Chapitre I : Le sang et l’hématopoïèse

1- Caractères physiques du sang

• Un tissu liquide.

• Plus dense que l’eau.

• Visqueux

• Rouge clair (oxygéné) et rouge foncé (perd son oxygène)

• Température (37°C).

• goût légèrement salé.

• Le volume total (environ 5 litres).

2- Hématopoïèse et cellules souches myéloïdes

L'hématopoïèse : la fabrication des cellules sanguines. Localisation de l'hématopoïèse : dans la moelle osseuse.

• De la naissance jusqu’à 5 ans : dans tous les os. • Après 5 ans : les os plats (crâne, sternum, côtes, vertèbres et os du bassin) et même les

épiphyses des os long.

Cellules souches hématopoïétique (CSH):

Os long

Épiphyse

L’hématopoïèse

Épiphyse

Cellule souche lymphoïde Cellule souche Myéloïde

Auto-renouvellement

CSH

LB LT NK Plaquettes Granulocytes Monocytes Érythrocytes

3- Les organes hématopoïétiques

Organes lymphoïdes primaires : La Moelle osseuse : myélopoïèse et lymphopoïèse B. Thymus : Lymphopoïèse T (les cellules souches lymphoïdes sont dans la moelle osseuse).

Organes lymphoïdes secondaires : passage et accumulation des cellules immunitaire. Ganglions, rate, amygdales, intestin.

3-1- Moelle osseuse :

Deux types : - Moelle osseuse rouge : lieu de l’hématopoïèse. - Moelle osseuse jaune : la moelle adipeuse.

Les cellules hématopoïétiques : L'hématopoïèse comporte 4 compartiments: Les cellules souches Les progéniteurs Les précurseurs Les cellules matures

Compartiments des cellules hématopoïétiques

3-2- Thymus :

• Les LT immatures de grandes tailles (lymphoblastes) qui produisent des cellules de plus petite taille (thymocytes) qui migrent vers le cortex profond, certains dégénèrent et sont phagocytés par les macrophages.

• Les thymocytes restants migrent vers la médulla et subissent des sélections par les cellules dendritiques, cela conduit à la maturation.

• Les corpuscules de Hassal correspondent à des cellules épithéliales dégénératives.

3-3- Rate :

La rate est constituée de : • La pulpe rouge : lieu de l’élimination des hématies vieillis et altérés • La pulpe blanche : le composant immunitaire de la rate (LB, LT, Macrophage)

La rate produit la réponse immunitaire contre les antigènes véhiculés par le sang. Remarque : le centre germinatif est une structure spécialisée se formant suite à l'activation des lymphocytes B par leur antigène.

Organisation cellulaire du thymus humain

Cellule épithéliale du cortex

Thymocyte

Cellule épithéliale de la médulla

Cellule dendritique

Macrophage

Capsule

Septum

Epithélium sous-

capsulaire

Jonction cortico-

médullaire

Corpuscule de Hassal

Cortex

Médulla

Lymphoblaste

3-4- Les ganglions lymphatiques :

Produit la réponse immunitaire contre les antigènes véhiculés par la lymphe.

Le cortex : • Le cortex externe contient des follicules lymphoïdes riches LB et des sinus

lymphatiques. • Le cortex profond héberge des LTh qui interagissent avec les LB pour produire une

réponse immunitaire. La médulla :

• Les sinusoïdes médullaires. • Des cordons médullaires contenant cordon des macrophages et des plasmocytes.

Les plasmocytes, migrent du cortex vers les sinus médullaires pour sécréter leurs immunoglobulines directement sans quitter le ganglion.

La rate

3-5- Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses :

Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT) sont les tissus lymphoïdes secondaires collectant les antigènes provenant du tractus respiratoire, gastro-intestinal et uro-génital (GALT et BALT). Exemple : (La plaque de Peyer) : présent dans la muqueuse intestinale de l’iléon. Une plaque de Peyer est formée des composants suivants : (1) l'épithélium de surface : constitué de cellules M (intercalées entre les entérocytes), spécialisées dans le transport des antigènes. Les cellules M peuvent introduire des LB et des monocytes qui, eux, peuvent internaliser des antigènes au sein du cytoplasme de la cellule M. (2) Les follicules lymphoïdes : riches en LB, chaque follicule est composé d’un centre germinatif et d’une zone de manteau. (3) Le dôme : sépare les follicules de l'épithélium superficiel et contient de nombreuses cellules présentatrices de l’antigène (macrophages). (4) Les lymphocytes T sont distribués entre les follicules.

Epithélium de surface

Sinus sous-capsulaire

Capsule (tissu

conjonctif)

Un ganglion lymphatique

Plaque de Peyer

Cordon médullaire

Chapitre II : Erythropoïèse et Erythrocytes

1- Définition de l’érythropoïèse :

Renouvellement des globules rouges afin de compenser leurs pertes.

2- Les divers stades de la formation des érythrocytes :

• CSH CS myéloïde CFU-GEMM.

CFU-GEMM BFU-E (Burst Forming Unit – erythroid) CFU-E.

• Différenciation des CFU-E en proérythroblastes

• Les proérythroblastes subissent 4 mitoses successives donnent naissance en 5 à 7 jours

aux réticulocytes qui évoluent en GR matures en 3 jours.

Proérythroblaste

Erythroblastes basophiles I

Erythroblastes basophiles II

Erythroblaste polychromatophiles

Erythroblastes acidophiles

16 Réticulocytes

3- Régulation de l'érythropoïèse :

3-1- Régulation positive :

a) Eléments nécessaires à l'érythropoïèse :

- Fer : est essentiel à la synthèse de l'hémoglobine

- Acides aminés : nécessaire à la synthèse de la globine et l’hème (synthèse de la

protéine d’hémoglobine)

- Les Vitamines : la vitamine B12 et les folates (vitamine B9): rôles principalement

liés à la synthèse d’ADN

- Autres substances nécessaires :

� Cuivre: favorise l’absorption intestinale du Fer, et la libération du fer par

les macrophages

� Vitamine B6: coenzyme d’ALA-synthétase synthèse l’ALA (acide

delta amino-lévulinique) indispensable à la synthèse de l’hème

� Vitamine C: facilite l’absorption intestinale du fer

b) Facteurs de croissance (FC) :

- L'érythropoïétine (EPO) : Hormone glycoprotéique (FC majeur de

l'érythropoïèse).

EPO permet la différentiation et la prolifération des BFU-E tardifs en CFU-E.

Mais surtout permet cette différenciation : CFU-E PE EB.

Molécule d’hémoglobine

- Autre cytokines :

* Interleukine 3

* GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor).

* SCF (Stem Cell Factor).

* Interleukine 9.

* Interleukine 11.

3-2- Régulation négative : Pour éviter une trop forte production de globules rouges,

l’érythropoïèse doit être régulée de façon négative comme suit :

� Cytokines inhibitrices: TNF alpha et interféron gamma libérés par les macrophages

ont une action négative sur la prolifération des CFU-E et des proérythroblastes.

� La sécrétion de l’EPO diminue.

� Caspase : enzyme provoquant l’apoptose des cellules qui forment les érythrocytes.

4- Aspects morphologiques :

1. Proérythroblaste :

� Cellule arrondie

� Taille = 20-25 µm de diamètre

� Rapport nucléo cytoplasmique élevé

� Noyau = rond ; chromatine fine et nucléoles nets

� Cytoplasme = intensément basophile

2. Erythroblaste basophile :

� Taille : 14-18 µm

� Noyau rond

� La chromatine se condense

� Le cytoplasme reste basophile

3. Erythroblaste polychromatophile :

� Taille : 12-15 µm

� Noyau rond dont la chromatine se condense plus

nettement

� Le cytoplasme devient gris (superposition du bleu

de l’ARN et de l’orangé de l’hémoglobine)

4. Erythroblaste acidophile :

� Petite cellule (8-10 µm)

� Petit noyau rond et dense

� Cytoplasme qui a presque la couleur d’une hématie

5. Réticulocyte: Expulsion du noyau de l'érythroblaste

acidophile.

De taille et de volume un peu supérieurs à ceux du GR

(8 µm de diamètre), il possède des ribosomes et des

mitochondries.

5- L’érythrocyte :

Le globule rouge, encore appelé hématie ou érythrocyte est la cellule sanguine la plus

abondante. Elle est ainsi appelée à cause de la couleur rouge-rosé qu'elle prend à la coloration

de May Grunwald Giemsa (MGG), au microscope optique. Cette coloration est due à son

contenu en hémoglobine.

5-1- Morphologie : disque biconcave, 7 µm de diamètre et 2 µm d’épaisseur. Cellule

dépourvue de noyau et d’organites.

Physiologiquement, les hématies d'un frottis sanguin sont de même taille, de même forme et

de même couleur.

5-2- Pathologie :

Les plus importantes sont :

Anisocytose : hématies de diamètres différents.

Anisochromie: hématies de colorations différentes.

Poïkilocytose : hématies de formes différentes.

Dacryocyte : (encore appelé "hématie en larme"

ou "en poire") hématie à extrémité allongée ou

effilée.

Corps de Howell-Jolly : granule sphérique de

1µm de diamètre environ, coloré en violet foncé

au MGG, correspondant à un fragment de

chromosome isolé lors de la mitose.

Anneau de Cabot : persistance anormale de fibres

du fuseau mitotique dans une hématie, sous forme

d'un fil rouge ou violet au MGG, en cercle ou en

huit.

6- Biochimie des constituants érythrocytaires :

Trois éléments : la membrane, les enzymes, et l'hémoglobine.

6-1- la membrane : * Lipides = 42%.

* Glucides = 8%.

* Protéines = 50%.

6-2- Métabolisme et enzymes érythrocytaires : plusieurs enzymes du stock érythrocytaire

interviennent dans ces réaction.

6-2-1- Métabolisme énergétique :

La voie principale (glycolyse) : transformation du glucose en pyruvate. Les molécules

générées : l'ATP et le NADH, H+, 90 % du glucose est catabolisé par cette voie.

La voie accessoire (cycle des pentoses phosphates) : assure 10 % du catabolisme du

glucose, régénère du NADPH, H+.

6-2-2- Système d’oxydoréduction :

Le glutathion : tripeptide formé d'acide glutamique, de cystéine et de glycine

Le glutathion réduit permet la détoxication des peroxydes (R-O-O-R', ex : H2O2) et donc

protège contre l'oxydation de l’hémoglobine.

2 GSH + peroxyde GSSG + peroxyde réduit.

6-3- l’hémoglobine : 6-3-1- Fonction : transport d’O2 et du CO2, et des échanges gazeux au niveau des tissus et du

poumon.

6-3-2- Structure : partie protéique (4 chaînes de globine) et une partie non protéique ou

groupement prosthétique (4 molécules d'hème) :

• L'hème : protoporphyrine comportant Fe2+

(fer ferreux).

Ponctuations basophiles et érythroblastémie :

Ponctuations basophiles (pb) : fines granulations bleutées au MGG,

dispersées dans le cytoplasme des hématies, de taille et de forme

hétérogènes, correspondant à une précipitation nucléotidique.

Erythroblaste circulant (ec) : présence anormale d'érythroblastes dans le

sang, le plus souvent acidophile ou polychromatophile.

Glutathion

• La globine : Chaque molécule d'Hb est formée de 4 sous-unités identiques deux à deux

: 2 chaînes α, et 2 chaînes β.

6-3-3- Biosynthèse :

Début : proérythroblaste et fin : réticulocyte.

1- Formation d'acide delta amino-lévulinique (ALA).

2- Formation de la protoporphyrine : suite de réactions.

3- Incorporation du fer.

6-3-4- Méthodes d’études : en plus de l’hémoglobine normale, il existe des Hb anormales,

exemples : HbS, HbC, HbE.

Il y a plusieurs méthodes qui permettent la différenciation des différentes hémoglobines

(normale ou anormale), les plus courantes :

• Electrophorèse

• Chromatographie

6-3-5- hémoglobines anormales : Les gènes de globine peuvent être le siège d'anomalies

moléculaires. On distingue deux grands groupes d'anomalies :

• Anomalie de structure, exemple de la drépanocytose : anémie à cellules falciformes.

• Un déficit de synthèse des chaînes de globine, exemple des thalassémies.

Protoporphyrine L’hème

Succinyl ─ CoA Glycine ALA

ALA synthase

CO2

+

CoA─SH

Ferrochélatase

Fe++

2H+

Séparation et

caractérisation des

molécules

Cycle de Krebs

7- Le métabolisme du fer :

7-1- Absorption digestive :

Alimentation : Apport de 10 à 15 mg / jour.

L'absorption par l'intestin ne dépasse pas 10 à 15% de ce contenu, seulement 2 à 4 mg/jour

absorbé sous forme de Fe++

.

Mécanisme : Réduction du Fe+++

(alimentaire) en Fe++

par une ferriréductase dans les

microvillosités de l’intestin grêle.

Transport du Fe++

par transporteur transmembranaire DMT1 (pôle apical de l'entérocyte).

Export du Fe++

par la ferroportine (pôle baso-latéral de l'entérocyte).

Oxydation du Fe++

en Fe+++

par la ferroxydase.

7-2- Transport :

2 Fe+++

sont liés à une molécule appelée : transferrine, qui amène le fer à la moelle osseuse.

8- Hémolyse :

L'hémolyse est le phénomène irréversible par lequel les globules rouges sont détruits et

libèrent leur contenu hémoglobinique.

8-1- Hémolyse physiologique :

Il s'agit d'un phénomène qui touche les hématies à la fin de leur vie dont la durée moyenne est

de 120 jours.

8-2- Hémolyse pathologique :

Elle peut être due à deux mécanismes principaux:

• Soit une anomalie du globule rouge : hémolyses corpusculaires ou globulaires

- Anomalie de la membrane.

- Anomalie de l'hémoglobine

- Déficit enzymatique

• Une agression extrinsèque des hématies : hémolyses extra corpusculaires

9- Les anémies :

9-1- Définition :

C’est une diminution du nombre des globules rouges, plus exactement, elle se caractérise par

la baisse du taux de l’hémoglobine du sang circulant par rapport à des valeurs normales.

9-2- Classification : Elles peuvent être classées également selon leurs caractéristiques sur la numération

globulaire :

• anémie arégénérative : les réticulocytes ne sont plus produits ce qui signe une anémie

centrale.

• anémie hypochrome : la teneur des hématies en hémoglobine (Teneur corpusculaire

moyenne en hémoglobine) est inférieure à la norme, par carence en fer par exemple.

• anémie macrocytaire : la taille des hématies (Volume globulaire moyen) est supérieure

à la norme, par carence en vitamine B12 ou en folates par exemple.

• anémie microcytaire : la taille des hématies (Volume globulaire moyen) est inférieure

à la norme, par carence en fer par exemple.

9-3- physiopathologie :

3.1. Origine centrale : insuffisance de production médullaire

Ce sont des anémies arégénératives; le taux des réticulocytes diminue, ou nous avons des

cellules effondrés.

Elles révèlent un trouble de la production des GR, en raison de:

− Diminution de la synthèse de l’Hb (carence en fer) ou de l'ADN (carence en folates ou en

B12)

− Diminution de la synthèse de l’Epo

− Atteintes des progéniteurs des GR, ou de la cellule souche

− Envahissement médullaire par une hémopathie maligne, un cancer ou une infection

3.2. Origine périphérique : raccourcissement de la durée de séjour des hématies dans la

circulation.

Ces anémies sont régénératives: la moelle est hyperproductive afin de compenser la perte des

globules rouges. Les réticulocytes sont élevés. Toutefois, un délai de 2 à 3 jours est nécessaire

avant que les réticulocytes ne soient déversés dans la circulation. Ces anémies relèvent de 2

entités :

− Les hémorragies

− L’hyperhémolyse pathologique.

Fiche TD n°1 Immunologie-Hématologie

Université Hassiba Benbouali de Chlef

Faculté SNV

Département de biologie

L3 Microbiologie

Les prélèvements en hématologie et transfusion sanguine

Analyses de la quantité et la qualité des éléments du sang : érythrocytes, leucocytes,

plaquettes, hémoglobine, vitesse de sédimentation, coagulation…etc.

1- Prélèvement du sang en hématologie :

1-1- Conditions du prélèvement :

Prélèvement effectué sur le sujet reposé, de préférence à jeûne (la période doit être supérieure

à 12 h).

Port des gants obligatoire.

1-2- Conditions de conservation et de transport :

Conserver les prélèvements à la température ambiante et les amener le plus rapidement

possible au laboratoire.

1-3- Principaux anticoagulants utilisés en Hématologie :

1-4- Mode opératoire

- Se munir d'une seringue au volume correspondant aux analyses qu’on veut faire.

- Le prélèvement se réalise au pli du coude, Aux avant-bras et sur la face dorsale de la

main. Pour faire saillir la veine, faire serrer le poing par le patient.

On cherche le site de ponction dans l’ordre suivant : 1, 2, 3.

Coagulation FNS

Vitesse de sédimentation

(VS)

- Garrotter le bras du patient. Déterminer le point de pénétration de l’aiguille par

palpation. Toujours désinfecter après palpation.

Le délai entre la pose du garrot et le prélèvement ne doit pas excéder 1 minute. La pose

prolongée d’un garrot peut fausser le résultat de certaines analyses.

- Désinfecter la zone cutanée.

- Lorsque le sang est prélevé retirer la seringue est remplir les tubes immédiatement.

- Remuer soigneusement ceux contenant l'anticoagulant: agitation par retournement 8 à

10 fois.

- Identifier immédiatement les tubes.

2- Modalités du prélèvement du sang en transfusion sanguine :

Une transfusion sanguine est une opération consistant à injecter, par perfusion intraveineuse,

du sang ou des dérivés sanguins.

Qui peut donner le sang ?

- Toute personne en bonne santé,

- Agée de 18 à 65 ans,

- Qui a un poids et une taille suffisants,

- Ne présentant pas de risque de maladies transmissibles par le sang

Le prélèvement :

Un médecin ou une infirmière place une aiguille stérile et à usage unique dans une veine du

pli du coude. Lors du prélèvement, la poche sera étiquetée et des échantillons seront recueillis

afin d’effectuer des analyses en laboratoire.

Pli du coude

Avant bras

Face dorsale de la main

1

2

3

1

Fiche TD n°2 Immunologie-Hématologie

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L3 Microbiologie

L’hémogramme

I- Définitions :

L’hémogramme ou Numérations-Formule Sanguine (NFS) englobe:

1) Numérations: GR (ou érythrocytes ou hématies), GB (ou leucocytes), Plaquettes (ou

Thrombocytes). (nb de cellules/mm3)

2) Valeurs et constantes:

-érythrocytaires:

� Taux Hémoglobine sanguin Hb : exprimé en g/dl (Dosage spectrophotométrique à 540

nm).

� Hématocrite Hte : Mesure du volume occupé par les globules rouges dans un échantillon

de sang par rapport au volume de celui-ci, exprimé en pourcentage.

Hte% = (Vol. globulaire / Vol. sanguin total) x100

� Volume Globulaire Moyen VGM : désigne le volume moyen, la taille de chaque globule

rouge, calculée par le rapport entre l’hématocrite et le nombre d’hématies, exprimé en fL

(femtolitre) (10−15

litre), fL = µm3.

VGM (L) = Hématocrite (nombre compris entre 0 et 1) / Nombre de Globules Rouges

par litre conversion en femtolitre.

� Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH : concentration moyenne en

hémoglobine contenu dans 100 ml d’hématie (hémoglobine divisée par hématocrite),

exprimée en g/100 ml.

CCMH = Hémoglobine (g/dl) / Hématocrite (L.L-1

).

� Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH : poids moyen d’hémoglobine contenu dans

une hématie, exprimé en pg (picogramme) (10-12

g)

TCMH = Hémoglobine (g/L) / Nombre de Globules Rouges par litre conversion

en picogramme.

2

-plaquettaires:

� Thrombocrite THT

� Volume Plaquettaire Moyen VPM

II- Indications de l’hémogramme : 1) Des signes évoquant une diminution ou augmentation d’une ou plusieurs lignées

sanguines

2) Atteinte de l’état général (exemple : anorexie)

3) Certaines situations précises (exemple : grossesse)

III- Valeurs normales :

GR Homme 4,5 à 6 .10

6 /mm

3

Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm

3

Hématocrite Homme 40 à 54 %

Femme 37 à 47 %

Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml

Femme 12 à 16 g/100ml

VGM 82 à 98 fl

CCMH 32 à 36 g/100ml

TCMH 27 à 32 pg

Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3

GB 5000 à 10 000 /mm3

Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3

Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3

Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3

Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3

Monocyte 200 à 800 /mm3

Même signification que celles des globules

rouges, sauf qu’ils sont spécifiques pour les

plaquettes.

Uni

L3 Microbiologie

TP n° 01 : n

1) But de la manipulation

Numération des globules rouges

2) Principe

Le principe de la numération d

comptage des cellules.

Lecomptage est réalisé sous

d'unecuvette microscopique de

(cellule de Malassez).

3) La cellule de Malassez

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Département de biologie

: numération manuelle des hématie

lation

rouges et blancs contenus dans 1mm3 de sang.

tion des hématieset leucocytes est basé sur la dilu

sous microscope en utilisant une cellule de n

ue de 1 mm3 de volume et dont le fond est qu

lassez :

Cellule de Malassez

Quadriallage de la cellule de Malassez

ématies

la dilution du sang et le

de numération dotée

est quadrillé en carrés

La gravure d'une lame de Malassez se compose d'un certain nombre de traits, délimitant en

fait, 100 rectangles, dont certains sont subdivisés en 20 petits carreaux.

Longueur = 0,25 mm

Largeur = 0,20 mm

Profondeur = 0,20 mm

Le volume total de la cellule est de 1 mm3(2,5 × 2 × 0,20)

Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales de 0,25 mm de large et de 10 bandes

horizontales de 0,20 mm de large formant ainsi 100 rectangles, on ne comptera les cellules

que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.

Pour réaliser le remplissage de la cellule, il faut :

• Humidifier les glissières latérales sur lesquelles va reposer la lamelle

• Déposer la lamelle sur les rebords, celle-ci doit adhérer par un "effet ventouses"

• Placer l'extrémité de la pipette sur la partie 2 contre la lamelle et délivrer par capillarité le

liquide en évitant tout débordement vers les rigoles.

4) Les pipettes de POTAIN :

La grande pipette est marquée 101 au-dessus de la boule, elle sert au comptage des hématies

dont le nombre est très grand. On dilue donc 1 partie de sang pour 100 parties de solution de

HAYEM ou d’eau physiologique (NaCl à 0.9%).

La petite est marquée 11 elle sert à diluer le sang au 1/10ème

avec la solution de LAZARUS qui

détruit les hématies et colore les globules blancs.

5) Mode opératoire

a- Dilution du sang :

Plonger la pipette (101 ou 11) qui doit être propre et sèche dans une goutte de sang. Aspirer

jusqu'au trait 1, essuyer la pointe à l’aide de papier hygiénique puis diluer avec les solutions

de HAYEM, d’eau physiologique ou de LAZARUS :

• Globules rouges : aspirer jusqu'au repère 101 la solution de HAYEM ou d’eau

physiologique.

• Globules blancs : aspirer jusqu'au trait 11 la solution de LAZARUS.

Maintenir la pipette horizontalement et la faire rouler entre les doigts. La petite boule à

l'intérieur assurera le mélange.

b- Comptage :

Bien nettoyer la cellule avant de l'utiliser, prendre la pipette de POTAIN et soufflez pour

rejeter les premières gouttes contenues dans la tige.

Déposer alors une goutte du mélange sur la zone quadrillée de la cellule recouverte d'une

lamelle en évitant les bulles d'air. Disposer sous le microscope au grossissement de 400 fois et

compter les cellules.

• Globules rouges

Compter le nombre d'hématies dans 10 rectangles et faire la moyenne - les rectangles seront

choisis au hasard.

C1 + C2 + C3 + ……. + C10

Moyenne MH =

10

Le nombre d'hématies NH = MH × 100 × 100 (hématies / mm3)

1mm3 = 100 rectangles, dilution du sang 100.

• Globules blancs Leur nombre étant plus réduit on comptera sur les rectangles constitués de 20 petits carrés -

on choisira 5 rectangles au hasard.

C1 + C2 + C3 + C4 + C5

Moyenne M =

5

Nombre de Globules blancs N = M × 100 × 10 (leucocytes / mm3)

1mm3 = 100 grands carrés, dilution du sang 10 fois.

Comparer les résultats de plusieurs échantillons de sang

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L3 Microbiologie-Parasitologie

TP n° 02 : détermination des taux d’hémoglobine et d’hématocrite

I- l’hémoglobine (Hb)

1) But de la manipulation

Détermination de la valeur de l’hémoglobine.

2) Principe

Le sang est dilué dans le réactif de DRABKIN (dissoudre dans 1 litre d’eau distillée 200 mg

de Ferricyanure de K, 50 mg de Cyanure de K et 140 mg de PO4H2K), l’Hb (Fe++) est oxydée

par le Ferricyanure de K en méthémoglobine (Fe+++).

La méthémoglobine ainsi formée se combine avec le cyanure de K pour former un complexe

(la cyanméthémoglobine) qui a un fort pouvoir d’absorption lumineuse à 540 nm.

L’absorbance de la solution est mesurée par le spectrophotomètre à 540 nm en considérant la

solution de Drabkin comme blanc. Les résultats sont exprimés en g/dl.

3) Méthode - Mettez 4 ml de la solution de Drabkin dans un tube.

- Prenez 20 µl de notre échantillon de sang avec une pipette, puis nettoyez bien sa partie

terminale et la verser dans le tube contenant le diluant (solution de Drabkin)

(dilution=1/200).

- Bien agiter et laisser le mélange reposer 5 à 10 minutes (réaction des deux solutions).

- Lire l’absorbance par spectrophotomètre à 540 nm.

4) Calcul

Absorption de l’échantillon

Hb (g/dl) = -------------------------------------X concentration du blanc

Absorption du blanc

5) Précautions à prendre :

- Bien agiter le sang avant manipulation.

- Attention au moment de l’utilisation du cyanure de K.

6) Valeurs normales :

• Homme adulte: 13-17 g/dl

• Femme adulte: 12- 16 g/dl

• Enfant: 11-14 g/dl.

• Nouveau né: 13.0-20 g/dl

II- l’hématocrite :

1) But de la manipulation

Détermination de la valeur de l’hématocrite.

2) Principe :

L’hématocrite représente le volume occupé par les hématies dans un volume de sang total

connu.

La détermination se fait en séparant les hématies du plasma par centrifugation du sang dans

des conditions standardisées de durée et de vitesse.

3) Matériel : -Prélèvement sanguin : sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA

-Tube hématocrite : tube capillaire de 75 mm de long et de 1mm de diamètre ouvert aux deux

extrémités

-Centrifugeuse : présente un plateau spécial et peut tourner à 10 000 tours/min

4) Technique :

-Plonger une extrémité du tube dans le sang veineux homogénéisé (ou dans une goutte du

sang capillaire)

-Laisser le sang monter par capillarité, arrêter le remplissage à environ 1cm de l’autre

extrémité

-Essuyer l’extérieur du tube avec un papier imprégné d’éthanol

-fermer l’extrémité libre avec la pâte à sceller

-Placer le tube sur le plateau, l’extrémité scellée vers la périphérie

-Centrifuger 3min à 10 000 tours/min

-Lire sur un abaque permettant de ramener la hauteur totale du sang à 100%

Calculer la valeur de l'hématocrite suivant la relation :

H (en%) = (Niveau du culot) / (Hauteur globale) x 100