, LMAP, French National Reference Laboratory for E. coli, FRANCE

2- French Food Safety Agency (ANSES)-Laboratoire de Sécurité des aliments, FRANCE

Results and discussion

N = 2476 samples (25g)

Markers/strains detected Nb of positive samples

stx+ eae+ 109

stx+ eae+ top 5+ 79

EHEC strains isolated (top 5) 6

Top 5 screening

4,4%

3,2%

0,2%

IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion

ISO TS 13136




stx+ eae+ 109

stx+ eae+ top 5+ 79



stx+ eae+ 109

stx+ eae+ nleB+ 88

stx+ eae+ nleB+ top 5+ 67

stx+ eae+ nleB+ top 5/eae assoc.+ 29


Top 5 screening

4,4%

3,2%

0,2%

4,4%

3,6%

2,7%

1,2%

0,2%

New approach

GD1

GD2


ISO TS 13136




stx+ eae+ 109

stx+ eae+ top 7+ 84

EHEC strains isolated (top 7 ) 7


stx+ eae+ 109

stx+ eae+ nleB+ 88

stx+ eae+ nleB+ top 7+ 71

stx+ eae+ nleB+ top 7/eae assoc.+ 29


Top 7 screening

4,4%

3,4%

0,3%

4,4%

3,6%

2,9%

1,2%

0,3%

GD1

New approach


ISO TS 13136 MLG 5B

GD2

! Variation with serotype


Top 5 contamination rate: 6/2476 (0,2 % CI95 [0,09%- 0,5%])


Year Type of minced beef Top 5 rate

2007 Frozen (production) 0,3% (11/3605)CI95 [0,2 – 0,5%]

2008 Frozen trims (production) 0,4% (15/4000)CI95 [0,2 – 0,6%]

2009 Fresh (at retail) 0,1% (2/1527)CI95 [0,04 – 0,5%]

• Low contamination rate• In accordance with previous results observed in France

• First data in French minced beef• Low contamination rate (comparison with other areas? USA: 0,2% CI95 [0,05 – 0,3%] (6/4133) (Bosilevac and Koohmaraie, 2011))

Top 7 contamination rate: 7/2476 (0,3 % CI95 [0,1%- 0,6%])


Characteristics of the 7 EHEC strains isolated

Serotype stx genes eae variants

OI 122marker

Nb of strains isolated

EHEC O157:[H7] stx2 eae γ nleB 1

EHEC O26:[H11] stx1 eae β nleB 4

EHEC O103:H2/H¯ stx1 or stx2 eae ε nleB 0

EHEC O111:H8/H¯ stx1 or stx2 eae θ nleB 0

EHEC O145:[H28] stx1 eae γ nleB 1

EHEC O121:H19/H¯ stx1 or stx2 eae ε nleB 0

EHEC O45:[H2] stx1 eae ε nleB 1

Top 5

Top 7


No EHEC O103, O111 nor O121

Only 1 EHEC O157:H7 and a majority of EHEC O26:H11 (4/7)

Prevalence of major EHEC in fresh minced meat in France

The 5 and the 7 major EHEC serogroups (top 5 and top 7) were detected at a low rate (0,2% and 0,3% respectively)

O26 was the main isolated EHEC serogroup in meatNone O111 nor O121 strains were isolated

A novel real-time PCR strategy for EHEC detection in foodusing OI122 marker and association of serotype with specific eae variants

A complementary approach to the ISO TS 13136A reliable strategy (specific and sensitive)A cost effective screening (reduce the number of PCR suspicions without increasing time analysis)

ConclusionIntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion

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EHECEHEC


31







EHECEHEC

Possé et al., 2008


32

Exemple: Facteurs biotiques et abiotiques influençant la croissance et la survie de STEC


Caractérisation de l’impact sur la croissance

Quelles voies métaboliques sont en jeu ?

M. Cornu et al., Food Microbiology 28 (2011) 639e647

Prigent-Combaret et al. 2012

Pourquoi y a-t-il une sélection des bactéries dans les matrices alimentaires? Transfert à l’optimisation des méthodes de détection (géloses)

Pourquoi y a-t-il une sélection des bactéries dans les matrices alimentaires? Transfert à l’optimisation des méthodes de détection (géloses)

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EHECEHEC


La première méthode de référence pour la recherche des STEC dans les aliments (comparaison des résultats possibles)

Méthode robuste (EILA UE et France)

Méthode compatible avec une accréditation ISO 17025

Optimisations méthodologiques nécessaires

! Sérotypes de STEC pathogènes non détectés (ex O104:H4 eae-)…mais modularités et flexibilité de la méthode.


Conclusion: ISO TS 13136

Le LNR STEC

Une équipe de 15 personnes

MERCI POUR VOTRE ATTENTION !

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