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Bioindicateurs - Biomarqueurs

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L'cotoxicologie

L'cotoxicologie, rassemblant, comme son nom lindique, toxicologie et cologie, a t dfinie en 1977 par Truhaut comme "la branche de la toxicologie qui tudie les effets toxiques provoqus par les substances naturelles ou les polluants d'origine synthtique sur les constituants des cosystmes animaux, y compris l'homme, vgtaux et micro-organismes, dans un contexte intgr".

Les donnes d'ordre cotoxicologiques sont indispensables pour l'valuation des risques et la gestion de l'environnement.

1. Concept et utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu1.1. Dfinitions1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE

2. Accumulation de contaminants dans les organismes2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes2.2. Les bioaccumulateurs idaux

3. Mesures deffets biologiques3.1. Les biomarqueurs

3.1.1. Df. : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.3.1.2. Le systme de biotransformation3.1.3. Gnotoxicit3.1.4. Protines de stress3.1.5. Mtallothionines3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.3.1.8. Les marqueurs morphologiques

3.2. Les tests de toxicit3.3. Effets biologiques au niveau des populations

3.3.1. Les indicateurs cologiques

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et notions de bioindicateurs

1. Concept et utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu1.1. Dfinitions1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE







BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION

BIOINDICATEUR BIOMARQUEUR

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU MILIEU MARIN

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUEParamtres physico-chimiques dans leau et les sdiments

(temprature, salinit, O2 etc.)

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION




(temprature, salinit O2 etc.)

Ensemble des procdures fondements biologiques qui peuvent servir ltablissement de diagnostics cologiques (Goldberg, 1976)


BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION




(temprature, salinit O2, etc.

Organisme ou ensemble dorganismes qui, par rfrence des variables biochimiques, cytologiques, physiologiques, thologiques ou cologiques, permet, de faon pratique et sre, de caractriser ltat dun cosystme ou dun cocomplexe et de mettre en vidence aussi prcocement que possible leurs modifications, naturelles ou provoques


BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION





Changement observable et / ou mesurable au niveau molculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou comportemental, qui rvle lexposition prsente ou passe dun individu au moins un facteur de stress


BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION





Accumulation par les organismes vivants de contaminants directement depuis le milieu ambiant (bioconcentration) ou depuis leur nourriture (biomagnification) jusqu des niveaux suprieurs ceux de la contamination du milieu physique


BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION





Indication des contaminants biodisponibles, donc

potentiellement toxiques pour les organismes

Indication des effets moyen et long terme sur les populations et communauts

Indication dune exposition ou deffets

prcoces sur les organismes


Dtecter les perturbations de lenvironnement marin

Mesurer les effets de cette perturbation

Apprcier les modifications des conditions environnementales rsultant de la prise de dispositions remdiatrices

Le rle des bioindicateurs :

Une seule espce (approche) ne peut pas permettre datteindre ces objectifs

Il faut abandonner ce concept au profit dune collection dorganismes (d outils) situs diffrents niveaux trophiques et couvrant tous les types dhabitats


Stress : ensemble de perturbations biologiques provoques par une agression quelconque sur un organisme.


Facteurs de stress dun organismes

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale 1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

mettre des signaux prcoces de problmes environnementaux ; identifier les relations de cause effet entre les facteurs daltration et les effets biologiques ; valuer ltat de stress global de lenvironnement travers diffrentes rponses dorganismes indicateurs ; valuer lefficacit de mesures rparatrices sur la sant des systmes biologiques.

Les bioindicateurs doivent tre utiliss pour :


Face un stress, ltat physiologique dun organisme peut tre caractris par trois niveaux majeurs de stress. Ces niveaux sont dtermins en fonction des dommages causs par les facteurs de stress


DES BIOINDICATEURS REPRESENTATIFS DE CHAQUE NIVEAU DE STRESS

NIVEAU 1 NIVEAU 2 NIVEAU 3

TRES SENSIBLE MOYENNEMENTSENSIBLE

PEU SENSIBLE

Enzymes de dtoxication Histopathologies Paramtres de la population

Dommages lADN Immunologie Paramtres de la communaut

Mtabolites dans la bile Energie Altration du sex-ratio

Enzymes anti-oxydantes Indices de condition Altration du rgime alimentaire

Paramtres sanguins Croissance Relations entre les niveauxtrophiques

Protines de stress Reproduction

Une sensibilit dpendante du niveau dorganisation biologique o leffet est mesur

Contaminants Sources Biomarqueurs potentielsHydrocarbures et ptroles Puits de ptrole, industrie

du ptrole, trafic maritime,accidents

CYP1A, Mtabolites des HAP

Mtaux lourds Extraction de minerais,mtallurgie, agriculture

MT, HSP, Marqueurs de stressoxydants

Pesticides Agriculture, industries, zones de loisirs

CYP1A, AChE, HSP, GST,Vitellogenine

Organochlors Activit industrielle,transformateurs, combustion,dchets toxiques, etc.

CYP1A, HSP, GST, Vitellogenine, Stress oxydant

Hydrocarburespolyaromatiques

Mtallurgie, combustion CYP1A, HSP, GST, Mtabolitesdes HAP, dommages lADN

TBT Peintures antifouling, ports,etc.

Imposex

Alkyl phnols Dtergents industriels,plastiques, etc.

Vitellogenine


Une bonne spcificit pour certains bioindicateurs(+++ les biomarqueurs)


Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CEtablissant un cadre pour une politique communautaire dans le domaine de l'eau

dfinir des principes communs pour . amliorer la qualit des eaux protger les cosystmes aquatiques assurer l limination de substances dangereuses prioritaires obtenir dans l'environnement marin des concentrations qui soient proches des niveaux de fond pour les substances prsentes naturellementetc. etc. etc...

Objectif 2015 !.Bon tat cologiqueNon dtrioration des milieuxUn effort sur les substances dites prioritaires Mise en place de zones protges


Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CENotion de Bon tat

tat cologique5 niveaux

tat physico-chimique2 niveaux

TrTrs bons bonBonBonMoyenMoyenMMdiocrediocreMauvaisMauvais

BonBonMauvaisMauvais

Dcoupage, typologie des masses d eau

Dfinition dindicateurs

Sites de rfrencesDfinir le TRES BON

Sites perturbs


Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CELes paramtres slectionns

1) Paramtres physico-chimiques(transparence, temprature, bilan oxygne, salinit, nutriments, polluants fixs par dautres textes)

2) Paramtres hydromorphologiques(profondeur, zone inter-tidale, structure sdiment, dbit, exposition aux vagues, etc.)

3) Paramtres biologiques ou plutt . cologiquePhytoplancton : composition, biomasse

Macrophytes benthiques : Phanrogames et macroalgues, composition et abondanceMacrofaune benthique : composition et abondance

Ichtyofaune : composition et abondance, ge (eaux douces et transition uniquement)

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu1.1. Dfinitions1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE



3.1.1. Df/ : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.3.1.2. Le systme de biotransformation3.1.3. Gnotoxicit3.1.4. Protines de stress3.1.5. Mtallothionines3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.3.1.8. Les marqueurs morphologiques




2. Accumulation de contaminants dans les organismes

Trois types de mesures pour trois informations complmentaires

Dans leau : image instantane de la quantit totale de polluants prsents dans le milieu (RNO)

Dans les sols, les sdiments : accumulation travers le temps, intgration des sources de variations (problme de granulomtrie)

Dans les organismes (biomoniteurs) : image de la fraction biodisponible, potentiellement toxique (en fonction de la biologie de lespce et du comportement trophique)

Limites de dtection des appareillages utiliss!...

2. Accumulation de contaminants dans les organismes

des espces opportunistes, tolrantes faces aux perturbations de l'environnement. sdentaires et abondants sur les sites tudier. faciles rcolter et identifier. Accumule et non pas rgule les contaminants ; reflte les variations de la qualit chimique du milieu

Les bioaccumulateurs idaux

Les vgtaux : algues et phanrogames marines sources dissoutes de contaminants Les invertbrs filtreurs : bivalves et spongiaires sources particulaires et dissoutes de contaminants Les dtritivores : vers polychtes et crustacs contaminants accumuls dans les sdiments

Ex. : Mussel watch








3. Mesures d effets biologiques

Bioindicateurs de quoi?

est-ce que les bioindicateurs peuvent attirer notre attention sur la qualit de lenvironnement ?

est-ce quun bioindicateur peut suggrer une cause responsable dune altration, et nous permettre den dduire des consquences et ventuellement des mesures de remdiation ?

est-ce quun organisme donn, prslectionn, peut servir caractriser brivement ou exprimer une gnralit ?

3. Mesures d effets biologiques

Les mesures deffets biologiques peuvent se faire diffrents niveaux, de linfra-individuel jusqu lcosystme

Les biomarqueurs sont dfinis comme des paramtres biologiques de rponses sub-ltales et deffets des polluants sur des organismes aquatiques. Cette dfinition inclut un certain nombre de paramtres molculaires, cellulaires et physiologiques, qui peuvent, en principe, tre mesurs par des mthodes peu onreuses (Lagadic et al., 1997).

Lunit biologique du monde vivant rend possible lutilisation des mmes types de biomarqueurs chez des organismes appartenant des groupes taxonomiques trs varis du rgne animal et vgtal.

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Dfinitions

Xnobiotique

Biotransformations(systmes

enzymatiques)

Mtabolites ractifs

Macromolcules cellulaires

Toxicit

limination

Organisme vivant

Mtabolites hydrosolubles

inactifs

Distribution tissulaire


On distingue gnralement plusieurs types de biomarqueurs :

+ les indices gnraux de stress, dits non spcifiques et les marqueurs plus spcifiques

valuer les consquences de la contamination des individus sur des niveaux dorganisation biologiques plus levs (populations, communauts), et finalement sur lcosystme.difficult

Le biomarqueur dexposition indique que le polluant prsent dans le milieu a pntr dans lorganisme. Gnralement, il est le rsultat dinteractions avec des molcules naturelles ou des liquides biologiques.

Le biomarqueur deffet indique, quaprs avoir pntr, le polluant sest rpandu dans les diffrents tissus, en exerant des effets toxiques ou non.



Lutilit des biomarqueurs comme outil dvaluation de la qualit de lenvironnement selon Wolfe, 1992

estimer la distribution de substances potentiellement toxiques la fois dans lenvironnement et dans les organismes vivants,

mettre en vidence des rponses des organismes lexposition des contaminants,

tablir des relations de cause effet entre la prsence des contaminants et les rponses biologiques,

valuer les consquences de la contamination des individus sur des niveaux dorganisation biologiques plus levs (populations, communauts), et finalement sur lcosystme

Xnobiotique

Mtabolites ractifs

Macromolcules cellulaires

Toxicit

Elimination

Organisme vivant

Mtabolites hydrosolubles

inactifs

Distribution tissulaire

Biotransformations

Phase I

Phase II

Phase I

Phase II

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

La mtabolisation de toute molcule xnobiotique caractre hydrophobe met en jeu des mcanismes permettant daugmenter son hydrosolubilit


Xnobiotiques

Xnobiotiques

Mtabolites

Conjugus

Mtabolites lectrophiles

Conjugus

Composs radicalaires

Espces ractives de loxygne

Xnobiotiques

Pntration

Excretion

Mtabolisme de Phase I

Mtabolisme de Phase II

Ractions radicalaires

Cycles redox + autres

Mtabolisme de Phase I

pro

tect

ion

s

Pigeurs de radicaux libres

Enzymes anti-oxydantes

Mtabolisme de phase II

EFFETS

TOXIQUES

Dtrioration des membranes

Proxydation lipidique

Enzymes inactives

Dtrioration de lADN

+ autres

Effets subcellulaires

CELLULE

Mtabolisme Activation Protection Toxicit

Des transformations non enzymatiques peuvent galement se produire par captage de formes actives de loxygne induites par le mtabolisme oxydant.= peroxydation

Malgr ces mcanismes de detoxication, certains mnent la formation

4 sources potentielles despces toxiques drives du contaminant

Le contaminant lui mme

des mtabolites issus de la phase I

des drivs radicalaires

des espces ractives de loxygne

Esp.toxiques lectrophiles susceptibles de se lier de manire covalente avec des sites nuclophiles (ADN, ARN, Prot.)


Phase I = phase de fonctionnalisation

une oxydation rendant la molcule plus polaire. Ce mcanisme est assur par les complexes multienzymatiques dpendants du cytochrome P450.

Phase II = phase de conjugaison Les enzymes intervenant sont principalement les UDP-glucuronosyl-transfrases, les glutathion-S-transfrases, les sulfotransfrases et catalysent respectivement la conjugaison du substrat avec l'acide glucuronique, le glutathion, le sulfateou une molcule d'eau. Les xnobiotiques, ainsi oxyds puis conjugus, sont hydrosolubles et donc excrtables.

Phase I = phase de fonctionnalisation


La distribution des monooxygnases P450 (ou MFO pour Multi-Function Monoxygenase) semble universelleDes systmes enzymatiques complexes intervenant :

dans l'limination des substances trangres l'organisme (xnobiotiques),

dans la mtabolisation de substrats physiologiques essentiels, le P450 tant aussi impliqu dans le mtabolisme endogne. Cela comprend des ractions d'hydroxylation du cholestrol, des strodes, des vitamines A et D, d'alcanes et d'acides gras.

Phase I = phase de fonctionnalisation Cytochrome P-450, sous-familles et substratsprincipaux

Inducteurs majeurs Activits types

IA

xnobiotiques plans(ex: HAP)

HAP3-mthylcholanthrne (3-MC) - naphtoflavonedibenzo-p-dioxines etdibenzofuranes chlorsPCB plan

ERODECODBPH

IIBxnobiotiques globulaires(ex: barbiturates)

phnobarbitalPCB non plan

PROD, EMND,APND

IIIA(ex: strodes)

prgnnolone-16a-carbonitrilephnobarbitaldexamthasone

EMNDT6HP6H

IVA(ex: acides gras)

clofibrateesters de phtalate

LAH

EROD (7-thoxyrsorufine O-dthylase); ECOD (7-thoxycoumarine O-dthylase); BPH (benzo(a)pyrne hydroxylase); PROD (pentoxyrsorufine O-dalkylase); EMND (thylmorphine N-dmthylase); APND (aminopyrine N-dmthylase); T6H (testostrone 6-hydroxylase); P6H (progestrone 6-hydroxylase); LAH (laurate hydroxylase)


Phase II = phase de conjugaison 3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

Le plus souvent indissociable de la phase I : la phase I prpare le xnobiotique pour la conjugaison, tape finale de la dtoxication

Les ractions de phase II ont comme rle physiologique :

la rgulation de l'activit biologique de composs endognes tels que les hormones strodes

le transport de ces hormones dans l'organisme afin de prolonger leur demi-vie et d'atteindre slectivement leurs cellules cibles

les plus importantes pour le mtabolisme des xnobiotiques

la glucuronidation, la sulfatation et la conjugaison au glutathion

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Gnotoxicit

ADN = structure molculaire dpositaire du patrimoine gntique

Lintgrit de sa structure complexe est essentielle la survie de la cellule

Modifiable par des agents dits gnotoxiques

Dtectable par : lanalyse directe de la structure de lADN la dtection des traductions fonctionnelles


Les xnobiotiques peuvent induire deux types daltrations susceptibles dtre utilises comme biomarqueurs:

1) la formation de produits daddition entre le xnobiotique et les nuclotides, appels adduits

2) des cassures au niveau dun seul brin, ou des deux brins, dADN conduisant parfois la formation de micronoyaux.


Formation d adduits

Liaisons covalentes entre un Liaisons covalentes entre un xxnobiotiques (nobiotiques (lectrophiles) et les lectrophiles) et les sites nuclsites nuclophiles de lophiles de lADNADN

Reprsentation schmatique de lactivation des HAP amenant la formation dadduits lADN Schma dactivation du benzo[a]pyrne en

carcinogne ultime (diolepoxyde) et formation de ladduit correspondant

N-2-benzo[a]pyrne-diol-dsoxyguanosine


Fragmentation de l ADN

Le test comte

Cassures de monoCassures de mono--brins brins ddADN (Single Strand ADN (Single Strand Break)Break)

Extraction, dnaturation et droulement de l ADN

Les brins casss sont les premiers

Sparation par chromatographie et quantification

Pas d extraction

Analyse sur les noyaux inclus dans de l agarose et prsents sur lame

Dnaturation et migration par lctrophorse

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress

Les protines de stress - toutes les protines inductibles par un sens au sens large : protines de choc thermique, protines glucose rgules , ubiquitine, mtallothionines ou P-glycoprotines du systme MXR...

Une rponse similaire chez tous les organismes. Des molcules ubiquistes, marqueurs phylogntiques.La rponse universelle un stress = induction de protines jouant un rle cl dans les processus de protection, rparation et/ou limination des protines endommages Des protines susceptibles daccrotre la tolrance des organismes Leur accumulation peut permettre d identifier les organes cibles de substances chimiques nouvelles

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP

Famille Fonctions Localisation

HSP 110 Chaperon Noyau

HSP 90 (83-90 kDa) Association au rcepteur desstrodes, antignes tumoraux

Cytoplasme,rticulum

HSP 70 (68-73 kDa) Chaperon molculaire :- assemblage des protines- translocation des protines- maintien de la solubilit desprotines nuclaires et

cytosoliques- ciblage des protines vers leslysosomes- apprtement de lantigne

Cytoplasme,rticulum,

mitochondrie,noyau

HSP 60 Chaperon molculaire Cytoplasme,mitochondrie,

chloroplaste,cytoplasme

HSP de faible poidsmolculaire (20-30kDa)

Protines de liaison du collagne,chaperons molculaires,

constitution du protasome

Cytoplasme

Nucloplasmide Formation du nuclosome NoyauFerritine Stockage du fer Cytoplasme

Ubiquitine (7-8 kDa) Constituant du protasome Cytoplasme

Protines de choc thermique :

Plusieurs familles de HSP de diffrents poids molculaires, surexprimes en rponse une grande varit de stress

Protines de stress :Maintien de l homostasie cellulaire sous l influence de stress environnementaux

Des gnes et des protines remarquablement conservs

Thierry Perez

Des protines normalement exprimes en labsence de stressElles peuvent reprsenter jusqu 5% des protines cellulaires totalesElles jouent un rle dans la rcupration (aprs dnaturation) ou dans la mise en place initiale (aprs synthse) de la conformation tridimensionnelle d autres protinesElles sont sur-exprimes pour faire face une grande varit de stress

Facteurs destress

HSP Rfrences

Spongiaires Temprature,PCB, TBT, Cd

70 Batel et al., 1993 ; Mller et al., 1995 ; Koziol, 1998 ;Mller et al., 1998 ; Schrder et al., 1999

Actiniaires Temprature 70 Sharp et al., 1994Madrporaires Temprature 20-30, 70, 90 Black et al., 1995Octocoralliaires Temprature,

PCB (CB118)90 Wiens et al., 2000

Mollusquesbivalves

Temprature,Cd, PCB

70 Sanders, 1988 ; Brown et al., 1995 ; Bradley et al., 1998 ;Smerdon et al., 1995 ; Chapple et al., 1998 ; Steinert &Pickwell, 1993 ; Lundebye et al., 1997

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP

PROBLEME

Bien que prometteur, ce biomarqueur a t rarement employ en conditions naturelles

Une majorit dtudes effectues en conditions exprimentales de stress aigu

OBJECTIFS

tudier in situ les variations des niveaux dexpression de la HSP 70Confronter les rsultats aux variations de la qualit du milieu, et en particulier aux variations de la contamination chimique de S. officinalis

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70

Une mthode de dtection : le western-blot

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70 3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70

0

0.02

0.04

0.06

0.08

1012141618202224

oct

20022002 20032003 20042004nov dec jan mar avr maifev jun jul aou sep oct nov dec jan fev mar avr jun jul aoumai

Temperature (C)HSP 60 (HSP 60 (g/g/g de protg de protine)ine)

0.08

0.06

0.04

0.02

0fev mar avr mai jun jul aou sep oct nov dec jan fev mar avr mai jun

1012141618202224Temperature (C)

20002000 20012001

HSP 60 (HSP 60 (g/g/g g de protde protine)ine)

Expression des protExpression des protines de choc thermique ines de choc thermique en relation avec les fluctuations saisonnien relation avec les fluctuations saisonnires res de tempde tempraturerature

Hemimysis margalefiHemimysis margalefi 1 1 chantillonnage mensuelchantillonnage mensuel 2 p2 priodes entre 2000 et 2004riodes entre 2000 et 2004

Analyse de corrAnalyse de corrlation multiple : lation multiple : temptemprature et facteurs biotiquesrature et facteurs biotiques

pas de corrpas de corrlation avec la templation avec la tempraturerature aucun autre facteur pris en compte aucun autre facteur pris en compte nnexplique la variabilitexplique la variabilit

HSP 85HSP 85

corrcorrlation significative avec la templation significative avec la tempraturerature variation partiellement expliquvariation partiellement explique par le % de e par le % de femelles gravides dans lfemelles gravides dans lchantillon chantillon (( HSP)HSP)

HSP 60HSP 60

corrcorrlation significative avec la templation significative avec la tempraturerature variation partiellement expliquvariation partiellement explique par le % e par le % ddindividus immatures (individus immatures ( HSP)HSP)

HSP 45HSP 45

Expression des protExpression des protines de choc thermique et ines de choc thermique et production de dproduction de dfenses chimiques dans le contexte de fenses chimiques dans le contexte de la maladie de 2003la maladie de 2003

0

100

200

300

400

500EC 50 EC 50 g / mlg / ml

Dates (chantillonnage mensuel)

0,0

0,6

1,2

1,8

2,4HSP 70 (HSP 70 (g / g prot.)g / g prot.)

Dates (chantillonnage mensuel)

27/08/200327/08/200311rere observation de nobservation de ncroses croses chez les spongiaireschez les spongiaires

RefRefrencerence MaladieMaladie

1,96*Ec.-Type

1,00*Ec.-TypeMoyenne

10/09/200310/09/2003

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - Mtallothionines

Cys Cys CysCys

Cys

Cys Cys Cys Cys Cys

Des ligands intracellulaires inductibles par les mtaux

La famille des mtalloprotines : faible PM (


Des groupements thiols libres

Formation de complexes metal-thiolates

Affinit pour les ions mtalliques lourds : Zn, Cd, Ag, Cu, Hg


Trois classes de protines de type MT (PTM ou MTLP)Classe I : MT des vertbrs, certains invertbrs, certains champignonsClasse II : entre autre, les MT des oursinsClasse III : petits peptides non cods gntiquement, des plantes, des champignons

Deux rles essentielsDeux rles essentiels

Homostasie : Zn et Cu sont essentiels, activit des polymrases, facteurs de transcription et autres mtalloenzymes. Les MT sont des formes de stockage de ces ions et peuvent librer en cas de ncessiter.

Detoxication : Fixe (squestre, chlate) les mtaux. Leur induction lors de contaminations suggrent leur implication dans la protection contre la toxicit des mtaux.

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs de Neurotoxicit

Action toxique des pesticides organophosphors et des carbamates au niveau du systme nerveux

Toxicit lie leur action inhibitrice sur lactivit de lactylcholinestrase

Lenzyme (AChE) met fin au signal nerveux en liminant le neuromdiateur des synapses

Sinon...

Blocage de linflux nerveux

Les toxiques prsentent des analogies avec lactylcholine. Il s agit donc d une inhibition comptitive(fixation du comptiteur au niveau du site actif de lenzyme)

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs physiologiques

Atteinte du mAtteinte du mtabolisme tabolisme nergnergtiquetique

BIL

AN

M

ETA

BO

LIQU

E =

F

(ta

t de

sant

)

Deux mthodes appliques en routine aux bivalves

Scope for Growth C = R + F + U + P (daprs Widdows)C: consommation

R: nergie lie au catabolisme endogne, estime par la conso. en O2F: nergie rejete sous forme particulaireU: nergie rejete sous forme d urine (ou excrtion azote)P: nergie disponible pour la production = gain brut (tissus, scrtion)c

ole

anglo

-sa

xonn

e

Stress on stress

cole i

talien

ne

(Daprs Viarengo)= la rsistance l anoxie

En dautres termes le temps de survie l air en laboratoire


Atteinte des fonctions reproductrices

Les facteurs du milieu exercent leur influence sur les gniteurs(gamtognse et fcondit), sur les gamtes (fcondabilit, spermiotoxicit, ovotoxicit) et sur ltat de la descendance(embryotoxicit, tratognse)

Trs employ chez les poissons

Trs employ chez les mollusques

Employ chez les chinodermes

Reproduction success

+++ tests de toxicit

Atteinte des fonctions reproductrices

IMPOSEX


Marqueur spcifique d une contamination par les TBT

Nucella lapillus (gastropodes)

En grande partie due linteraction avec le mtabolisme des strodes

Apparition de caractres mle chez des femelles

Un indice TRP (%) = moy X / moy Y RSP

moy X = valeur moyenne (male) du rapport poids penis / poids du corpsmoy Y = valeur moyenne (femelle) du rapport poids penis / poids du corps

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs morphologiques

Changements physiologiques et

biochimiques induits par les contaminants

Lsions des cellules, des tissus et organes

Les altrations morphologiques permettent

dvaluer les effets dexposition de longues

dures, mme de faibles niveaux de contamination

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs morphologiques

Ncroses chez les invertbrs marins

Un concept applicable aux mtazoaires et macrophytes

Biomarqueur deffet , indicateur cologiques ?

HSP 70 Paramuricea clavata

Peu de variabilitPeu de variabilit intraintra--individuelleindividuelle

Forte variabilitForte variabilit intraintra--individuelleindividuelle

VariabilitVariabilit plus forte plus forte faible profondeur :faible profondeur :

Plane Cv = 85% Plane Cv = 85% (contre 40%)(contre 40%)Riou Cv = 40%Riou Cv = 40% (contre 22%)(contre 22%)

Un marqueur de rsistance au stress

VariabilitVariabilit de lde lexpression des protexpression des protines de ines de choc thermique chez un gorgonairechoc thermique chez un gorgonaire

HSP 70 Paramuricea clavata

Un marqueur de rsistance au stress

Une variabilitUne variabilit des capacitdes capacits de rs de rsistance visible sistance visible llil nu !il nu !

VariabilitVariabilit de lde lexpression des protexpression des protines de ines de choc thermique chez un gorgonairechoc thermique chez un gorgonaire

Les limites des biomarqueurs

Les traitements des chantillons La rfrence bruit de fond Facteurs gntiques (MXR Multi-Xenobiotic-

Resistance) Facteurs physiologiques (lage, le sexe, les facteurs

nutritionnels, les saisons) Les pollutions mixtes et les interactions avec

dautres polluants La dure des effets biologiques

Le caging pour matriser les sources de variations




3.1.1. Dfinitions : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcifiques3.1.2. Le systme de biotransformation3.1.3. Gnotoxicit3.1.4. Protines de stress3.1.5. Mtallothionines3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit3.1.7. Les marqueurs physiologiques : exemple de limposex chez les gastropodes3.1.8. Les marqueurs morphologiques




Les tests ltaux

Ces tests sont les plus couramment utiliss en laboratoire, du fait de leur simplicit et de leur rapidit de mise en uvre. Les effets ltaux sont facilement identifiables et la courte dure du test ne pose pas de problme en ce qui concerne le maintien technique des organismes-test et des conditions exprimentales. Ces tests sont raliss partir de concentrations en polluant nettement suprieures celles mesures dans le milieu. De ce fait, leur manque de reprsentativit et la difficult d'extrapolation au milieu naturel leur ont valu de nombreuses critiques. Cependant, malgr leurs limites, ils restent indispensables ( condition qu'ils soient rigoureusement conduits) pour des tudes prliminaires sur l'valuation de l'impact de nouveaux produits chimiques, le suivi des effluents, les accidents ptroliers impliquant l'utilisation de dispersants, les "screening" des rejets de produits chimiques et les installations offshore.

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Les tests subltaux

Ils sont bass sur l'apprciation d'effets indsirables sur les individus. Ces effets ont souvent une origine biochimique tant donn que la plupart des toxiques exercent leurs effets par le biais de modifications d'activits enzymatiques. Les effets les plus couramment tudis concernent des arrts de croissance, des perturbations de la reproduction, des baisses de l'activit, des effets mutagnes L'effet pourra tre qualifi "d'indsirable" dans la mesure o l'on connat sa signification physiologique et cologique et o il ne s'agit pas d'une raction d'adaptation bnfique pour l'espce tudie.


Les tests incluant des cosystmes exprimentaux

Ces tests consistent soit reproduire des cosystmes en laboratoire, soit raliser des expriences in situ par contamination du milieu. Leur finalit est l'tude des phnomnes de fixation et de concentration des polluants rmanents travers les espces.


Diffrents tests de toxicit disponibles

Souvent empiriques (ne tiennent pas compte des mcanismes biochimiques et physiologiques qui aboutissent un effet ltal ou sub-ltal)

Pour une meilleure valuation de la qualit du milieu est envisager de coupler des bio tests avec des mesures de biomarqueurs


Tests de toxicit oprationnelles: Tests letauxAcartia torsaChaetogamarus marinus boues de forageCrangon crangonBrachionus plicatilis effluents industrielsNitocra spinipesDicentrachus labrax produits chimiquesArtemia salinaFundulus heteroclitus dispersants dHC Tests subletauxPhotobacterium phosphoreumSkeletonema costatumBalanus improvisus boues de forageMytilus edulisMysidopsis bahiaArbacia punctulata effluentsCyprinodon variegatus

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit 3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Des tests standardiss

Effet ltal sur le loup ou la truite : CL 50

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri(ex- Photobacterium phosphoreum)

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri(ex-Photobacterium phosphoreum)

Extraction des substances toxiques dans un solvant organique (mthanol/di-chloromthane)

Dissolution de lextrait dans de leau de mer synthtique

CompositionCompositionde lde lextraitextrait

Test pour une gamme de Test pour une gamme de concentrations constanteconcentrations constante EC 50 EC 50 ToxicitToxicit

Chromatographie Chromatographie (CCM, GC(CCM, GC--MS)MS)

Production de dProduction de dfenses chimiquesfenses chimiques1,5 fois inf1,5 fois infrieurerieure

Expression HSP 70Expression HSP 70 2 fois sup2 fois suprieurerieure

0

100

200

300

400


EC 50 EC 50 g / mlg / ml

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

RRffrencerence MaladieMaladie

HSP 70 (HSP 70 (g / g prot.)g / g prot.)


1,96*Ec.-Type


1,96*Ec.-Type


0

100

200

300

400


EC 50 EC 50 g / mlg / ml

CapacitCapacit de dde dfense fense ==

Porte ouverte aux pathogPorte ouverte aux pathognesnes

Une diminution significative de la Une diminution significative de la production de dproduction de dfenses chimiquesfenses chimiques

Expression de Expression de certaines certaines molmolculescules

?



Des tests standardiss

Effet ltal sur le loup ou la truite : CL 50

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri(ex- Photobacterium phosphoreum)

Test dinhibition de la croissance de Skeletonema costatum

Des critres de slection

Sensibilit : dceler des petites variations

Spcificit : rponse un paramtre donn

Reprsentativit : de phnomnes naturels








Les changements de structure des assemblages benthiques peuvent permettre une meilleure caractrisation de la distribution spatio-temporelle de la pollution. Il est ainsi possible de classer les espces des diffrents grands groupes dorganismes marins selon leur sensibilit ou leur tolrance aux perturbations dorigine anthropique (Glmarec, 1985) : les espces sensibles, dominant largement le peuplement en conditions normales,

les espces tolrantes, parmi lesquelles certaines ne fluctuent pas de faon significative dans des conditions anormales, et dautres prolifrent lorsquil y a une perturbation,

les espces opportunistes, supportant aisment des conditions de perturbation extrmes.

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

Les indicateurs cologiques



Des espces indicatrices : prsence, absence, abondance, morphologie (biomarqueur?)



Des indices mathmatiques ou indices biotiques : des indices de diversit (Shannon), des distributions thoriques

Distribution log-normale (Gray, 1981; Warwick; 1993) Indice trophique (Word, 1990) Indice Annelidien de Pollution (Bellan, 1979) Indices biotiques et coefficient biotiques (Borja et al., 2000)

etc etc.

des indices simplifies (peut tre la solution?)

Capo (1998). Evaluation des bryozoaires comme bioindicateurs. Diplome d'Etudes Approfondies. Universit de la Mditerrane, 38 pages Harmelin & Capo (2002). Effects of sewage on bryozoan diversity in Mediterranean rocky bottoms. In : P. Wyse Jackson, C. Buttler & M. Spencer Jones (eds), Bryozoan Studies 2001: Proceedings of the 12th International Bryozoology Association Conference , Swets & Zeitlinger Publishers, Sassenheim.

Richesse spRichesse spcifique des assemblages de bryozoaires en souscifique des assemblages de bryozoaires en sous--blocsblocs


0

2

4

6

8

10

12

Riou Sormiou Vaisse 1 Vaisse 2 Calsom CORTIOU Melette Cirque Maire

N SpeciesN Colonies

OUTLETSEWER

900m 700m 400m 400m 1300m 5000m2400m5000m

0 0 0

6

4 44

1

DOMINANT CIRCULATION: E - W

Large erect bryozoansRichness & abundance (x + sd)/quadrat

Distribution des grandes espDistribution des grandes espces dressces dresses sur le gradient de pollution es sur le gradient de pollution


bioindicateurs_biomarqueurs

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