Représentation schématique des bicouches

OH

NH2

OH

Préparation de liposomes

1- Dissolution des lipidesdans un solvant organique

2- Evaporation sous vide dusolvant organique : Obtentiond’un film

3- Dispersion des lipides séchésdans une solution aqueuse(+/- principe actif)

4- Réduction de la taille desparticules(éventuellement séparation duprincipe actif)

3- Hydratation des lipides

Obtention de vésiculesmultilamellaires (MLV)de l’ordre du micron

4- Réduction de la taille des particules

MLV (µm) SUV (nm)

- Ultrasons

- Extrusion- presse de French (sous pression)- membranes de polycarbonate

- Microfluidisationhomogénéisation par chocs sous pression

-Congélation/décongélation

Purification- Chromatographie (sephadex, sepharose)- Dialyse- Centrifugation

Résumé : obtention de liposomes

Phase fluide

MLV

SUV

Caractérisation des liposomes

Analyse chimique

-Quantification calorimétrique des phospholipides (Bartlett assay)- CCM- Estimation de l’oxidation des phospholipides (UV, HPLC)

Propriétés des liposomes

-Pourcentage d’encapsulation quantification de l’actif dans le surnageant puis 100 % par rupture du liposom

-Pourcentage de libération-Radioactivité, fluorescence (calcein), densité optique

Détermination de la taille des liposomes

-Diffraction de la lumière-Microscope électronique

ADN

Liposome

Micelle

Application aux acides nucléiques :formation de lipoplexes

Il a été montré par Rädler et al. (Science 1997) que les lipoplexes présentaient unestructure particulière dans laquelle l ’ADN s’intercalait entre les bicoucheslipidiques.Il a ainsi obtenu par étude de diffraction aux rayons X une structure avec alternancede bicouches lipidiques et de couches d ’ADN.

Structure des lipoplexes

Mesure de taille par diffusion dynamique de la lumièreLa mesure de la vitesse de diffusion de la lumière est basée sur le mouvementbrownien des particules en suspension. La mesure de la suspension est réaliséedirectement. Les tailles de complexes recherchées pour une étude chez l’animalseront de 50 à 200 nm.Evaluation de la complexationLa mesure de taille est un élément insuffisant pour établir une complexationADN/vecteur. Les particules sont soumises à un test de fluorescence par ajout debromure d’éthidium (BET) dans la suspension. Le BET a la capacité de s’intercalerentre les bases de l’ADN et d’émettre un signal de fluorescence à 590 nm. Or sil ’ADN est complexé, il n ’est plus accessible au BET et on ne mesure aucun signalde fluorescence.

Préparation des lipoplexes

Une solution d ’ADN est ajoutée volume à volume sous agitation à une suspensionde liposomes de taille définie ou bien à une solution micellaire de lipide.

Préparation et caractérisation physico-chimiquedes complexes ADN/lipides (lipoplexes)

Lipides cationiques de type lipopolyamines (Byk, G; Scherman, D)

NNH O

ONH

NH

NH

NH2

N

ONH

NH O

N

NH2

NH2

RPR 209120 : Tête globulaire

RPR 120535 : Tête linéaire

Titre du graphique

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 2 4 6 8 10Rapport de charge (lipide/ADN : +/-)

Tai

lle d

es p

arti

cule

s (n

m)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% f

luo

resc

ence

(59

0 n

m)

Taille des lipoplexes et % d'ADN libre

A B C

Nature des lipoplexes formés en fonctiondu rapport de charge lipide/ADN

Zone A�Rapport de charge < 1 : l’ADN est en excès = les charges négatives sont en excès. Lasuspension est colloïdalement stable en raison des répulsions électrostatiques. La tailledes particules obtenue est de l’ordre de 100 à 200 nm. Le % de fluorescence est élevé,l’ADN est donc accessible au BET. Dans cette zone, l’ADN n’est pas totalementcompacté. Inutilisable in vivo : risque de dégradation de l ’ADN par les nucléases.

Zone B1 < rapport de charge < 3 : les charges apportées par le lipide et l’ADN se neutralisent.Il n’y a plus de répulsions électrostatiques entre les particules, elles s’agrègent. C ’estune zone de précipitation caractérisée par l’augmentation drastique de la taille desparticules (1 à 4 µm). La courbe de fluorescence a diminué atteignant un minimum,l ’ADN n’est plus accessible au BET, il est compacté.Inutilisable in vivo : taille des particules trop importante.

Zone CRapport de charge > 3 : les charges positives sont en excès, on retrouve une zone destabilité colloïdale, les particules sont de petites tailles 50 -150 nm. L ’ADN esttotalement compacté. Injection in vivo acceptable.

Différentes zones de stabilité colloïdale obtenues

In vivo Aggregated Aggregated Toxic+ Serum Poorly efficient Efficient Poorly efficient

A

B C

80 Å

HN

NH

O

N2

NH

NH

NH O

RPR120535

In vitro Poorly efficient Highly efficient Highlyefficient

Facteurs influencant la physico-chimie des lipoplexes

J.Turek, C. Dubertret, G. Jaslin, K. Antonakis, D. Scherman, B. Pitard the Journal of gene medecine 2000, 2, 32-40

Compaction de l ’ADN

La mesure de fluorescence par intercalation du bromure d’éthidium entre les paires debase de l ’ADN est indicative de l’accessibilité de l’ADN au sein des complexes maispas de sa compaction. En effet les complexes peuvent être peu serrés et permettre auBET de passer même s’il y a une interaction lipide/ADN.La migration sur gel d’agarose de complexes de rapports de charge différents est unélément supplémentaire pour s’assurer de la compaction de l’ADN.

Rapport de charge lipide/ADN ADN 0,5 1 2,5 4 6 ADN 0,5 1 2,5 4 6

Liposomes Micelles

Evaluation de la stabilité colloïdale par mesure du potentiel Zeta

Le potentiel zeta correspond à la mesure de lamagnitude de répulsion ou d’attraction entre lesparticules.Dans un milieu aqueux, une particule chargéeva attirer les ions de charge opposée formantune couche ionique fortement liée à la surfacede la particule. Ces ions vont à leur tour formerune couche diffuse d’ions de charge opposée,plus éloignée du centre de la particule.C ’est le potentiel de cette surface qui estappelé potentiel zeta. Cette mesure donne doncune bonne idée de la dispersion électrostatiquedes particules. Elle est bien sur dépendante dumilieu dans lesquelles ont été dispersées lesparticules.

Polymère le plus utilisé : Polyéthylène Glycol (PEG) H(OCH2CH2O)nOH

Stabilisation colloïdale par des polymères

Enjeu : atteindre sélectivement une cible choisiePour cela, modification chimique au niveau du lipide ou dupolymère, ajout d’agents de ciblage (C. Girard)

Mime synthétique d’un vecteur viral

Perspectives = ciblage

Autres systèmes colloïdaux

Nanocapsule Nanosphère Emulsion

Polymère entourant une goutte d’huile ou d’eau

Constitué d’un réseau de polymères

W/OO/WW/O/W

Adaptation aux molécules sensibles : peptides, protéines