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Difetti congeniti del metabolismo II
Lezione 2
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Albinismo oculocutaneo OCAEsistono diverse forme di albinismo: sono
tutte recessive e una forma e’ X-linkede’ presente eterogeneita’ genetica
L’albinismo oculocutaneo OCA e’ caratterizzato da:assenza di pigmentazione dovuta all’incapacita’ di sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanocitie’ normale. La melanina e’ presente nei capelli, nella cutee nella retina.
La via che porta alla sintesi della melanina parte dall’amminoacidotirosina, che e’ coinvolto in una serie di altre reazioni il cui mancatosvolgimento porta alla manifestazione di altri difetti congeniti del metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria
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La tirosinasi
Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la tirosina e successivamente catalizza l’ossidazione della diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone.
Il gene della tirosinasi e’ stato clonato e sono stateidentificate le mutazioni che sono la causa della comparsadell’albinismo
Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e’ quello di identificare lasequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare
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La tirosinasi clonaggio
Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche dellapatologia e’ stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale
Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa
Produzione di anticorpi specifici per la tirosina
Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione
Screening della library di espressione e isolamento della colonia
Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che eracoinvolta, pertanto si sintetizzo’ il cDNA a partire da RNA totale estratto da cellule che sintetizzano l’enzima e si inserirono i cDNAin fagi.
Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato
Sequenza dei cDNA cercando una ORF
Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni
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Polimorfismo RFLP Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite,
microsatellite. Individuabili con southern blottling o PCR
RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri
A1 A2 A3B1 B2
A1 A3B1 B2mutazioneelimina il sitodi restrizione
endonucleasi Bendonucleasi A
EnzimaA
EnzimaB
Pattern di ibridazione sufiltro
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Polimorfismo
Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%
Polimorfismi proteici
Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR
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Alleli identificati dall’ibridazionesu Southern
Possibile interpretazione dei risultati
I1 I2 I3 I4II1 II2
III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8
I
II
Lunghezzadei frammenti
Polimorfismo RFLP esempio
1 2 3 4
1 2
1 2 3 4 5 6 7 8
III
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Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR
Polimorfismo PCR
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Analisi delle mutazioni di OCA I
Il gene della tirosinasi e’ lungo circa 50Kb ed e’composto da 5 esoni
La ricerca delle mutazioni e’ essenziale per definire se il gene clonato e’ quello che una volta mutato provoca la patologia in esame
Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre sono patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel caso delle recessive costituiscono un problema.
Perche?
Nella popolazione generale e’ impossibile definire se un soggetto e’ portatore o meno dell’allele patogeno.Bisogna sempre esaminare gli affetti e i loro genitori, anche i fratelli possono essere fonte di errore: potrebbero essere non portatori
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Analisi delle mutazioni di OCA II
Nell’albinismo oculocutaneo grazie alsequenziamento del gene e’ stata evidenziata la presenza di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia multipla), che possono provocare fenotipi leggermente diversi.
Non confondere questo con l’eterogeneita’ genetica chee’ pure presente nell’albinismo. Esistono altre forme di albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi, che dipendono da mutazioni di altri loci
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Analisi delle mutazioni di OCA III
Eterogeneita’ genetica :e’ fra locus
Il fenotipo e’ il risultato di una catena di interazioni:il risultato finale puo’ risultare simile anche quando i locus sono diversi. E’ importante identificare con precisione i criteri di definizione nel caso dell’albinismo un primo criterio e’ il dosaggio della tirosinasi
Apriamo una parentesi
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Analisi delle mutazioni di OCA IV
Le strategie per individuare le mutazioni negli affetti o nei potenziali eterozigoti sono varie, la piu’ usata e’ la PCR o l’utilizzo di oligonucleotidi allele specifici sintetizati ad hoc per le singole famiglie
Come si studiano le famiglie?
Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme,utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazionegenerale.
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Analisi delle mutazioni di OCA V
Presenza di piu’ di una mutazione nel DNA dell’affetto:
Le mutazioni possono essere :
Missenso: sostituzione di una base che porta al cambiamento dell’amminoacido.
La stessa sostituzione e’ presente nella popolazione generale anchein omozigosi senza conseguenze? se si e’ un polimorfismo e ci diceche quella regione della proteina o quell’amminoacido non e’ criticoper la funzione.E’ una mutazione conservativa.(L’accumularsi di dati su piu’ famiglie e sulla popolazione generale facilita l’interpretazione)
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Analisi delle mutazioni di OCA VI
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se si e’ probabileche siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli dell’affetto lo fa identificare come portatore (la mutazionedeve essere presente in eterozigosi in un genitore)
Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda unaregione nota per essere necessaria al funzionamento dellaproteina? Se si e’ probabile che sia patogenetica(cfr. sopra)
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Analisi delle mutazioni di OCA VII
Nell’albinismo oculocutaneo sono stati trovati eterozigoticomposti: soggetti affetti in cui la mutazione patogeneticanon e’ presente in omozigosi, ma la presenza di due allelipatologici fa manifestare la malattia. I genitori ed eventuali fratelli in cui e’ presente anche l’allele wild-typesono eterozigoti per una sola mutazione.
Nel gene della tirosinasi sono riportate anche mutazioniframeshift che possono originare una proteina tronca.
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Mappa delle mutazioni di OCA
I II III IV V
Cu(A) Cu(B)
Mutazioni puntiformi: patogeneMutazioni puntiformi:polimorfismi
Mutazioni frameshift