TD Noyau, Chromatine,

Chromosome, Caryotype

(S. Delbecq)

N. Boulle Année 2013-2014

Le noyau

NOYAU

Caractéristique des cellules eucaryotes +++

- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)

- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)

QCM 1

Mise en évidence en microscopie:

- fluorescence: agents intercalant de l’ADN (DAPI, BET…)

- colorants basiques : hématoxyline, bleu de méthylène…

- réaction de Feulgen : hydrolyse acide de l’ADN et révélation avec le réactif de Schiff (détecte les aldéhydes)

DAPI (Fluorescence)

FeulgenHématoxyline

NOYAU

L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau

Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950

chromatine

QCM 1

QCM 1 L’enveloppe nucléaire

Description:

Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RER- membrane interne- espace périnucléaire Membrane

externe

Membrane interne

Enveloppe nucléaire Réticulum

Endoplasmique

Lumière du RE

Espace périnucléaire

Lamina nucléaire

Pore nucléaire

ribosome

L’espace périnucléaire

Espace en continuité avec la lumière du RE:- contenu similaire- stockage du calcium

Percée par les pores nucléaires

Récepteur des lamines

La membrane nucléaire

Récepteur pour histones ou protéines associées

Membrane externe, cytosolique = région spécialisée de RER

Membrane interne nucléocytoplasmique

→→→→ composition ≠≠≠≠

Ca++

QCM 1

QCM 1

Cytosquelette

Nucléosquelette: pas de microtubules dans le nucléoplasme !

→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette

Microtubules

Microfilaments

Filaments intermédiaires

Filaments intermédiaires (lamines)

Microfilaments d’actine

Exemple de syncytium: fibres musculaires

(muscles striés)

Coupe longitudinale

Coupe transversale

Myofibrille

Sarcoplasme

Noyauxpériphériques

Sarcolemme

Planche donnée pour information

Le muscle strié :la fibre musculaire

Le syncytium contient plusieurs noyaux dans un cytoplasme unique

Exemple de cellules multinuclééesQCM 1

- Position centrale en général

Relation avec centrosome (→ fuseau mitotique)

Structure du noyauQCM 2

- Nombre : en général, 1 par celluleExceptions - plusieurs : ex.fibres musculaires (syncitium)

- aucun : GR, plaquettes

- Forme : ronde ou ovaleExceptions : polynucléaires

-Taille : - 5 à 6 µm- 6% du volume cellulaire- rapport nucléo/protoplasmique selon activité / type cellulaire

N/P = Vol. Noyau / Vol. cellule

http://www.physique.univ-paris-diderot.fr/IMG/jpg/image4.jpg

Lamina: Face interne de l’enveloppe nucléaire

- Interagit avec les pores nucléaires

- Rôle dans la régulation de l’expression des gènes

lamina

QCM 2 Structure du noyau

Mutations de la lamine A :

observées dans le syndrome de Hutchinson-Gilford = progeria

Patient muté

Mère non

mutée

Eriksson et al; 2003, Nature 423: 293-298

QCM 2 Structure du noyau

Lamines A, B et C: → Filaments intermédiaires

→ spécifiques du noyau

→ formation de la lamina nucléaire

- Lamine B fixée à la face nucléocytoplasmique de l’enveloppe nucléaire par un groupement farnésyl ≠≠≠≠ Lamines A et C

- Lamines A et C: lamina + nucléoplasme

- Récepteurs des lamines: prot. transmembranaires

QCM 2 Structure du noyau

Protéines:

- Lamines A et C hors lamina

- Actine

- Particules ribonucléoprotéiques

- Enzymes du métabolisme ADN, ARN

QCM 2 Structure du noyau

L’enveloppe nucléaire se dissocie à chaque mitose, puis se reconstitue Rôle des complexes

cyclines / Cdks (voir cours sur le cycle cellulaire)

QCM 2

Exercice 1

Transport nucléo-cytoplasmique

Les pores nucléaires

- Seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme

- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité

- Passage de petites molécules, ions

Protéines

ARNm, ARNt, ARNr

ribonucléoprotéines, particules ribosomales…

- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)

Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues~ 450 protéines en tout (par pore)

Molécules de taille variable!

Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable

Les pores nucléaires

16 bras radiaires (2x8)

16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)

Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757

Structure 3D des pores nucléaires

Microscopie electronique, cryofracture

8 unités répétées

notion de sélectivité

Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique

- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)

- Importines, exportines: Récepteurs de transport

-Les Nucléoporines:

-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore

Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sensÉlément transporté = cargo

Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):

Domaine FG ( Ex: motif FXFG)

Séquences de reconnaissance pour les Importines / ExportinesInterviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!

Signaux d’adressage:-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)

Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)

Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction

REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique

Les signaux d’adressage nucléaires

Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153

Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG

Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757

Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 1 53

Extrémité flexible

Fixe importine / exportine

GEF

GTPGDP

PiGAP

GDPGTP

RanRan

GAP: GTPase-Activating Protéin

GEF: Guanine –nucleotide

Exchange Factor

Le système Ran: orientation du transport NC

Ran = GTPase

Echange

Hydrolyse

• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:

GEF / GAP

noyau / cytosol

• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme

Le système Ran

Ran GDP Cytosol

Ran GTP

NoyauRan GDP

Ran GTP

GEF

Importine

Exportine

GAPcytosolique

GEFnucléaire

Gradient de Ran à travers l’enveloppe nucléaire

Figure 1 : Représentation schématique du résultat des observations sur les lots de cellules. La membrane plasmique des cellules est représentée par un simple trait noir délimitant le cytosol, l’enveloppe nucléaire est représentée par un double trait délimitant le nucléoplasme. La fluorescence observée au microscope est représentée en gris.

1 2 3 4 5

Figure 2 : Représentation schématique du résultat des observations sur les lots de cellules exprimant P-YFPwt (contrôle) ou la protéine P-YFP-XX en présence ou non d’inhibiteur du transport nucléocytoplasmique. La fluorescence observée au microscope est représentée en gris.

1 2 3 4

Exemple de la localisation nucléo-cytoplasmique d’une protéine marquée GFP (FoxA1-GFP)

Kau TR et al. Cancer Cell 2003

QCM 3 Fonctions internes du noyau

! Imp. αααα a un signal NES

ADN: 5%

ARN: 10%

Protéines: 85%

QCM 3 Le nucléole

QCM 3 Le nucléole

Région intranucléaire bien individualisée:

- Biogénèse des ribosomes- présent à l’interphase- contient des portions de chromosomes: régions NOR

Cellule eucaryote fabrique 2000-3000 ribosomes par minute

Le nucléole – Régions NORQCM 3

Remarque : les chromosomes acrocentriques peuvent être répartis sur plusieurs nucléoles

NOR = - Constrictions secondaires au niveau des chro mosomes acrocentriques

- Centre fibrillaire des nucléoles

Constrictions secondaires

Région NOR

N = 5 chromosomes acrocentriques x 2 = 10 régions NOR

ADNr ADNr ADNr ADNr

Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)

ARNr 45S

Grande sous-unité ribosomale (60S)

Petite sous-unité ribosomale (40S)

Clivage / maturation de l’ARN

(Polymérase III)

NOR (organisateur nucléolaire)

QCM 3

ARN Polymérase I

Cf cours sur la transcription (UE1)

Le nucléole – Régions NOR

+ protéines = Grande particule RNP

En Microscopie électronique (MET)

- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR

- Composant fibrillaire dense (grande particule RNP)

- Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)

QCM 3

Uniquement au moment de la traduction

Organisation de l’ADN dans le noyau

Organisation de l’ADN dans le noyau:

génome haploïde = 3,2 x 109 pb => Noyau = 6,4 x 109 pb

23 paires de chromosomes: ADN réparti en 46 molécules

- 1 chromosome = 50.106 à 250. 106 pb

1,7 cm à 8.5 cm si l’ADN était déroulé

=> noyau cellule humaine ≈ 2 m d’ADN

=> nécessité d’un compactage

Exemple du génome humain:

QCM 8

Principaux niveaux de repliement de l’ADN

Facteur de compaction ∼ x50 000

Interphase

Chromatine dispersée (eu-) ou condensée

(hétéro-)

Mitose

Chromatine hypercondensée

Forme condenséeSpirale

interphasique

Double hélice d’ADN

Collier de perles

Fibre de 30 nm

Repliementen boucles

Chromosome mitotique:

Chromosome métaphasique

QCM 8

Matrice nucléaire

QCM 8

Chromosome en écouvillon (ovocytes) → boucles

Boucles → Transcription active

boucles

Interphase: chromosomes décondenséspas d’enchevêtrement aléatoire: Territoires chromosomiques

Territoires chromosomiques

QCM 8 Cellule en interphase

QCM 8 Cellule en interphase

Positionnement des fragments de chromosomes et activité transcriptionnelle

= Mosaïque physiologique

?Inactivation du chromosome X

• Respect du dosage génique entre homme (XY) / femme (XX) :Inactivation quasi-complète d’un chromosome X chez la femme

• X inactivé forme le corpuscule de Barr

• se met en place pendant l’embryogenèse mais réversible durantl’ovogenèse (hétérochromatine facultative )

• L’inactivation se fait au hasard puis se transmet aux cellules filles= Mosaïque de cellules

QCM 7

Mosaïque chez les femelles

Inactivation du chromosome X

Corpsucule de Barr

QCM 7

Chromosomes - Caryotype

Accumulation de cellules

Synchronisation / blocage

Culture cellulaire: cellules somatiques

Prométaphase ou métaphase

Solution hypotonique

Obtention d’un caryotype

Dispersion chromosomique

Fixation, coloration

Division cellulaire

QCM 7

Colchicine

lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)(Cellules tumorales)

Obtention d’un caryotypeQCM 7

Répétition 5’ TTAGGG 3’

sur 5-10 kpb

Se raccourcit à chaque division

Structure d’un chromosome métaphasiqueQCM 7

Observation après coloration

Classement des chromosomes ?

- Taille

- Position du centromère

Ic= p/(p+q)

- Bandes (G, R…)

Classement en 7 groupes (A à G)

Caryotypes:

A B

C

D E

F G C G

métacentriques

submétacentriques

acrocentriques

Classement d’après la longueur et l’index centromérique :7 groupes de A–>G

acrocentriques

13 14 15

21 22

Obtention d’un caryotypeQCM 7

Région pseudo-autosomique 1PAR 1

Crossing-over obligatoiredes chromatides non-sœurs

pendant la méïose

Région pseudo-autosomique 2PAR 2

Centre d’inactivation en Xq13

SRY

X Y

Les gonosomes

Y: Contient 10 fois moins de

gènes que le X

Coloration des chromosomes au Giemsa

Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine

- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa

- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa

• Bandes:

→ Caractéristiques d’une paire chromosomique

→ Reproductible d’une mitose à l’autre

→ Caractéristique d’une espèce donnée

• Métaphase: 200 – 500 bandes

résolution 5-10 Mpb

QCM 7

Scan résultat caryotype avec résolution

QCM 7

FISH: Hybridation In Situ Fluorescente

Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)

+Ne nécessite pas de cellules en division (métaphase ou interphase)

Bonne résolution

Outil de recherche

-Etude ciblée (sonde spécifique)

Les différents types de sonde

Cytogénétique moléculaire:

FISH: Fluorescent in situ hybridization:

Sondes télomériques

QCM 7

QCM 7

- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise

- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée

- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)

• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX

• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3

Exemple: 47, XY, +21

Les anomalies chromosomiquesQCM 7

Les anomalies chromosomiques

Translocation robertsonienne

Translocation réciproque équilibrée

Chromosomes acrocentriques (NOR):

13, 14, 15, 21 et 22

Ex: 45, XY, der(14,21)(q10; q10)

Ex: 46, XX, t(7,8)(q11.1; q21.2)

Nomenclature à connaître!

QCM 7

Les anomalies chromosomiquesAnomalies de structure

délétion inversion duplication isochromosome

QCM 7

Exercice 2

Exploration d’une anomalie chromosomique

Figure 3

Figure 4A- pcp 3q: sonde spécifique du bras long du chromosome 3 –

subtel 3q: sonde subtélomérique spécifique du bras long du chromosome 3

B- cen 12: sonde spécifique du centromère du chromosome 12 –

subtel 12p: sonde subtélomérique spécifique du bras court du chromosome 12

Exercice 2 Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

Préparation de l’ADN

Hybridation sur support contenant les sondes (« puce »)

Acquisition des signaux d’hybridation

Analyse quantitative des données

Exercice 2

Aspect comparatif et « quantitatif » du CGH (Intensity Ratio):

- Normal:

2 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin : ln(2/2) = ln (1) = 0

- Trisomie complète:

3 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (3/2) = ln (1,5) = + 0,4

- Monosomie complète:

1 allèle sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (1/2) = ln (0,5) = - 0,7

Mosaïcisme: entre les 2….

Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support

Mais on ne voit pas les chromosomes

anomalie équilibrée→ pas de différence quantitative

Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

IR =

Intensity Ratio

Figure 5