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TD Noyau, Chromatine,
Chromosome, Caryotype (n°9)
(S. Delbecq)
N. Boulle Année 2012-2013
Caractères généraux et enveloppe nucléaire
NOYAU
Caractéristique des cellules eucaryotes +++
- Limité par l’enveloppe nucléaire
- Contient presque la totalité information génétique (le génome nucléaire)
QCM 1
Noyau → contient presque la totalité information génétique
ADN mitochondrial: ADN circulaire - 5 à 10 copies
Code pour - des ARN ribosomaux spécifiques (2) (mitoribosomes)
- des ARNt
- des protéines mitochondriales (13) (ex: sous unité de l’ATP synthase)
- Code génétique spécifique
- Importation de l’ADN polymérase, des ARN polymérases, protéinesribosomales …
Hérédité « cytoplasmique », maternelle
QCM 1
L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau
Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950
chromatine
QCM 1 L’enveloppe nucléaire
Description:
Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RE- membrane interne- espace périnucléaire
Membrane externe
Membrane interne
Enveloppe nucléaire Réticulum
Endoplasmique
Lumière du RE
Espace périnucléaire
Lamina nucléaire
Pore nucléaire
ribosome
L’espace périnucléaire
Espace en continuité avec la lumière du RER:- contenu similaire- stockage du calcium
Récepteur des lamines
La membrane nucléaire
Récepteur pour histones ou protéines associées
Membrane externe,cytosolique = région spécialisée de REG
Membrane interne nucléocytoplasmique
→→→→ composition ≠≠≠≠
Ca++
QCM 1 L’enveloppe nucléaire se dissocie à chaque mitose, puis se reconstitue Rôle des complexes
cyclines / Cdks (voir cours sur le cycle cellulaire)
QCM 1
- Position centrale en général
Relation avec centrosome (→ fuseau mitotique)
NoyauQCM 1
- Nombre : en général, 1 par celluleExceptions - plusieurs : ex.fibres musculaires (syncitium)
- aucun : GR, plaquettes
- Forme : ronde ou ovaleExceptions : polynucléaires
-Taille : - 5 à 6 µm - 6% du volume cellulaire- rapport nucléo/protoplasmique selon activité / type cellulaire
N/P = Vol. Noyau / Vol. cellule
http://www.physique.univ-paris-diderot.fr/IMG/jpg/image4.jpg
Exemple de syncytium: fibres musculaires
(muscles striés)
Coupe longitudinale
Coupe transversale
Myofibrille
Sarcoplasme
Noyauxpériphériques
Sarcolemme
Planche donnée pour information
Le muscle strié :la fibre musculaire
Le syncytium contient plusieurs noyaux dans un cytoplasme unique
Exemple de cellules multinucléesQCM 1
Mise en évidence en microscopie:
- fluorescence: agents intercalants de l’ADN (DAPI, BET…)
- colorants basiques : hématoxyline, bleu de méthylène…
- réaction de Feulgen : hydrolyse acide de l’ADN et révélation avec le réactif de Schiff (détecte les aldéhydes)
DAPI (Hoescht)
(Fluorescence)FeulgenHématoxyline
PAS FEULGENCH2OH
O
OH
OH
HO O OH
O
OH
OH
CH2OH
HIO4
HO
OOCH2 A / G
PO
OHOCH2 C / T
H
HCl, 60°C
HO
OOCH2 H
OHO
CH2OH
O
OO
HO
OH
OCH2
OXYDATION
1
2 FUSCHINEFUSCHINE
HYDROLYSE
Polysaccharides (amidon,
glycogène, amidon…)
Polysaccharides ADN
Desoxyribose (ADN)
Base purique
OH du désoxyribose
QCM 1
Les pores nucléaires
- Seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme
- Passage de petites molécules, ions
Protéines
ARNm, ARNt, ARNr
ribonucléoprotéines, particules ribosomales…
- Passage dans les 2 sens
- Symétrie radiale d’ordre 8 (nucléoporines)
- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)
Symétrie d’ordre 8
QCM 2
Molécules de taille variable!
Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable
Les pores nucléairesQCM 2
16 bras radiaires (2x8)
16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)
Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757
Structure 3D des pores nucléaires
Microscopie electronique, cryofracture
QCM 2 Nucléoporines (Nup)
Unité d’organisation x 8Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues
~ 450 protéines en tout (par pore)
Origine
REProtéines transmb. N-glycosyléesAncrage des pores à l’enveloppe nucléaire
CytosolAutoassemblage protéines solublesCertaines sont O-glycosylées
(! O-glycosyl transférases dans le cytosol et le Golgi)
QCM 2
Les Nucléoporines - Fonctions
Plusieurs groupes de nucléoporines:
1- Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):
Domaine FG
Ex: motif FXFG
Séquences de reconnaissance pour les Importines / Exportines
Interviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!
2- Nucléoporines (sans FG): ∼ nucléoporines structurales
3- Protéines membranaires: ancrent le pore dans la membrane nucléaire
Remarque : Certaines nucléoporines sont liées à l’ADN
QCM 2
Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153
Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG
Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757
Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 153
Extrémité flexible
Fixe importine / exportine
QCM 2
QCM 2
Cytosquelette
Nucléosquelette: pas de microtubules dans le nucléoplasme !
→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette
Microtubules
Microfilaments
Filaments intermédiaires
Filaments intermédiaires (lamines)
Microfilaments d’actineNesprines: protéines transmembranaires
→ relie le cytosquelette (filaments intermédiaires , microfilaments d’actine, microtubules) avec l’enveloppe nucléaire
→ Interagit avec des protéines ancrées dans la face nucléoplasmique
→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette
QCM 2
NesprineFilaments
intermédiaires
QCM 3
GEF
GTPGDP
PiGAP
GDPGTP
RanRan
GAP: GTPase-activating protéin
GEF: Guanine –nucleotide
Exchange Factor
Le système RanQCM 3
Ran = GTPase
Echange
Hydrolyse
QCM 3
• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:
GEF / GAP
noyau / cytosol
• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme
Le système Ran
RanGDP Cytosol
RanGTP
NoyauRanGDP
RanGTP
Diffusion de Ran à travers l’enveloppe nucléaire
GEF
GAP
Importine
Exportine
QCM 3
GAP
cytosolique
GEF
nucléaire
QCM 3 Filaments intermédiaires
Lamines A, B et C: → spécifiques du noyau
→ formation de la lamina nucléaire
- Lamine B fixée à la face nucléocytoplasmique de l’enveloppe nucléaire par un groupement farnésyl ≠≠≠≠ Lamines A et C
- Lamines A et C: lamina + nucléoplasme
- Récepteurs des lamines: prot. transmembranaires
Lamina: Interagit avec les pores nucléaires
lamina
QCM 3 QCM 3La lamina nucléaire
- Organisation :Face nucléoplasmique de la membrane interne: formation de l’enveloppe nucléaire
- rôle dans la régulation de l’expression des gènes + ++
- Liaison avec les pores nucléaires
- au cours du cycle cellulaire (cf cours Mitose):
- désorganisation en prométaphase (phosphorylation des lamines …): rupture de l’enveloppe en prométaphase- réassemblage en début de télophase
Mutations de la lamine A :
observées dans le syndrome de Hutchinson-Gilford = progeria
Patient muté
Mère non
mutée
Eriksson et al; 2003, Nature 423: 293-298
L’enveloppe nucléaireQCM 3 Diffusion de Ran à travers l’enveloppe nucléaire
GEF
GAP
Importine
Exportine
QCM 3- 4
GAPcytosolique
GEFnucléaire
- Imp. ββββ
- Imp. αααα / exportine
Importines et exportines: récepteurs à double affinité-Liaison à la charge (cargo)-Liaison aux motifs FG des Nup
Signaux d’adressage:-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)
Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)
Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction
QCM 4 Le transport nucléocytoplasmique
L’importation:
Le transport nucléo-cytoplasmique:
cytosol
nucléoplasme
Imp. αα αα
cargo
Imp. ββ ββ
1: interactionsimp. ββββ – motifs FG
2: translocation par transporteur
central
3: interaction RanGTP- imp. ββββinduit dissociation imp. αααα-cargo
RanGTP
Imp. αααα
cargo
Imp. ββββ
Imp. αααα
cargo
Imp. ββββ
RanGTP
QCM 4 Le transport nucléocytoplasmique
ADN: 5%
ARN: 10%
Protéines: 85%
QCM 5 Le nucléole QCM 5 Le nucléole
Région intranucléaire bien individualisée:- Biogénèse des ribosomes- présent à l’interphase- contient des portions de chromosomes: régions NOR
Cellule eucaryote fabrique 2000-3000 ribosomes par minute
Constituant granulairePré-ribosomes
Constituant fibrillaire dense Constituant
fibrillaire clair
ChromosomeUn seul représenté
ADN en cours de transcription -> 45S
Microscopie électronique (MET):
-Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)
- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR
Le nucléole – Régions NORQCM 5
Remarque : les chromosomes acrocentriques peuvent être répartis sur plusieurs nucléoles
N = 5 x2
NOR = - Constrictions secondaires au niveau des chro mosomes acrocentriques
- Coloration au nitrate d’argent (caryotype)
- Translocation robertsonienne
ADNr ADNr ADNr ADNr
Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)
ARNr 45S
Grande sous-unitéribosomale (60S)
Petite sous-unitéribosomale (40S)
Clivage / maturation de l’ARN
(Polymérase III)
NOR (organisateur nucléolaire)
QCM 5
ARN Polymérase I
Cf cours sur la transcription (UE1)
Le nucléole – Régions NOR
RibosomesQCM 6
Uniquement au moment de la traduction
Biogénèse des ribosomes:
- Action des 3 ARN polymérases (pol I, II et III)
- Transfert des sous -unités par le pore nucléaire vers le cytosol
- Assemblage des sous-unités dans le cytosol sur l’ARNm (cf UE1)
QCM 6 Le noyau
Le recyclage des importines
Le transport nucléo-cytoplasmique:
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
exportine
Imp. αααα
RanGTP
exportine
Imp. αααα
RanGAPRanGDP
exportine
Imp. αααα
! Imp. αααα a un signal NES
2: hydrolyse du GTP: libération de imp. αααα
Exercice 1:
Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES
Le transport nucléo-cytoplasmique: export
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
NES
exportineRanGTP
exportine
NES
RanGTP
exportine
NES
RanGAP
RanGDP
exportine
NES
exportine leptomycine
Exercice 1:
Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES
Figure 1
A l’équilibre
Exercice 1:
Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES
Figure 2
A l’équilibre
Chromosomes - Caryotype
Organisation de l’ADN dans le noyau:
génome haploïde = 3.2 109 pb => Noyau = 6,4 109 pb
23 paires de chromosomes: ADN réparti en 46 molécules
- 1 chromosome = 50.106 à 250. 106 pb
1,7 cm à 8.5 cm si l’ADN était déroulé
=> noyau cellule humaine ≈ 2 m d’ADN
=> nécessité d’un compactage
Exemple du génome humain:
Principaux niveaux de repliement de l’ADN
Facteur de compaction ∼ x50 000
Interphase
Chromatine décondensée
Mitose
Chromatine condensée
Forme condenséeSpirale
interphasique
Double hélice d’ADN
Collier de perles
Fibre de 30 nm
Repliementen boucles
Chromosome mitotique:
Chromosome métaphasique
Chrom.
- Écouvillons
- Polyténiques
Dans les chromosomes interphasiques
Interphase: chromosomes décondenséspas d’enchevêtrement aléatoire: Territoires chromosomiques
Territoires chromosomiques
Organisation de l’ADN dans le noyau:
Chromosomes: de 50 à 250 x 106 pb
Répétition 5’ TTAGGG 3’
sur 5-10 kpb
Se raccourcit à chaque division
Structure d’un chromosome métaphasiqueQCM 7
Observation après coloration
Classement des chromosomes ?
- Taille
- Position du centromère (Ic= p/(p+q)
- Bandes G, R, C
Classement en 7 groupes (A à G)
Accumulation de cellules
Synchronisation / blocage
Culture cellulaire: cellules somatiques
Prométaphase ou métaphase
Solution hypotonique
Obtention d’un caryotype
Dispersion chromosomique
Fixation, coloration
Division cellulaire
QCM 7
Colchicine
lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)
Obtention d’un caryotypeQCM 7
Caryotypes:
A B
C
D E
F G C G
métacentriques
submétacentriques
acrocentriques
Classement d’après la longueur et l’index centromér ique :7 groupes de A–>G
acrocentriques
13 14 15
21 22
Obtention d’un caryotypeQCM 7
Région pseudo-autosomique 1PAR 1
Crossing-over obligatoiredes chromatides non-sœurs
pendant la méïose
Région pseudo-autosomique 2PAR 2
Centre d’inactivation en Xq13
SRY
X Y
Les gonosomes
Y: Contient 10 fois moins de
gènes que le X
Coloration des chromosomes
Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine
• Bandes: Caractéristiques d’une paire chromosomique
Reproductible d’une mitose à l’autre
Caractéristique d’une espèce donnée
• Métaphase: 200 – 500 bandes résolution 5-10 Mpb
QCM 7
Riches en AT
Réplication tardive
Bandes G (sombres)Digestion enzymatique
ménagéeColoration Giemsa
(≈ bandes Q)
Hétérochromatine
- Centromères et constrictions IIaires (1, 9, 16)
- Satellites des Chromosomes acrocentriques
- Bras long du chromosome Y
Bandes C
Coloration Baryte + Giemsa
Bandes R (sombres)Digestion thermique
ménagéeColoration Giemsa
Riches en GC
Réplication précoce
Coloration des chromosomes
Scan résultat caryotype avec résolution
FISH: Hybridation In Situ Fluorescente
Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)
+Ne nécessite pas de cellules en division (métaphase ou interphase)
Bonne résolution
Outil de recherche
-Etude ciblée (sonde spécifique)
Les différents types de sonde
Cytogénétique moléculaire:
FISH: Fluorescent in situ hybridization:
Sondes télomériques
- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise
- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée
- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)
• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX
• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3
Les anomalies chromosomiques
Remarque: Mosaïque physiologique ?Inactivation du chromosome X
• Respect du dosage génique entre homme (XY) / femme (XX) : Inactivation quasi-complète d’un chromosome X chez la femme
• Cependant certains gènes échappent à l’inactivation.
• L’inactivation se fait au hasard puis se transmet aux cellules filles= Mosaïque de cellules
• X inactivé forme le corpuscule de Barr
• se met en place pendant l’embryogenèse mais réversible durant l’ovogenèse (hétérochromatine facultative ) Mosaïque chez les femelles
Inactivation du chromosome X
Corpsucule de Barr
Les anomalies chromosomiques
Translocation robertsonienne
Translocation réciproque équilibrée
Chromosomes acrocentriques (NOR):
13, 14, 15, 21 et 22
Ex: 45, XY, der(14,21)(q10; q10)
Ex: 46, XX, t(7,8)(q11.1; q21.2)
A connaître!
Les anomalies chromosomiquesAnomalies de structure
délétion inversion duplication isochromosome
Exercice 2
46, XX, del(9)(p22.1)
46, XX, der(9)t(5;9)(p13.3; p22.1)
Exercice 2
Coloration conventionnelle (bande G)
46, XX, del(9)(p22.1) 46, XX, der(9)t(5;9)(p13.3; p22.1)
Exercice 2
del (9) der (9)der (9)sondes
sondes
sondes
sondes
der (9)der (9)
Exercice 2 Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
Exercice 2
Aspect « quantitatif » du CGH array:
- Normal:
2 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin : ln(2/2) = ln (1) = 0
- Trisomie complète:
3 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (3/2) = ln (1,5) = + 0,4
- Monosomie complète:
1 allèle sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (1/2) = ln (0,5) = - 0,7
Mosaïcisme: entre les 2….
Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
Exercice 2
Mb Mb
Mb
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