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CHARME 1

Thème Thème : : Culture et production de cellules phytoplanctoniques. Réponses du phytoplancton aux ajouts de contaminants métalliques. Caractérisation structurale des exsudats

Orateur: MARZOUKI Mohamed

- Laboratoire d’accueil :

PROTEE-CAPTE (Toulon)

– Maître de stage : M. C. Le PouponMme. Ortalo-Magne

Annick,

12 juin 2006

CHARME 2

Carbone organique extracellulaire (exsudat)

1. Cultiver et produire des cellules de diatomées

2 . Isoler et caractériser leurs polymères

butbut Amélioration de la connaissance des phénomènes chimiquesdans l’environnement côtier

CHARME 3

Intérêt de travailIntérêt de travail

•importance écologique : source d’énergie

• causer des changements sur l’écosystème

Carbone organique extracellulaire (exsudat)

CHARME 4

Analyse des données bibliographiques

Secteur d’étude

La petite rade de Toulon - grande activité humaine

- industrie chimique- port commercial et militaire

Apport conséquent en Contaminants variés

CHARME 5

La connaissance de trois termes suivants:- Phytoplancton- Polysaccharide- cuivre


• Phytoplanctoncroit prés de la surface première chaîne alimentairela production de la matière organique(MO) équivalent à

l‘ensemble de la végétation terrestre puis de CO2

peut avoir une grande influence sur le climat par l’échange de CO2

Lumière pour la photosynthèse

CHARME 6


• Polysaccharides

- les plus abondants dans les océans - présentent une grande surface active permettant de jouer un

rôle dans la fixation des polluants métalliques il y a deux types de polysaccharides

- polysaccharides de réserve: source d’énergie- polysaccharides structuraux

[Cx(H2O)y)]n- (où y est généralement x – 1)

• Cuivre- le plus complexé par la MO- on le trouve partout dans l’environnement - Facile à analyser

CHARME 7

1.1. Cultiver et produire des cellules de diatomées Cultiver et produire des cellules de diatomées

Méthodologies

Souche naturelle de diatomée

cylindrotheca Closterium

- Prélèvement: rade de Toulon- Concentrer par filtration inverse - Isolation par dilutions successives- Repartir entre différents erlen-meyer

Dans un milieu f/2:

f/2: Solution de sels nutritifs Solution métallique Solution vitaminique

CHARME 8

Méthodologies

Le développement des cultures se fait :- Chambre thermostaté 17°C- Éclairement contenu

Éclairement contenu plus d’exsudation

CHARME 9

Méthodologies

Les Conditions optimales de la culture

Travail précédent M2 a permit d’obtenir les résultats suivants:

1- la croissance algale se fait selon 3 phases

Phase exponentielle

Phase stationnairePhase de latence

CHARME 10

Méthodologies

2- la production de polysaccharides est maximale à la phase stationnaire

Pour obtenir le maximum d’exsudationTravail dans les mêmes conditions

- dans une chambre thermostatée 17°C- Éclairement contenu - l’arrêt de la culture à la phase stationnaire

- Double densité cellulaire- Augmentation de volume

4 fois

On a ajouté

Phase stationnaire

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Méthodologies

Suivre la croissance et l’excrétion phytoplanctonique- L’étape de la croissance - Concentration du carbone organique totale

1- Suivre la croissance- Comptage- Concentration en chlorophylle-a

MicroscopeFluorescence

2- Suivre l’excrétion d’exsudats- concentration de COD- concentration de glucose

analyseur TOCSpectroscopie UV-visible

analyseur TOC

CHARME 12

MéthodologiesCulture en phase stationnaire (7 jours)

Arrêt de la culture par filtration (0,45 µm)

Séchage

Extraction avec NaCl 1,5 M + Agitation

Centrifugation 30’/4°C

Filtration 0, 45µm

Filtrat surnageant

Ultrafiltration, (dialyse concentration) 1kDa

Rotavapor

Partage CHCl3/MeOH/H2O

Phase aqueusePhase Organique

Ethnol. (4fois V)/4°C/1 nuit

EPS liée

Centrifugation 30’/4°C

EPS libre

Isolement

CHARME 13

Caractérisation structurale des exsudatsCaractérisation structurale des exsudats

Méthodologie

1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 3- Voltampérométrie à redissolution anodique (DPASV).4- Spectre Infra Rouge IR

1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)- mettre en évidence l’existence des polysaccharides - la différence de structure entre les deux phases, particulaire et dissoute- la différence entre les deux milieux (sain et pollué)

2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)- déterminer les compositions monosaccharidiques - taux de glucides

3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV).- l’adaptation des cellules aux deux concentrations d’un polluant métallique - envisager le déroulement des mécanismes de détoxification

4- Spectre Infra Rouge IR voir les groupements fonctionnels qui peuvent complexer le cuivre

CHARME 14

1- Culture et production de cellules phytoplanctoniques.

ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES

Témoin 0 Cu 3 erlen-meyer x 1L500 ppb Cu 3 erlen-meyer x 1L1000 ppb Cu 3 erlen-meyer x 1L

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3 4 5 6 7

Jours

Inte

nsi

té e

n c

hlo

rop

hyl

e-a

Témoin

500ppb

1000ppb

Phase exponentielle

Phase stationnairePhase latence

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Jour

[ ]

CO

D (

en m

g/l

)

Témoin

500ppb

1000ppb

3 jours

CHARME 15

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

jour

[ ]

TO

C Témoin

500ppb

1000ppb

Deuxième culture

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Jours

inte

nsit

é e

n c

hlo

rop

hyll

e-a

Témoin

500ppm

1000ppm

Troisième culture

9

11

13

15

17

19

21

23

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

heures

[ ]

CO

D (

en

mg

/l)

Témoin

500ppb

1000ppb

Troisième culture


- Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente pour les trois cultures réalisées?- Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente par rapport aux recherches précédentes pour des espèces voisines ?- Pourquoi y a t-il une chute de COD dans la première culture ? - Quelle transformation a subi le COD dans la première culture ?

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On considérer qu’il y a- Une culture homogène- Une seule espèce

en réalité- Culture hétérogène- Il y a d’autres micro-organismes

(bactérie…….)

Pour avoir une bonne culture il faut: - Sélection par prélèvement contenu 4, 5 fois - élimination des autres espèces (bactérie) - Ajuster les facteurs influencent la culture (lumière, température,….)

La disparition de COD dans la première culture:- Consommation bactérienne- Précipitation

CHARME 17


Isolement

masse polysaccharide

ppb Cuivr

e EPS libre EPS liée

la première culture(7 jours)

Témoin 6,05 5,6

500 8,02 8,17

1000 6,9 1,84

la deuxième culture(11 jours 1 /2)

Témoin 1 –

500 2,15 –

1000 1,55 –

La quantité augmente avec la [ ] de cuivre- 500 ppb Cu: utilisation de polysacch pour la détoxification- 1000 ppb Cu: non adaptation au milieu, mortalité

La quantité de polysaccharides dans la phase dissoute est plus important que sur les cellules

Dans la phase stationnaire la quantité de polysacch est plus importante

CHARME 18


Spectre H-RMN

0 ppb Cu PES Liée 0 ppb Cu PES Libre

Il n’a y pas nécessité de se protéger la quantité des EPS faibles

CHARME 19

500 ppb Cu PES Libre

1- Spectre H-RMN


500 ppb Cu PES Liée

Différence- l’intensité - l’environnement moléculaire

Existence des EPS

CHARME 20


2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).

Arabinose Rahmanose Manose Xylose Galactose Glucose

α Q P α Q P α Q P α Q P α Q P α Q P

0 1,06 0,03 3,41 1,12 0,49 50 1,12 0,11 11,2 1,1 0,11 11 1,1 0,12 12 1,1 0,1 5,54

ESPLibres 500 1,06 - - 1,12 0,74 74 1,1 0,07 7 1,1 0,15 15 1,1 0,2 35 1,1 0,1 10

1000 1,06 0,09 9,11 1,12 0,49 50 1,1 0,14 14,9 1,1 0,34 34 1,1 0,35 35 1,1 0,2 15

0 1 - - 1,13 - - 1,12 - - 1,1 - - 1,1 - - 1,1 - -

ESP Liés 500 - - - 1,12 0,42 42 1,1 0,06 6 1,1 0,04 4 1,1 0,13 13 1,1 0,1 11

1000 1,06 - - 1,12 0,8 8 1,12 0,03 3 1,1 0,08 8 1 0,02 2 1,1 0 3

α = temps de rétentionQ = la quantité de chaque monosaccharide en µLR%= le pourcentage de chaque monosaccharide - = traces monosaccharides non quantifiés

Identification des 6 monosaccharides (/ références) pour les 6 EPS La même origine

CHARME 21


30,031,1220,021,0480,081,091000

110,111,12130,131,0540,041,09500ESP Liés

--1,12--1,05--1,090

150,151,12350,351,0534,40,341,091000

100,11,11350,21,05150,151,09500ESP Libres

5,540,051,12120,121,0511,30,111,110

P %QαP %QαP %Qα

xylose Galactose Glucose

2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).

La pourcentage augmente en milieu contaminé

EPS Liésrenouvellement

EPS LibresAccumulation

CHARME 22


3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV).

Ajout de Cu de deux EPS libre

0

2

4

6

8

10

0 500 1000 1500 2000

ajout de Cu (µL)

nA

/V(

E -

10)

ESP Témoin

ESP 500 ppb Cu

Nous continuons encore à ajuster notre protocole

- les ESP ont une grande capacité complexante- les ESP en milieu contaminé est plus complexant

[ ] Cu = 1000µM[ ] ESP = 1mg/l

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4 Infra rouge (IR) 1- sur les cellules

500

Témoin

1000

Superposition des bandes +

déplacement de certaines fréquence du fait de leur environnement structurale=

Distinction nette est très difficile des bandes

1000

Témoin

500

déconvolution

Cu 500 ppb

Témoin

Cu 1000 ppb

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Associés à des liaison de compléxation M-O(O acide carboxylique)

Cu 1000 ppb

Témoin

Cu 500 ppb

déconvolution

Les fonctions structurales sont associées au métal

4 Infra rouge (IR) 1- Des cellules

CHARME 25

4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS


0 ppbCu 500 ppbCu

1000 ppbCu

Absorption plus important quand la [ ]Cu augmente

Attribuée à l’utilisation des fonctions organiques dans Les liaisons M-O/O-M-O

Sont moins intenses Attribué à l’augmentation de la contribution des

Bandes de vibration Métal-N

CHARME 26

0 ppbCu 500 ppbCu

1000 ppbCu

4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS


Illustre bien la mobilisation des ses groupes fonctionnels avec le Métal

quasi-absent

quasi-absent Existence da l’acide uroniqueAbsence des signaux de CH2 et CH3(2924,2854) principalement composé d’acide uronique

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Conclusions et perspectives

Ce stage nous a permit:

- La sélection des individus qui ont les mêmes caractéristiques- Traitement spécial pour éliminer tous micro-organismes culture homogène

- amélioration des connaissances des cultures

- confirmation de certains résultats sur l’exsudation- caractérisation structurale des polysaccharides

- Le développement cellulaire est affecté par la contamination métallique- L’exsudation est d’autant plus importante que le milieu est contaminé

La présence des différentes composésLe pourcentage relatif de certains croit avec la [ ] en Cu La contamination augmente les sites complexants jouer un rôle considérable dans le mécanisme de détoxificationperspectives

- Orientation vers une caractérisation fine des exsudats- Travail multiparamètrés sur différentes espèces phytoplanctoniques et contamination par plusieurs métaux lourds

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Merci pour votre Merci pour votre attention attention

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