caractérisation chimique des principes à effet antidermatophyte des racines.pdf

7/24/2019 Caractrisation chimique des principes effet antidermatophyte des racines.pdf

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Soutenue le : 24 / 06 / 2009

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE

FACULTE DES SCIENCES EXACTES

DEPARTEMENT DE CHIMIE

Mmoire

Prsent pour Lobtention du diplme de Magisteren chimie organiqueoption : Substances thrapeutique dorigine naturelle

Caractrisation chimiquedes principes effet antidermatophyte des racines

dAnacyclus pyrethrum

L.

Prsente Par : sous la direction du :

Melle Hamimed Souad Dr :Belkhiri Abdelmalik

Devant le jury :

Prsident : Mr Belattar Abdelhamid Prof.Dpt de Chimie, UMC

Rapporteur : Mr Belkhiri Abdelmalik MC.Dpt de Pharmacie, UMC

Examinateurs : Melle Kabouche Zahia Prof.Dpt de Chimie, UMC

Mr Boulebda Nadji MC.Dpt de Pharmacie, UMC

N dordre :Srie :


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I

Remerciements :Mes remerciements sont d'abord au Dieu de m'avoir donner la force et le courage ncessaire

pour mener ce travail bout.

Ce mmoire n'aurait pu voir le jour sans la participation de nombreuses personnes, je vais

m'essayer trouver les mots justes pour exprimer spcifiquement mes reconnaissances tous

ceux qui ont contribus de prs ou de loin ce travail.

mon directeur de thse, Monsieur Belkhiri Abdelmalik, Docteur dEtat et Matre de

confrences au Dpartement de Pharmacie, Facult de Mdecine. Universit Mentouri

Constantine. Vous m'avez initi la recherche.V

otre orientation ma t trs bnfique

pour la ralisation de ce travail,V

otre rigueur et faon de travailler, mas permis d'tre

plus attentif et critique vis--vis de mon travail. Mercipour votre patience dans la

correction de ce mmoire.

J espre avoir t la hauteur de votre attente.

Mes remerciements vont aussi aux membres de mon jury de mmoire,

Monsieur, le ProfesseurBelattar Abdel Hamid

, Vous me faites un trs grand

honneur en acceptant de prsider ce jury ;

Mademoiselle, le Professeur Kabouche Zahia, responsable de ma promotion, recevez

ici lexpression de ma profonde gratitude. Je vous remercie vivement pour me faire

lhonneur de participer ce jury. Cest grce votre bienveillance que jai pu raliser

certaines analyses physico-chimiques.


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II

Monsieur, le Dr Boulebda Nadji, Matre de confrences, biologiste et pharmacologue

au dpartement de pharmacie de Constantine, je vous remercie pour les discussions

enrichissantes dans le domaine de la biologie, pour votre coute et votre gentillesse.

Au chef de service du laboratoire de parasitologie du Centre hospitalo-universitaire de

Constantine, le Professeur Moulahem Tayeb, quil trouve ici toute ma gratitude pour nous

avoir fournis les souches fongiques.

Au A. Lobstein, Professeur de pharmacognosie, facult de pharmacie de Strasbourg

(France), pour sa collaboration dans la ralisation des spectres de masse.

Nos remerciements vont aussi :

Monsieur Ben Abbes Badr-ezamane, responsable du laboratoire de parasitologie, pour

avoir superviser les tests dactivit antimycosique ;

Monsieur Touil Ahmed, Merci pour votre gentillesse et votre aide dans la ralisation

danalyses physico-chimiques.

Je remercie tous mes amis et camarades chimistes, Notamment Ma trs chre amie Warda,

collgue du labo, avec qui j'ai pass de trs bons moments inoubliables en ralisant ce

travail dans une ambiance damiti. Merci pour ton encouragement et ton soutien moral

depuis le jour o nos chemins se sont croiss.

Enfin,Je ne saurais oublier Monsieur Sami et Mademoiselle Wided qui ont contribu la

ralisation de ce modeste travail.

Merci tous.


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III

Ddicaces :Ce qui sont les plus chers au monde, mes parents :

mon pre, pour m'avoir soutenu moralement et matriellement jusqu' ce jour.

Pre, ce travail est le tien.

ma mre, voici l'aboutissement de tes nombreuses nuits de prires de ta

sagesse et ta gnrosit pour votre petite fille. Chre mre, ce travail est le fruit

de tes efforts.

mon frre Mohamed, le chemin est dur et encore long, il faudrait du courage

et beaucoup de chance, que dieu vous garde.

J e noublie jamais la gnrosit illimite de mes surs :

Khadidja, Houria, Warda, Nour elhouda et Hanen.

Leurs soutien moral et financier, sans lesquels je naurais pu continuer mes

tudes dans de bonnes conditions, tous simplement je voudrais leurs dire je les

aimes de tout mon cur. . . .

A mes neveux et nices :

Je vous souhaite beaucoup de chance. Jespre que vous allez suivre les pas de

votre tante, que Dieu vous protge.

Souad


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6/166

ii

Etude des mtabolites secondaires isoles de la plante.II

les Terpnoides.

III 1 Introduction.------------------------------------------------------------------------------------- 24III 2 Classification structurale et biosynthse des Triterpnes.----------------------- 24III 3

abc

Mthodes danalyses des Triterpnes :292930

Analyse par Infra Rouge (IR).----------------------------------------------------Analyse par rsonance magntique nuclaire (RMN).----------------------Analyse par spectroscopie de masse (SM).---------------------------------------

III 5 Proprits biologiques et pharmacologiques des Triterpnes.------------------- 31

les Coumarines.

III 1 Dfinition.--------------------------------------------------------------------------------------- 32III 2 les coumarines dans le rgne vgtal.-------------------------------------------------- 32III 3

IIIDiversit structurale des coumarines:

343535

35363737

3 1 Coumarines Simples.--------------------------------------------------------3 2 Coumarines Prnyles. ----------------------------------------------------3 3 Furanocoumarines (Linaires et Angulaires). --------------------3 4

IIIIII

Pyranocoumarines :33

44

12

Pyranocoumarines simples.--------------------Dipyranocoumarines.----------------------------

3 5 Coumarines ltat dimrique (Bicoumarines).-------------------3 6 Coumarines ltat trimrique (Tricoumarines).-----------------

III 4ab

Etude de la voie de Biosynthse des coumarines :3739

Biosynthse des coumarines simples. -------------------------------------------Biosynthse des furanocoumarines. ---------------------------------------------

III 5abcde

Analyse structurale des coumarines :4141414242

Fluorescence sous la lumire UV.-------------------------------------------------Spectroscopie infrarouge IR.--------------------------------------------------------Spectroscopie ultraviolette UV.----------------------------------------------------Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire RMN.-----------------La spectromtrie de masse des coumarines.-------------------------------------

III

6 Intrt pharmacologique des coumarines.-------------------------------------------- 43


7/166

iii

2

me

Partie : Partie Exprimentale.

I Matriel vgtal.---------------------------------------------------------------------------------- 45

II

Mthode dExtraction. ------------------------------------------------------------------------- 45III IIIIII

IIIIII

Mthodes chromatographiques :46

47484849

12

IIIIII34

Chromatographie sur couche mince (CCM) analytique.----------------Chromatographie sur colonne de gel de silice (CC) :

22

12

Fractionnement de l'extrait DCM.----------------------Fractionnement de l'extrait EtOH.---------------------

Chromatographie sur plaques prparatives.--------------------------------Ractifs de rvlation utiliss en CCM.-------------------------------------

IV Analyses microchimique didentification.----------------------------------------- 50V

VVVV

Mthodes danalyse spectroscopiques :

50505151

1234

Spectroscopie UV visible.--------------------------------------------------------Spectroscopie infrarouge (IR).-----------------------------------------------------Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire (RMN 1H).---------Masse spectroscopique (MS).-------------------------------------------------------

VI VIVI

VIVIVIVI

Activit antidermatophyte :51

12ab

c3456

Prparation du milieu de culture.------------------------------------------------Prparation des solutions tester :

Extraits vgtau et fractions enrichies.--------------------------------Solution de rfrence.------------------------------------------------------------

Contrle.------------------------------------------------------------------------------

5252

52Prparation des plaques multi uits.--------------------------------------------Prparation de linoculant fongique.--------------------------------------------Mesure de lactivit antifongique.-----------------------------------------------Traitement statistique des donnes.---------------------------------------------

52525353

3

me

Partie : Rsultats et Discussion.

I

Obtention des extraits bruts dAnacyclus pyrethrum.------------------------------ 54II Criblage biologique prliminaire des extraits bruts.---------------------------------- 56III

IIIIII

Etude phytochimique approfondie de lextrait actif DCM :58

61

65

12

III

III

Analyses microchimique et chromatographique.---------------------------Fractionnement bio guid de l'extrait DCM :2

2

1

2a

Evaluation de lactivit antifongique des fractionsriches----------------------------------------------------------------------- Etude du Lot 4 et 5 : Purification.------------------------------------------------------


8/166

iv

III 2

b

3a

b

b

b

Caractristiques des produits isols :

6666

67

6868

69707177

798088

1b 11b 122

b 21

b 22b 233

b 31b 32b 33b 34

Le Compos A:

Proprits physico-chimiques.----------Spectre IR.-------------------------------------

Le Compos B :

Proprits physico-chimiques.----------

Spectre UV.------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------

Le Compos C :

Proprits physico-chimiques.----------Spectre IR.-------------------------------------Spectre RMN 1-------------------------------Spectre SM.------------------------------------

Etude du Lot 6 : Le Compos D :

a 1a 2a 3

Proprits physico-chimiques.---------------------Spectre RMN 1H.--------------------------------------Spectre SM.-----------------------------------------------

IV IV

IV

Etude phytochimique de l'extrait EtOH :

90

93939495

101

102103

103

104105106

107108108

1

2IV

IV

Examen par chromatographie en couche mince de lextraitEtOH.----------------------------------------------------------------------------------- Fractionnement de l'extrait EtOH :2 1

aEtude du Lot 6 :a 1a 2a 3a 4

Caractristiques du Compos E :

Proprits physico-chimiques.----------------------Spectre UV.---------------------------------------------Spectre IR.------------------------------------------------Spectre RMN 1H.--------------------------------------

2 2abb

b

b

Etude du Lot 10 : Examen du Lot 10 S 2.--------------------------------------- Caractristiques des produits isols du lot 10S2 : 1 Le Compos F :

b 11b 12

b 13

Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------

Spectre IR.------------------------------------------- 2 Le Compos G :

b 21b 22b 23

Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------------

3 Le Compos H :b 31b 32b 33

Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------------


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v

Conclusion.--------------------------------------------------------------------------------------------------- 110

Rfrences Bibliographiques.---------------------------------------------------------------- 112

Annexes :

124Glossaire des termes scientifiques.-----------------------------------------------------Annexe 1 :

128Les Spectres RMN 1H des Composs identifis.---------------------------------Annexe 2 :

136Constantes physiques et donnes spectrales des composs isols.-----------Annexe 3 :


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Abrviations


11/166

1

A.pyrethrum

ALKAM

CC

CCM

CD Cl 3

CH3COOH

CMI

COUMAR

D cont

D trait

d

d d

DCM

DMSO

EP

E

EtOAc

EtOH

F

J

H

HA

HCOOH

Hz

Hex

H2O

H2 SO4INH (%)

IPP

IR

Gem

GRISEO

M

m

Me OH

Anacyclus pyrethrum

Alkamides

Chromatographie sur colonne

Chromatographie sur Couche Mince

chloroforme deutr

acide actique

concentration minimale dinhibition

Coumarines

Diamtre de croissance dans le contrle

Diamtre de croissance dans le traitement

doublet

doublet de doublet

dichloromthane

dimthylsulfoxyde

ther de ptrole

Epidermophyton

actate dthyle

thanol

fraction

constante de couplage

proton

hydoalcoolique

acide formique

Hertz

Hexane

Eau distille

Acide sulfuriquePourcentage de linhibition du myclium

isoprnique

Infrarouge

gminal

griseofulvine

Microsporum

Multipletmthanol


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2

MHz

Moy

MS

MV

m/z

n/d

P

PAL

PHENYLP

ppm

PHYTOST

RDA

R f

RMN 1H

S

SD

T

t

TRITER

UV

max

max

A, B, C, D, E, F,

G et H.

Mga Hertz

Moyenne

Masse spectroscopique

Matire Vgtale

masse/charge dun ion

non dtermin

facteur statistique de comparaison de populations

phnylalanine ammonialyase

Phnyle propane

Partie par million

Phytostrols

Rtro Diels Alder

Rapport frontal

Rsonance Magntique Nuclaire du proton

Singulet

+/- cart type

Trichophyton

triplet

Triterpnes

Ultraviolet

Dplacement chimique

Longueur donde maximale dabsorption

Frquences dabsorption

Symbole utilis pour les composs isols


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Introduction

Gnrale


14/166

3

Malgr les progrs raliss en mdecine au cours des dernires dcennies, notamment la disponibilit

dune gamme large de produits de sant, les traitements mdicamenteux actuels restent insuffisants face

aux maladies, telles que les infections dorigine infectieuse, bactrienne ou fongique.

Lmergence de nouvelles maladies qui affaiblissent le systme immunitaire (ex. SIDA), ainsi que

lapparition de souches microbiennes (virus, bactries, champignons), de plus en plus rsistantes aux

traitements actuels, soulignent lurgence de la recherche de nouveaux agents thrapeutiques.

Le rgne vgtal constitue une source inpuisable de nouvelles molcules utilisables directement comme

principe actif ou pouvant servir comme molcule guide pour le dveloppement de nouveaux agents

thrapeutiques. La recherche de nouveaux mdicaments dorigine naturelle action antifongique

constitue un axe important de recherche au niveau mondial. En Algrie, les maladies infectieusesdorigine bactrienne ou fongique constituent lune des pathologies, les plus rpandues dans les

statistiques des maladies dans notre pays.

Le prsent travail concerne ltude dune plante mdicinale locale, de la famille des Asteraceae, en

loccurrence lAnacyclus pyrethrum, une plante vivace commune notamment dans le tell constantinois. La

mdecine traditionnelle locale utilise les racines de cette espce mdicinale, connue sous lappellation de

Guentess , pour traiter diverses pathologies. Cette drogue vgtale est connue depuis lantiquit pourses proprits mdicinales, et surtout son efficacit contre les infections de la peau, notamment les

maladies fongiques. Lespce a fait lobjet de peu dtudes chimiques et pharmacologiques. La slection

de cette espce fait suite un travail de criblage prliminaire dans notre laboratoire, recherchant les

extraits vgtaux potentiellement antifongiques vis--vis de cultures de dermatophytes. Lextrait hydro-

alcoolique des racines dA. pyrethrumsest rvl trs active sur des cultures fongiques de Microsporum

canis, M. nanum et Trichophytum rubrum, compar la Grisofulvine, mdicament antifongique de

rfrence.


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4

Au vu de ces rsultats encourageant, la prsente tude a t initie dans le but de dterminer le profil

mtabolique de la plante et de caractriser le ou les principes responsables de leffet antifongique.

Pour ce faire, un protocole de travail a t labor (schma 1), sarticulant sur 03 principales tapes :

1 le criblage biologique dun gradient dextraits dA. pyrethrumet fractionnement bioguid des extraits

potentiellement actifs ;

2 la caractrisation phytochimique prliminaire des fractions issues des extraits actifs ;

3 la purification et dtermination structurale des molcules isoles des fractions actives


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5

Schma 1 :De la plante aux phytoconstituants bioactifs.


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6

Ce mmoire est partag en 3 parties :

La premire partie est essentiellement consacre aux donnes bibliographiques. Elle traite des

dermatophytes pathognes et des aspects botanique, chimique et pharmacologique dAnacyclus

pyrethrum. Elle abord aussi dune faon exhaustive la biosynthse, la diversit structurale, les mthodesde sparation et danalyses ainsi que les proprits pharmacologiques des triterpnes et des coumarines,

principales molcules isoles pour la premire fois dans le cadre de ce travail, partir des racines dA.

pyrethrum

La deuxime partie contient la section exprimentale. Elle dcrits le matriel et mthodes chimiques,

physico-chimiques et biologiques utiliss dans cette tude.

La troisime partie regroupe les principaux rsultats et leur discussion.

Une conclusion avec nos recommandations sur les travaux futurs, suivie de rfrences bibliographiques

ainsi quune section des annexes, clturent ce mmoire.


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1 re Partie :

tude Bibliographique.


19/166

I Les dermatophytes.


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7

I 1 Introduction :

Les microorganismes fongiques pathognes constituent une srieuse menace pour lhomme. Lafrquence

des infections fongiques a augment de faon considrable au cours des dernires annes notamment dans

les pays en voie de dveloppement, sous leffet de facteurs socio-conomiques.

Les Dermatophytes constituent un groupe de champignons filamenteux adapts la kratine humaine et

animale. Chez lhomme, la peau et les phanres (ongles, cheveux, poils) sont les sites privilgis de ces

champignons (Harouna.H et al., 1993; Chabasse. D et al., 2004;Zagnoli.Aet al, 2005).

I 2 Classification des dermatophytes:

Selon leur habitat naturel, on distingue trois espces de dermatophytes (Boursiquot, J.M et al., 2002) :Les espces anthropophiles: issues exclusivement de lhomme, leur transmission est interhumaine ;

Les espceszoophiles: issues de lanimal, leur transmission lhomme ncessite un contact, direct ou

indirect, avec un animal infect.

Les espcesgophiles ou tellurique: se transmettent accidentellement lhomme, suite une blessure

tellurique.

Dun point de vue taxonomique, les dermatophytes sont reprsents par 3 genres : Epidermophyton,

Microsporum et Trichophyton. Ces microorganismes sont caractriss par la production de spores

diverses : microconidies, macroconidies, arthrospores et chlamydospores. Ils ont une affinit particulire

pour la kratine, ils attaquent la peau et les phanres indemnes (Boursiquot, J.M et al., 2002; Zagnoli, A

et al, 2005; Carballeira, N.M., 2008).


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8

Le tableau suivant prsent les principaux dermatophytes.

Tableau I 1 :Principaux dermatophytes (regroups selon leur habitat).

Espces anthropophiles Espces zoophiles Espces telluriques

GenreEpidermophyton :

Exemple :

GenreMicrosporum :M. canis

M. equinumM. nanum

M. persicolorM. praecox

Exemple :GenreMicrosporum :

M. cookei

M. fulvumM. gypseumM. praecox

GenreMicrosporum :M. ferrugineum

M. audouinii

Exemple :

Genre Trichophyton:T.concentricum

T. mentagrophytes var .interdigitale

T. rubrum

T. schoenleiniiT. soudanense

T. tonsurans

T. violaceumExemple :

Genre Trichophyton:T. equinumT. erinacel

T. gallinaeT. mentagrophytes var.

mentagrophytesT. verrucosum

Exemple :Genre Trichophyton:

T. ajelloiT. mentagrophytes var.

mentagrophytes

T. terrestre

I 3 Rpartition gographique :

La plupart des dermatophytes sont cosmopolites (ex.E. floccosum, M. canis, M. gypseum, T.

mentagrophytes). Dautres espces restent spcifiques certaines rgions du globe commeM.

ferrugineumen Asie et en Afrique (Dieng, M.T et al., 2000; Soussi , A.M et al., 2007)(voirla figure

suivante).

Epidermophyton floccosum

Microsporum canis

Microsporum audouinii

Trichophyton mentagrophytesTrichophyton rubrum


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9

Figure I 1 :Aire de rpartition de

A: Microsporum ferrugineum et M.langeronii

B: Trichophytum concentricum, T. soudanense, T. tonsurans et T.violaceum

I 4 Thrapeutiques des dermatophytoses :

Les antifongiques sont des molcules capables de dtruire spcifiquement les diffrents champignons

impliqus en mycologie mdicale.Contrairement au grand nombre dantibiotiques et malgr dimportants

progrs, la gamme dantifongiques disponibles reste limite un petit nombre de produits. En effet, il

nexiste ce jour que trois classes dantifongiques : les polynes, les drivs pyrimidiques et les drivs

azots (figure I 2).


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10

Figure I 2 :

Structures de quelques antifongiques representatifs.

Les polynes :

Le plus connu des polynes est lAmphotricine B, utilis depuis 1960 comme le chef de file des

antifongiques. Il sagit dun polyne macrolide, produit naturel dune bactrie Streptomyces nodusus.

LAmphotricine Bcomprend une chane polyhydroxyle hydrophile, associe une chane polyne

lipophile (Sylvie, C et al., 2003).

Les drivs azots :

Les drivs azots sont des substances synthtiques ayant un noyau azol contenant soit deux soit trois

atomes dazote (imidazole et triazole respectivement). La tolrance de ces traitements reste bonne, avec

seulement quelques troubles digestifs et de rares ractions cutanes (Sylvie, C et al., 2003;Zagnoli, Aet

al, 2005; Carballeira, N.M., 2008).

Les drivs pyrimidiques :

Le plus connu dentre eux est la 5-fluorocytosine (5-FC). Il sagit dun driv fluor de la pyrimidine,

substance hautement soluble dans leau, qui peut tre administre par voie orale ou veineuse.

Les dermatophytes sont regroups selon leur mode dadministration, par voie gnrale ou en usage local :


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11

Les molculesutilises par voie gnrale :

Les molcules usage local (les drivs azots) :

la grisofulvine, Grisofulinele bifonazole

la terbinafine, Lamisillconazole, Pvaryl

le ktoconazole, Nizorallisoconazole, Fazol

le Ktoconazole, Ktoderm

En raison des nombreux cas deffets secondaires indsirables, de contre-indications et dchec

thrapeutique reports suite lusage de nombreux antifongiques utiliss actuellement, un besoin urgent

de nouveaux agents est ncessaire. Cest dans cette optique que depuis un certain nombre danne, des

efforts ont t consentis en vue de dcouvrir de nouveaux mdicaments (voir la figure suivante). Ces

molcules ont t dveloppes pour lessentiel partir de chimie de synthse. Leur taux de succs est

par contre relativement faible, en particulier pour les mycoses invasives Aspergilluset les candidmies

(Sylvie, C et al., 2003).


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12

Figure I 3 :Molcules antifongiques dveloppes entre 1950 2006.

I 5 Mthodes de criblage de substances antifongiques :

Dans le cas de dcouverte dagents antibactrien et antifongique, trois tests simples sont dcrits dans la

littrature : la mthode de diffusion sur agar, la mthode de dilution et la mthode bioautographique

(Hostettmann, K et al., 1994).

I 5 1 Mthode de diffusion sur agar (boite ptri) :

Elle consiste faire diffuser dans un milieu glos un antifongique et mesurer le diamtre dinhibition. La

souche tudier est inocule sur toute la surface de la glose et entre en comptition durant lincubation

37 0C, avec leffet inhibiteur de lantifongique. Une zone dinhibition circulaire se forme pour les

concentrations inhibitrices du produit.

I 5 2 Mthode de dilution sur agar (boite multi puits) :

Le milieu de culture inocul avec le microorganisme, puis mlanger avec lchantillon test. Les cultures

sont maintenues 37 0C jusqu la croissance du matriel fongique compar avec le contrle.

Lexprience est rpte avec plusieurs dilutions de lchantillon dans le milieu de culture et avec une

dilution suprieure pour dtermin le CMI.


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13

I 5 3 Mthode bioautographique :

La mthode bioautographique employ pour localiser lactivit antifongique sur un chromatogramme, la

zone dinhibition est visualise avec le ractif de dtection dehydrogenase, les composs antifongiques

apparatre comme des spores colores dans le fond.

Aet B mthode bioautographiqueC mthode diffusion sur agar (boite ptri)

D mthode de dilution sur agar (boite multi puits)

Figure I 4 :

I 6 Stratgie de recherche des nouvelles substances antifongiques :

Les produits naturels, notamment dorigine vgtale, sont utiliss comme une source de diversit

molculaire dans plusieurs programmes de dcouverte de nouveaux mdicaments (Rahman, Aet al.,

2005; Steven, M.C et al., 2008).

Dans les nombreux programmes de dcouvertes de produits naturels bioactifs, dans lesquels le produit

final est soit utilis comme un mdicament ou un produit guide pour le dveloppement de nouvelle classe

de mdicament, des bio tests de criblage simples et reproductibles sont ncessaires pour les tapes de

criblage prliminaire et pour guider le processus disolement vers la molcule active.


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14

Le tableau suivant rassemble quelques travaux concernent lactivit antifongique des plantes.

Tableau I 2 : Quelques rfrences sur lactivit antifongique des plantes.

Rfrencesarties utilisesa familleespce

Webser, D et al.,2008

Coopoosamy,R.Met al., 2007

Cruz, M.C.S et al., 2007Giordani, R et al., 2007

Hostettmann, K et al., 2000

Liu, Met al., 2007

Liu, Met al., 2007

Liu, Met al., 2007

Liu, Met al., 2007

Diallo, D., 2000



Igor, P.L.B., 2003

Diallo, D., 2000

Giordani, R et al., 2007

Igor, P.L.B., 2003

Hostettmann, .Ket al., 2000

Hostettmann, Ket al., 2000

Motsei, M.L et al., 2003

Giordani, R et al., 2007Igor, P.L.B., 2003

Igor, P.L.B., 2003

Liu, Met al., 2007

Liu, Met al., 2007

Dohou, .N et al., 2004

Igor, P.L.B., 2003

Steenkamp, Vet al., 2007

Cruz, M.C.Set al., 2007

racines

Feuilles + racines

tigesparties ariennes

racines

tiges

Feuilles

Feuilles

Feuilles

racines

Feuilles

racines

racines

parties ariennes

parties ariennes

corce du tronc

racines

Feuilles

Feuilles + tiges

parties ariennesplante entire

racines

Feuilles

Feuilles

plante entire

racines

corce

tiges

Araceae

Aloeaceae

SpotaceaeAsteraceae

Verbenaceae

Combretaceae

Combretaceae

Combretaceae

Combretaceae

Ebenaceae

Umbelliferae

Leguminosae

Rutaceae

Aizoaceae

Lamiaceae

Mimosaceae

Polygalaceae

Myrsinaceae

Roseaceae

LamiaceaeFabacaea

Leguminosae

Combretaceae

Combretaceae

Thymeleaceae

Oleraceae

Rutaceae

Rhamnaceae

Acorus calamus

Aloe excelsa

Bumelia sartorum

Artemisia herba alba

Clerodendrum uncinatum

Combretum elaeagnoides

Combretum fragrans

Combretum kirkii

Combretum zeyheri

Diospyros abyssinica

Diplolophium buccinateur

Eriosema tuberosum

Fagara zanthoxyloides

Glinus oppositifolium

Origanum majorana

Parkia biglobosa

Polygala fruticosa

Rapanea melanophloeos

Rubus rigidus

Rosmarinus officinalis

Stylosanthes micronata

Swartzia madagascariensis

Terminalia brachystemma

Terminalia mollis

Thymelaea lythroides

Ximenia Americana

Zanthoxylum davyi

Ziziphus joazeiro


28/166

II Aspects :Botanique, Chimique

et Pharmacologique de laplante.


29/166

15

II 1 Aspect Botanique :

II 1 1 Famille Asteraceae :

La famille des Astraces reprsente lune des taxons les plus importants du rgne vgtale. Elle est

principalement reprsente par des espces vivaces. Les feuilles sont le plus souvent alternes, mais aussiopposes ou radiales, bractes, simples ou parfois composes (Gaussen, H et al., 1982). Les fleurs ont la

caractristique commune d'tre runies en capitules, cest--dire serres les unes aux autres (Gaussen, H

et al., 1982; Osborn, R.W et al., 1995). La famille des Astraces (Compositae) compte

approximativement 900 genres avec plus de 13000 espces (Trease, G.E et al., 1983).

II 1 2 Genre Anacyclus :

Le genreAnacyclusregroupe des espces capitules composs en principe de fleurs extrieures ligules

et de fleurs intrieures tubules (Lloyd, C.G et al., 1911). La principale particularit du genre est la

prsence dailes aplaties entourant les fruits et faisant penser des paires d'oreilles, Ce sont des plantes

annuelles, feuilles alternes embrassantes, profondment divises. La tige portant le capitule s'paissit en

dessous de celui-ci. L'involucre est form de bractes ingales, se recouvrant en partie, ne portant pas

d'appendice terminal. Le taxon Anacyclus, tel que dfini lorigine par Linn (voir classification), En

Algrie le genre Anacyclusest reprsent par deux espces, a savoire Anacyclus pyrethrum(L.) Link et

Anacyclus clavatus(Pers) (Julien, A., 1894).

II 1 3 Espce Anacyclus pyrethrum :

LespceAnacyclus pyrethrum (synonyme : Anthemis pyrethrum) a tdfinie par Linn et rvise par

Link. Sa taxonomie est dcrite dans le tableau I 3. plante trs commune des hauts plateaux et montagnes

du Tell, Il sagit dune plante de 30 cm de haut maximum, vivace par ses racines longues, paisses,

fibreuses, rudes, brunes lextrieur, blanches linterieur (Lloyd, C.G et al., 1911; Paris, R.R et al.,1971). Les tiges sont nombreuses couches sur le sol, simples ou peu rameuses. Les feuilles sont finement


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dcoupes, dlicates et alternes sont pubescentes. Les fleurs sont blanches au cur jaune ordinairement

solitaires (Paris, R.R et al., 1971).

Tableau I 3 : Taxonomie dAnacyclus pyrethrum.

DIVISION : ANGIOSPERMAEClasse : Dicotyledoneae

s/Classe : Asteridae

Ordre : Asterales

Famille : Asteraceae

s/Famille : Asteroideae

Tribe : Anthemideae

Genre : Anacyclus

Espce : Anacyclus pyrethrum (L.) Link.

Figure I 5 :Anacyclus pyrethrum L.


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Les noms communs et vernaculaires :

Nom arabe : oued el athas, agargarha, tigenthas, ignens et Guenthus

Nom franais : pyrthre d'Afrique

Nom anglais : Pellitory

II 2 Aspect Chimique :

II 2 1 Chimie du genre Anacyclus :

Le genreAnacyclusa fait lobjet de quelques investigations chimiques, signalant la prsence de nombreux

types de mtabolites secondaires, incluant des triterpnes, des strodes, des coumarines, des lignanes, despolyactylnes (alkamides) et des flavonoides. Le tableau I 4 rassemble les diffrents mtabolites

secondaires isols du genreAnacyclus.

Tableau I 4 : Quelques donnes chimiques sur le genre Anacyclus.

Espce

Organes

tudis

Molcules extraites Rfrences

Anacyclus

Clavatus

Feuilles Quatre flavonoides :Isomeric7-glucoside, Luteolin7-glucoside,

7-rhamnosylglucoside, Quercetin7-glucoside.

Harald, G.,1978

Anacyclus

cyrtolepidioides

FleursFraches

Six strodes :cholestrol, campestrol,stigmastrol, sitostrol, delta-7-stigmastroleet delta-5-ovenastroleUn htroside stroidique:

le -sitostrol-3- O--D-glucoside.Des hydrocarbures sesquiterpniques :Le -cadinne et le Valencne.Des alcools : le Nonadcan-1-ol, lEicoson-1-ol.Des ctones : la 6, 10,14-Trimthyl-pentadcan-2-one.Des esters : le (9Z, 12Z)-Octadca-9,12-dinonate de mthyle et L'Octadcanoate de

mthyle.Des acides carboxyliques : l'acideHexadcanoique et l'acide Ttradcanoique

Bergaoui, Aet al., 2006(a)

Fleurs

Des monoterpnes : 49,55% de la totalit desconstituants, le Compos majoritaire(43,81%) Est l'pinne.26 composs sesqui Terpniques :

7,9% de cette huile essentielle, le-cubebne(2,37%).

Bergaoui, Aet al., 2006(b)


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Suite du Tableau I 4 :

Anacyclus

cyrtolepidioides

Partiearienne

Deux coumarines :herniarine et 3,4 dehydroherniarine.

Benkiki, Net al., 2007

Anacyclus

pyrethrum

Feuilles

Deux flavonoides :

Flavonol5-glucoside, Diosmetin7-glucoside.

Harald, G.,

1978

Racines

Une alkamide :la Pellitorine. (le principaleconstituent prsent dansA pyrethrum)

Chaaib,K.F., 2004Sukumaran,K et al.,1995Arnason,J.Tet al., 1989Adesina,S.Ket al.,1988Crombia,L.,1954

Iso butylamide:anacycline. Arnason,J.Tet al., 1989Bohlmann,Fet al., 1973

Une srie des amides :des amidesmonosubstitues contenant - dienne-

unsaturation.

Arnason,J.Tet al., 1989Harald,G.,1978

Des polyactylnes :

Artemisia Ktone, triyne-Triene.

Divers: acide linolique, Dehydromatricar ester.

Sukumaran,K et al.,1995Arnason,J.Tet al., 1989

Harald,G.,1978Jente, Ret al., 1976

Anacyclus

radiatus

Fleurs

Des flavonoides :Isorhamnetin5-glucoside, Quercetin5-glucoside,Flavonol5-glucoside,Quercetin7-glucoside,Isomeric7-glucoside, 7-glucosides deQuercetagetine, Patuletine,Quercetagetin3-mthyle ther, Quercetagetin6, 3'-dimethylther (spinacetine).

Harald, G.,1978

Partiearienne

Deux flavonoides :Isorhamnetine, Quercetine.Une coumarine :isoscopoletine.Un triterpne : Taraxasterole.Trois strodes : sitostrol, campestrol,stigmastrol.Nouveau germacranolide : Marioline.

Gonzalez,C.F.A et al.,1985

Anacyclus

valentinusFeuilles

Trois flavonoides :

Luteolin7-glucoside, 7-rhamnosylglucoside,Quercetin7-glucoside.

Harald, G.,1978


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Figure I 6 :Structures chimiques de quelques mtabolites secondaires isoles du genre Anacyclus.


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II 2 2 Chimie dAnacyclus pyrethrum :

A loppos de la chimie des autres espces du mme genre, celle d'Anacyclus pyrethrum demeure

insuffisamment tudie. La bibliographie signale la prsence dans les racines de composs

polyactylniques(Bohlmann, F et al., 1973; Jente, R et al., 1976; Harald, G., 1978; Arnason, J.Tet al.,1989),damides (Harald, G., 1978; Arnason, J.Tet al., 1989; Sukumaran, K et al., 1995) et de lignanes

(Adesina, S.Ket al., 1988; Chaaib, K.F., 2004). Les racines accumulent surtout des alkamides (Crombia,

L., 1954; Adesina, S.Ket al., 1988; Arnason, J.Tet al.,1989;Sukumaran, K et al., 1995; Chaaib, K.F.,

2004), notamment la Pellitorine, constituent principale prsent dans les racines d'A.pyrethrum, isol en

1895parDunstan et Garnett (Adesina, S.K., 1988; Chaaib, K.F., 2004). Ces substances azots et

insatures sont associes leffet sialagogue connu depuis longtemps (Jacobson, M., 1956).

Figure I 7 :Structures chimiques de principaux mtabolites secondaires identifis chez l'espceAnacyclus pyrethrum.


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II 3 Aspects biologique et Pharmacologique :

II 3 1 Famille Asteraceae :

Les Asteraceae est une famille particulirement riche en espces mdicinales. Elle comprend notamment

des plantes utilises dans le traitement des maladies parasitaires et anti-infectieuses (Bruneton, J., 2001).Parmi, les molcules isoles et utilises en thrapeutique, on peut citer le cas de lArtemisinine, un

sesquiterpne lactone isoler de lArmoise annuelle (Artemisia annua), une espce chinoise. Cette

molcule est un antipaludique, indique dans le traitement de certaines formes de malaria.

Le tableau ci-aprs donne quelques exemples sur cette activit chez certaines espces appartenant la

famille des Asteraceae.

Tableau I 5 :Lactivit antifongique chez certaines espces dAsteraceae.

Plante source de

La molculePartie

utiliseMolcules responsables

lactivitMicroorganismes Rfrences

Artemisiaabsinthium Feuilles

et

fleurs

Huiles Essentielles :Camphore et1, 8-cineole

Jos, A.M etal., 2007Artemisia

santonicumArtemisia

spicigera

Bidens

pilosa

Feuilleset

fleurs

Huiles

essentielles

Corticum rolfsiiFusarium solaniFusarium oxysporu

Deba, F et al., 2008

Feuilles Inconnu Candida albicans Motsei, M.Let al., 2003

Blumeabalsamifera

Feuilles

Flavonoides :hyperoside

Aspergillus nigerTrichophyton

mentagrophytesCandida albicans

Jos, A.M etal., 2007

Blumeagariepina

Inconnu Cladosporiumcucumerinum

Chrysanthemum

coronariumFeuilles

Huiles Essentielles :Camphore, et -Pinne et lyratyleactate

Cichorium

intybusRacines Inconnu Les dermatophytes :

Zoophiles etanthropophiles


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Echinaceapurpurea

Racines Polyacetylnes,Alkamides

Candida shehata Hymete, A etal., 2005Echinops

ellenbeckiiFleurs

et

Racines

Alcalodes,Saponosides,

Phytostrols, Polyphnols etCarotnodes.

Candidaalbicans

Echinopslongisetus

Flaujasiopsis

flexuosaPartiesariennes

Inconnu Aspergillus niger Motsei, M.Let al., 2003

FlauresiaCernua

Feuilles

FlavonoidesetSesquiterpnes

Fusarium oxysporumRhizoctonia solani

Jasso, R.Det al., 2007

FlauresiaMicrophylla

Flauresia

Oxysporum

FlauresiaRetinophylla

Helichrysum

nitens

Partiesariennes

Flavones :5,7-dimethoxyflavone

Cladosporium

cucumerinum

Hostettmann, Ket al., 2000

Inulantheranuda

Acetylne :(E)-O-cetyldendranthe-menole

Cladosporiumcucumerinum

Leontodon

filiiTriterpnes :

triterpeneteroleRhizoctonia solani

Glomerelia cinguiata


Mutisiafriesiana

Coumarines :Scopoletine

Cladosporiumcucumerinum

Psiadialithospermifolia

Huilesessentielles

Aspergillus ochraceusCandida

pseudotropicalisFusarium moniliform

Psiadia

trinerviaFlavones :3-O- methoxylatedflavonols

Cladosporium

cucumerinumHostettmann, Ket al., 2000

PterocaulonAlopecuroides

PterocaulonBlansae

Pterocaulon

Polystachyum

Coumarines :Prenyletine,Prenyletin-mthyl-ether

Candida albicansCandida tropicalisSaccharomycescerevisae

Aspergillus flavusAspergillus fumigutusAspergillus nigerTrichoophyton rubrum

Trichoophytonmentagrophytes

Stein, A.Cet al., 2006

Senecioinaequidens

SenecioVulgaris

Inconnu Trichophytontonsurans



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Spilanthesacmella

Fleurs Alkamides :Spilanthole

Aspergillus nigerAspergillus paractitu

Sabitha, A.Ret al., 2006

Tagetesminuta Feuilles

Inconnu Candida albicans Motsei, M.Let al., 2003

Tarchonanthuscamphoratus

Huiles essentielles Candida albicans Matasyoh, J.C et al., 2007

Tithoniadiversifolia

Partiesariennes

Isocoumarines :Tithoniamarine

Microbotryumviolaceum

Chloralla fusca


II 3 2 Espce Anacyclus pyrethrum :

Lutilisation dAnacyclus pyrethrumest dcrite dans les pharmacopes de nombreux pays du monde. Les

racines sont inscrites la pharmacope franaise depuis 1937, pour leurs proprits sialagogues (Paris,

R.R et al., 1971).

En Algrie, linfusion des racines du pyrthre dAfrique est recommande en bain de bouche contre les

maux de dents et les problmes lis la scrtion salivaire comme sialogogue (Boulos, L., 1983;Beloued,

A., 1998). Le dcoct des racines est galement cit en friction locale en cas de paralysie des membres(Boulos, L., 1983). Les racines sont galement utilises sous forme de crme a base de graisses animales

pour traiter la goutte et la sciatique (Boulos, L., 1983). Un mlange de racines et de lait, additionn de

miel est propos comme aphrodisiaque, contre linfertilit fminine(Boulos, L., 1983). On reconnat aux

racines de pyrthre des proprits antiparasitaires et antibiotiques (Beauquesne, B.L et al., 1990; Baba

Aissa, F., 1999)

Peu dtudes dvaluation exprimental ont t effectues sur les racines dAnacyclus pyrethrum. On

signale une activit immunostimulante de la fraction riche en polysaccharides (Bendjeddou, D et al.,

2003) et une action anesthsique local des extraits aqueux et hydro alcooliques (Panchal, G.M et al.,

2001). La Pellitorine, compos connu des racines sest montr douer dactivits anesthsique local,

antibactrienne, larvicide, ainsi que insecticide (Chaaib, K.F., 2004; Molina, T.J., 1999).


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III tude desmtabolites secondaires

isoles de la plante :


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a Les Terpnoides.


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III 1 Introduction :

Dans le rgne vgtal, les terpnodes sont des mtabolites secondaires, dont le rle cologique a t

prouv, notamment dans le processus de communications et de dfense (Lamarti, A et al., 1994).

Les triterpnes, dont plus de 4000 structures sont connues, sont reprsents par plus de 40 squelettes

diffrents (Bruneton, J., 1999). Lintrt thrapeutique et lemploi industriel des triterpnes en font un

groupe de mtabolites secondaires de premire importance (Rodney, C et al., 2000; Yutaka, E et al.,

2003).

III 2 Classification structurale et biosynthse des Triterpnes:

Les triterpnes sont construits partir de plusieurs entits isoprniques, constituant une famille trs

diversifie tant au niveau structural que pharmacologique (Goodwin, T.W., 1971). Selon la nature du

noyau, ces mtabolites sont regroups en triterpnes ttracycliques (Dammaranes, Cucurbitanes,

Lanostanes) et pentacycliques (Lupanes, Ursanes, Olananes et Friedelanes) (figure I 7).


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Figure I 8 :Principaux classes des triterpnes.


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La diversit au niveau structurale des triterpnes rsulte des nombreuses conformations que peut adopter

le substrat acyclique. Pour une raction de cyclisation donne, cest lenzyme qui impose cette

conformation via tes interactions enzymes / substrat au sein du site actif (Alkins, P.Wet al., 1987; Abe,

I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998).

Par exemple, les enzymes prnyl-transfrase et terpne synthase sont responsable de la diversification des

triterpnes par deux ractions opres sur des diffrents substrats :

Lune de laddition rptitive dunit C 5, lautre de la cyclisation.

Figure I 9 : Oxydation du squalne.

(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987)

Cest de la conformation initiale de lpoxysqualne sur la surface de lenzyme que dpend lorientation

de la biosynthse vers strodes et les triterpnes dautre part.

1 si lpoxysqualne est maintenu dans une conformation chaise-bateau-chaise-bateau, la cyclisation

conduit un cation protostane prcurseur immdiat, par une suite de migration 1, 2 de protons et de

mthyles, des cycloartanes et des cucurbitanes (ces migration sont rendues possibles par la disposition

trans-antiparallle des protons et mthyles en C-17, C-13, C-14 et C-8).

2 si lpoxysqualne est maintenu dans une conformation chaise- chaise- chaise-bateau, la

cyclisation conduite un cation dammarane, qui peut aussi se rarrange :

soit par des migrations concertes conduisant au tirucallol et leuphol, prcurseurs des

limonodes et quassinodes.


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soit, et cest le cas le plus frquent, par formation dun cycle supplmentaire ce qui conduit aux

triterpnes pentacycliques : Olananes, Ursanes, Lupanes, Friedelanes et taraxastanes, etc., (Bruneton, J.,

1999).

Figure I 10 :Principaux cations dans la biosynthse.

(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987; Abe, I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998; Yutaka, E et al., 2003).


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Figure I 11 :

La voie des Olananes, Fridelines et Ursanes.

(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987; Abe, I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998; Yutaka, E et al., 2003).


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III 3 Mthodes danalyses des triterpnes :

Les triterpnes ont fait lobjet de plusieurs tudes consacres lanalyse structurale des triterpnes (Kuo,

Y.H et al., 2000; Thanakijicharoenpath, W et al., 2007; Andras, K et al., 2008; Chiy, R.C et al., 2008).

a Analyse par Infra - Rouge (IR) :

Le spectre Infrarouge permet de reprer les fonctions chimiques prsentes comme les groupement

ctones, alcool, acide carboxylique actate, etc. qui caractrisent la plupart des triterpnes (Dosseh, Ch

et al., 1980; Druet, D et al., 1986; Ahmed, S.Met al., 2004).

b Analyse par rsonance magntique nuclaire (RMN) :

Le spectre RMN- 1 H des triterpnes est peu spcifique. Il prsente nanmoins une srie de pics

caractristiques dans lintervalle 0,5 ppm 2 ppm, correspondant aux groupements mthyles. Le profil

(nombre, multiplicit, dplacement) permettent une orientation concernant le type et la srie du noyau

triterpnique (Hans, F.J et al., 1973; Charrouf, Z et al., 1991; Marcia, L.Net al., 1999; Asaph, A et al.,

2005;Hu, H.J et al ., 2005; Hua, S et al., 2006;Yu, Q.L et al ., 2006; Mario, J.Jet al., 1999; Andras, K

et al., 2008; Chiy, R.C et al., 2008; Igoli, J.O et al., 2008;Yuan, J.Qet al., 2008). Lexamen de la rgion

2 6 ppm indique lenvironnement auquel est soumis les protons fonctionnels (hydroxyle, double

liaison,).

Le spectre RMN-13C est plus prcieux dans la dtermination structurale des noyaux triterpniques nous

permet de bien mettre en vidence les 30 atomes de carbone qui constituent le squelette des triterpnes, et

en particulier les groupements carbonyles, acide carboxylique et alcool, par leurs dplacements chimiques

spcifiques (environ 210 ppm pour un carbonyle, 170 ppm pour un acide carboxylique et 70 ppm pour un

alcool (Marcia, L.Net al., 1999; Mario, J.Jet al., 1999).


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c Analyse par spectroscopie de masse (SM) :

En spectroscopie de masse, les fragments des triterpnes sont caractristiques, comme les pics de

fragmentation caractristiques du mcanisme de Rtro-Diels-Alder par clivage du cycle D / E et C / D

des triterpnes pentacycliques (Hans, F.J et al., 1973; Dosseh, Ch et al., 1980;Branco, A et al., 2004;

Viswanadh, G.S et al., 2006).

Schma I 1 :Exemples des fragmentations en spectromtrie

de masse des triterpnes.


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III 4 Proprits biologiques et pharmacologiques des triterpnes :

Les triterpnes sont caractriss par une diversit structurale remarquable. Cette diversit chimique se

traduit par des proprits biologiques et pharmacologiques varies et des potentialits thrapeutiques dans

les domaines les plus divers :cytostatiques, antiviraux, antiinflammatoire, antioedmateuses, cytoprotectives, imminomodulatrices,

analgsiques et antifongiques (Bruneton, J., 1999;Kazumasa, S et al., 2001;Jiri, P., 2003; Hua, S et al.,

2006; Eder, B et al ., 2008).

Lactivit lencontre des champignons est bien tablie in vitro, aussi bien lgard despces

phytophatognes, qu lencontre de divers Candida ou dermatophytes. Elle est sans doute la consquence

de la raction des triterpnes avec les strols membranaires du micro-organisme (Bruneton, J., 1999).En dehors des potentialits pharmacologiques des triterpnes, leur toxicit chez les animaux sang froid

est connue depuis lantiquit. Elle explique titre simple, les proprits piscicidales (ex. Balanites,

Zygophyllaceae) et molluscicidales (Phytolacca, Phytolaccaceae) des plantes qui les contiennent.


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b Les Coumarines.


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III 1 Dfinition :

Historiquement le nom de coumarine vient de cumaru qui est le nom dans une langue amazonienne,

de l'arbre de Tonka (Dipteryxodoratawilld., Fabaceae) dont les fves contiennent 1 3 % de coumarine.

Les coumarines ont t isoles pour la premire fois en 1820 (Bruneton, J., 1999). Elles sont prsentes en

quantits plus faibles dans plusieurs plantes comme le mlilot, la sauge sclare et lavande. On la trouveaussi dans le miel, le th vert, etc. Les coumarines sont des composs phnoliques vgtaux, portant un

noyau benzopyrone dans leur structure (Alignan, M., 2006), ils sont des 2H-1-benzopyran-2-ones que

lon peut considrer, en premire approximation, comme tant les lactones des acides 2-hydroxy-Z-

cinnamiques (Bruneton, J., 1999).

III 2 Les coumarines dans le rgne vgtal :

Les coumarines et ses drivs dont plus de 300 structures sont connues, se rpartissent dans plus de 70

familles de dicotyldones et 9 familles de Monocotyldones.Ils prsent sous forme libre ou htorosides

dans la plus part des familles de dicotyldones incluant Apiaceae, Asteraceae, Fabiaceae, Moraceae,

Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae et Solanaceae.le tableau suivant rassemble les principaux coumarines et

leur distribution dans le rgne vgtal.


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Tableau I 6 :

Distribution des coumarines chez certaines plantes.

Coumarines Plantes Localisation Rfrences

AesculetineAngelicine2-Angeloyl-3-isovalerylvaginateApterine

ArchangelicineArchangelineBergaptene

(-)-ByakangelicineByakangelicin-2-O-isovalerateChalepensineColumbianadineColumbianadinoxideDaphnoretineDaphnoretine methyl etherDophnorineGravelliferoneGravelliferone methyl etherGraveoloneHeraclenoleHeraclenol-2-O-isovalerateHeraclenol-2-O-senecioteHerniarine8-HydroxybergapteneImperatorine

IsobergapteneIsobyakangelicine angelateIsoimperatorine

IsooxypeucedanineIsopeulustrineIsopimpinellineIsorutarineMarmesine

Marmesinine

5-Methoxy-heraclenolisovalerateOroseloneOsthenoleOsthole(+)-OxypeucedaninePangeline

Anethum graveolensAngelica archangelicaAngelica archangelica

Aegopodium podagrariaAngelica archangelica

Levisticum officinalePeucedanum palustreAngelica archangelicaAngelica archangelicaAnethum graveolensAngelica archangelicaLevisticum officinalePeucedanum palustre

Ruta graveolensRuta graveolensAngelica archangelica

Ruta graveolensPeucedanum palustrePeucedanum palustre

Ruta graveolensRuta graveolens

Ruta graveolensRuta graveolensRuta graveolens

Anethum graveolensPetroselinum crispum

Angelica archangelica

Angelica archangelicaRuta graveolensAngelica archangelicaAngelica archangelicaPeucedanum palustreAngelica archangelica

Peucedanum palustreAngelica archangelicaPeucedanum palustreRuta graveolensPeucedanum palustrePeucedanum palustre

Angelica archangelicaRuta graveolensRuta graveolens

Ruta graveolensAngelica archangelica

Angelica archangelicaAngelica archangelicaAngelica archangelica

Angelica archangelicaRuta graveolens

fruitsfruits, feuilles et racinesracines

racinesracinesracinesracinesracinesracinesfruitsfruits, feuilles et racinesracinesracinestiges et feuillesracinesracines

racinesfruits et racinesfruitsparties ariennesracinesracinesracinesracines

parties ariennestigesracines

racinesracinesfruitsfruits, feuilles et racinesfruits et racinesracinesracinesfruits, feuilles et racinesfruits et racinestiges et racinesfruitsfruits

fruits, feuille et racinesracinesracinesracinesracines

fruits et racinesfruits et racinesfruits et racinesfruits, feuilles et racinesracines

Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969Mulier, M et al., 2004Sarker, S.D et al., 2005

Mulier, M et al., 2004

Shults, E.E et al., 2003Steck, W et al., 1969

Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969

Shults, E.E et al., 2003Livre, K. 2004

Kostova, I., 2005

Livre, K. 2004Shults, E.E et al., 2003

Kostova, I., 2005

Kostova, I., 2005

Shults,E.E et al., 2003

Steck, W et al., 1969

Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004


Livre, K. 2004


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Peucedanine

PhellopterinePimpinellinePsoralene

RutacultineRutamarineScopoletineSuberenoneUmblliferone

Umbelliprenine

Xanthotoxine

XanthotoxoleXanthyletine

Peucedanum palustrePeucedanum palustreAngelica archangelicaAngelica archangelica

Angelica archangelicaRuta graveolens

Ruta graveolensRuta graveolensAnethum graveolensRuta graveolensAnethum graveolensAngelica archangelica

Livisticum officinaleRuta graveolensAnethum graveolensAngelica archangelicaPeucedanum palustre

Anethum graveolensAngelica archangelicaRuta graveolensAngelica archangelica

Ruta graveolens

fruits et racinesfruits et racinesfruitsfruitsracinestiges et racinesracinesparties ariennes + racinesfruits, feuilles et racinesracinesfruits et racinesfruits et racinesfeuilles et racinesracinesfruitsfruits et racinesfruits

fruitsfruits, feuilles et racinestiges et feuillesfruits et racinesracines

Hehn, A., 2007


Livre, K. 2004

Livre, K. 2004


Livre, K. 2004Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969

Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004

III 3 Diversit structurale des coumarines :

La coumarine est une famille de composs, qui se forment par une substitution sur un cycle aromatique,

de ce faire et daprs la nature des substitutions, on peut classer les coumarines en :

III 3 1 Coumarines Simples :


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35

III 3 2 Coumarines Prnyles :

III 3 3 Furanocoumarines (Linaires et Angulaires) :

III 3 4 Pyranocoumarines :

III 3 4 1 Pyranocoumarines simple :


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36

III 3 4 2 Dipyranocoumarines :

La srie des Calanolides :

La srie des Inophyllums :

La srie des Cordatolides :

Les coumarines peuvent galement exister deux tats :


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37

III 3 5 Coumarines ltat dimrique (Bicoumarines) :

III 3 6 Coumarines ltat trimriques (Tricoumarines) :

III 4 Etude de la voie de Biosynthse des coumarines :

a Biosynthse des coumarines simples :

La formation de la phnylalanine partir de lacide chorismique implique un rarrangement de claisen

catalys par lenzyme chorismate mutase.

La conversion de la phnylalanine en acide cinnamique par la phnylalanine ammonialyase (PAL)marque lentre dans la voie des phnylpropanoides (Livre, K., 2004).

La voie exacte des coumarines partir dacides cinnamiques spcifiques est quasi inconnue, bien que la

cinnamate-2-hydroxylaseait t propose comme une tape enzymatique cl.


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38

Figure I 12 :Schma rcapitulatif des voies de biosynthse des coumarines simples

et lUmbllifrone.


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39

b Biosynthse des coumarines furanocoumarines :

La voie des furanocoumarines est prsente chez un petit nombre despces vgtales (Livre, K., 2004).

La premire tape propre de la voie de biosynthse est propose comme tant une para-hydroxylation de

lacide p-coumarique qui conduit lUmbllifrone (Bourgaud, F et al., 2006). Certains auteurs suggrent

que cette raction est catalyse par une enzyme de la famille des cytochromes P450 (C4H) (une enzyme cl dans la voie des phnylpropanoides) (Hehn, A., 2007).

La production de drivs de la 7-O-prenylUmbelliferone ne se fait que dans certaines conditions

dlicitations comme a t dcrit par Hamerski et ses collaborateurs en 1990.

Il a t dmontr que la prnylation de lUmbelliferone pour former la demethylsubrosine tait due une

activit enzymatique (Hehn, A., 2007).

Ltape suivante est la synthse de la dmethylsubrrosine par ajout dune unit isoprnique (IPP)

catalyse par la dimthylallylpyrophosphatase (Prenyltransferase).Ltape suivante conduisant la cyclisation de la dimthylsuderosine en (+) marmsine, puis sa

conversion en psoralne est prise en charge par des cytochromes P450 (Livre, K., 2004).

Lutilisation de marmsine radio marque a permis de suivre lapparition de psoralne en prsence de

NADPH (lenzyme responsable de la raction est stro slective) (Bourgaud, F et al., 2006; Hehn, A.,

2007).

Lhydroxylation en position 5 et 8 du psoralne gnre la formation de xathotoxole et de Bergaptole, cette

double hydroxylation squentielle est ncessaire pour permettre la formation du 5-8 dihyroxypsoralne,

prcurseur non methoxyl dun produit mineur de la voie de biosynthse : lisopimpinelline.

La mthylation du Bergaptole et de xathotoxole est catalyse par des mthyltransfrases, pour finalement

donner la Xanthotoxine et le Bergaptne.

La figure suivante rassemble les voies de biosynthse possible conduisant aux furanocoumarines

linaires et Angulaire.


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Figure I 13 :Schma rcapitulatif des voies de biosynthse des furanocoumarines.


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III 5 Analyse structurale des coumarines :

a Fluorescence sous la lumire UV :

Les coumarines sont caractrises par une fluorescence lUV 366 nm (Mead, J.A.R et al., 1958;Macek, K., 1972; Harbone, J.B., 1984; Wagner, H et al., 1984; Bruneton, J., 1999).Cette fluorescence est

en gnral :

Bleue pour les coumarines hydroxyles en 7 (Umbllifrone).

Pourpre pour les coumarines prnyles.

Jaune pour les furanocoumarines (Wagner, H et al., 1984).

Cette fluorescence est intensifie en chromatogramme par les vapeurs de NH3observe sous la lumire

UV, par pulvrisation du chromatogramme par le ractif de Borntrager ou lactate de plomb (Macek, K.,1972; Harbone, J.B., 1984; Wagner, H et al., 1984).

b Spectroscopie infrarouge IR :

Cette technique fournit des informations sur les groupements fonctionnels dune molcule. Pour les

coumarines :

Labsorption C=O de la lactone conjugue apparat pratiquement dans la rgion (1550-1750 cm -1)

(Prachyawarakorn, V et al., 2006; Kostova, I et al., 2007).

Labsorption OH du phnol est observe 3550 cm -1.

c Spectroscopie ultraviolette UV :

Les coumarines ont un spectre UV caractristique, fortement influenc par la nature et la position des

substituants, profondment modifi en milieu alcalin : KOH, NaOH, NaOCH3et en prsence dAlCl3.

AlCl3 forme un complexe avec les hydroxyles ports par des carbones adjacents, ce qui induit un

dplacement bathochrome (Bruneton, J., 1999).Pour la coumarine, les absorptions maximales sont prsentes dans deux bondes en 276 cm -1et 311 cm -

1. La prsence des substituants alkyls induit par des modifications des valeurs de la bande en 311cm -1

vers 325 cm-1 (Abu, E.R.A et al., 1985; Shults, E.E et al., 2003). Selon la position de OH, le dplacement

est plus au moins fort (Bruneton, J., 1999).


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d Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire RMN :

L'allure des spectres RMN 1H des coumarines est caractristique,les protons olfiniques H-3 et H-4

apparaissent respectivement sous forme de deux doublets :

(ppm) [6,10 6,40] , [7,50 7,90] pour les coumarines simples et les furanocoumarines (Sariaslani, S.F

et al., 1983; Lalande, J et al., 2003; Tosun, A et al., 2005; Xiao, W.L et al., 2007 ; Widodo, G.P et al.,2008).

e La spectromtrie de masse des coumarines :

Les composs cycliques fortement insaturs tels que la coumarines , et mmes les ions qui ont forms

par fragmentation au niveau d'un groupement carbonyle, ont la proprit de pouvoir perdre un

groupement CO (28 uma). S'il y a plusieurs groupements CO dans une molcule, ils peuvent tre limins

les uns aprs les autres (Harbone, J.B., 1984; Lalande, J et al., 2003; Prachyawarakorn, V et al., 2006).

Schma I 1 :Exemples des fragmentations en spectromtrie

de masse des coumarines.


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III 6 Intrt pharmacologique des coumarines :

Les coumarines manifestent diverses activits biologiques, qui varient selon la substitution sur le cycle

benzopyrone (Barnard, D.L et al., 2002; Kostova, I., 2005;Sarker, S.Det al., 2005; Kostova, I et al.,

2006).

Les coumarines simples contribuent gnralement fluidifier le sang par leur activit veinotonique et

vasculoprotecteur, cest le cas de lesculoside du Marronnier dInde, ou anticoagulate du dicoumarol

produit par le Mlilot (Melilotus officinalis). Lintrt des furanocoumarines a t signal dans le cas du

traitement des spasmes nphrtiques, de langine de poitrine (khelline de lAmmi visnaga). La capacit

que possdent diverses structures furanocoumariniques provoquer une hyperpigmentation cutane

transitoire est bien connue. Ces proprits photodynamisantes sont mises profit dans le traitement des

manifestations d u vitiligo, du psoriasis et dautres affections dermatologiques. Elles peuvent aussi treutiles dans les cures de bronzage (crmes base de psoralne, Bergaptne). La visnadine, une

pyranocouamrine, est doue de proprits vasodilatatrices coronariennes et prsente comme ayant une

action favorable sur les troubles de la snescence crbrale.


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Le tableau suivant rassemble quelques exemples sur lactivit biologique des coumarines.

Tableau I 7 :Quelques exemples sur lactivit biologique des coumarines.

Lactivit Coumarines Information Rfrences

anti-inflammatoire

Angelicine

AthamantineBergaptneHerniarineImpratorineLedebouviellolePsoralneScopoletine

Cette activit dpend de la nature des

substituants des coumarines,Plusintressant, les coumarines peuventpossder des effets proinflammatoires : Le Psoralne etImpratorine une baisse dosepossdent une activit anti-inflammatoire, mais une fortedose a un effet pro inflammatoire.

Rouxel, T., 1989

Antimicrobienne

AngalicineCichoriineCiichoriine actateHerniarineUmbelliprenine

ils sont montrent que le groupehydroxyle libreen position 6 descoumarines est trs important pourlactivit antifongique ,tandis que lemme libre en position 7estimportant pour lactivitantibactrienne.

Phototoxicit

AthamantineBergaptneIsopimpinellinePeucedaninePsoralneUmbllifroneXanthotoxine

Les Psoralnes, furanocoumarinestypiques sont desphotosensibilisateurs dans la gammede 320-380 nm, une gamme ou lesacides nucliques et les protinescellulaires montrent les bandesdadsorption faible.

Crpy, M.N.,2006.

Cytotoxicit

NiffcoumarinePaepalantine

Seseline5-methoxySeselineSuberosinXanthyletineXanthoxyletine

Cette activit baser sur lessubstituant ortho-dihydroxy, enplus le groupe phnyle avoir un rletrs important dans cette activit.

Kostova, I.,2005.

Inhibiteurs de HIV

(+)-Calanolide A(-)-Calanolide BCordatolite ACordatolite BCoriandrineImperatorineSuksdorfine

Quelques coumarines inhibentdiffrents stages du cycle derplication de HIV.

Kostova, I et al.,2006.Spino, C et al.,1998.Singh, I.P et al.,2005.


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2 me Partie :

Partie Exprimentale.


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I Matriel vgtal :

Les racines d'Anacyclus pyrethrumont t obtenues de source commerciale en Avril 2007. La drogue a

t identifie grce ses caractres botaniques macro- microscopiques selon les standards. Un spcimen

de l'chantillon de rfrence se trouve dans l'herbier du laboratoire de botanique mdicale et de

pharmacognosie, du dpartement de pharmacie de l'Universit Mentouri Constantine, sous le nAPY001-

97.

II Mthode dExtraction :

Les racines dAnacyclus pyrethrum sches sont finement pulvrises dans un broyeur couteaux. La

poudre dA pyrethrum(700 g) est macre froid en contact avec lhexane (Hex) pendant 3 jours. Aprs

filtration, le solvant est limin par vaporation sous vide une temprature modre (


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III Mthodes chromatographiques :

III 1 Chromatographie sur couche mince (CCM) analytique :

Les plaques chromatographiques en couche mince analytiques ont t obtenues de source commerciale

(Merck). Elles sont constitues dune plaque daluminium recouverte dun gel de silice 60F254. Aprs leur

dveloppement, les chromatogrammes sont examins, la lumire du jour et sous lampe UV 254 et 366

nm. Elles sont rvles ensuite par les ractifs de dtection.

Tableau II 1 :Composition dessolvants pour lanalyse par CCM des extraits bruts.

Pourcentagelange du solvantextrait test

9 : 1

7 : 3

Hex / EtOAc

Hex / EtOAc

Hex

9 : 19 : 16,5 : 3,59 : 19 : 19 : 1

EP / EtOAcHex / CH2Cl2CHCl3 / ActoneCHCl3/ Me OHEtOAc / Me OHHex / EtOAc

DCM

8 : 21 : 9

Hex / EtOAcHex / EtOAc

EtOAc

6 : 46 : 4 : 1

EtOAc / Me OHEtOAc / Me OH / H2O

EtOH

8 : 28 : 2

Hex / EtOAcEtOAc / Me OH

HA

Pour lanalyse de la puret des composs isols par CCM, les systmes de solvants suivants ont t

utiliss (tableau II 2).

Tableau II 2 :

Conditions chromatographiques particulires.

Pourcentagelange du solvantomposs

9 : 1EP / EtOAcA, B et C

9 : 1100 %4 : 1

CH2Cl2/ ActoneCH2Cl2Cyclohexane / EtOAc

D

1 : 1 : 1Tolune / EP / CH3 COOH glacialE100 : 11 : 11 : 27EtOAc / HCOOH / CH3 COOH glacial / H2 OF, G et H


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III 2 Chromatographie sur colonne de gel de silice (CC) :

Les caractristiques de la colonne en verre utilise dans le fractionnement des extraits bruts DCM et

EtOH sont reportes dans le tableau II 4.

Tableau II 3 :Caractristiques de la colonne chromatographique (CC).

Diamtre de la colonne 2,5 cmHauteur de la colonne 40 cmHauteur du gel de silice dans la colonne 23 cm

Poids du gel de silice 48 g

Type de Gel de silice 60 (0.063-0.200 mm),(70-230 mesh ASTM)Fournisseur MERCK

III 2 1 Fractionnement de l'extrait DCM :

Lextrait DCM (2 g) a t fractionn par chromatographie sur une colonne de gel de silice en phase et

pression normale. Llution est ralise au moyen de lhexane dont augmente la polarit par laddition

progressive de lactate dthyle. La polarit de l'luant est ensuite augmente par l'addition graduelle du

mthanol. Llution complte de la colonne est ralise avec du mthanol pur.

Tableau II 4 :

Composition de lluant utilis dans le fractionnementpar CC de lextrait DCM.

Fractions Eluant Volume (ml)

Hexane EtOAc Me OH

F1F3 100 00 00 200F4F7 90 10 00 300F8F10 80 20 00 200F11F15 70 30 00 300F16F20 60 40 00 300F21F23 50 50 00 200

F24F26 40 60 00 200F27F33 30 70 00 400F34F38 20 80 00 300F39F43 10 90 00 300F44F46 00 100 00 300F47F53 00 90 10 200F54F59 00 50 50 200F60F62 00 10 90 100

F63F67 00 00 100 150

III 2 2 Fractionnement de l'extrait EtOH :


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Lextrait EtOH (2 g) a t fractionn sur colonne de gel de silice en phase et pression normale. Llution

est ralise au moyen de lactate dthyle dont augmente la polarit par laddition progressive de

mthanol.

Tableau II 5 :Composition de lluant utilis dans le fractionnement

par CC de lextrait EtOH.

15000100F1F71000595F8F101001090F11F141002080F15F191002575F20F231003070F24F301003565F31F37504060F38F40504555F41F44505050F45F47506040F48F50507030F51F53

1008020F54F601009010F61F6710010000F68F74

III 3 Chromatographie sur plaques prparatives :

Des plaques chromatographiques de verre (20x20cm), recouvertes de gel de silice 60F254, dpaisseur de

2 mm ont t utilises dans un but de sparation et purification. Les plaques sont prpares selon la

mthode standard (Macek, K., 1972) et actives dans une tuve 105C pendant 30 min.

Tableau II 6 :Systmes de solvants utiliss pour la CCM prparative.

Pourcentagelange du solvantot purifi

9 : 1EP / EtOAcLot 4 et 5 (pour lextraitDCM)100 %EtOAcLot 6 (pour lextraitEtOH)6 : 4EtOAc / Me OHLot 10 (pour lextraitEtOH)100 : 11 : 11 : 27EtOAc / HCOOH / CH3 COOH glacial / H2 OLot 10 S 2(pour lextraitEtOH)

Fractions

Volume (ml)

EtOAc

MeOH

Eluant


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III 4 Ractifs de rvlation utiliss en CCM :

Les ractifs chimiques didentification ont t prpars selon les mthodes standards (Macek, K., 1972;

Wagner, Het al., 1984). Les principaux ractifs de rvlation sont prsents dans le tableau II 9 suivant

:Tableau II 7 :Ractifs de rvlation en CCM utiliss.

Mtabolites secondaires

dtect

Mode opratoireactifs

Coumarines.Vaporiser une solution aqueuse dactate de plomb 5 % sur la plaque et voir directement sous la lampeUV 366 nm.

Lactate

de Plomb

Strodes, Terpneset drivs phnyle-

propane.

Solution dacide sulfurique 10 %. Aprs lapulvrisation du ractif mettre la plaque CCM

pendant une dizaine de minutes ltuve (1000

C).

Acide

sulfurique

Strodes, Terpnes,drivs phnyle-

propane etAlkamides.

Mlanger 0,5 ml d'anisaldhyde (4-mthoxybenzaldhyde) avec 10 ml d'acide actiqueglacial. Ajouter 85 ml de mthanol puis mlanger.Ajouter 5 ml d'acide sulfurique concentr, lasolution ainsi obtenue est homognise et garde 4 0C pendant toute la dure d'utilisation. Aprs lapulvrisation du ractif mettre la plaque CCMpendant une dizaine de minutes ltuve (100 0C).

Lanisaldhyde

Coumarines.10 % thanolique potassium hydroxyde (KOH).Aprs la pulvrisation du ractif voir la plaque CCM

sous la lampe UV 366 nm.

Borntrager

Alcalodes.

une solution de 0,85 g de nitrate basique de bismuthet 10 g dacide tartarique dans 40 ml deau (solutionA), une solution contenant 16 g de KI dans 40 mldeau (solution B). Mlanger 5 ml de A, 5 ml de B,100 ml deau et 20 g dacide tartarique, vaporiser lemlange sur la plaque.

Dragendorff

Strodes etTerpnes.

Une premire solution compose d'un mlange volume gale (5 ml) d'acide sulfurique et l'anhydrideactique, cette solution, on rajoute 50 ml d'thanolabsolu. La prparation est effectue froid dans dela glace. Aprs la pulvrisation du ractif mettre laplaque CCM pendant une dizaine de minutes

ltuve (1000

C).

Liebermann

Burchard

Strodes, Terpneset drivs phnyle-

propane.

mlange d'une solution thanolique d'acidesulfurique et d'une solution thanolique de vanilline 1 %. Aprs la pulvrisation du ractif mettre laplaque CCM pendant une dizaine de minutes ltuve (100 0C).

Vanilline

sulfurique


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IV Analyses microchimique didentification:

Des ractions en tube ont t utilises pour la caractrisation prliminaire des principes prsents dans les

extraits bruts. Leur prparation sest faite selon les protocoles standards dcrits dans la littrature

(Debray, M.M., 1970; Dohou, Net al., 2003;Akinlolu, A.A et al., 2006; Egwaikhide, P.A.Eet al., 2008).

Tableau II 8 :Ractions de caractrisation chimique en tubes.

Classes des Composs Mode opratoire Observation

Anthracniques

libres

A 1 ml d'extrait DCM ajouter 1 mld'ammoniaque.

la coloration rouge indiquant laprsence d'anthracniques libres.

Coumarines

Dissoudre 1 ml d'extrait DCMdans deux tubes essai, aucontenu de l'un des tubes ajouter0,5 ml de NH4OH 25 %.

Procder lobservation sous UV 366 nm.Une fluorescence intense indiquela prsence des coumarines.

Strols

et Triterpnes

Dissoudre 1 ml d'extrait DCMdans 1 ml d'anhydride actiquepuis 1 ml de chloroforme etrpartir la solution entre 2 tubes essai. A l'aide d'une pipette ajouter1 ml de H2SO4concentr au fonddu tube sans agiter.

La formation d'un anneau rougebruntre la zone de contact desdeux liquides et une colorationviolette de la couche surnageantrvlent la prsence de strols ettriterpnes.

Tanins

A 5 ml d'extrait DCM ajouter 1 mld' HCl.

en prsence de tanins il sedveloppe un prcipit rouge.

V Mthodes danalyse spectroscopiques :

V 1 Spectroscopie UV visible :

Les spectres UV des diffrents produits sont enregistrs dans le MeOH grade spectroscopie, sur un

appareil Shimadzu UV 3101 PC (Laboratoire de physique, Universit de Mentouri, Constantine).

V 2 Spectroscopie infrarouge (IR) :

Les spectres IR des diffrents produits sont enregistrs, en utilisant des pastilles de KBr, sur un appareil

de type Shimadzu FT / IR 460 (Unit danalyses physico-chimiques, dpartement Chimie, Universit de

Mentouri, Constantine).


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V 3 Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire (RMN

1

H) :

Les spectres de rsonance magntique nuclaire, en mode 1H, sont raliss sur un appareil Brucker

250MHz (Unit danalyses physico-chimiques, dpartement Chimie, Universit de Mentouri,

Constantine). Les dplacements chimiques sont exprims en partie par million (ppm), les constantes de

couplage J sont exprimes en Hertz (Hz).

V 4 Spectromtre de masse :

Les spectres de masse des produits C et D ont t enregistrs en EI (Impact Electronique) sur un

spectromtre de masse de type Bruker Daltonics Data Analysis 3.4, (Facult de pharmacie, Universit

Louis Pasteur de Strasbourg, France, voir remerciements).

VI Activit antidermatophyte :

VI 1 Prparation du milieu de culture :

Le milieu de culture Sabrouraud glucose classique (voir le tableau II 12) est modifi par lajout de 0,4

g de chloramphnicol et 0,5 g cycloheximide par litre au milieu reconstitu. Aprs strilisation (1bars,

1200

C, 20 min) lautoclave le milieu est conserv basse temprature jusqu lutilisation.

Tableau II 9 :Composition (g/l) du milieu Sabouraud pour la culture de dermatophytes.

Constituants Teneur (g/l)

Peptone pour mycologie

Glucose

agar

10

40

15


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VI 2 Prparation des solutions tester :

a Extraits vgtaux et fractions enrichies:

Les extraits et fractions enrichies secs ont t reconstitues en solution en utilisant 70 % de mthanol dans

leau, additionne de 1% de DMSO. Les prparations vgtales ont t additionnes au milieu de culture

avec une concentration de 100 g/ml.

b Solution de rfrence :

Lantifongique tmoin, Grisofulvine, est mis en solution par dissolution de la quantit requise dans leau

distille contenant 1% de DMSO. La grisofulvine est additionne une concentration de 0,6 g/ml,

correspondant la CMI vis--vis de la souche fongique deMicrosporum canis(Larpent, J.Pet al., 1989).

c Contrle :

Le contrle est constitu par addition dune solution alcoolique 70% deau distille, additionne de 1%

de DMSO.

VI 3 Prparation des plaques multi puits :

La mthode dvaluation de lactivit antifongique a t adapte pour les besoins du criblage des extraits

et fractions des racines dAnacyclus pyrethrum. Des plaques multi puits striles, 12 puits de diamtre 2

cm, obtenues de chez IWAKI Japan, ont t utilise la place des boites ptri classiques.

VI 4 Prparation de linoculant fongique :

Linoculation des cultures est ralise sous hotte, partir de matriel fongique jeune, croissance rapide

contenant du myclium et chlamydospores. Un disque du myclium prlev sur le pourtour dune culturefongique ge de 5-8 jours est tritur dans un volume suffisant deau strile utilisant un agitateur vortex

pour librer le maximum de myclium dans le milieu. La qualit (densit et homognit) de la solution


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dinoculation est apprcie par examen sous microscope avant chaque srie linoculation. Celle-ci est

ralise sous des conditions dasepsie, par laddition dun volume dtermin de linoculant fongique au

milieu de culture. Les cultures sont maintenues 37 0 C pendant 5 8 jours, jusqu une croissance

approprie du matriel fongique.

VI 5 Mesure de lactivit antifongique :

Lactivit antifongique est ralise par comparaison du diamtre de croissance des souches, en prsence et

en absence des prparations vgtales testes, du contrle et de lantifongique tmoin (Grisofulvine). Le

diamtre de la croissance des colonies est mesur laide dun pied coulisse lectronique affichage

digitale (Velleman DCA 150, lecture aux 1/100 prs).

Le pourcentage de linhibition du myclium (INH) est calcul comme suit :

INH (%) = [(D cont D trait) / D cont] X 100

D cont : Diamtre de croissance dans le contrle.

D trait: Diamtre de croissance dans le traitement.

VI 6 Traitement statistique des donnes :

Les rsultats sont exprims sous forme de moyennes affectes de lcart type [Moy SD]. Pour ltude

statistique, les diffrents relevs ont t analyss par le test student, sur un logiciel Microcal, version 6,0

Windows (Microcalsoftware, USA).


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3 me Partie :

Rsultats et Discussion.


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Introduction

Une tude effectue auparavant sur lextrait hydroalcoolique des racines dAnacyclus pyrethruma rvl

une forte activit antifongique sur trois souches de dermatophytes tudies : Microsporum canis,

Microsporum nanumet Trichophytum rubrum.

Ce prsent travail est une continuit de ltude cite et a comme objectif de contribuer caractriser le

profil mtabolique des racines dA.pyrethrum et la nature chimique des substances intervenant dans

lactivit inhibitrice des dermatophytes.

I Obtention des extraits bruts dAnacyclus pyrethrum :

Cinq extraits bruts de polarit distincte, ont t obtenus selon le protocole dextraction dcrit en partie

exprimentale, est repris dans le schma III 1. Les extraits bruts prsentent les caractristiques

physiques reportes dans le tableau III 1.

Tableau III 1 :Caractristiques physiques des extraits bruts dA.pyrethrum.

Extraits Masse

(g)

Rapport dextraction

(masse extrait/MV)

Aspect Couleur

Hex 12,64 (1 : 55) Sirop Jaune citronDCM 16,22 (1 : 43) Rsineux Marron brillantEtOAc 04,57 (1 : 153) Rsineux Marron brillantEtOH 18,77 (1 : 37) Rsineux Marron foncHA 26,06 (1 : 27) Rsineux Marron trs foncMV : matire vgtale


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Schma III 1 :Protocole dextraction en mode gradient.


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II Criblage biologique prliminaire des extraits bruts :

Lvaluation biologique des cinq extraits bruts des racines dA. pyrethrum a t effectue selon la

procdure dcrite en partie exprimentale ( VI, page 51), en utilisant une souche de dermatophyte, le

Microsporum Canis.

Les solutions dextraits bruts de concentration 100 g / ml, sont reconstitues dans un mlange de 70% de

mthanol dans leau distill, additionn de 1% de DMSO. La croissance des colonies de dermatophyte au

contact des divers extraits est compare celle du contrle (solution dalcool + 1%DMSO) et de

lantifongique tmoin (griseofulvine, GRISEO). Le test dactivit est rpt au moins 3 fois pour chaque

traitement.

Les rsultats de cette valuation dactivit sont exprims en diamtre de croissance (tableau III 2) et enpourcentage dinhibition (tableau III 3, figure III 1)

Tableau III 2 :Effet des extraits bruts dA.pyrethrum sur les cultures de M. canis (exprim en diamtre decroissance fongique +/- cart type ou SD).

Extra

caractérisation chimique des principes à effet antidermatophyte des racines.pdf

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