chapitre 1

5/17/2018 chapitre 1 - slidepdf.com

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2 C.I

Dr. Dorsaf Ben Ahmed

MALADIES VIRALES

Durée:10 h 1



Plan du cours

1. Rappel sur les virus phytopathogènes;

2. Méthodes de lutte;

3. Maladies virales des céréales et deslégumineuses;

4. Maladies virales des arbres fruitiers etdes cultures maraîchères.

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INTRODUCTION



Dépréciation de la qualité des produits récoltésainsi que des baisses de rendement;

Avortement des bourgeons et des boutons floraux

(pollen stérile de 30 à 40 % des plantes ligneuses);

En Tunisie, en moyenne 13 à 15T/ha d’agrumes sontperdus à cause des virus;

Certaines souches virulentes (Virus Y de la pommede terre ) anéantissent complètement la récolte.

Incidences Economiques des virus

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Parasites intra-cellulaires obligatoires quine se multiplient que dans les cellulesvivantes;

Un seul type d’acides nucléiques (ADN:Acide Désoxyribonucléique ou ARN: AcideRibonucléique);

Particules ultra-microscopiques (20 à

300nm); Sa multiplication est assurée par laréplication de l’acide nucléique au momentde l’infection;

Définition et caractéristiques généralesd’un virus

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Structure des virus Une particule virale est composée de:

Acide nucléique (ADN ou ARN) base del’information génétique;

Capside: a une structure protéique quiassure la protection de l’acide nucléique

Capside + génome = nucléocapside

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La capside confère une grand stabilitéchimique et une forte résistancemécanique aux particules virales;

La structure de la capside entraîne laforme du virus, ce qui permet de

distinguer 3 organisations symétriques: Hélicoïdale, filamenteux ou en

batonnets

Cubique ou icosaédrique Complexe 7



• Virus en batonnet, 300 nm de longueurexemple: TMV.

• Virus sphérique:

la mosaïque de la tomate

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Nomenclature des virus

La nomenclature des virus n’obéit pas ausystème binomial de la classificationinternationale des micro-organismes.

Il faut suivre trois règles:1. Inclure le nom de la plante hôte sur laquelle il

a été décrits pour la première fois

2. Inclure le symptôme spécifique induit par levirus sur les plantes qu’il attaque.

3. Ajouter le terme V c.à.d Virus pour avoir lenom complet composé de 3 mots

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Exemples:

•

Virus de la Mosaïque du Tabac: TMV• Le nom des virus sont souvent présentés

par un script représentant les initiaux

du nom commun du virus en anglaisTobacco Mosaic Virus

Exceptions:• PVX; PVY; PVS; PVM; PVA….

• TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus

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Classification des virus

Règne Division Sous Division Famille Groupes

Vira Virus à ADN

Virus à ARN

Monocaténaire Bicaténaire Monocaténaire Bicaténaire

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Les familles renfermes plusieurs sous familles et cessous familles renferment des groupes.

Il existe une vingtaine de groupes de virusphytopathogènes

Un groupe renferme des virus ayant des propriétésphysico-chimiques, biochimiques, génétiques,

morphologiques et biologiques semblables. Chaque groupe renferme un membre type ou chef de

groupe qui n’est qu’un virus représentatif du groupe.

Actuellement seulement 920 phytovirus sont décrits

dont 92 genres et 16 familles.

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Exemples de groupes de virus

Les Poty-virus (PVY): - virus à ARN monocaténaire

- filamenteux

- transmis par puceron.

Les Tobamo-virus (TMV):-ARN monocatéraire- En batonnet

- Transmis par semences,champignons

Les Rabdho-virus (AMV): - virus à ARN monocaténaire

- bacilliforme- transmis par puceron.

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TRANSMISSION DES VIRUS

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La transmission verticale:

La transmission verticale correspond à la transmissiondu virus à la descendance d'une plante infectée;

Tous les organes de propagation tel que les boutures,les greffons, les bulbes et les tubercules prélevés surune plante mère virosée seront infectés,

La transmission horizontale

La paroi pecto-cellulosique du végétal est une barrièreinfranchissable par le virus c’est pourquoi il y aintervention d’un troisième facteur appelé vecteur (insectes, champignons, nématodes).

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La transmission mécanique

La multiplication végétative (greffage, bouturage,marcottage, bulbe, tubercule, éclat de souche …).

10% des virus connus sont transmis par les semences (108

virus).

Dans le cas ou le virus infecte les téguments de la graine(localisation exogène) la plantule qui en résulte sera saine.

Cas du TMV Tobacco Mosaic Virus.

En cas d’infection embryonnaire le virus passeautomatiquement à la jeune plantule. (Cas du Pea Sead bornMosaic Virus PSbMV).

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La transmission mécanique

• Lors des opérations culturales (taille, ébourgeonnage,prélèvement de bouture, cueillette…), l’Homme peutcontaminer ses mains, ses vêtements ou ses outils nondésinfectés par des virus et effectuer unetransmission involontaire d’une plante à une autre.

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Transmission mécanique

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Transmission par vecteur

Un vecteur est un organisme biologique mobile qui estcapable d’acquérir et d’inoculer les particules virales à descellules vivantes.

Les principales étapes de la transmission:

1. La période d’acquisition: c’est le temps nécessaire auvecteur pour acquérir un virus d’une plante infectée.

2. La période de latence: correspond au laps de tempsentre l’acquisition du virus et le moment où il pourra letransmettre;

3. La période d’inoculation: c’est le temps nécessaire auvecteur de transmettre le virus à la plante saine;

4. La période de rétention: c’est la période pendant laquellele vecteur demeure capable de transmettre un virus c.à.d

porteur du virus.19



Transmission par les nématodes

• Les nématodes sont munis de stylets leur permettantd’atteindre les tissus conducteurs de la plante pour senourrir.

• Trois genres de nématodes sont vecteurs de virus:Longidorus , Xiphenema et Trichodorus .

• Exemple: TRSV (virus de la tache annulaire du tabac).

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Transmission par les champignons

Seuls les champignons parasites obligatoires quitransmettent les virus;

Appartiennent aux phylums desPlasmodiophoromycota (Pythium ) et au

Chytridiomycota (Olpidium , Polymyxa , Spongospora );

L’activité vectrice est assurée par le stade zoosporemobile;

Une vingtaine de virus sont transmis par leschampignons dont le virus de la nécrose du tabac(TNV) qui est transmis par Olpidium brassicae.

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Transmission par les insectes

Environ 99 % des virus sont transmis par les insectes.

- Pucerons (Aphidide)

- Cicadelles (Delphacides)- Aleurodes (Bemisia, Trialeurodes)

- Thrips (Tingides)

- Coléoptères(Chrysomélides, Coccinelle phytophage)

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Insectes piqueurssuceurs

Insectes broyeurs



Les pucerons

Plus que 160 espèces de puceron sont capables detransmettre les virus.

Le périmètre de dispersion est de 100 à 150 km ouplus avec l’aide du vent.

Modalités de transmission:

* Les virus non circulants ou non persistants* Les virus semi-persistants

* Les virus circulants ou persistants

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Les virus non circulant ou non persistant, les virussont acquis et transmis rapidement (absence depériode de latence);

Le puceron réalise plusieurs piqûres d’essai avant des’installer sur une plante, favorisant ainsi ladissémination du virus d’une plante à l’autre.

Les piqûres d'essai des pucerons durent quelquessecondes à 1 minute puis il y a passage à une autreplante;

Exemple: le virus Y de la pomme de terre (PVY).

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Les virus non circulant ounon persistant



Les virus circulant ou persistant, passent par unecirculation du virus dans le corps de l’insecte.

La période d’acquisition et d’inoculation sont assez longuesdurent de 10 min à quelques heures.

Les pucerons restent virulifères plusieurs jours et parfoistoute leur vie.

Dans le cas où le virus est capable de se répliquer au seinde l’insecte (on parle de virus circulant propagatif).Exemple: Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) jaunissenanisante de l’orge.

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Les virus circulants oupersistant



Transmission persistante

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http://www.google.tn/imgres?imgurl=http://www3.jardiniere.net:443/bebittes/images/Cicadelle%20de%20la%20vigne.jpg&imgrefurl=http://www3.jardiniere.net:443/bebitte/Insectes%20C.aspx&h=150&w=253&sz=11&tbnid=7foXGyy_EOXHuM:&tbnh=90&tbnw=152&prev=/search?q=cicadelle+de+la+vigne&tbm=isch&tbo=u&zoom=1&q=cicadelle+de+la+vigne&docid=1rME0ZcdQioGVM&hl=fr&sa=X&ei=o8kWT-DzEsy0hAeWh8z4Ag&ved=0CCwQ9QEwAzgK&dur=780



1. Les Cicadelles:

-Transmettent les Rhabdovirus et les Geminivirus

Exemple: Virus de l’enroulement des feuilles de pommede terre (PLRV)- Transmission selon le mode circulant propagatif.

2. Les Aleurodes ou mouches blanches:- Transmettent les Clostérovirus et les Geminivirus (111 espèces de virus).Exemple: Virus de la feuille jaune enroulée de la tomate

(TYLC).

-Trois espèces d’aleurodes sont vectrices de virus dontBemisia tabaci est la plus efficace sous abri.

- Le mode de transmission est persistant à semi-persistant.27

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Bemisia_tabaci_from_USDA_1.jpg

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Bemisia_tabaci_from_USDA_1.jpg

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3. Les Thrips: Transmettent les Tospovirus selon un mode detransmission persistant.

Exemple: Frankinella occidentalis vecteur de TomatoSpotted Wilt Virus (TSWV). Virus de quarantaine

en Tunisie.

4. Les Coléoptères:

Sont des chrysomélidés, coccinelle phytophage et lescharançons Ils transmettent des virus appartenant aux genresTymovirus, Comovirus et Sobemovirus.

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Processus d’infection

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1. L'infection se fait à la suite de la rupture de la paroivégétale. Facilité par un vecteur (insecte,arthropode, nématode, champignon…).

2. L'ARN ou l’ADN génomique est décapsidé dans lecytoplasme de la cellule hôte: Décapsidation.

3. La nucléoprotéine virale (ARNg) est transcrit en(ARNm) grâce à l’ARN polymérase synthétise denouveaux ARNg est sera traduit au niveau desribosomes de la cellule hôte pour donner la protéinede la capside. L’ARNg est de nouveau encapsidés, etles virus néo-formés vont infecter d'autres cellules.



Cinétique du virus dans la celluleparasitée

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Protéines demouvement MP



Les phytovirus envahissent leur hôte par lesconnexions cytoplasmiques reliant les cellules ettraversant les parois végétales: plasmodesmes à unevitesse de 1mm ou 8-10 cellules/jour.

Les phytovirus synthétisent des protéines de

mouvement (MP) qui sont responsables de lamigration du virus vers les cellules voisines.L'infection systémique s'effectue ensuite parl'intermédiaire du système vasculaire.

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Cinétique du virus dans la plante hôte



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SYMPTOMATOLOGIE



Introduction

La multiplication des particules virales provoque desperturbations métaboliques conduisant àl'extériorisation de symptômes variés et qui sontcaractéristiques de l’agent infectieux.

Les symptômes varient en fonction du virus, de l'étatphysiologique de l'espèce atteinte et del'environnement dans lequel se trouve la plante.

Certains cas d’infection virale ne sont pasaccompagnés de l’apparition de symptômes: viruslatent on parle de porteur sain.

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Les symptômes foliaires Les mosaïques:

• Il s’agit d’une répartition anormale des pigments

chlorophylliens, associée souvent à une altération dela structure des chloroplastes.

• Les mosaïques typiques sont verts clair ou jaunes.

Exemple typique: Tobacco mosaic virus Tobamovirus(TMV).

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Autres cas de mosaïques

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Tâches diffuses et discrètes: marbrure (Mottle);Exemple: Virus de la marbrure du fraisier (SMV).

Systemic mottle onNicotiana glutinosa , 14days after inoculation

with PVY.



• Tâches en anneaux simples ou concentriques (RingSpot).

Exemple: Virus de la tâche annulaire de la tomateTomRSV.

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Ring Spot



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Coloration plus intense le long des nervures: Mosaïquedes nervures (Vein banding) et si la coloration est plus

claire: il s’agit de vein clearing.

Mosaïque des nervures sur melon infecté

par le SqMV.

Vein banding Vein clearing



Le nanisme et les malformations:

• Le virus entraine une déviation du métabolisme de laplante baisse de la vigueur et un retard decroissance (petite feuille, entre-nœud court, fruitsde petite taille…) Baisse de rendement.

Nanisme ou rabougrissement.

Exemple: Virus de la jaunisse nanisante de l’orge (BYDV).

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• Des malformations spectaculaires peuvent êtreobservées sur feuilles ou fruits.

Tel que: Boursouflures, cloques, gaufrage du limbe.

• Certains virus entraine des excroissances au niveaudes nervures de la face inférieure des feuilles:Enations.

Exemple: Virus de la mosaïque énation du poisPea enation mosaic virus (PEMV).

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Enations on leaf of systemicallyinfected Metilotus indica

Malformations des auberginesbushy stunt virus



Les symptômes corticaux L’écorce fendillé:

• Les fentes niveau de l’écorce peuvent être sèchespour devenir spongieuses et fragiles ou gommeuses.

L’écaillement de l’écorce:

•

C’est un écaillement épidermique de l’écorce.• L’épiderme se détache et tombe;

Exemple: la psorose écailleuse des agrumes

Citrus psorosis virus (CPV).

Ecorce rugueux:• Il s’agit d’une mauvaise lignification des branches d’où

le bois reste souple et parfois un aplatissement desbranches.

40



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Sa Lut,,

Lorsqu’on ne sait pas ce qu’on cherche,

il est difficile de trouver

Diagnostic



Sachant que les phytovirus sont desparasites obligatoires qui ne peuventpas être cultivés sur milieu de cultureartificiel (in vitro ).

Cependant les phytovirus jouissent depropriétés particulières de naturebiologique, physico-chimiques ou

antigéniques qui permettent leursidentification au laboratoire.

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1. Le pathogène (virus) soupçonné doit être associé auxmême symptômes dans toutes les plantes malades;

2. Le virus doit être purifié de la plante malade, inoculé artificiellement à une plante hôte sensible et les

symptômes sont notées.3. Le virus purifié doit être réinoculé à des plantes

saines de la même espèce sur laquelle la maladie estapparue; et doit induire les même symptômes

décrites au départ.4. Le virus doit être inoculé à la même plante hôte

sensible dans la 2ème étape et l’ensemble descaractéristiques doivent être exactement les mêmes

observés initialement à la 2ème

étape.43

Postulat de Koch

h d d



2.Les techniques de diagnostic 2.1. Diagnostic visuel

- Basée sur l’observation des symptômes et se pratiquedeux fois/an;

- Au printemps, quand la plante est en pleine végétationet que la température n’est pas trop forte pourmasquer les symptômes foliaires.

- En été, pour les virus qui se manifestent sur les fruitspar des déformations, décolorations, tâchesannulaires…

Le diagnostic visuel reste un moyen limité dans letemps et dans l’espace et n’est justifié qu’en cas desouche virulente.

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2.2. Diagnostic biologique• Chaque virus a une gamme d’hôtes qu’il est capabled’infecter.

• Les plantes indicatrices ou hôtes différentiels sont

des espèces cultivées ou sauvages.• Développent des réactions particulières (lésionslocales, symptômes généralisés) qui peuvent êtrecaractéristiques d’un virus donné.

•

La transmission expérimentale d’un virus à des plantesindicatrices=Indexage biologique est basé sur lespropriétés infectieuses du virus.

Il y a deux techniques de diagnostic biologique:

2.Les techniques de diagnostic

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Diagnostic sur indicateur ligneux

- Les plantes indicatrices ligneuses doivent être jeunes et àcroissance rapide;

- La technique d’inoculation artificielle est le greffage d’une partie de l’écorce, qui peut révéler l’absence ou la présence

d’infection chez les plantes infectées.

Diagnostic sur indicateur herbacé

- Cette technique permet de révéler la présence du virus

dans un temps court de 7 à 15 jours après inoculation.

- La réussite de cette méthode dépend des facteursbiologiques, physiques et chimiques.

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Diagnostic biologique

L h i d’i l i



- Les techniques d’inoculation:

o L’inoculation mécanique est la plus utilisée pour lesindicateurs herbacés;

- Les plantes tests les plus universelles sont desChénopodes: Chenopodium quinoa et C. clevelandii oules Nicotiana benthamiana et N. clevelandii au stade4-6 feuilles.

o L’inoculation par vecteur:

- Concerne les virus non transmissibles mécaniquement.

- Les vecteurs sont des insectes sains (pucerons,

cicadelles, aleurodes …) qui sont maintenus en élevagesous des conditions contrôlés au laboratoire.

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le diagnostic Sérologique

Repose sur la réaction de deux types de protéines:

1. L’antigène: c’est une molécule étrangère à l’organisme etqui est susceptible de déclencher une réactionimmunitaire chez l’animal cas de protéines virales.

2. L’anticorps: Protéines spécifiques du groupe desImmunoglobulines (Ig) de cet antigène élaborées dans lessérums sanguins d’un animal en réponse de l’injection de

l’antigène.

L’affinité antigène/anticorps se base sur des liaisonshydrogènes et des forces électrostatiques.

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Principe de la production d’antisérumpolyclonaux

1. Injection intramusculaire de virus ou de protéines viralespurifiés (0.1 à 1 mg);

2. Des injections de rappel sont réalisées dans unespacement de 1 à 2 semaines (période de suivit de 1

mois).3. Des prises de sang régulières sont réalisées pour évaluer

le niveau des anticorps spécifiques. Les prises de sangsont réalisés par des ponctions cardiaques ou à partir desveines de l’oreille de l’animal.

4. La séparation du sérum est effectuée à la suite decentrifugation pendant 15 min à 1500 rpm.

5. Le sérum est additionné d’un volume de glycérol puis estmaintenue en conservation à -20°C.

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L’antisérum obtenu est dit polyclonal vu la diversitédes anticorps développés contre les divers

déterminants antigéniques présents sur les particulesvirales ou les protéines virales.

Inconvénients:

Les anticorps polyclonaux sont produits en faible

volume, avec des performances variables d’une prisede sang à une autre et d’un lapin à un autre.

Principe de la production d’antisérum monoclonaux

Les antisérum monoclonaux sont produits chez la

souris et ne contiennent qu’un seul type d’anticorps correspondant à une seule protéine virale.

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51

Immuno-précipitation: Cette technique peut être conduite en milieu liquide sur lame de

verre ou en tube à Hémolyse. Elle est basée sur l’affinité antigène/anticorps qui se traduit par

une précipitation visible à l’œil nu ou au microscope optique.

Consiste à apporter un certains volume de jus clarifié à partirdes plantes à tester et une quantité d’antisérum et laisserincuber dans un bain marie à la température adéquate.

Le précipité se forme au fond du tube ou à la partie médiane encas de plante malade.

Avantages/Inconvénients: Méthode rapide la précipitation se fait en quelques minutes; Peu sensible vu que l’excès d’antigène ou d’anticorps empêche la

visibilité de la précipitation.

Quelques techniques d’analysesérologique



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Immuno-précipitation: Cette technique peut être conduite en milieu liquide sur lame de

verre ou en tube à Hémolyse. Elle est basée sur l’affinité antigène/anticorps qui se traduit par

une précipitation visible à l’œil nu ou au microscope optique.

Consiste à apporter un certains volume de jus clarifié à partirdes plantes à tester et une quantité d’antisérum et laisserincuber dans un bain marie à la température adéquate.

Le précipité se forme au fond du tube ou à la partie médiane encas de plante malade.

Avantages/Inconvénients: Méthode rapide la précipitation se fait en quelques minutes; Peu sensible vu que l’excès d’antigène ou d’anticorps empêche la

visibilité de la précipitation.


l h d’ l



Immuno-diffusion radiale:

Cette techniques est réalisée dans un milieu gélosé (boite depétri contenant 1 à 2 mm d’agar) où les réactifs diffusent àpartir de puits dans lesquels ils sont déposés.

Le sérum est déposé dans le puits central et les différentsantigènes dans les puits à la périphérie.

La rencontre antigène/anticorps aboutit à la formation d’arc deprécipitation de couleur blanche.

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Immuno-diffusion radiale

54

Eperon

é é



Différents cas se présentent

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La formation d’un éperon indique une identité partielle entre les

antigènes 1 et 2 (cas N° 1).

La formation d’un arc continue indique une identité complète entre lesantigènes 1 et 2 (cas N° 2).

La formation d’un croisement entre les arcs indique l’absence d’identité

entre les antigènes 1 et 2 (cas N° 3).



Limites de l’Immuno-diffusion radiale

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• Cette technique ne permet pas de détecter les viruspeu concentrés dans les extraits de plantes.

• La sensibilité peut aller de 1 à 20 ug/ml

• Nécessite des quantités importantes de sérums brut

Assez couteuse.

Q l h i d’ l



Technique ELISA (Enzyme LinkedImmunoSorbent Assay)

Principe:Le couple anticorps/antigène est révélé grâce

à l'action d'une enzyme (la Phosphatasealcaline) couplée aux anticorps qui en contactavec son substrat ajouté donne une coloration

jaune.

57


E d l h i ELISA i l



Etapes de la technique ELISA simple

58

ee

ee

e

Addition del’anticorps marqué

Addition du substratde l’enzyme

Coloration en jaune

Double Antibody Sandwitch



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Double Antibody Sandwitch(DAS- ELISA)



60

é é



Matériel utilisé

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Plaque ELISA polystyrène8/12 puits

Spectrophotomètre Incubateur de plaque



Diagnostic au microscope électronique

Le microscope électronique a été conçu lors desannées 1930 (Ernst Ruska);

Le microscope électronique à transmission«Transmission Electron Microscope » (TEM) génère

un faisceau d’électrons qui est dirigé sur unéchantillon qu’il traverse pour en révéler l’image surun écran.

Le principe de Dip method : il s’agit de déposer une

goutte d’extrait brut sur une membrane déposée surla grille du microscope + une goutte de contrastant Acétate d’uranyle. Les particules virales apparaissenten clair sur un fond sombre.

62



63

• Morphologie des virus• Détection des virus dans les tissus du végétal.

Diagnostic au microscope électronique

2 5 D lé l



• Basé sur la connaissance des séquences du génomeviral (ADN ou ARN).

Hybridation moléculaire (Dot Blot):

Dénaturation d’extrait de plante à la suite d’une exposition à une température de 94°C.

Dépôt de gouttes des échantillons à tester (4-50ul)sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon quisera fixé à la lumière U.V.

Hybridation par une sonde radioactive (marquée au32P) ou bien une sonde froide (marquée à la biotine ouà Acétyl-aminofluorène).

L’intensité des spots indique la teneur en agentviral à rechercher.

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2.5. Diagnostic moléculaire

H brid ti n m lécul ir



Hybridation moléculaire(Dot Blot)

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Amplification moléculaire PCR: PolyméraseChain Reaction

La PCR permet de recopier de manière

exponentielle une séquence nucléotidique (ADN viral) en un très grand nombre defois.

La réaction a lieu dans un tube PCR, enadditionnant l’ADN viral à la TaqPolymérase, un couple d’amorce spécifiqueet les dNTP( A,T, C et G).

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2.5. Diagnostic moléculaire



67

Thermocycleur

Migration du produit PCR



Migration du produit PCRsur gel d’agarose

chapitre 1

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