clonage
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LE CLONAGE
Procédure
Les enzymes de restrictionCaractéristiques:• la plupart des sites sont des séquences inversées répétées:cas de EcoRI: 5 ’ GAATTC 3 ’ 3 ’ CTTAAG 5 ’• Coupure avec formation de bouts collants ou à bouts francs
Les vecteurs de clonage
•capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée (origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)
•possède un polylinker ou site multiple de clonage
•supporte l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur
Les plasmides comme vecteur de clonage
Les cosmides comme vecteurs de clonage
Les phagemedes come vecteurs de clonage
Les YACs comme vecteurs de clonage
Fonctionnement de la ligase
Clonage de l’ADN recombiné dans une cellule en culture
L’ADN hybride recombiné et l’ADN non recombiné seront introduits
1) dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection
(bactériophage),
2) dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection
avec un virus à ADN.
Isolement des bactéries contenant les plasmides transférés facilement.
Détection des bactériophages recombinants par des plages de lyse.
L’ADN recombiné peut être cloné dans une cellule en culture.
Identification du clone cellulaire ou du virus contenant l’ADN recombinant
Etude et criblage de l’ADN cloné
1/ Le criblage par des oligonucléotides de synthèse
Le principe consiste à utiliser, dans un criblage classique, une sonde
oligonucléotidique marquée synthétisée (courts de 18 à 25 bases ou quelques
oligonucléotides longs de 40 à 45 bases ) à partir des données de séquençage d’une
fraction de la protéine. Le code génétique permet de déterminer les séquences
possibles du gène correspondant.
Les appareils automatiques permettent actuellement de séquencer une protéine
en 24 heures et de synthétiser des oligonucléotides dans le même laps de temps.
Les oligonucléotides purifiés sont marqués au 32P et utilisés comme sonde
d’hybridation in situ d’une banque génomique.
2/ Le criblage par des anticorps
Cette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expression
puisqu’elle vise à révéler le produit d’expression d’un gène cloné.
Il faut pour cela disposer d’un anticorps, de préférence polyclonal dirigé
contre le produit du gène.
Le complexe antigène-anticorps est révélé par un autre complexe protéique
possédant soit une activité enzymatique dont les produits sont colorés (B-
galactosidase), soit marqué à l’iode 125.
3/ Electrophorèse
permet de récupérer les fractions d’intérêt pour un séquençage de
l’ADN inséré. La révélation des différentes bandes est faite soit par :
Une utilisation du bromure d’éthidium et une lecture sous une
illuminationultra-violette.
Un marquage chimique ou enzymatique des produits obtenus pour
le séquençage (utilisation de radio-isotopes, 32P, 35S) suivi d’une
autoradiographie.
4. Le séquençage
Il a pour but la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolé pour définir les introns, les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré dans le vecteur. Deux méthodes classiques sont alors utilisées.
a - La méthode de Maxam et Gilbert: la méthode chimique.
1. L’ADN double brin à séquencer est d’abord marqué au 32P au niveau du
phosphate en 5’.
2. Il doit ensuite être digéré par une endonucléase de restriction en deux
fragments différents de taille, qui sont séparés par électrophorèse.
3. On obtient ainsi un fragment dont une seule extrémité 5’ est marquée.
4. Il est séparé en 4 lots et dans chaque lot, au moyen de réactifs chimiques
différents, on réalise une coupure au niveau d’un type de base différent.
5. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide des 4 produits de réaction et
autoradiographie, les positions relatives des différentes bases sont déduites de
la comparaison des distances de migration des fragments marqués en 5
b - La méthode de Sanger: la méthode enzymatique.
La méthode de séquençage enzymatique par l’incorporation de didésoxyribonucléotides.
Cette méthode met à profit l’absence d’un hydroxyle en 3’ d’un ddXTP qui ne permet pas la formation d’une liaison phosphodiester.
La conséquence est un arrêt de l’élongation lorsqu’un didésoxyribonucléotide est incorporé dans un brin d’ADN en synthèse.
Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot
L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction
appropriée
Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose,
L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,
L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide
(filtre de nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utilisées
car par un traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre le
DNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieurs fois avec
d’autres sondes.
Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faible
stringence puis lavé
Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de
l’autoradiographie.
6. La PCR
consiste à amplifier sélectivement une séquence particulière d’ADN par l’action répétée
d’une ADN polymérase.
Le fragment d’ADN à amplifier est compris entre deux séquences (complémentaires des
amorces) qui doivent être connues et la longueur ne peut excéder 10 kb.
La réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours duquel la
quantité d’ADN à amplifier est doublée.
Ces cycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en fonction de la quantité d’ADN cible de
départ et du but recherché.
la dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C,
l’hybridation avec une amorce, appariement primer, à 64°C
L’extension de l’amorce à 70 - 72°C par la Taq polymérase.
L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une duplication
exponentielle de chaque brin.
7/ Les RFLP (restriction frament length polymorphism)
sont des variations de séquence de l’ADN révélées par des modifications de la carte de
restriction.
L’ADN est soumis à une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction suivie
d’un Southern blot.
En d’autres termes : l’hydrolyse d’un ADN par une endonucléase conduit à une série de
fragments, appelés fragments de restriction.
La longueur des fragments est déterminée par la distance séparant les séquences
spécifiques reconnues par cette endonucléase.
Une molécule d’ADN donnée coupée par une enzyme de restriction donnée produit
toujours les mêmes fragments : cette série de fragments fournit une empreinte
caractéristique de l’ADN hydrolysé, on parle de carte d’identité moléculaire.
8/ Les minisatelites ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
Les VNTR sont des séquences particulières. Elles sont répétitives, dispersées et très polymorphes.
Elles ont souvent 11 à 16 bp (GGAGGTGGGCAGGA [A/G] G. Elles permettent la réalisation de l’empreinte genetique (ADN finger printing)
9/ Les microsatelites
sont plus fréquent et les mieux caractérisés : les SSTR (Short Sequences
of Tandem Repeats).
Ils sont favorisé par des crossing over inégales lors de la méiose. La
chorée de Hungtington qui est une maladie neurodégénérative est
provoquée par des crossing-over inégaux.
La technique des SSTR permettent d’établir des polymorphismes à plus
de 99,99%.
10/ SSCP (single Strand Conformation Polymorphism)
La mise en évidence des mutations ponctuelles utilise le système de l’analyse des
polymorphisme de conformation de l’ADN simple-brin .
Une mutation ponctuelle au sein de cette séquence modifie la structure secondaire
pour qu’il en résulte une modification de la migration en électrophorèse.
Processus :
- La séquence où l’on souhaite rechercher une mutation est amplifiée par PCR.
- Cette séquence ne doit pas dépasser 300 à 500 bp.
- L’ADN est marqué par un iso-radioactif au cours de l’amplification.
On peut introduire un nucléotide 32P dCTP ou alors utiliser des primers marqués.
11. Puces à ADN (microarray) ou ADN chips
La technologie des puces ADN permet l’analyse de l’expression de milliers de
gènes simultanément.
Employer les puces ADN vise à caractériser les relations gène-fonction ou
définir et comparer les profils d’expression des messagers exprimés dans des
cellules isolées dans différentes conditions (exemple : cellules normales
comparées aux cellules tumorales) ou soumises à différents traitements
(définition du profil d’action d’une drogue). Les puces ADN sont un outil de
choix dans la recherche et la caractérisation de nouvelles molécules à visée
thérapeutique.