Biogenèse de latélomérase chez l’humain.

Christian Trahan

Centre BioMed, Département des

sciences biologiques, UQÀM.

Aplasie de la moelle osseuse (86%)Aplasie de la moelle osseuse (86%)

Pathologie qui affecte principalement les tissus à haut renouvellement

diagnostique difficile en raison des désordres variés:

Hyperpigmentation de la peau (89%)

Dysplasie des ongles (88%)

Leucoplasies des muqueuses (78%)

Pathologies pulmonaires (20%)

Perte prématurée des cheveux (16%)

Tendance à la malignité (10%)

Ostéoporose (10%)

Dyskératose congénitale (DC)

Dyskératose congénitale (DC)

Petite stature /retard de développement Microcéphalie

Épiphora

Hypoplasie cérébellaireNécrose avasculaire des articulations

Problèmes gastroentériqueDéficiences immunologique

Perte prématurée des dentsAutres désordres:

autres…

Des mutations dans 6 gènes sont responsables de la moitié des cas répertoriés au DCR (Londres).

Ces gènes ont en commun une fonction dans la biologie des télomères.

Autres désordres:

Gènes reliés à la DC

TIN2 (AD)– composante du complexe shelterin qui protège et régule les télomères.

hTERT (AD-AR)– transcriptase inverse de la télomérase.

hTR (AD)– RNA de la télomérase.

Dyskérine (XR)NOP10 (AR)NHP2 (AR)

protéines communes à la télomérase, ainsi qu’aux petits RNA H/ACA (snoRNA/scaRNA).

La DC est donc principalement considérée comme un défaut dans la biologie des télomères.

Les sujets atteints de DC ont des télomères critiquement courts.

[TTAGGG]n

[AATCCC]n

2-30 kpb50-300 b

3’5’

[TTAGGG]n

[AATCCC]n

T-loop

D-loop5’

3’

Problème de réplication des extrémités chromosomiques

fourche de réplication 3’

5’

synthèse dubrin avancé

3’5’

Synthèse dubrin retardé

3’5’

5’3’

3’5’

Extension et dégradationdes amorces

Télomères et problème de réplication

DNA télomérique

Transcriptase inverse (hTERT)

ARN (hTR)

3’

5’

CAAUCCCAAUC

Transcriptase inverse (hTERT)

ARN (hTR)

3’

5’

CAAUCCCAAUC

50-300 b

GGTTAGGGTTAGGGTTAGnGGTTAG

Extension des télomères par la télomérase

Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC.

rRNA (ribosome) snRNA (spliceosome)

ψ ψ

snoRNA scaRNA

GAR1

GAR1

NAF1

Nucléole ou Corps de Cajal

Noyau

Site de transcription des ARN H/ACA

Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo.

Cytoplasme

dyskérine

NAF1

NOP10

NHP2

Pré-RNP

RNP active

Problématique et hypothèses

Problématique

Peu ou pas d’étude sur l’assemblage de complexes H/ACA en relations aux:

Hypothèses

• mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR.

2. Des mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 peuvent affecterl’assemblage de d’autres pré-RNP en plus de l’assemblageprécoce de la télomérase.

• mutations dans les protéines dyskérine, NOP10 et NHP2.

Les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 pourraient-elles affecter d’autres RNP en plus d’affecter la télomérase?

1. Des mutations dans le domaine H/ACA de hTR interfèrentavec l’assemblage de ce domaine en pré-RNP.

1er volet

Christian Trahan and François Dragon, 2009. Dyskeratosis congenita mutations in the H/ACA domain of human telomerase RNA affect its assembly into a pre-RNP. RNA 15 :235-243

Des mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR affecte son assemblage en pré-RNP.

Domaine H/ACA de hTR et ses dérivés utilisés.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

Inv 4

13-416

C408G

Méthodologie; Reconstitution et analyse de complexes H/ACA in vitro.

Transcription/traductionin vitro (35S-méthionine)

NAF1DyskérineFibrillarine CTRL-NHP2NOP10

IP dyskérine ou NAF1

Gel d’acrylamideBis-Tris 4-12%

fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.

Analyse des RNA sur Molecular Imager FX

35Stransparent

Analyse surnageantsGel d’acrylamide urée

Gel d’acrylamideBis-Tris 4-12%

Transcription in vitro (32P-CTP)

hTR204 hTR204 mutésU3 RNA CTRL-

Purification sur gel

IP dyskérine ou NAF1

Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 s’assemble correctement.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

T IP T IP T IP T IP T IP

- NAF

1

- NHP2

- NOP1

0

- dys

k.

Tout

es

IP dyskérine

NAF1dyskérine

NOP10

NHP2

fibrillarine

Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

T IP T IP T IP T IP

hTR204

- dys

k.

- dys

k.

Tout

es

Tout

es

RN

A

NAF1dyskérine

NOP10

NHP2

fibrillarine

hTR204 IP

IP dyskérine

RN

A

T IP T IP T IP T IP RN

A

RN

A

- NAF

1

- NAF

1

Tout

es

Tout

es

hTR204 U3

IP NAF1

hTR204 sng

U3

dyskérine-NOP10-NHP2; un minimum requis pour lier hTR204.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

IP dyskérine

T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP

- NAF

1

- NHP2

- NOP1

0- N

AF1,

NOP1

0- N

AF1,

NHP2

- dys

k.

NAF1dyskérine

NOP10

NHP2To

utes

hTR204 IP

hTR204 sng

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer à hTR204.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP

- dys

k., N

OP1

0-d

ysk.

, NOP1

0,

- N

HP2

- NAF

1- d

ysk.

- NOP1

0- N

HP2

Tout

es

IP NAF1

NAF1dyskérine

NOP10

NHP2

hTR204 IP

hTR204 sng

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer aux RNA H/ACA.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

IP NAF1

IP NAF1

inv413-416

Les boîtes H et ACA dans hTR sont essentielles à la formation de pré-RNP.

Les mutations C408G et ∆378-451 empêchent la formation de RNP.

IP NAF1

Conclusions

Notre système de reconstitution in vitro est spécifique et récapitule l’assemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis d’analyser l’effet de mutations dans ce domaine sur l’assemblage de la pré-RNP.

Contrairement à la boîte CAB, les boîtes H et ACA sont indispensables à la formation de pré-RNP avec hTR204.

Nos résultats suggèrent que ces mutations engendrent également des défauts d’assemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC.

Les deux mutations reliées à la DC testées abolissent la formation de pré-RNP avec hTR204 alors que la mutation G450A reliée à l’anémie aplasique n’a aucun effet.

2e volet

Analyse de l’effet des mutations associées à la DC dans les protéines dyskérine, NHP2 et NOP10 sur l’assemblage de pré-RNP H/ACA

Christian Trahan, Caroline Martel and François Dragon, 2009. Effects of dyskeratosis congenita mutations in dyskerin, NHP2 and NOP10 on assembly of H/ACA pre-RNPs. Human Molecular Genetics 19 :825-836

Structure d’une RNP H/ACA d’archaebactérie

R65TT66AT67IH68QL72Y

Q31EF36VL37delI38TK39EP40RE41KK43ET49M

A2V

N-terminal

P384LP384SA386TL398PG402EG402RT408IP409LS420Y

C-terminal493-514del

Extensions dyskérine

Mutations dans dyskérine reliées à la DC

IP NAF1

Mutations dans dyskérine reliées à la DC

IP NAF1

Mutations dans NHP2 reliées à la DC

IP NAF1

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

Mutations dans NHP2 reliées à la DC

Mutation dans NOP10 reliée à la DC

IP NAF1

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

Mutation dans NOP10 reliée à la DC

Conclusion

hTR est plus sensible que les autres RNA H/ACA à la mutation A353V dans dyskérine lors de l’assemblage de pré-RNP.

La mutation R34W dans NOP10 cause un défaut majeur d’assemblage de pré-RNP H/ACA ¨classiques¨, alors qu’elle n’a aucun effet sur l’assemblage de pré-RNP H/ACA encodant des miRNA.

L’association de NOP10 aux mutants V126M / Y139H de NHP2 est compromise, ce qui engendre par conséquent des défauts majeurs d’assemblage de tous les RNA H/ACA.

Conclusion

Nos résultats démontrent que les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 reliées à la DC affectent différentes populations de RNP H/ACA en plus de la télomérase.

Cela suggère que certains désordres entre individus atteints de DC pourraient être reliés à différentes populations de RNP H/ACA affectées en plus de la télomérase.

Notre étude rend possible le criblage et le développement de petites molécules thérapeutiques personnalisées afin de traiter la DC.

3e volet

Maturation de hTR.

En préparation Christian Trahan, Amed Hossain et François Dragon

hTR possède son propre promoteur, est transcrit par la Pol II (présence d’une coiffe), et ne possède pas de séquence 5’ immature.

Tous les ARN sont synthétisés sous forme de précurseurs plus longs in vivo. Extrémités 5’ et 3’ ou seulement 3’.

Généralités

Une étude démontre que la séquence du domaine H/ACA de hTR contient tous les éléments nécessaires à sa maturation 3’ (Fu et Collins, Mol Cell 2003).

La longueur de l’extrémité 3’ de transcrits précurseurs de hTR est toujours indéterminée.

Cette même étude fait mention de la présence d’un transcrit > 1000 nt amplifié par RT-PCR à partir d’ARN de cellules HeLa (¨data not shown¨.

…

Anémie aplasique reliées à la mutation G450A dans hTR

…

Hypothèse de départ

A AGTTCGCT…

Méthodologie: 3’ RLM-RACE

cellules VA-13 (hTR négatives)Transfections

RNA total (QIAGEN RNeasy)DNase RNase free (sur colonne)

Ligation d’un adaptateur miRCAT-33rApp ddC

RNase DNase free

RT

PCR EcoRI pBS

EcoRV EcoRI

T4 RNA ligase 2 tronquée

EcoRI

Prom-hTR+500

Prom-hTRG450A+500Prom-hTRA446G+500

hTR+500 hTRG450A+500

Mature

3’-end

3’ flanking

sequence

Mature

3’-end

3’ flanking

sequence

ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency ACAUAC AGUUCGCUU… Frequency

ACAUGC 1/23 ACAUAC 5/20

ACAUGC A 6/23 ACAUAC A 3/20

ACAUGC AA 1/23 ACAUAC AAAA 1/20

ACAUGC AAAA 1/23 ACAUAC AG 3/20

ACAUGC AGAAA 3/23 ACAUAC AGAA 1/20

ACAUGC AGUA 2/23 ACAUAC AGAAA 1/20

ACAUGC AGUUA 1/23 ACAUAC AGUA 1/20

ACAUGC AGUUAAAAA 1/23 ACAUAC AGUUA 2/20

ACAUGC AGUUC 1/23 ACAUAC AGUUC 1/20

ACAUGC AGUUCGA 1/23 ACAUAC AGUUCGCU 1/20

ACAUGC AGUUCGCU 2/23 ACAUAC AGUUCGCUU 1/20

ACAUGC AGUUCGCUAA 1/23

ACAUGC AGUUCGCUU 1/23

ACAUGC AGUUCGCUUA 1/23

Le mutant G450A de hTR n’influence pas la maturation de son extrémité 3’

L’absence de formation de pré-RNP mène à la dégradation des transcrits

Oligo-adénylation de hTR dans des cellules HeLa et BeWo.

HeLa BeWo

Mature

3’-end

3’ flanking

sequence

Mature

3’-end

3’ flanking

sequence

ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency

ACAUGC 12/18 ACAUGC 21/26

ACAUGC A 3/18 ACAUGC A 1/26

ACAUGC AG 1/18 ACAUGC AA 1/26

ACAUGC AGAAAAA 1/18 ACAUGC AGUA 1/26

ACAUGC AAAAAA 1/18 ACAUGC AAAAA 1/26

ACAUGC AAAAG 1/26

Conclusions

La mutation G450A dans hTR ne semble pas influencer la maturation de son extrémité 3’.

Des transcrits de hTR subissent une oligo-adénylation en 3’ de la séquence codante, à proximité de la séquence mature de hTR.

L’implication de cette oligo-adénylation demeure spéculative:maturation ou dégradation?

Les résultats du 3’ RLM-RACE du mutant A446G supportent l’idée qu’en absence de formation de pré-RNP, les transcrits naissants sont rapidement dégradés.

Des fragments mesurant entre 1000 et 3000 nt ont été amplifiés par 3’ RLM-RACE, mais se sont avérés êtres non-spécifiques.

Un ou des éléments situés à plus de 500 pb en aval de la séquence codante de hTR contribuent à l’efficacité de maturation de l’extrémité 3’ de hTR.

Perspectives des études 1 et 2

Déterminer si le mutant NHP2-X154R est présent dans les RNP H/ACA matures et fonctionnelles in vivo (hTR et autres RNA H/ACA).

Vérifier si le mutant NOP10-R34W peut former des RNP active (pseudouridylation) avec les RNA H/ACA codant pour des miRNA in vivo (ACA36B et U92), et vérifier si ces miRNA sont toujours générés dans un tel contexte.

Tester d’autres mutations dans le domaine H/ACA de hTR ou de dérivés de ce dernier sur l’assemblage de pré-RNP.

Si des miRNA sont effectivement produits, identifier leurs cibles permettrait de mieux connaître l’impact des mutations dans NHP2 qui affectent tous les pré-RNP H/ACA.

Perspectives 3e volet

Possibilité de combiner une immunopurification de NAF1 la purification par affinité MS2 n’est pas suffisante.

Utiliser des constructions ayant des séquences 3’ flanquantes de plus en plus longues de hTR qui sont transfectées dans des cellules VA-13, dont l’efficacité de maturation serait comparée à celle obtenue dans des cellules HeLa et BeWo par RLM-RACE

Produire des ARN synthétiques presque matures oligo-adénylés dans lesquelles le pseudonoeud de hTR est remplacé par 2 petites tiges-boucles ayant une forte affinité pour la protéine MS2.

Transfecter des siRNA contre les candidats identifiés en MS dans des cellules VA-13 et procéder au 3’ RLM-RACE de hTR.

Purifier ces RNP par affinité (agarose-MS2) et identifier des candidats par MS.

Incuber ces ARN avec des extraits nucléaires ou les transfecter dans des cellules.

Conclusion

Remerciements

François Dragon, Directeurles membres du laboratoire

Yves Henry, CNRS Toulouse.

Caroline Martel, assistante de recherche.

Chantal Autexier, McGill.

Steve Reichow et Gabriele Varani,Université de Washington

Kathleen Collins, Berkeley UC.

Amed Hossain, étudiant M. Sc.

Maturation de snoRNA H/ACA chez S. cerevisiae

Grzechnik & Kufel, Mol Cell 2008

3000

13001200

Transcrits précurseurs de hTR dans des cellules HeLa?

1kb+ RT+ RT-

NetGene2

Donor splice sites, direct strand--------------------------------- pos 5'->3' confidence 5' exon intron 3' 1160 0.81 TCACGACAAG^GTAATTCCGT

Box et al., Nature 2008

S. pombe

1000

850

650

500

400

1650

2000

3000

Perspectives 3e volet

Utiliser des siRNA contre:

RRP6 (accumulation de précurseurs? polyadénylés/oligo-adénylés?)TRF4/5 (perte de l’oligo-adénylation)PAP1 (perte de polyadénylation)

Inhiber le spliceosome (isoginkgetin):Accumulation de long transcrits précurseurs?

3’ RLM-RACEen parallèle