1

CCAATTAALLOOGGUUEE

MMAATTEERRIIAALLSS EETT CCOONNSSUUMMAABBLLEESS

MMaayy 22001155

VV66

2

TTAABBLLEE ooff CCOONNTTEENNTTSS

I. Conditions of a PCR lab implementation ........................................................................... 3

1 Necessary material ................................................................................................................. 3

2 Training ................................................................................................................................... 5

3 Prix des kits ADNucleis ........................................................................................................... 6

4 Avantages des kits ADNucleis ................................................................................................ 6

II. Methodologie ..................................................................................................................... 6

1 Enrichissement et milieux de culture ..................................................................................... 6

2 Extraction et purification d’ADN ............................................................................................ 7

3 Les kits d’amplification ........................................................................................................... 7

4 External Point Control (EPC) & Internal Point Control (IPC) .................................................. 8

III. Products.............................................................................................................................. 9

3

I. Conditions of a PCR lab implementation

1 Necessary material

RReeaall ttiimmee RRTT PPCCRR oorr QQPPCCRR

APPLIED BIOSYSTEMS7000-7300-7500-7900

STRATAGENE-AGILENTMX 3005P

QIAGENRotorgene

EPPENDORFRealplex

AAUUTTRREESS MMAATTEERRIIEELLSS

THERMOCYCLER MULTICHANNEL

MICROPIPETTE

1-10µL / 30-50µL

PLATE OR STRIPS

CENTRIFUGE

STOMACHER

MICROBIOLOGICAL SAFETY CABINET(MSC-P2)

REFRIGERATOR / FREEZER

Material installation + trials : 48h.

Level P1 laboratory : no specific sanitary requirements. Ventilation : air extraction from the amplification room /air entry inside the DNA extraction room. Air-conditionning system recommended (room temperature inferior or equal to 25°C).

4

MMaatteerriiaall && CCoonnssuummmmaabblleess nneecceessssaarryy ffoorr tthhee ddeetteeccttiioonn ooff ggeenneettiicc ttaarrggeettss vviiaa rreeaall

ttiimmee PPCCRR

ENRICHIMENT :

Homogeneization

Stomacher

Stomacher bag with filter (precision : 400ml)

Incubation

Oven stabilised at 37°C or 30 °C

Transfer

Micropipettes : 25-200µl, 1 ml ….

Graded tube with cap (15ml)

Bacterial growth

Culture media (PCRone, EPT, Half Fraser …)

Deionised water

Bacterial concentration (optional)

Graded tube with cap (1.5ml)

Centrifuge (rotor compatible for 1.5ml microtube)

DNA EXTRACTION Pelleting reagents

Plate or strips centrifuge

Thermal and Chemical Lysis

Thermocycler or water bath or dry bath

Extraction buffer

Ethanol 96°

Transfer

Micropipette 25-200µl

PURIFICATION using COLUMNS

Pelletting reagents

Tubes, plates or strips centrifuge

Transfer

Micropipette 25-200µl and 300µl (1 or 8 channels)

Distripette with combitips

Filtration

Filtration Columns

4 Collecting tubes

Wash buffers 1 and 2

Elution

Elution buffer

Conic Tubes of 1.5ml volume

DNA Conservation

200µl Microtubes

AMPLIFICATION

Materials

Thermocycler (sybr channel)

Centrifuge with plate rotor

Plate holder

Microtube (200µl) plate holder

Reagents

Master mix PCR (1)

Master mix PCR Salmonella (AFNOR ADN 33/03 – 04/10) (1)

Master mix PCR O157 (AFNOR ADN 33/01 – 02/10) (1)

Master mix PCR H7 (AFNOR ADN 33/01 – 02/10) (1)

Master mix PCR Ti (inhibition control) (AFNOR ADN 33/01 –

02/10)

Standard DNA for each target (3µl)

(1) Strip of 8 colored wells filled beforehand, breakable, with

individual optic caps.

PURIFICATION using MAGNETIC MICROBEADS

Pelletting reagents

Tubes, plates or strips centrifuge

Transfer

Micropipette 25-200µl and 300µl (1 or 8 channels)

Distripette with combitips

Reservoirs for buffers

Magnetic separation

Deep-well plate, X-pierced film, aluminium foil

Magnetic separating device 96

Wash buffers 1 and 2

Elution

Elution buffer

Conic Tubes of 1.5ml volume

DNA Conservation

200µl Microtubes

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2 Training

ADNucleis is registered for professionnal training :

SIREN number of the training organism: 497 802 165 000 17

TVA intraCEE : FR 3649780216500017

Fees and duration of training:

In accordance with the level of initial training of personnel and complexity of the demand.

Trainers schooling level : Master degree

Cost evaluation according to number of training days:

- For 1 functionnal laboratory : 1 work day- For 1 laboratory in design: 5 work days

TRAINING activity registered under the N° 82 69 09708 69 with Préfecture of Rhône-Alpes Region.

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3 Prix des kits ADNucleis

Le prix des kits d’extraction et d’amplification varie en fonction des cibles et du nombre d’analyses annuelles.

Pour plus d’information liée à une demande de devis, merci de nous contacter à l’adresse suivante : contact@adnucleis.com

4 Avantages des kits ADNucleis

Réponse en 3h, 15h lors d’un enrichissement. Kits optimisés pour une utilisation avec des matrices complexes Présentation sous forme de barrettes sécables colorées et/ou en bulk. Profils thermique des different compatible (permet de tester plusieurs cibles à la fois avec le même

ADN). Pas de manipulation des réactifs de lyse et de PCR car les tubes réactionnels sont pré-remplis

(sauf incompatibilité avec le thermocycleur) ou bulk Purification sur colonne ou par billes magnétiques pour une pureté des ADN optimale. Protocoles compatibles avec les grandes séries (96) Compatibilité avec tous les thermocycleurs (Système ouvert). Robotisation possible de la purification sur billes magnétiques

Les thermocycleurs suivant ont été testés dans le cadre de la marque AFNOR Validation : Applied Biosystems : 7000, 7300, 7500, 7900 Qiagen : Rotorgene (Corbet) Stratagen-Agilent : MX 3005P Eppendorf : Realplex

II. Methodologie

1 Enrichissement et milieux de culture

Milieux déshydratés Référence Tarif € HT

EPT (Eau Peptonée Tamponnée) 500g

EPT 45

BLEB 500g BLEB 70

PCRone 400g Mpcr_001_100g 25

PCRone 400g Mpcr_001_400g 60

PCRone 2kg Mpcr_001_2kg 240

Le milieu PCRone de ADNucleis est un milieu de culture multi germes spécifiquement développé pour la détection des germes par PCR lors d’un enrichissement court (12h à 24h). Sa formule est optimisée afin de garantir la croissance de la plupart des germes dont Listeria monocytogenes, Salmonella spp, et des Entérobactéries (dont E coli O157 :H7 et plus généralement de tous les sérotypes).

Sa conception diverge des principes habituellement utilisés en microbiologie classique pour s’adapter à l’évolution des techniques et en particulier aux méthodes PCR. La température d’enrichissement préconisée est de 37°C+/-1°C pour tous les germes. Le but de ce milieu est de permettre une croissance rapide des germes présents dans l’échantillon en limitant les effets compétitifs et sans apport d’inhibiteur de PCR pour les durées d’enrichissement préconisées (12h à 24h).

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Le développement de la PCR comme méthode de routine de détection, permet une analyse de plusieurs germes à partir d’un seul bouillon d’enrichissement. Préparer le milieu de culture PCRone conformément à la fiche technique du produit (ajouter 47g/L d’eau déminéralisée, homogénéiser, autoclaver 15minutes à 120°C).

2 Extraction et purification d’ADN

ADNucleis propose plusieurs solutions afin de réaliser l’extraction et la purification d’ADN. Les solutions sont soit à base de colonnes de silice ou de billes magnétiques. Les tampons et les protocoles d’extraction de l’ADN (lyse des cellules dans la matrice) d épandent du type et de la complexité de la matrice. Une fois les cellules lysé et l’ADN libéré dans le milieu, la purification de l’ADN est commune aux protocoles en regard de l’utilisation des colonnes ou des billes magnétiques. Nous consulter pour obtenir la solution la mieux adaptée à vos applications.

Kit d’extraction d’ADN

Références

matrice alimentaire HQS_ExtractP Pour les colonnes et les microbilles

(matrice alimentaire, eau complexes)

HQS_Extract F Pour les microbilles

Eau simple HQS_Extract E Pour les microbilles

Kit de purification d’ADN

Références

Toutes matrices HQS_purif_Col Pour la purification sur colonnes (inclus : tampon de lyse, tampon de lavage 1 et 2, tampon d’élution, colonne et tubes 4 collecteurs

Toutes matrices HQS_purif_BM Pour la purification avec microbilles magnétiques (inclus :

plaque deepwell, film X percé, film aluminium, tampon de lavage 1 et 2, tampon d’élution).

3 Les kits d’amplification

ADNucleis fournit des bulk ou des barrettes prêts pour l'amplification (PCR) du ou des gènes avec leurs témoins. Les technologies proposées utilisent soit des sondes d’hydrolyses, soit du Sybr

®.

Kit HQS_salmo_sybr 5 dilutions successives d’ADN de Salmonella spp purifiée par billes magnétiques

Temperature [°C]

959493929190898887868584838281807978777675747372717069686766

- d

I / dT

(%

)

105

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

Threshold: 1%

Cycle

4544434241403938373635343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ore

scence (

norm

)

6600

6400

6200

6000

5800

5600

5400

5200

5000

4800

4600

4400

4200

4000

3800

3600

3400

3200

3000

2800

2600

2400

2200

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

-200

Threshold: 134 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

Courbes d’amplification et de dissociation sybr obtenues avec le kit HQS_salm_sybr, ADNucleis sur plateforme PCR Realplex Eppendrof

(Color-enhanced scanning electron micrograph showing Salmonella typhimurium (red) invading cultured human cells Credit: Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH Source: http://www2.niaid.nih.gov/biodefense/public/images.htm NIAID]

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4 External Point Control (EPC) & Internal Point Control (IPC)

Les témoins de contrôle (IPC ou EPC) fournis dans les kits ADNucleis correspondent à un fragment d’acide nucléique.

ADNucleis fabrique des EPC et IPC à la demande de la clientèle et en fonction des cibles recherchées.

Temperature [°C]

94929088868482807876

-dI / dT

(%

)

100

80

60

40

20

0

-20

Threshold: 15% Kit HQS_BVD_sybr Courbes de dissociation sybr optenues avec le kit HQS_BVD_sybr, ADNucleis sur plateforme PCR Realplex Eppendrof

Courbe de dissociation sybr obtenue pour la cible BVD (Tm de 86.5°C +/-1°C)

Courbe de dissociation sybr obtenues pour l’IPC de la cible BVD (Tm de 90.75°C +/-1°C)

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III. Products

ADNucleis fournit ses produits sous deux modes de conditionnement : - barrettes sécables (8 puits)- bulk (50 – 100 - 500 – 1000 – 5000 puits)

ADNucleis fourni sa Taq DNA polymerase standard avec ou sans Tampon PCR 10 X, ions Mg2+, dNTPs

La transcriptase inverse est fournie avec des Oligo dT et random hexamers

Seul le conditionnement des ADNs standard (Ref : ADN_cible) est fixé à 50µl.

EExxtteerrnnaall PPooiinntt CCoonnttrrooll ((EEPPCC)) && IInntteerrnnaall PPooiinntt CCoonnttrrooll ((IIPPCC)) PPrriinncciippllee

Internal Point Control (IPC) HQS_IPC (préciser la cible) taqman

External Point Control (IPC) HQS_EPC Sybr

PPCCRR MMaasstteerr mmiixx

Tampon PCR Master mix Sybr Green

HQS_AmpliS Sybr

Tampon PCR Master mix TaqMan

HQS_AmpliT taqman

Tampon PCR Master mix Sybr Green one step

HQS_RT_AmpliS Sybr

Tampon PCR Master mix TaqMan one step

HQS_RT_AmpliT taqman

ADN standard ADN_cible

TTaaqq DDNNAA PPoollyymmeerraassee

Taq DNA Polymérase

HQS_Taq_Nucleis

TTrraannssccrriippttaassee iinnvveerrssee

Reverse transcriptase

HQS_RT_Nucleis

FFoooodd PPrriinncciippee

Cronobacter sakazakii spp (AFNOR Validation 12h-24h)

HQS_saka_sybr

Sybr

E.coli Stx1 HQS_stx1_sybr Sybr

E.coli Stx2 HQS_stx2_sybr Sybr

E.coli eaea HQS_eaea_sybr Sybr

E.coli O103 HQS_O103_sybr Sybr

E.coli O111 HQS_O111_sybr Sybr

E.coli O113 HQS_O113_sybr Sybr

E.coli O145 HQS_O145_sybr Sybr

E.coli O157(AFNOR Validation12h-24h)

HQS_O157_sybr Sybr

E. coli H7(AFNOR Validation12h-24h)

HQS_H7_sybr Sybr

E.coli O26 HQS_O26_sybr Sybr

10

E.coli O55 HQS_O55_sybr Sybr

Listeria monocytogenes

(en cours de certification AFNOR 16h-24h)

HQS_Listm__IPC_tqm

taqman

Listeria spp HQS_Listspp_sybr Sybr

Salmonella spp (AFNOR Validation 12h-24h)

HQS_Salm_sybr Sybr

AAnniimmaall HHeeaalltthhspecies Canin Félin bird fish swine Reptile Rodent Ruminant

BVD HQS_BVD_sybr

Coxiella burnetii HQS_FQ_IPC_tqmn

Listeria spp HQS_listsp_sybr

Salmonella spp HQS_salmo_sybr

EEnnvviirroonnnneenntt PPrriinncciippee

Listeria spp HQS_listsp_sybr Sybr

Salmonella spp HQS_salmo_sybr Sybr

Legionella spp HQS_Legiospp_IPC_tqm Sybr

Legionella pneumophila

HQS_LegioP_tqm Sybr

HHuummaann hheeaalltthh

Chlamydia trachomatis

HQS_ChlamyT_IPC_tqm Taqman

Streptocoque -hémolytique (S. agalactiae)

HQS_GBS_IPC_tqm

Taqman

Mycoplasma genitalium

HQS_MycoG_IPC_tqm Taqman

Legionella spp HQS_Legiospp_IPC_tqm Taqman

Legionella pneumophila

HQS_LegioP_tqm Taqman

Pseudomonas aeruginosa

HQS_Paer_IPC_tqm Taqman

E.coli eaea HQS_eaea_sybr Sybr

E.coli O157H7HQS_O157_sybr // HQS_H7_sybr

Sybr

E.coli Stx1 HQS_stx1_sybr Sybr

E.coli Stx2 HQS_stx2_sybr Sybr

Listeria monocytogenes

HQS_listm_IPC_tqmr Taqman